Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Дефицит остеопонтина изменяет гомеостаз желчных протоков и защищает от образования желчных камней

Osteopontin Deficiency Alters Biliary Homeostasis and Protects against Gallstone Formation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4971489/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Выпадение избыточного желчного холестерина в виде твердых кристаллов является предпосылкой для образования желчного желчного протока, что происходит из-за нарушенного гомеостаза желчного протока. Билиарный гомеостаз регулируется сложной сетью генов в гепатоцитах. Если неуправляемые, кристаллы холестерина будут собираться, сливаться и образовывать желчные камни. Ранее мы наблюдали, что уровни остеопонтина (OPN) в желчи и желчном пузыре были снижены у пациентов с желчным камнем. Однако роль и механизм печеночной ОПН в образовании желчного желчного протока не определены. В этом исследовании мы обнаружили, что экспрессия печеночного OPN была увеличена у пациентов с желчным камнем по сравнению с аналогами, не содержащими желчно-камне. Затем мы заметили, что мыши с дефицитом OPN были менее уязвимы к образованию желчных камней холестерина, чем мыши дикого типа. Дальнейшие механистические исследования показали, что этот защитный эффект был связан с изменением состава желчи и вызван увеличением экспрессии печени CYP7A1 и сниженной экспрессией печеночных SHP, ATP8B1, SR-B1 и SREBP-2. Наконец, корреляции между экспрессией печеночной OPN и экспрессией этих печеночных генов были подтверждены у пациентов с желчным камнем. Взятые вместе, наши результаты показывают, что печеночный OPN способствует образованию желчного желчного протока, регулируя метаболизм желчных путей и может быть разработан как терапевтическая цель для лечения желчных камней.

Заболевание желчных камней является одной из основных проблем со здоровьем во всем мире, и связанные с ней осложнения и сопутствующие заболевания налагают существенное финансовое бремя на экономику здравоохранения1234. Желчнокаменная болезнь является многофакторной болезнью, подверженной сложному взаимодействию генетических и экологических факторов5. Выделение избыточного холестерина в желчи в виде твердых кристаллов является предпосылкой для образования желчного протока холестерина67. Кроме того, некоторые билиарные белки, а именно пронуклеация и белки против зарождения, могут также влиять на кристаллы холестерина и образование камней. Критический баланс между этими белками определяет предрасположенность желчи к образованию кристаллов холестерина или продлевает процесс образования кристаллов8. Растворимость холестерина в водных растворах крайне ограничена. Однако холестерин может быть превращен в желчь через смешанные мицеллы, состоящие из желчных солей и фосфолипида5. Выпадение холестерина происходит из-за чрезмерного холестерина, дефицита желчных солей или фосфолипида или комбинации этих факторов5. Метаболизм желчных солей и липидов регулируется сложной сетью транспортеров. Вкратце, секреция холестерина регулируется ABC-транспортерами ABCG5, ABCG8 и Scavenger, B1 (SR-B1) 91011. Секрецию фосфолипида контролируют ABCB4, P-гликопротеиновый член семейства генов с множественной лекарственной устойчивостью12. Затем желчные кислоты секретируются в желчь по ABCB11 и ABCB1a / b13. Если функция этих транспортеров нарушена, что приводит к неуравновешенному билиарному гомеостазу, кристаллы холестерина будут собираться, сливаться и в конечном итоге формировать патологические желчные камни.

Остеопонтин (OPN) представляет собой растворимый цитокин и связанный с матрицей белок, выраженный в большинстве тканей и жидкостей организма14, и способен контролировать прогрессирование опухоли и метастазы15. Наши предыдущие исследования показали, что OPN может ингибировать образование желчного протока холестерина в качестве фактора против зарождения в желчном пузыре1617. Другое исследование показало, что OPN высоко экспрессируется в эпителии каштанообразных внутрипеченочных желчных протоков, внутримышечных, заочных желез и камней, что указывает на то, что OPN участвует в гепатолитозе18. Однако роль печеночной ОПН в холестериновом желчном камне не определена. Chapman J. et al. что OPN-дефицитные (OPN — / -) мыши были полностью защищены от печеночной резистентности к инсулину, которые развивались в контроле дикого типа (WT) при кормлении диеты с высоким содержанием жиров в течение 2-4 недель19. Biddinger S.B. и другие. что печеночная резистентность к инсулину непосредственно способствовала образованию желчных камней холестерина за счет увеличения экспрессии переносчиков желчного холестерина ABCG5 и ABCG8 и уменьшения активности синтетических ферментов желчных кислот у мышей20. Эти исследования показывают, что OPN может регулировать соли печени и липидного обмена и влиять на формирование желчного протока холестерина.

В этом исследовании мы проанализировали соотношение между экспрессией печеночной OPN и образованием желчного протока как у пациентов, так и у мышей. Мы обнаруживаем, что печеночный OPN способствует образованию холестерина в желчном пузыре, регулируя метаболизм желчных путей у мышей.

Чтобы исследовать роль печеночного OPN в образовании желчного пузыря, мы сначала проанализировали экспрессию OPN в образцах ткани печени GS и GSF с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия печеночной OPN в мессенджере РНК (мРНК) была выше в GS, чем в GSF (рис.1a). Результаты количественной иммуногистохимии также показали, что экспрессия белка OPP печени была увеличена в GS (фиг.1b-d). Между группами GS и GSF (дополнительная таблица S1) не наблюдалось существенной разницы в возрасте, полу, индексе массы тела или глюкозе натощак. Эти результаты свидетельствуют о том, что печеночный OPN играет важную роль в формировании патологических желчных камней.

Затем мы использовали OPN — / — мышей для дальнейшего изучения роли и механизма печеночной ОПН в образовании желчного протока. При кормлении диеты чау-чау (CD) ни у мышей WT, ни у мышей OPN — / — не было кристаллов или желчных камней (таблица 1). Восемьдесят процентов (4 из 5 мужчин и 4 из 5 женщин) мышей WT развивали желчные камни при подаче литогенной диеты (LD) в течение 8 недель, тогда как пенетрант у мышей OPN — / — составлял 10% (1 из 5 мужчин и 0 5 женщин) (таблица 1). По сравнению с мышами OPN — / — желчь желчного пузыря мышей WT казалась мутной и полной осадков и камней (рис.2а). Микроскопическое исследование желчи желчного пузыря выявило холестериновые кристаллы у мышей WT, тогда как мышей OPN — / — в значительной степени не были выделены осадки холестерина (фиг.2b). Гистология желчного пузыря и печени была сходна у мышей, получавших LD (дополнительный рисунок S1).

У ОПН — / — мышей, получавших CD, наблюдались повышенные уровни желчных кислот (рис. 2е, левая колонка), но сходные уровни желчного холестерина и фосфолипида по сравнению с мышами WT (рис. 2c, d, левые столбцы). Однако мыши OPN — / -, которым вводили LD в течение 8 недель, показали увеличение уровней фосфолипида и желчной кислоты (рис. 2d, e, правые столбцы), но снижение содержания холестерина по сравнению с мышами WT (рис.2c, правая колонка) , Этот комбинированный эффект биохимических изменений привел к уменьшению CSI у мышей с OPN — / — мышам LD (рис.2f, правые столбцы), что обеспечило биохимический механизм дефицита OPN для защиты мышей от образования желчного камня холестерина.

Не было различий в массе тела, массе печени или липидных и желчных кислотных профилях печени и сыворотки между мышами WT и мышами OPN — / -, которые получали CD (таблица 2). После 8 недель кормления LD, OPN — / — мыши показали увеличение массы тела, но снижение их массы тела / массы тела по сравнению с мышами WT (таблица 2). Липидный профиль сыворотки между двумя генотипами не проявлял никаких изменений после 8 недель LD. Хотя сывороточная желчная кислота, как правило, увеличивалась у мышей OPN — / -, получавших LD, изменение не было статистически значимым (Таблица 2). Содержание печеночных липидов, включая уровни холестерина и триглицеридов (ТГ), и уровни печени желчных кислот были выше у мышей OPN — / -, чем у мышей WT, получавших LD (таблица 2). Эти данные свидетельствуют о том, что LD сопровождается отличительными изменениями метаболизма печеночных липидов и желчных кислот у мышей OPN — / — по сравнению с мышами WT.

Чтобы понять механизм, с помощью которого дефицит OPN защищает мышей от образования желчного протока холестерина, мы проанализировали экспрессию печеночных генов, которые участвуют в билиарном гомеостазе. Не было существенных различий в этих генах между двумя генотипами, питавшими CD (фиг.3a, b). При обследовании с LD в течение 8 недель мы впервые измерили экспрессию печеночной желчной кислоты и переносчиков липидов. Экспрессия фосфолипидных обратных транспортеров, АТФазы, аминофосфолипидного транспортера, класса I, типа 8B, члена 1 (ATP8B1) была снижена почти на 40% у мышей OPN — / -, тогда как экспрессия фосфолипидного оттока ABCB4 не изменялась (фиг.4а) , Среди переносчиков желчных кислот мышей OPN — / — не было обнаружено различий в экспрессии N-таурохолатного котранспортирующего полипептида (NTCP), органического анион-транспортера (OATP), ABCB11 или ABCB1a / b (фиг.4а). Среди переносчиков холестерина экспрессия SR-B1 была уменьшена почти на 50% у мышей OPN — / -, тогда как экспрессия ABCG5, ABCG8 и ABCA1 не была затронута (фиг.4а). Экспрессия внутриклеточных переносчиков холестерина типа Niemann типа C1 (NPC1), типа Ниманна типа C2 (NPC2) и белка-носителя стерола 2 (SCP2) не отличалась (фиг.4а). Экспрессия липопротеинового рецептора низкой плотности (LDLR) и связанного с LDLR белка (LRP) также не изменилась, тогда как экспрессия индуцируемого деградиента рецептора липопротеинов низкой плотности, LDLR (IDOL) и пропротеин-конвертазы субтилизина / кексина типа 9 (PCSK9 ) было значительно снижено у мышей OPN — / -, которым вводили LD (фиг.4a).

Биосинтез желчных кислот в печени контролируется несколькими ферментами CYP. Уровень мРНК 7-альфа-монооксигеназы холестерина (CYP7A1) был заметно увеличен у мышей OPN — / — с использованием LD. Однако экспрессия других ферментов CYP существенно не изменилась (фиг.4b). Экспрессия рецептора XY активатора рецептора CYP7A1 (LXR) не показала различий (фиг.4е). Затем мы оценивали экспрессию фарнезоидного X-рецептора (FXR), малого гетеродимерного партнера (SHP), рецептора фактора роста фибробластов 4 (FGFR4) и бета-клото (β-KLOTHO), которые играют важную роль в контроле отрицательной обратной связи транскрипции CYP7A1 , Экспрессия SHP и β-KLOTHO была снижена у мышей OPN — / -, тогда как экспрессия FXR и FGFR4 не была затронута (фиг.4c).

Затем мы оценили экспрессию 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент-синтазы (HMGCS) и 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермента A редуктазы (HMGCR), двух ключевых ферментов в синтезе печеночного холестерина. Экспрессия HMGCR была снижена на 40% у мышей OPN — / -, тогда как экспрессия HMGCS не отличалась. Затем мы измеряли два транскрипционных фактора восходящего потока, связывающий белок 1c рецептора стерола (SREBP-1c) и связывающий белок 2 регулятора стерола (SREBP-2). Экспрессия SREBP-2 была уменьшена у мышей OPN — / -, тогда как экспрессия SREBP-1c не была затронута (рис.4d). Мы также профилировали выражение других ядерных рецепторов, которые могут влиять на билиарный гомеостаз, но они не показали значительных изменений (рис.4е). Изменение экспрессии белка SR-B1 и CYP7A1 было подтверждено вестерн-блот-анализом (фиг.5).

Наконец, мы проверили корреляции между экспрессией печеночной OPN и родственными генами печени в GS. Как и ожидалось, экспрессия мРНК печеночной OPN имела сильную положительную корреляцию с экспрессией печеночных SHP, ATP8B1, SR-B1 и SREBP-2 в GS (фиг.6). Полученные результаты показывают, что печеночный OPN изменяет билиарные композиции, регулируя экспрессию ключевых генов, участвующих в метаболизме холестерина в печени и желчных кислотах.

В этом исследовании мы продемонстрировали, что печеночный OPN участвует в билиарном гомеостазе, регулируя экспрессию генов печеночных генов и играет важную роль в формировании желчного протока холестерина.

Наше предыдущее исследование показало, что OPN может ингибировать образование желчного протока холестерина в качестве фактора против зарождения желчи желчного пузыря, а ОПН в желчном пузыре, вероятно, из тканей желчного пузыря1617. В текущем исследовании мы обнаружили, что экспрессия печеночной OPN была увеличена у GS, а дефицит OPN изменил билиарный гомеостаз и защищен от образования желчного протока у мышей. Скорее всего, печеночный OPN играет более важную роль в процессе образования желчного протока, чем желчный пузырь OPN. Повышенная экспрессия печеночной OPN в GS подтверждает, что OPN играет роль в патогенезе желчнокаменной болезни.

Мыши OPN — / — показали увеличение массы тела, чем мышей WT при кормлении LD в течение 8 недель. Это может быть результатом уменьшенной экспрессии печеночной β-KLOTHO у мышей с OPN — / — (LD), приводимых в LD (рис.4c), что может привести к ослаблению сигнальной функции печени FGF1521. Сообщалось, что активация печеночной передачи FGF15 может снизить массу тела и повысить скорость метаболизма222324. Кроме того, мы обнаружили, что экспрессия ацетил-СоА-карбоксилазы 2 (ACC2) 2526 и стеароил-CoA-десатуразы 1 (SCD1) 2728, которые являются целевыми генами FGF15, регулирующими окисление и синтез жирных кислот, была выше у мышей OPN — / — чем мыши WT, получавшие ЛД (дополнительный рисунок S2). Таким образом, увеличение массы тела у мышей с OPN — / — мышей, получавших LD, может быть частично вызвано ослаблением передачи сигналов печени FGF15, в то время как подробный механизм требует дальнейшего изучения.

Сообщалось, что самцы мышей C57BL / 6J более восприимчивы к желчным камням, вызванным диетой, чем у мышей C57BL / 6J29. В нашем исследовании равное количество мышей мужского и женского пола использовалось в двух генотипах. И частота образования желчного пузыря у мышей мужского и женского WT, которым кормили LD в течение 8 недель, была одинаковой. Кроме того, у CSI у мышей с женским и женским лимфоузлами не было существенной разницы (дополнительная таблица S2). Эти результаты свидетельствуют о том, что на образование желчных камней не влиял пол мышей линии C57BL6 / J в наших экспериментальных условиях. Сравнивая условия эксперимента между нашим исследованием и предыдущим исследованием21, мы обнаружили, что LD, использующий в нашем исследовании, содержало более высокое содержание холестерина, чем диета (в основном содержалось 19,4% масла, 3,4% кукурузного масла, 0,38% холестерина и 0,5% холевой кислоты ) в предыдущем исследовании21. Вероятно, что при более высоких уровнях холестерина влияние пола на дистрофию желчнокаменной болезни снижается.

В желчном пузыре желчь растворимость холестерина поддерживается балансом между холестерином, желчной кислотой и фосфолипидом30. Таким образом, мышей OPN — / -, которым вводили LD, были защищены от образования желчного протока из-за значительно более низкой концентрации холестерина, с более высокими уровнями желчной кислоты и фосфолипида в желчном пузыре желчи и, следовательно, уменьшением CSI.

Хотя экспрессия выброса фосфолипидов ABCB4 не изменилась, увеличение содержания желчных фосфолипидов в мышах OPN — / — мышей с ЛД приводило к уменьшенной экспрессии АТФ8В1, которая играет роль в переносе фосфолипида из внешней в внутреннюю каналообразную membrane3132. К сожалению, не было различий в содержании фосфолипидов в печени между двумя генотипами.

Что касается механизмов повышенной желчной и печеночной желчной кислоты у мышей с OPN — / — мышами, получавшими LD, мы измерили печеночные гены, участвующие в метаболизме и переносе желчной кислоты, и обнаружили, что среди измеряемых генов только ген CYP7A1 скорость ограничивающий фермент синтеза желчных кислот33, был отрегулирован у мышей OPN — / — с использованием LD. Сообщалось, что мыши, чрезмерно экспрессирующие пептид CYP7A1, имели более высокие скорости секреции желчных кислот, чем мыши WT34. Затем мы измерили размер пула желчных кислот и выделение фекальной желчной кислоты и обнаружили, что оба они были увеличены у мышей OPN — / — с помощью LD (дополнительный рис. S3). Кроме того, мы также изучили экспрессию кишечных генов, участвующих в энтерогепатическом цикле желчных кислот, но не обнаружили статистически значимой разницы между генотипами (дополнительный рис. S4). Повышенные уровни пула желчных кислот и экскреция желчных кислот фекалий при установлении каких-либо изменений в экспрессии родственных генов кишечника свидетельствуют о том, что синтез и секреция желчной кислоты в печени печени OPN — / — печени может быть увеличена. Однако очень жаль, что мы не измеряли скорости секреции желчных кислот во время экспериментов с мышами, что является ограничением нашего исследования. Взятые вместе, увеличение желчных и печеночных желчных кислот у мышей с OPN — / — мышей, получавших LD, может быть в основном обусловлено усиленной экспрессией CYP7A1.

Экспрессия CYP7A1 взаимно регулируется желчной кислотой через путь FXR-SHP и оксистеролами через путь LXR. LXR сочетается с ретиноидным X-рецептором (RXR) с образованием гетеродимера. Затем гетеродимер LXR-RXR способствует экспрессии CYP7A1 путем связывания с промоторной областью CYP7A133. К сожалению, мы не обнаружили разницы в выражении LXR или RXR. Кроме того, было показано, что эффекты FXR, модулирующие экспрессию CYP7A1, доминируют над эффектами LXR35. В печени SHP уменьшает вербовку коактиваторов на промотор гена CYP7A1, тем самым ингибируя экспрессию CYP7A13637. Между тем, фактор роста фибробластов 15 (FGF15) из кишечника может связываться с FGFR4 и β-KLOTHO, что приводит к потере связывания коактиватора с промотором гена CYP7A1 и последующему ингибированию экспрессии CYP7A138. Мы обнаружили, что экспрессия SHP и β-KLOTHO, которая требуется для сигнального 3940 FGF15, была снижена у мышей OPN — / -, получавших LD. Эти результаты показывают, что высшая экспрессия CYP7A1 у мышей OPN — / — обусловлена ​​подавлением SHP. SHP — один ген-мишень FXR41. Однако экспрессия FXR не была затронута в OPN — / — мышах с ЛД. Эти данные свидетельствуют о том, что потеря OPN приводит к ослаблению сигнализации SHP. Кроме того, мы подтвердили актуальность наших результатов в человеческих условиях, наблюдая сильную положительную корреляцию между экспрессией мРНК OPN и SHP в печени GS. Существует только несколько исследований взаимосвязи между OPN и SHP. OPN может вызвать значительное увеличение уровня фактора некроза опухоли α (TNFα) у мышей42. TNFα также может активировать путь N-концевой киназы c-Jun (JNK )43. Более того, активация JNK-пути может индуцировать экспрессию SHP44. Эти исследования показывают, что OPN может влиять на SHP через пути TNFα и JNK. Таким образом, мы проанализировали экспрессию печеночной мРНК TNFα в двух генотипах мыши и обнаружили, что экспрессия TNFα была значительно снижена у мышей OPN — / — по сравнению с мышами WT, которые получали LD (дополнительный рисунок S5), что указывает на то, что дефицит OPN может подавляют экспрессию TNFα и приводят к уменьшению экспрессии SHP. Механизм, с помощью которого нокаут OPN приводит к подавлению SHP, нуждается в дальнейшем изучении.

Содержание холестерина в желчном пузыре было снижено, тогда как уровень холестерина в печени увеличивался у мышей с OPN — / — мышей, получавших LD. Это явление может быть результатом дисфункции транспортера холестерина. Неожиданно экспрессия ABCG5 и ABCG8 не показала различия между генотипами. Предыдущее исследование показало, что пути, не зависящие от ABCG5 и ABCG8, также существуют и способствуют секреции холестерина в желчи45. SR-B1 способствует ABCG5 / G8-независимой секреции желчного холестерина, которая локализована в желчном канале 1046. Как и ожидалось, экспрессия мРНК SR-B1 была снижена у мышей OPN — / — по сравнению с мышами WT. Таким образом, основной причиной снижения профиля желчного холестерина у мышей, получавших LDN — / -, может быть снижение экспрессии SR-B1. Однако SR-B1 также локализуется на мембране гепатоцитов в качестве рецептора липопротеинов высокой плотности4647, поглощая холестерин из сыворотки. Кроме того, мыши OPN — / -, полученные с помощью LD, показали повышенный уровень холестерина в печени и снижение экспрессии фермента синтеза HmGCR. Для дальнейшего объяснения этого явления мы обнаружили, что экспрессия IDOL и PCSK9, которые являются генами SREBP-мишеней, способствующими деградации LDLR4849, были значительно уменьшены у мышей с OPN-β-LD, которые сопровождались увеличением уровня белка LDLR в LD -один OPN — / — мышей (дополнительный рис. S6). Эти результаты могут частично объяснять повышенный уровень холестерина в печени у мышей OPN — / -, которым назначают LD.

Неожиданно мы наблюдали повышенное содержание печеночной ТГ у мышей с OPN — / — мышей, получавших LD. Мы измерили экспрессию генов, участвующих в метаболизме ТГ в печени, и обнаружили, что уровни мРНК и белка аполипопротеина В (ApoB) были уменьшены у мышей с OPN — / — с помощью LD (дополнительные фиг. S7 и S8). ApoB используется для конститутивного образования VLDL, который несет как TG, так и холестерин в гепатоцитах50. Предыдущее исследование показало, что уменьшение ApoB снизило сборку и секрецию VLDL в кровообращение, что привело к увеличению содержания ТГ в печени51. Таким образом, повышенное содержание печеночной ТГ в мышах OPN — / — мышей, получавших LD, может быть частично вызвано уменьшением экспрессии печеночного ApoB.

В заключение мы описали ранее неизвестную функцию OPN, регулирующую билиарный гомеостаз, что влияет на образование желчных камней как у мышей, так и у людей. Наши результаты показывают, что новые терапевтические стратегии, предназначенные для модуляции активности OPN, могут быть полезны для предотвращения образования желчных камней холестерина.

Образцы тканей печени человека были собраны из 21 GS, запланированных для лапароскопической холецистэктомии, и 14 GSF, перенесших другие операции на брюшной полости. Все образцы желчного пузыря были классифицированы как желчные камни холестерина, потому что все камни содержали более 65% холестерина. Никакой желчный камень не был обнаружен ни в одном из контролей GSF через ультрасонографию. Ни один из пациентов не показал никаких клинических или лабораторных данных о сахарном диабете, гиперлипопротеинемии, ожирении, злоупотреблении алкоголем, карциноме печени или других состояниях, которые могут повлиять на функцию печени. Кроме того, ни один из них не принимал какие-либо лекарства, которые, как известно, влияли на метаболизм липидов. Информированное согласие было получено от всех участников до регистрации в исследовании, включая разрешение на сбор биопсии печени. Протокол исследования был одобрен комитетами по этике больницы Хуашань, Университет Фудань. Процедуры проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

Мыши C57BL / 6J WT были приобретены в Университете Фудана (Шанхай, Китай). Мыши OPN — / — на конъюнктивном фоне были приобретены в Лаборатории Джексона (Бар-Харбор, штат Мэн, США). Мышей WT и OPN — / — вводили CD или LD (CD с добавлением 15% жира, 2% холестерина и 0,5% холевой кислоты) в течение 8 недель. Все эксперименты проводились на мышах в возрасте от 8 до 10 недель (пол мышей показан в таблице 1). Все животные получали гуманную помощь, и их использование было одобрено Комитетом по этике животных Университета Фудань. Все процедуры были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами. Желчь собирали, и сразу производили кристаллический анализ. Кровь собирали через прокол сердца правого желудочка. Желчный пузырь и печень собирали, а затем замораживали в жидком азоте для выделения белка и РНК или фиксировали в 4% параформальдегиде в течение ночи для гистологического анализа.

Пептидный липид экстрагировали в хлороформ / метанол (2: 1) 52. Желчная кислота выделялась из печени, как описано ранее53. Уровни холестерина, желчной кислоты и ТГ измеряли с помощью наборов для анализа от Kehua Bio-engineering (Shanghai, China), а содержание фосфолипидов измеряли с использованием набора для анализа от Wako (Осака, Япония) в соответствии с инструкциями производителей. Все биохимические показатели анализировали трижды три раза. Желчные камни были определены как макроскопически видимые камни, тогда как кристаллы были определены с помощью поляризационной световой микроскопии (Olympus, Tokyo, Japan). CSI был рассчитан в соответствии с критическими таблицами Кэри54. Эти методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Фудань.

Общая РНК была получена из ткани с помощью набора RNAprep Pure Tissue (TianGen, Beijing, China) в соответствии с инструкциями производителя. Случайные праймеры (Takara, Shiga, Japan) использовали для обратной транскрипции полной РНК в комплементарную ДНК. Количественная ПЦР в реальном времени была выполнена с использованием химии SYBR Green I (TianGen, Beijing, China) и быстрой плазменной системы ABI 7900HT с быстрым постоянным временем (Applied Biosystem, Shanghai, China). Ген-специфические последовательности праймеров показаны в дополнительных таблицах S3 и S4. Уровни экспрессии мРНК вычисляли по отношению к гену глицеральдегидфосфатдегидрогеназы домохозяйства (GAPDH) и далее нормализовались к уровням экспрессии соответствующих контролей в соответствии с методом относительных выражений55. Эти методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Фудань.

Замороженную ткань печени лизировали в ледяной RIPA. буфер, дополненный ингибиторами протеазы. Концентрацию белка в экстрактах измеряли с использованием набора для анализа протеина BCA (Thermo, Shanghai, China). Белок анализировали 8-12% -ным электрофорезом на полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и переносили на поливинилиденфторид-мембраны. Антитела против CYP7A1 (Abcam, Shanghai, China) использовались при разведении 1: 1000, антитела против SR-B1 (Abcam, Shanghai, China) использовались при разведении 1: 2000. В качестве вторичного антитела использовали разведение 1: 3000 антитела против кроличьего иммуноглобулина G-HRP (Santa Cruz, Shanghai, China). После зондирования индивидуальных антител комплекс антиген-антитело визуализировали с использованием улучшенных сверхсветовых реагентов хемилюминесценции (TianGen, Beijing, China). Относительный средний уровень белка определяли путем денситометрии. Эти методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Фудань.

Финальные биопсии человека были встроены в парафин и разрезаны на 3 мм секции. Образцы слайдов инкубировали с анти-OPN-антителами (Abcam, Shanghai, China) при разведении 1:75 с последующей 30-минутной инкубацией с меченым HRP вторичным антителом (Santa Cruz, Shanghai, China). Разделы были просмотрены с помощью микроскопа Nikon ECLIPSE E600 (Nikon, Tokyo, Japan) с использованием объективов 10 ×, а изображения были получены с помощью цифровой цветной камеры SPOT INSIGHT ™, модель 3.2.0 (Sterling Heights, Мичиган, США). Количественная оценка иммунореактивности проводилась на цифровых изображениях, сохраненных в виде файлов TIFF, и анализировалась с использованием Image-Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, Maryland, USA). Слепой иммуногистохимический анализ проводил патологоанатом Фуданьского университета. Эти методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по этике животных Университета Фудань.

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD), если не указано иное. Статистическую значимость различий между средствами экспериментальных групп оценивали с помощью непарного теста Стьюдента и корреляцию проводили с помощью теста Пирсона с использованием Prism 6.00 (GraphPad, La Jolla, CA, USA). Чтобы соответствовать критериям гомоседастичности между переменными, экспрессия мРНК печеночной OPN до анализа анализировалась логарифмом. Разница считалась статистически значимой при p <0,05.

Как процитировать эту статью: Lin, J. et al. Дефицит остеопонтина изменяет гомеостаз желчных протоков и защищает от образования желчных камней. Sci. По донесению
6, 30215; doi: 10.1038 / srep30215 (2016).

Мы благодарим профессора Цзянь-хая Цзяна и Чань-цзюнь Лю за техническую помощь и д-р Йи-фэй Ван и др. для обеспечения образцов человеческой ткани. Это исследование было поддержано Национальным научным фондом Китая (№ 81270536).

Авторские материалы J.L. написал основную рукопись и выполнил большую часть экспериментов. W.-q.S. провели механистические исследования. Z.-y.C., W.-w.Z. и Л. Л. помогали с некоторыми экспериментами. D.C. и L.-x.Q. помогли написать рукопись. J.-h.C. и M.L. и H.-l. Дж. Разработал проект, переработал рукопись и возглавил команду. Все авторы рассмотрели рукопись.

(a) Количественный анализ ПЦР в реальном времени уровней мРНК печеночной OPN в тканях печени GS и GSF. Экспрессия мРНК печеночной OPN перед анализом логарифмически трансформировалась. Экспрессия мРНК печеночной OPN была выше у GS, чем в GSF. (b) ОПН иммуногистохимическая средняя оптическая плотность (MOD) значительно различалась между GS и женским GSF. Данные выражаются как среднее ± SD (GS: n = 21, GSF: n = 14). (c) Показаны печеночные образцы из GS, которые были иммуногистохимически окрашены для OPN (увеличение, × 100). (d) Показаны печеночные образцы из GSF, которые были иммуногистохимически окрашены для OPN (увеличение, × 100). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01.

Желчь собирали у мышей WT и OPN — / -. (a) Общий вид репрезентативной желчи от WT и OPN — / — мышей, получавших LD. (б) Поляризационное световое микроскопическое исследование кристаллов желчного холестерина (обозначено черными стрелками) у мышей WT и OPN — / -, которым вводили LD (увеличение, × 10). (c-f) Содержание желчного холестерина (c), уровни фосфолипидов (d), содержание желчных кислот (e) и CSI (f) были измерены у мышей OPN — / — и мышей WT, которым вводили CD или LD. Данные выражаются как среднее ± SD (CD: n = 9, LD: n = 10). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01. WT, дикий тип; OPN - / -, OPN дефицит; CD, диета для чау, LD, литогенная диета; CSI, индекс насыщенности холестерина.

Количественный анализ ПЦР в реальном времени уровней мРНК для генов, участвующих в метаболизме холестерина и метаболизме желчных кислот в тканях печени у мышей WT и мышей OPN — / -, кормящих диету чау. Данные выражаются как среднее ± SD (n = 8 на группу). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01. WT, дикий тип; OPN - / -, ОПН-дефицит.

Количественный анализ ПЦР в реальном времени уровней мРНК для генов, участвующих в метаболизме холестерина и метаболизме желчных кислот в тканях печени у мышей WT и мышей OPN — / -, которые питали литогенную диету. Данные выражаются как среднее ± SD (n = 8 на группу). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01. WT, дикий тип; OPN - / -, ОПН-дефицит.

(a, c) Белки печени были выделены из мышей WT и OPN — / — и проанализированы с помощью Вестерн-блоттинга для экспрессии белка SR-B1 и CYP7A1. Пол мышей был помечен над полосами. β-актин был выбран в качестве контроля для загрузки геля. (b, d) Количественная оценка вестерн-блотов. Относительный средний уровень белка определяли путем денситометрии. Данные выражаются как среднее ± SD (n = 6 на группу, 3 самки и 3 самца мыши). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01. WT, дикий тип; OPN - / -, OPN дефицит; M, мужчина; F, женщина.

Относительные уровни мРНК анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Экспрессия генов генов была подвергнута трансформации до анализа. Корреляция между уровнями мРНК печеночной SHP и OPN (n = 21) (а) уровнями мРНК пептида ATP8B1 и OPN (n = 21) (b) уровнями мРНК печени SR-B1 и OPN (n = 21) (c) и печеночной SREBP -2 и OPN мРНК (n = 21) (d). Корреляции проводились с использованием теста Пирсона.

Данные выражаются в процентах.

WT, дикий тип; OPN — / -, ОПН-дефицит.

Данные выражаются как среднее ± SD (n = 8 на группу). Статистический анализ проводился с использованием теста непарного Стьюдента, * P <0,05, ** P <0,01.

WT, дикий тип; OPN — / -, OPN дефицит; ТГ, триглицерид.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *