Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Митохондриальная функция в диафрагме эмфизематных хомяков после лечения нандролоном

Mitochondrial function in diaphragm of emphysematous hamsters after treatment with nandrolone
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2706598/

Дыхательная недостаточность у пациентов с ХОБЛ может быть вызвана недостаточным производством силы или недостаточной выносливостью дыхательных мышц. Анаболические стероиды могут улучшить функцию дыхательных мышц при ХОБЛ. Влияние анаболических стероидов на митохондриальную функцию в диафрагме при эмфиземе неизвестно. В эмфизематной модели мужского хомяка мы исследовали, повлияло ли введение анаболического стероидного нандролона деканоата (ND) на активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме. Вес тела хомяков, обработанных ND, уменьшался после лечения по сравнению с исходными значениями, а уровни тестостерона в сыворотке были значительно ниже у хомяков, получавших ND, чем у контрольных хомяков. Не наблюдалось различий в активности митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме между нормальными и эмфизематовыми хомячками. Лечение ND не меняло активности митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме как нормальных, так и эмфизематных хомяков. У эмфизематозных хомячков введение ND уменьшало активность сукцината: цитохрома c-оксидоредуктазы по сравнению с лечением ND у нормальных хомяков. Мы пришли к выводу, что анаболические стероиды оказывают отрицательное влияние на активность сукцината: цитохрома c оксидоредуктазы и анаболического статуса в этой модели эмфизематозного хомячка.

У пациентов с ХОБЛ диафрагма хронически перегружена, что является более серьезным с увеличением тяжести расстройства. В результате происходит несколько адаптаций, включая переход от быстрых, гликолитических волокон типа II к медленным, окислительным, типам I типа (Levine et al 1997, Mercadier et al., 1998). Кроме того, происходят метаболические изменения, напоминающие те, которые появляются после тренировки на выносливость, такие как увеличение окислительной способности (Noble and Ianuzzo 1985; Green et al 1995, Proctor et al 1995). Митохондриальная функция усиливается в диафрагме пациентов с ХОБЛ (Ribera et al 2002), о чем свидетельствует увеличение максимальной скорости дыхания митохондрий и эффективности транспортной цепи митохондриальных электронов. Это считается полезным, поскольку эти изменения вызывают увеличение выносливости.

Несмотря на этот сдвиг в сторону более устойчивой к усталости мышцы, большинство пациентов с тяжелой ХОБЛ умирают от респираторной недостаточности (Braghiroli et al 1997). Эта респираторная недостаточность может иметь несколько причин, включая недостаточное производство силы или недостаточную выносливость дыхательных мышц или комбинацию этих факторов. Например, Levine et al (2003) наблюдали снижение силовой способности в диафрагме пациентов с ХОБЛ.

Анаболические стероиды могут быть полезны при профилактике респираторной недостаточности. Клинические исследования в основном исследовали эффект лечения анаболическими стероидами на мышечную силу-генерирующую способность. Например, было показано, что лечение с помощью нандролона деканоата (ND) улучшает функцию дыхательных мышц и способность к физической нагрузке после программы легочной реабилитации у пациентов с ХОБЛ с использованием пероральных глюкокортикостероидов (Creutzberg et al., 2003). Лечение тестостероном приводило к увеличению мышечной силы и выносливости четырехглавой мышцы с помощью и без тренировочной программы по сопротивлению у пациентов с ХОБЛ (Casaburi et al 2004). В этом исследовании тестостерон не изменял силу дыхательной мышцы.

В моделях на животных исследовано влияние анаболического стероидного лечения на окислительную способность в нескольких скелетных мышцах. В литературе существует противоречие о влиянии анаболических стероидов на митохондриальную функцию и связанной с ними способности к выносливости. Эффект анаболических стероидов на митохондриальную функцию, по-видимому, зависит от типа волокна, с быстроразрывными волокнами (Saborido et al., 1991) или аэробными мышцами (Egginton 1987), наиболее чувствительными к увеличению окислительной способности у крыс.

Для предотвращения респираторной недостаточности важно знать, приводит ли лечение анаболическими стероидами к увеличению окислительной способности дыхательных мышц и к функции митохондрий, особенно при эмфиземе. Поэтому мы исследовали, увеличило ли применение ND активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме эмфизематозных хомяков. С этой целью мы лечили здоровых и эмфизематозных хомячков с помощью ND или плацебо и определяли активность нескольких частей митохондриальной энергогенерирующей системы.

Использовались 40-недельные инбредные сирийские золотые хомяки (Elevage Janvier) с первоначальным весом ~ 100 г. Животные были случайным образом разделены на нормальные (NH) и эмфизематозные (EH) группы. Исследование было одобрено Комитетом по экспериментальным исследованиям животных Университета Медицинского центра в Неймегене и проведено в соответствии с Национальным руководством по уходу за животными Нидерландов.

При анестезии смеси 2,5% изофлурана и N2O и (1: 2), физиологического раствора (NH) или свиной поджелудочной эластазы (18 U / 100 г O2 веса тела [Raub et al., 1982] [EPC, Owensville, MI, USA] в 0,50 мл нормального физиологического раствора) вводили интратрахеально, как подробно описано ранее (Lewis et al 1992, van der Heijden et al 1998, van Balkom et al., 1999).

Когда животных убивали, легкие удаляли для измерения объема легких путем смещения жидкости для оценки степени эмфиземы.

Через пятьдесят две недели после индукции эмфиземы нормальные хомяки и эмфизематозные хомяки были разделены на обработанные (ND) и непрореагировавшие (CON) группы. Хомяков в обработанных группах вводили в течение 10 недель с 2,5 мг / кг ND (Deca-Durabolin, NV Organon, Oss, Нидерланды) один раз в неделю внутримышечно. Для достижения максимального эффекта ND вводили в максимальной дозе, как рекомендовано изготовителем для использования у пациентов. Хомякам в контрольных группах вводили физиологический раствор за тот же период. Группы подразделялись следующим образом: NH CON (n = 9), EH CON (n = 12), NH ND (n = 10) и EH ND (n = 14).

Через шестьдесят две недели после инстилляции хомяков анестезировали пентобарбиталом натрия (нембутал, 70 мг / кг внутрибрюшинно). Катетер из полиэтилена вводили через трахеотомию для механической вентиляции со 100% O2. Диафрагму быстро удаляли после комбинированной лапаротомии и торакотомии и немедленно помещали в холодный буфер СЕТН (0,25 моль / л сахарозы, 2 ммоль / л ЭДТА, 10 ммоль / л Трис, 5 × 104 ед. Гепарина, рН 7,4).

Мембранную мышцу промывали свежим ледяным СЕТРОМ, и жир и соединительная ткань были отсоединены. Ткань была разрезана очень маленькими кусочками около 0,1 × 0,1 мм с помощью тканевого измельчителя Sorvall TC2 с лезвием бритвы. Ткань гомогенизировали в свежем холодном буфере SETH (5% -10% мас. / Об.) С гомогенизатором ткани Potter Elvehjem согласно Fischer, Ruitenbeek, Stadhouders и др. (1985). Некоторые 100 мкл образцов неочищенного гомогената немедленно замораживали в жидком азоте и выдерживали при -80 ° C для измерения содержания белка, цитохромоксидазы и цитрат-синтазы (CS). Остальную часть неочищенного гомогената центрифугировали в течение 10 минут при 2 ° С при 600 × g. Супернатант 600 × g замораживали в аликвотах по 100 мкл в жидком азоте и выдерживали при -80 ° С для измерения содержания белка, активности CS и активности ферментов дыхательной цепи. Активность CS была измерена в соответствии с Srere (1969) с небольшими изменениями. Вкратце, образец супернатанта 600 × g разбавляли (1: 1) буфером SETH, содержащим 0,5% Triton X-100. Образец в 50 мкл инкубировали в общем объеме 1,0 мл, содержащем 0,1 моль / л Tris, 0,1 ммоль / л DTNB (5,5′-дитио-бис (2-нитро) -бензоат), 0,3 ммоль / л ацетилкофермента-А , и 0,5 ммоль / л оксалоуксусной кислоты, pH 8,1. В пробе отсутствовала оксалоуксусная кислота. Получение коэнзима-А с помощью CS измеряли спектрофотометрически при 412 нм путем измерения уменьшения DTNB. Концентрацию белка измеряли согласно Lowry et al (1951) с незначительными модификациями.

Инкубации для определения активности сукцината: цитохрома c-оксидоредуктазы (SCC) проводились в соответствии с Fischer, Ruitenbeek, Berden и др. (1985) с незначительными модификациями. Инкубации для определения активности комплекса III (C-III) и комплекса IV (C-IV) выполнялись соответственно Bentlage et al (1996) и Cooperstein and Lazarow (1951). Деятельность SCC, C-III и C-IV была разделена на активность CS для коррекции содержания митохондрий.

Когда животных убивали, образцы крови брали из брюшной аорты для измерения концентрации тестостерона в сыворотке. Тестостерон в сыворотке оценивали с помощью 3H-радиоиммуноанализа (RIA) после предварительной очистки с помощью бумажной хроматографии эфирных экстрактов образцов, включая коррекцию для процедурных потерь, как описано ранее (Swinkels et al., 1987). Резюмируя кратко, перед экстракцией добавляли 3H-тестостерон для коррекции процедурных потерь. После хроматографии радиохроматографическое сканирование идентифицировало местоположение зоны тестостерона; зона была вырезана и смочена в буфере. Восстановленную радиоактивность измеряли жидким сцинтилляционным счетчиком аликвоты из элюата. Затем добавляли тест-тест и антисыворотку, и после инкубации свободные и связанные трассирующие вещества разделяли с помощью древесного угля, покрытого декстраном. Радиоактивность, связанная с антителом, оценивали с помощью жидкостного сцинтилляционного счета супернатанта. Расчеты выполнялись специальным программным обеспечением, предназначенным для коррекции массы и радиоактивного вклада индикатора восстановления в РИА. Предел обнаружения составлял 3,5 пмоль / л.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM), когда это необходимо. Данные были проанализированы с помощью SPSS для Windows, версия 12.0.1 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Для определения наличия различий между группами использовали односторонний тест ANOVA (анализ дисперсии) и пост-hoc-тест Tukey. Для определения различий внутри групп до и после лечения использовался парный тест t. Значение было установлено на уровне 0,05.

Вес тела был значительно ниже у обеих эмфизематных групп хомяков, чем у нормальных групп до лечения (р <0,05). После лечения вес тела был значительно ниже в нормальной группе хомяков, обработанной нандролоном, и группе эмфизематом, обработанной нандролоном, чем до лечения (p <0,05). Результаты показаны в таблице 1.

Средний объем легких был значительно выше у эмфизематозных групп хомяков, чем в нормальных группах (17,0 ± 0,5 мл против 11,4 ± 0,5 мл, р <0,001), что указывает на то, что в эмфизематозных группах действительно индуцируется эмфизема. Кроме того, объем легких был выше у эмфизематозных обработанных нандролоном, чем эмфизематных контрольных хомяков (р = 0,004). Объемы легких представлены в таблице 1.

Уровни тестостерона в сыворотке были равны у эмфизематозных и нормальных хомяков. После обработки ND уровни тестостерона в сыворотке у нормальных хонмеров, обработанных нандролоном, были значительно уменьшены по сравнению с нормальными контрольными хомячками и эмфизематовыми хондерами, обработанными нандролоном, по сравнению с эмфизематомными контрольными (p = 0,001 и p <0,001 соответственно). Уровни тестостерона в сыворотке представлены на рисунке 1.

Активность CS, C-III и C-IV была одинаковой между четырьмя группами лечения. Активность SCC не отличалась между нормальными контрольными хомяками и эмфизематом контроля. Однако после лечения ND активность SCC была значительно выше в диафрагме нормальных хомяков, чем активность эмфизематозных животных. Результаты митохондриальной функции представлены на рисунках 2-5.

Это первое исследование для изучения эффектов лечения анаболическим стероидом на активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме эмфизематозных хомяков. Это показывает, что активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме не отличалась от нормальных и эмфизематозных хомяков. Лечение ND не изменяло активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов у нормальных или эмфизематозных хомяков. Однако у эмфизематозных животных лечение ND уменьшало активность SCC по сравнению с лечением ND у нормальных хомяков. Содержание митохондрий после лечения ND не изменялось. Кроме того, вес тела хомяков, обработанных ND, снижался после лечения по сравнению с исходными значениями, а уровни тестостерона в сыворотке были значительно ниже у животных, получавших ND, чем у контрольных.

В митохондриях энергия вырабатывается системой митохондриального окислительного фосфорилирования, которая встроена в митохондриальную внутреннюю мембрану и включает в себя пять ферментных комплексов (I-V) и два электронных носителя (кофермент Q и цитохром c) (Hatefi 1985, Saraste, 1999). Основной функцией системы является скоординированный перенос электронов и протонов через различные комплексы, что приводит к образованию аденозинтрифосфата (АТФ) (Smeitink et al., 2001). Этот АТФ может использоваться для различных функций клеток, включая сокращения в скелетных мышцах. В нашем исследовании мы обнаружили, что митохондриальная энергоемкая способность диафрагмы не изменялась после лечения анаболическими стероидами, как у нормальных, так и у эмфизематозных хомяков. Это согласуется с результатами Saborido et al (1991), которые обнаружили, что у крысиного экстензора digitorum longus (EDL), но не в подошвенной мышце, митохондриальная функция усиливалась после лечения флуоксиместероном и мет-андростанолоном, что указывало на более высокую чувствительность для анаболического стероида в быстрой подтяжке (EDL) мышцы. В том же исследовании количество митохондрий не изменялось после введения анаболических стероидов. Напротив, Egginton (1987) предположил, что аэробные мышцы, такие как подошва и диафрагма, более восприимчивы к увеличению митохондриальной способности после лечения нандролоном фенилпропионатом. Бек и Джеймс (Beck and James, 1978) показали увеличение объема митохондрий в крысиной диафрагме после лечения 19-нортестостероном. Это согласуется с выводами Satoh et al (2000), которые обнаружили увеличение площади поперечного сечения митохондрий после обработки нандролоном фенилпропионатом в мышиной диафрагме.

Сравнение с предыдущими результатами затруднено, поскольку в разных исследованиях используются разные дозы, виды, продолжительность лечения, возраст, способ введения и уровень активности. Было показано, что эти факторы влияют на эффекты анаболического лечения (Bresloff et al 1974; Beck and James 1978; Kopera 1985; Prezant et al., 1993). Например, лечение крыс-самцов 19-нортестостероном в низкой дозе приводило к увеличению доли объема митохондрий в типе I и промежуточных волокнах, тогда как обработка с высокой дозой приводила к менее выраженному увеличению объемных долей митохондрий, особенно в промежуточных что ответ на анаболические стероиды был ниже в группе с высокими дозами (Beck and James 1978). Изменение вышеупомянутых факторов может объяснить тот факт, что литература очень несовместима с эффектом лечения анаболическими стероидами на митохондриальную функцию.

Еще одно открытие в нашем исследовании заключается в том, что после лечения ND активность SCC на митохондрию снижается в диафрагме эмфизематом по сравнению с нормальными хомячками. SCC измеряет комплексы II и III и кофермент-носитель электронов Q, которые расположены в внутренней мембране митохондрий (Molano et al 1999). Molano и коллеги сообщили о сниженной активности ферментов в внутренней мембране митохондрии печени крыс после лечения станозололом и флуоксиместероном, но без изменения активности CS, которая находится в матричном пространстве. Авторы предположили, что анаболически-андрогенные стероиды могут влиять на митохондриальную мембрану из-за их гидрофобной природы. В этом же исследовании после обработки станозололом и флуоксиместероном не было обнаружено никаких изменений в активности С-IV, что указывает на то, что электронный транспорт нарушается в цепи переноса электронов до C-IV этими анаболическими стероидами (Molano et al 1999). Однако в нашем исследовании мы не обнаружили снижения активности С-III после лечения НД. Это расхождение в результатах может быть связано с различием в изучаемой ткани, а именно с диафрагмой хомяка в нашем исследовании против печени крысы в ​​исследовании Molano и его коллег. Кроме того, в последнем исследовании анаболические стероиды вводились перорально, что давало эффект первого прохода в печени, где измеряли активность фермента. Возможное объяснение нашего обнаружения того, что активность SCC снижается в диафрагме эмфизематозных хомяков, леченных ND, заключается в том, что, возможно, эта специфическая митохондриальная часть более восприимчива к эффектам введения ND в более активных мышцах (как и диафрагма в эмфиземе).

Недавно было показано, что максимальная скорость митохондриального дыхания и эффективность электронной транспортной цепи для производства АТФ увеличиваются в диафрагме пациентов с ХОБЛ (Ribera et al 2002). Максимальная частота дыхания митохондрий в диафрагме пациентов с ХОБЛ была в два раза выше, чем в диафрагме контрольных субъектов. Обучение выносливости обусловливает увеличение максимальной частоты дыхания митохондрий в мышце лаурального мышцы человека (Walsh et al 2001). Однако это увеличение намного меньше, чем в диафрагме пациентов с ХОБЛ (Ribera et al 2002). Частота дыхания зависит от мышцы, исследованной у крыс, варьируя от 9,6 мкмоль O2 / мин / г сухой массы в подошвенной мышце до 32 мкмоль O2 / мин / г сухой массы в сердечной мышце (De Sousa et al., 2001). Этот показатель также, по-видимому, зависит от вида, поскольку максимальная частота дыхания митохондрий, сообщаемая Ribera et al (2002) в диафрагме человека, составляла 5,28 мкмольO2 / мин / г сухой массы, тогда как максимальная частота дыхания в крысиной диафрагме составляла в среднем 12 мкмоль O2 / мин / г сухого веса (De Sousa et al., 2001). Данные о вмешательствах, вызывающих изменения в диафрагмальной митохондриальной функции человека, недоступны. Поэтому нельзя предсказать, может ли увеличение вмешательства митохондриального дыхания, обнаруженное Риберой и коллегами, усилить вмешательство.

Тот факт, что в нашем исследовании мы не обнаружили увеличения активности митохондриальных дыхательных цепных комплексов после лечения ND, как у нормальных, так и у эмфизематозных хомячков, подразумевает, что лечение с помощью ND не может увеличить выносливость диафрагмы. Это говорит о том, что лечение анаболическими стероидами не может предотвратить респираторную недостаточность. Однако респираторная недостаточность также может быть вызвана уменьшением мощностей, создающих силу вдоха. Роль анаболических стероидов в предотвращении этой причины респираторной недостаточности у пациентов с ХОБЛ противоречива. Например, Creutzberg et al (2003) обнаружили увеличение максимальной силы вдоха после лечения ND у пациентов с ХОБЛ (50 мг ND / 2 недели). Пациенты в этом исследовании провели лечебно-реабилитационную программу, состоящую из нескольких видов выносливости. Только у пациентов, использующих пероральные глюкокортикостероиды, лечение ND оказывает дополнительное положительное влияние на функцию дыхательных мышц выше эффекта легочной реабилитации. Этот эффект ND не наблюдался у пациентов, которые не использовали пероральные глюкокортикостероиды. Это соответствует результатам Casaburi et al (2004), которые не обнаружили изменений в максимальной силе вдоха после введения тестостерона у пациентов с ХОБЛ, которые не получали длительное пероральное лечение кортикостероидами. Вывод, что у пациентов, использующих лечение кортикостероидами, восстанавливает функцию дыхательных мышц в соответствии с экспериментальными экспериментами на животных (van Balkom et al 1998, 1999). В модели крыс лечение с помощью ND предотвращало потерю силы диафрагмы, вызванной долгосрочным введением низких доз метилпреднизолона (van Balkom et al., 1998). В последующем исследовании (van Balkom et al., 1999) сообщалось, что ND также способно предотвратить потерю диафрагмальной функции у эмфизематозных хомяков, получавших долгосрочный метилпреднизолон с низкой дозой. Эти результаты, в сочетании с результатами исследований в вышеупомянутых исследованиях (Creutzberg et al 2003, Casaburi et al., 2004), показывают, что лечение только анаболическими стероидами может быть полезно для предотвращения респираторной недостаточности только у пациентов, получающих кортикостероиды.

В нашем исследовании мы обнаружили, что вес тела уменьшился после лечения ND. Это согласуется с другими исследованиями, в которых обнаружено снижение массы тела у самцов крыс после лечения ND (Bisschop et al 1997). Циркулирующие эндогенные андрогены могут играть определенную роль. Сообщалось, что превышение физиологического уровня андрогенов у мужчин приводит к снижению естественного производства тестостерона (Ryan 1981), снижению регуляции андрогенсвязывающих рецепторов (Rance and Max 1984), снижению аппетита (Kochakian and Endahl 1959) и метаболическое превращение в избыточный эстрадиол (Hickson and Kurowski 1986). Естественное производство тестостерона действительно уменьшилось у хомячков, обработанных ND, в нашем исследовании, что показано более низким уровнем тестостерона в сыворотке в группах ND.

В заключение, это исследование показывает, что активность митохондриальных дыхательных цепных комплексов в диафрагме как у нормальных, так и у эмфизематозных хомяков была одинаковой, и что лечение с помощью ND не изменяло эту активность. У эмфизематозных хомячков администрация ND уменьшала активность SCC по сравнению с лечением ND у нормальных хомяков. Кроме того, мы показали, что вес тела хомяков, обработанных ND, снижался после лечения по сравнению с исходными значениями, и что лечение с помощью ND приводило к значительно более низким уровням тестостерона в сыворотке крови у нормальных и эмфизематозных хомяков. Принимая во внимание все результаты, наши данные не поддерживают использование анаболических стероидов для предотвращения респираторной недостаточности, вызванной усталостью диафрагмы.

Мы благодарим технических специалистов лаборатории биохимической диагностики митохондрий Лаборатории педиатрии и неврологии за проведение митохондриальных измерений. Это исследование было финансово поддержано Boehringer-Ingelheim, Нидерланды (грант 4922 BA12).

Концентрация тестостерона в сыворотке.

p <0,05 против группы NH CON.

b p <0,05 против группы EH CON.

Сокращения Рисунки 1-5: NH, нормальный хомяк; EH, эмфизематный хомяк; CON, контрольная группа; И, нандролоновая группа.

Активность цитрат-синтазы (CS) в диафрагме.

Активность сукцината: цитохрома c оксидоредуктазы (SCC) в диафрагме.

p <0,05 против NH ND группы.

Активность комплекса III (C-III) в диафрагме.

Активность комплекса IV (C-IV) в диафрагме.

Вес тела и объемы легких (среднее ± SEM)

p <0,05 EH против NH.

p <0,05 до и после лечения.

p <0,001 EH против NH.

p <0,01 EH ND против EH CON.

Сокращения: CON, контрольная группа; EH, эмфизематный хомяк; NH, нормальный хомяк; ND, нандролон.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *