Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Гистондезацетилаза 2-опосредованное деацетилирование глюкокортикоидного рецептора позволяет подавлять NF-κB

Histone deacetylase 2–mediated deacetylation of the glucocorticoid receptor enables NF-κB suppression
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2118081/

Это S poppers: Kazuhiro Ito: k. Большинство @ имеют м Перия л. О с. Бакланы K

Глюкокортикоиды являются наиболее эффективными противовоспалительными средствами для лечения хронических воспалительных заболеваний, хотя некоторые заболевания, такие как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), относительно нечувствительны к глюкокортикоиду. Однако молекулярный механизм этой глюкокортикоидной нечувствительности остается неопределенным. Мы показываем, что дефект деацетилирования глюкокортикоидного рецептора (GR), вызванный нарушенной гистоновой деацетилазой (HDAC) 2, индуцирует глюкокортикоидную нечувствительность к экспрессии гена, опосредованного ядерным фактором (NF) -κB. Конкретный нокдаун HDAC2 путем интерференции РНК приводил к снижению чувствительности к подавлению дексаметазона индуцированного интерлейкином 1β гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Потеря HDAC2 не уменьшала транслокацию GR, привязку GR к глюкокортикоидному ответному элементу (GRE) на ДНК или индуцированную ГР ДНК или индукцию гена, но ингибировала связь между GR и NF-κB. GR становится ацетилированным после связывания лиганда, а HDAC2-опосредованное деацетилирование GR позволяет связывать GR с комплексом NF-κB. Site-направленный мутагенез K494 и K495 уменьшал ацетилирование GR, и способность подавлять экспрессию гена NF-κB-зависимостей становилась нечувствительной к ингибированию гистондезацетилазы. В заключение мы показываем, что избыточная экспрессия HDAC2 в глюкокортикоид-чувствительных альвеолярных макрофагах у пациентов с ХОБЛ способна восстанавливать глюкокортикоидную чувствительность. Таким образом, снижение HDAC2 играет критическую роль в глюкокортикоидной нечувствительности в подавлении опосредованной NF-κB, но не GRE-опосредованной экспрессии генов.

В покоящейся клетке хроматин плотно уплотняется для предотвращения доступности фактора транскрипции. Во время активации клетки этот компактный недоступный хроматин становится доступным для ДНК-связывающих белков, что позволяет индуцировать транскрипцию гена (1, 2). Имеются убедительные доказательства того, что усиленная транскрипция гена связана с увеличением ацетилирования гистонов, индуцированным гистон-ацетилтрансферазой, тогда как гипоацетилирование коррелирует с уменьшенной транскрипцией или молчанием генов (2, 3), которое контролируется гистондезацетилазами (HDACs).

По меньшей мере 18 HDACs теперь распознаются в клетках млекопитающих (4, 5) и сгруппированы в 4 класса на основе сходства генов у дрожжей. В предыдущих исследованиях мы обнаружили, что общая ядерная активность HDAC и экспрессия HDAC2 снижаются в макрофагах легких и периферической легочной ткани, полученной при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) (6, 7), и что это сокращение коррелирует с тяжести заболевания.

Глюкокортикоиды являются наиболее эффективной терапией для лечения многих хронических воспалительных заболеваний, таких как астма и воспалительное заболевание кишечника (8). Они действуют путем связывания с цитозольными глюкокортикоидными рецепторами (ГР), которые после связывания активируются и быстро транслоцируются в ядро. Внутри ядра GR либо индуцирует транскрипцию генов, таких как ингибитор протеиназы лейкоцитарного секрета (SLPI) (8) и митоген-активированную киназную фосфатазу-1 (9), либо ингибирует экспрессию генов, таких как IL-6 (10) путем связывания к специфическим элементам ДНК (глюкокортикоидные элементы ответа [GREs]) в промоторе / усилителе чувствительных генов. При более низких концентрациях глюкокортикоиды уменьшают воспалительную генную транскрипцию, индуцированную NF-κB или AP-1, посредством ассоциации между этими факторами и GR (11). Кроме того, Ogawa et al. также показывают, что GR подавляет большой набор функционально связанных генов воспалительного ответа, нарушая комплексы регуляторного фактора p65-интерферона (12). Таким образом, связывание GR с p65-NF-κB имеет решающее значение для трансрепрессии кортикостероидами. Однако неясно, как GR отделяет его способность контролировать воспаление, подавляя NF-κB от его способности непосредственно трансактивировать гены посредством связывания с GRE.

ХОБЛ является распространенным и изнурительным хроническим воспалительным заболеванием, характеризующимся прогрессирующим ограничением воздушного потока, которое плохо обратимо (13) и глюкокортикоидом нечувствительным (14, 15). Ранее мы продемонстрировали, что общая активность HDAC отрицательно коррелирует с ингибирующим действием дексаметазона (Dex) на продукцию IL-8, индуцированную TNF-α (16), в альвеолярных макрофагах у курильщиков и некурящих. Мы также сообщили, что теофиллин может восстановить глюкокортикоидную чувствительность посредством повышения активности HDAC в макрофагах ХОБЛ (7). Тем не менее, не было выяснено, что HDAC регулирует чувствительность глюкокортикоидов и то, как он модулирует глюкокортикоидное действие.

В этой статье мы идентифицировали фермент HDAC, участвующий в глюкокортикоид-зависимой репрессии экспрессии генов, индуцированных NF-κB, и показали, что избыточная экспрессия HDAC2 способна восстанавливать глюкокортикоидную чувствительность при глюкокортикоидных нечувствительных заболеваниях, таких как ХОБЛ.

Первоначально мы оценивали, приводит ли потеря специфических ферментов HDAC к глюкокортикоидной нечувствительности к индуцированной IL-1β-продуцированию GM-CSF, которая опосредована NF-κB, как сообщалось ранее (17, 18), и из наших данных, показывающих зависимое от концентрации ингибирование с помощью киназы IκB 2 (AS602868, IC50 = 3,6 × 10-6 М). Ферменты класса 1 HDAC (HDAC1, -2, -3 и -8) (4) были выборочно сбиты интерференцией РНК в клетках A549 (фиг.1А). Когда производство GM-CSF нормализовалось к жизнеспособным числам клеток, HDAC2 (1 057,1 ± 209,3 нг / 106 клеток), HDAC3 (910,5 ± 230,5 нг / 106 клеток) и HDAC8 (919,5 ± 64,8 нг / 106 клеток) нокдауна (KD) но не HDAC1 KD, значительно усиливает продукцию GM-CSF, индуцированную IL-1β (против 335,0 ± 55,5 нг / 106 клеток в контроле, фиг.1B). Эти исходные результаты показывают, что HDAC2, -3 и -8 регулируют индуцированную NF-κB индукцию GM-CSF. Ранее мы показали, что трихостатин А (TSA), неселективный ингибитор HDAC, улучшает продукцию GM-CSF в клетках A549 (19).

HDAC2-индуцированная глюкокортикоидная нечувствительность в клетках A549. (A) Dot-блот-анализ ядерных экстрактов из клеток A549 через 48 ч после трансфекции siRNA против HDAC1, -2, -3 и -8; Sc; или только для транспортного средства (NT). (B) IL-1β-стимулированный (1 нг / мл в течение 24 часов) GM-CSF. Значения представляют собой ± SEM. * и **, P <0,05 и P <0,01 соответственно, по сравнению с контролем IL-1β; #, P <0,05 по сравнению с базальным контролем. n = 4 ~ 8 экспериментов. (C) Кривая реакции концентрации подавления Dex индуцированного IL-1β продуцированием GM-CSF и (D) суммировала значения EC50 Dex (n = 4-8). Значения в C представляют собой ± SEM. (E) Корреляция между экспрессией EC50 и HDAC2 в клетках HDAC2 RNAi. Различные уровни экспрессии HDAC2 индуцировали с использованием индивидуальной siRNA или комбинаций до четырех дуплексов против HDAC2. Выражение HDAC2, оцениваемое с помощью Вестерн-блоттинга, было показано как процентное соотношение, полученное в не обработанных клетках. Пунктирные и непрерывные линии представляют собой доверительный интервал 95%.

Кроме того, HDAC2 KD смещал зависимое от концентрации ингибирование высвобождения GM-CSF, индуцированного IL-1, с помощью Dex вправо, что указывает на снижение глюкокортикоидного действия (фиг.1, C и D). Аналогичный результат наблюдался после лечения TSA (19). Аналогичное действие наблюдалось и с подавлением индуцированной IL-1β продуцированием IL-8 (фиг.1D). Напротив, HDAC1, -3 и -8 KD не влияли на действие Dex на продукцию GM-CSF или IL-8 (фиг.1D). Используя индивидуальную короткую интерференционную РНК (siRNA) или комбинации до четырех дуплексов против HDAC2, мы смогли получить различные уровни снижения HDAC2 в клетках (рис.1 E). Это исследование HDAC2 показало, что существует значительная отрицательная корреляция между экспрессией HDAC2 после RNAi и Dex EC50 в отношении продуцирования IL-1β-GM-CSF (r = -0,771, P = 0,0020, фиг.1 E). Это ступенчатое снижение глюкокортикоидной реакции с уменьшением экспрессии HDAC2 свидетельствует о том, что HDAC2 играет важную роль в противовоспалительных действиях глюкокортикоидов. Интенсивно, KD HDAC2 не влияет на максимальный ответ на Dex, наблюдаемый при очень высоких концентрациях (1 мкМ, рис. 1 C), и предполагает, что при этих супрафизиологических концентрациях могут возникать альтернативные механизмы действия (20).

HDAC2 KD не влиял на экспрессию GR или ядерную транслокацию (фиг.2А). Потеря HDAC2 не уменьшала связывание GR-GRE (рис.2 B), GRE-зависимую активность люциферазы (фиг.2 C) или GRE-опосредованную экспрессию гена SLPI (фиг.2D). Кроме того, связывание GR-GRE после лечения Dex продолжалось дольше в клетках HDAC2 KD, чем в не обработанных клетках или скремблированных олигонуклеотидных (Sc) -трансфецированных клетках (фиг.2 E).

HDAC2 KD не ингибирует активацию гена, опосредованного GR. (A) GR транслокации транскрипции в клетках Sc и HDAC2 siRNAs (H2), стимулированных 10-8 M Dex в течение 1 часа. В качестве контроля загрузки использовали β-актин и гистон H1. Связывание GR-GRE (B), активность GRE-люциферазы (C) и индукция гена SLPI (D). * и **, P <0,05 и P <0,01 соответственно (n = 3 эксперимента). NT, не обработанный. (E) связывание GR-GRE 1 ч (закрытый круг) и 8 ч (открытый круг) после стимуляции Декса. Значения в B-E представляют собой ± SEM.

Кроме того, HDAC2 KD не влиял на экспрессию NF-κB, ядерную транслокацию (фиг.3А) или связывание NF-κB-ДНК (фиг.3В). Мы подтвердили предыдущие данные, свидетельствующие о том, что Dex увеличил связь GR и HDAC2 с комплексом p65-NF-κB (рис.3 A) (19). Однако GR не был завербован в комплекс p65-NF-κB после HDAC2 KD (фиг.3А). Анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) показал, что Dex не удалось ингибировать ацетилирование гистона 4 в сайте связывания p65-NF-κB в промоторной области GM-CSF после HDAC2 KD (фиг.3C). Таким образом, HDAC2 KD не уменьшал способность GR индуцировать GR-чувствительную экспрессию гена, но имел преимущественное влияние на подавление опосредованной NF-κB воспалительной экспрессии гена.

HDAC2 KD вызывает ингибирование ассоциации GR-NF-κB. (A) GR и HDAC2 коиммунопреципитировали с p65-NF-κB в ядерных экстрактах в присутствии или в отсутствие 30-минутной обработки IL-1β с предварительной или предварительной 20-минутной обработкой 10-9 M Dex. H2, HDAC2. (B) активацию NF-κB, измеряемую связыванием NF-κB с олигонуклеотидами, включая сайт связывания NF-κB, через 30 мин после лечения IL-1β (n = 3). (C) гистона 4 ацетилирования сайта связывания NF-κB в промоторной области GM-CSF, обнаруженной с помощью анализа ChIP. Ct (пороговые) значения ПЦР-продуктов были нормированы на значения входных образцов. *, P <0,05 по сравнению с контролем IL-1β (n = 3 эксперимента). Значения в B и C представляют собой ± SEM.

Предыдущие исследования показали, что как рецептор эстрогена α, так и андрогенный рецептор ацетилированы в пределах их связывающих доменов с шарниром / лигандом и что он может модулировать индуцированную гормоном индукцию гена (21, 22). Этот сайт ацетилирования ядерного рецептора сохраняется среди членов родственных ядерных рецепторов и, основываясь на этих данных (22), существует потенциальный сайт ацетилирования при aa 492-495 (KTKK) в области ДНК-связывающего домена / шарнирной области GR. Действительно, мы показываем, что GR ацетилируется после связывания Dex (фиг.4, A и B) и уровни ацетилирования были уменьшены, когда K494 и K495 на GR были мутированы с аланином (A), аспарагином (N) или глутамином (Q ) (Фиг.4С). Эти мутанты больше не индуцировали экспрессию SLPI с помощью Dex, несмотря на то, что избыточная экспрессия экспрессии SLPI нативной GR улучшала Dex (фиг.4D). Не было различий в способности нативного или мутантного GR связываться с p65-NF-κB (фиг.4 E). Однако GR-опосредованное подавление IL-1β-стимулированного высвобождения GM-CSF не влияло на TSA с мутантами K494 и K495 (фиг.4F), даже несмотря на то, что репрессия была ослаблена TSA в нативных клетках повышенной экспрессии GR. Это говорит о том, что ацетилирование GR отрицательно регулирует индуцированную Dex репрессию экспрессии гена, зависимого от NF-κB. Кроме того, мы обнаружили, что связанный с p65-NF-κB GR был деацетилирован (фиг.4А). Поскольку GR неспособна связываться с комплексом p65-NF-κB в клетках HDD2 KD, это деацетилирование должно быть важным для GR-опосредованной трансрепрессии (фиг.4, A и B). Важно отметить, что HDAC2 KD не ингибирует связывание GR-GRE или трансактивацию SLPI (фиг.2, B и D), что указывает на то, что ацетилированный GR все еще способен активировать гены, реагирующие с глюкокортикоидами, которые могут быть вовлечены в некоторые побочные эффекты которые ограничивают клиническое применение этих мощных лекарств, а также некоторые незначительные противовоспалительные эффекты посредством индукции противовоспалительных молекул, таких как SLPI и MKP-1.

Деацетилирование GR по HDAC2 является необходимым условием для связывания p65-NF-κB. (A) GR осаждали после лечения автомобилем или Dex анти-GR-антителом в цельных клеточных экстрактах и ​​с олигонуклеотидами GRE или антителом против p65-NF-κB в присутствии 10-8 M Dex и 1 нг / мл IL-1β , Группы визуализировали антиацетил-лизиновым антителом (α-AcK) и анти-GR-антителом (α-GR). (B) Графическое представление результатов, показанных в A, с отношением полосы AcK к диапазону GR в не обработанной (заштрихованной полосе) и клетках HDAC2 RNAi (закрытый бар). X не представляет собой набор GR для NF-κB. *, Р <0,05. (C) уровень ацетилирования GR каждого сайт-направленного мутанта после лечения 10-6 М Dex в течение 1 часа. GR были снесены анти-His-tag-антителом. (D) уровень мРНК SLPI после лечения 10-6 М Dex в течение 4 часов. (E) GR связывание с p65 при обработке 10-8 M Dex в течение 1 часа. GR иммунопреципитируется His-tag-антителом через 1 час после лечения IL-1β. (F) Эффект 10-8 M Dex на продукцию, индуцированную IL-1β GM-CSF, в присутствии 10 нМ TSA в течение 10 мин. *, Р <0,05. (G) AcK-детектирование на иммунопреципитированной GR в присутствии 10-6 M Dex после инкубации с HDAC1, -2, -3 или -8 в течение 4 ч при 30 o C. Отношение полосы AcK к диапазону GR изображается графически. * и **, P <0,05 и P <0,01 соответственно, против контроля (n = 3 эксперимента). Значения в B, D, F и G представляют собой ± SEM.

Чтобы определить, является ли ацетилированный GR субстратом для HDAC2, ацетилированный GR был иммунопреципитирован в присутствии Dex и инкубирован с иммуноочищенным HDAC1, -2, -3 и -8 (доведенный до такой же степени активности HDAC) в неизотопической in vitro. Ацетилированный GR был явно субстратом для HDAC2, хотя он также частично деацетилирован HDAC3 (фиг.4G). Таким образом, ацетилированный GR является субстратом HDAC2, и деацетилирование GR с помощью HDAC2 может быть предпосылкой для ассоциации GR с комплексом p65-NF-κB-активации и последующим подавлением экспрессии воспалительных генов. Этот механизм обеспечивает молекулярное объяснение способности GR различать рекрутирование коактиватора и белков корецептора, как ранее продемонстрировано для GRIP (23), и последующую способность трансактивировать или подавлять транскрипцию гена.

Ранее сообщалось, что экспрессия и активность HDAC2 снижается у курильщиков (16) и пациентов с ХОБЛ (6), которые, как известно, нечувствительны к противовоспалительным эффектам глюкокортикоидов (14). Кроме того, существует отрицательная корреляция между репрессивным эффектом Dex на производство цитокинов и общей активностью HDAC в альвеолярных макрофагах у курильщиков и некурящих (16). Чтобы определить, является ли HDAC2 важным для действий Dex в первичных клетках у пациентов с глюкокортикоидозависимым заболеванием, мы получили альвеолярные макрофаги у здоровых некурящих, здоровых курильщиков и пациентов с ХОБЛ. Не было существенной разницы в выражении макрофагов GR между образцами нормальной и ХОБЛ (неопубликованные данные). Общая активность HDAC, активность иммунопреципитированного HDAC2 (фиг.5 A) и экспрессия белка HDAC2 (фиг.5 B, NT) были заметно снижены в клетках у пациентов с ХОБЛ. Уровень ацетилирования в иммунопреципитированной ядерной ГР после лечения Dex (10-8 М) был увеличен в альвеолярных макрофагах, полученных у пациентов с ХОБЛ (фиг.5С). В этих клетках, полученных от пациентов с ХОБЛ, Dex не ингибировал NF-κB-зависимую (24) LPS-индуцированную GM-CSF продукцию in vitro (фиг.5D, верхняя часть). Сверхэкспрессия белка HDAC2 на 6,5 ± 1,1 раза в первичных макрофагах у пациентов с ХОБЛ (рис.5 B) восстановила эффективность Dex в отношении подавления высвобождения GM-CSF, индуцированного LPS, до уровней, наблюдаемых в клетках у здоровых контрольных субъектов (фиг.5D, средняя ). Напротив, сверхэкспрессия HDAC2 на 3,3 ± 0,86 раза и 5,2 ± 1,1 раза у некурящих и курильщиков, соответственно, не повышала эффективность Dex до получения ЛПС-индуцированной GM-CSF в клетках у некурящих / курильщиков, по-видимому, поскольку эти клетки являются уже чувствительный к действиям Dex (рис. 5 D). Сверхэкспрессия HDAC1 не влияла на чувствительность глюкокортикоидов (рис. 5 D, нижняя). Кроме того, 40% KD HDAC 2 в макрофагах мокроты из здоровых некурящих RNAi вызывали снижение ингибирующего эффекта Dex (10-8 M) от 62 до 36% (рис.5 E).

Сверхэкспрессия HDAC2 восстанавливает глюкокортикоидную чувствительность в альвеолярных макрофагах у пациентов с ХОБЛ. (A) Общая активность HDAC (закрытый бар) и иммунопреципитированная активность HDAC2 (заштрихованная полоса) в ядерных экстрактах. * и **, P <0,05 и P <0,001 соответственно против здоровых некурящих; #, P <0,05 против курильщиков. (B) Репрезентативный образ экспрессии белка HDAC2 в ядерных экстрактах через 24 ч после трансфекции носителем (NT), пустым вектором (Em) и HDAC2-вектором (H2). (C) Уровень ацетилирования иммунопреципитированной GR альвеолярных макрофагов у пациентов с нормальным (N), курильщиком (S) и ХОБЛ (C). Клетки стимулировали 10-8 М Dex в течение 1 часа. (D) 100 нг / мл LPS-индуцированного GM-CSF-продуцирования в отсутствие (закрытый бар) или присутствие (заштрихованный бар) 10-8 М Dex (в течение 20 мин) через 24 ч после трансфекции с каждым вектором. Открытые стержни - это несимметричные контрольные образцы. *, P <0,05 по сравнению с контролем ЛПС (n = 6 экспериментов). (E) LPS-индуцированное GM-CSF-продуцирование в непрореагировавших (NT), Sc или HDAC2 siRNA (H2) -трансфецированных макрофагах мокроты в отсутствие (закрытый бар) или присутствие (заштрихованный бар) 10-8 M Dex в течение 20 мин , *, Р <0,05. Значения в A, D и E представляют собой ± SEM.

В совокупности наши результаты показывают, что HDAC2 является ключевым белком, участвующим в подавлении экспрессии гена воспалительного гена p65-NF-κB, который проявляется при низких концентрациях Dex, тогда как модуляция экспрессии HDAC2 не снижает индуцированную GR-генную индукцию. HDAC2 действует путем деацетилирования GR, тем самым обеспечивая ассоциацию p65-NF-κB и последующее затухание транскрипции провоспалительного гена. Важность этого механизма при ХОБЛ, глюкокортикоидозависимой болезни, подчеркивается сверхэкспрессией HDAC2, которая восстанавливает глюкокортикоидную чувствительность в первичных клетках у этих пациентов.

Линия клеток аденокарциномы легкого человека II типа (клетки A549) была приобретена в Американской коллекции типовых культур. Были набраны здоровые некурящие, настоящие здоровые курильщики и пациенты со стадией 2-3 ХОБЛ. Исследование было одобрено комитетами по этике Института им. Бромптона Харефилда и Национального института сердца и легких, и все испытуемые дали подписанное информированное согласие. Бронхоскопия, бронхоальвеолярный лаваж, выделение бронхоальвеолярного лаважа и макрофагов мокроты выполнялись, как описано ранее (24, 25).

100 ммоль siRNA трансфекции с использованием Gene Silencer (GTS Inc.) для клеток A549 и jetSI (Polyplus-transfection SA) для макрофагов мокроты. siRNAs были приготовлены с набором GeneSilencer (Ambion) или куплены у QIAGEN или Dharmacon. Используемыми дуплексами были HDAC1 (SMART пул [Dharmacon] и nt 89), HDAC2 (nt 96, 177, 642 и 813), HDAC3 (SMART пул [Dharmacon] и nt 411) и HDAC8 (nt 155 и 373). Неспецифический контрольный дуплекс (Sc, 47% гуанин-цитозина) также был приобретен у Dharmacon.

Плазмиды (pcDNA3.1), содержащие гены HDAC1 и HDAC2, были переданы S. Georas (Университет Джона Хопкинса, Балтимор, MD). Альвеолярные макрофаги (3 × 105 клеток / лунку) трансфицировали с использованием jetPEI-Man (Polyplus-transfection SA).

Полное извлечение РНК и обратная транскрипция выполнялись с использованием набора RNeasy (QIAGEN) и набора Omniscript RT (QIAGEN). Уровень транскрипции гена SLPI и GAPDH определяли количественно в ПЦР в реальном времени с использованием набора QuantiTect SYBR Green PCR (QIAGEN) на Rotor-Gene 3000 (Corbett Research).

Концентрации IL-8 и GM-CSF определяли с помощью сэндвич-ELISA (R & D Systems) и нормировали на количество клеток, как определено методом MTT.

Биотизированные олигонуклеотидные дуплексы, содержащие два GRE (26), инкубировали в 96-луночных планшетах с контагированием стрептавидином (Thermo Labsystems). Связывание GR с олигонуклеотидами было коструктивно обнаружено в ядерных экстрактах (19) с помощью иммуноферментного метода с использованием анти-GR-антитела (Santa Cruz Biotechnology, Inc.).

Ядерные экстракты и иммунопреципитированные образцы готовили и оценивали с помощью обычного SDS-PAGE / Вестерн-блоттинга (19). Определение экспрессии белка HDAC после RNAi проводили с помощью дот-блот-анализа.

GR был иммунопреципитирован в целых клеточных экстрактах анти-GR-антитело-конъюгированными агарозными гранулами A / G. GR также осаждали авидин-агарозными гранулами, конъюгированными с биотинилированными олигонуклеотидами, содержащими 2 × GRE (5′-aagattcaggtcatg-acctgaggaga-3 ‘), или коиммунопреципитировали с ацерозными агарозными гранулами, конъюгированными с p65-NF-κB, в ядерных экстрактах в присутствии 10-8 М Dex и 1 нг / мл IL-1β.

ChIP с панацетилированным антителом гистона 4 (набор для анализа ChIP, Upstate Biotechnology) проводили в промоторной области GM-CSF, как описано выше (19), используя вышеупомянутую систему ПЦР в реальном времени.

Site-направленный мутагенез проводили с использованием системы Mutagenesis на основе гена Tailor (Invitrogen).

Активность HDAC измеряли с помощью набора HDAC Fluorescent Activity Assay (BIOMOL Research Laboratories, Inc.).

Активацию NF-κB определяли с помощью набора NAM-KB TransAM (активный мотив).

Плазмиды, содержащие две GRE-люциферазы, были подарены Дж. Блумом (University of Arizona, Tucson, AZ). Плазмиды трансфицировали в клетки A549 с помощью pSV-β-галактозидазы (Promega) с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen), как описано ранее (27).

Результаты выражаются как средства ± SEM. Анализ дисперсии проводился анализом Крускала-Уоллиса и, когда были сделаны значительные сравнения, с помощью теста Манна-Уитни U с использованием пакета анализа SPSS 10.0 (SPSS Inc.). P <0,05 считалось статистически значимым.

Мы обязаны доктору Onn Min Kon за помощь в предоставлении клинических образцов.

Работа в этой лаборатории финансировалась Британским фондом легких (P00-13), Комитетом клинических исследований (Королевская больница Бромптон, C / 02/15). Б. Козио был получателем стипендий Европейского респираторного общества и Separ. P.J. Barnes, I.M. Adcock и K. Ito получили неограниченное финансирование от Boehringer Ingelheim и GlaxoSmithKline для финансирования части этой работы.

Авторы не имеют противоречивые финансовые интересы.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *