Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Химическая характеристика желчных камней: подход к исследованию этиопатогенеза желчных камней в Шри-Ланке

Chemical Characterization of Gallstones: An Approach to Explore the Aetiopathogenesis of Gallstone Disease in Sri Lanka
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4390354/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: HW AN S. Ranasinghe KBG S. Rosairo. Провели эксперименты: HW AN. Проанализированы данные: HW AN S. Ranasinghe RS. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: С. Ранасинге А.Н. КБГ С. Росаиро. Написал статью: HW AN S. Ranasinghe.

Записи о желчных камнях и связанных с ними заболеваниях в сообществе Шри-Ланки мало, несмотря на частое выявление желчнокаменной болезни. Идентификация химического состава желчных камней в местной обстановке важна для определения этиопатогенных факторов, которые в свою очередь полезны при реализации терапевтических и профилактических стратегий. Это исследование предназначалось для описания химического состава желчных камней и социально-демографических факторов когорты шри-ланкийских пациентов с желчнокаменной болезнью.

Данные о клинических и социально-демографических факторах, а также о желчных камнях, удаленных при хирургическом вмешательстве, были собраны у пациентов с желчнокаменной болезнью, поступивших в Преподавательскую больницу, Перадения, Шри-Ланка с мая 2011 года по декабрь 2012 года. Внешние и поперечные морфологические особенности желчных камней регистрировались невооруженным глазом , Композиционный анализ проводили с помощью инфракрасной спектроскопии Фурье-преобразования, рентгеновской порошковой дифракции и спектроскопии атомной абсорбции. Сканирующая электронная микроскопия была использована для идентификации микроструктуры желчных камней.

Проанализированы данные 102 пациентов. Из них большинство (n = 77, 76%) были женщинами с соотношением женщин и мужчин 3: 1. Средний возраст исследуемой группы составил 46,1 ± 11,6 года. У всех пациентов были первичные камни желчного пузыря. Согласно физико-химическому анализу, большинство (n = 54, 53%) были желчными камнями пигмента, за которыми следуют желчные камни смешанного холестерина (n = 38, 37%). Только у 10 (9%) были желчные камни с высоким содержанием холестерина. Билирубинат кальция, карбонат кальция и фосфат кальция были наиболее распространенными солями кальция, идентифицированными в желчных камнях пигмента и ядром желчных камней смешанного холестерина.

Присутствие пигментного очага в желчных камнях является общей чертой у большинства пациентов в Шри-Ланке, что указывает на возможную роль повышенного неконъюгированного билирубина в желчи при патогенезе GS. Поэтому крайне важно изучить это далее, чтобы понять атиопатогенез GS среди Шри-Ланки.

Все соответствующие данные приведены в документе.

Желчные камни (GS) образуются в желчном пузыре (ГБ) и желчном протоке от составляющих желчи [1]. Холестерин и билирубинат кальция являются основными химическими соединениями, присутствующими в GS, и их осаждение в желчи индуцируется множественными этиологическими факторами. Поэтому химический состав GS будет указывать на факторы, участвующие в процессе развития этих GS. В ГС холестерин осаждается главным образом из-за пересыщения холестерина в желчи [2], в то время как осаждение кальция билирубинатом происходит из-за дефектного конъюгирования билирубина [1, 3]. Помимо этого, карбонат кальция, фосфат кальция и жирные кислоты кальция (такие как пальмитат и стеарат) встречаются в GS как незначительные соединения [4]. Широкий диапазон элементов, включая тяжелые металлы, также обнаруживается в различных концентрациях в разных типах GS [5-8], и эти микроэлементы, как предполагается, также участвуют в разработке пигментных GS [5].

В зависимости от их основного состава GS обычно подразделяются на две основные категории: холестерин и пигмент GS [1]. Холестерин является основным химическим соединением, идентифицированным в холестерине GS, тогда как билирубинат кальция присутствует в качестве основного химического соединения в пигменте GS [1]. В японской системе классификации эти два основных типа далее подразделяются на морфологию поперечного сечения [4]. В этой классификации холестериновые камни подразделяются как чистые, смешанные и комбинированные камни. Пигментные камни далее классифицируются как черные и кальциевые билирубиновые (коричневые) камни [4].

Распространенность и химический состав GS варьируются от популяции к популяции [9]. Это указывает на участие нескольких этиологических факторов в патогенезе GS [9]. Поэтому исследование химического состава GS в первую очередь важно для признания этиологических факторов для заболевания GS в данном сообществе. Болезнь GS не была должным образом исследована у населения Шри-Ланки, несмотря на ее высокую распространенность по данным больничных записей. Помимо идентификации колоний бактерий в желчи пациентов с Шри-Ланкой с заболеванием GS [10], исследования по определению механизма образования GS еще не проводились. Кроме того, из Индии, ближайшего соседа Шри-Ланки, сообщается о высокой распространенности (10-12%) болезни ГС и ее осложнениях (например, карциноме GS) [11]. Исходя из этих фактов, обширное описание болезни GS среди Шри-Ланки можно считать императивной. Кроме того, определение химического состава GS среди шри-ланкийцев было бы важным воротом для изучения этиопатогенеза болезни GS.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) является наиболее широко используемым методом [12-15] при анализе химического состава GS, поскольку она является точной, менее трудоемкой и экономически эффективной. Таким образом, это основной метод, используемый при крупномасштабном анализе образцов ГС [13]. Кроме того, доступен химический анализ GS с помощью рентгеновской порошковой дифракции (XRD) [16-17] и колориметрических анализов [18]. XRD используется для описания кристаллического состава GS, а микроструктура GS идентифицируется с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) [12, 19] и в настоящее время считается лучшим методом описания микроструктуры GS. Элементарный состав этих GS обычно анализируется с использованием атомно-абсорбционной спектрофотометрии (AAS) и индуцированной частицами рентгеновской эмиссией [7, 8]. В настоящее время стандартная классификация GS также была модифицирована с помощью данных химического состава GS с использованием этих передовых аналитических методов [12].

Целью этого исследования было описать химический состав GS в когорте пациентов с болезнью GS, принятой в Преподавательскую больницу, Перадения, Шри-Ланку и их социально-демографические факторы, чтобы понять этиопатогенез состояния.

Исследование проводилось в Преподавательской больнице, Перадения, Шри-Ланка в период с мая 2011 года по декабрь 2012 года. Этическое разрешение для исследования было получено в Комитете по этике, медицинском факультете Университета Перадения, Шри-Ланка. Получив информированное письменное согласие, социально-демографические данные были зарегистрированы у взрослых пациентов, проживающих в районе Канди более 5 лет, которые были допущены к операциям по удалению GS из-за симптоматических GS.

GS, удаленные в хирургии, собирали и сразу промывали проточной водой и сушили на воздухе. Образцы затем промывали дистиллированной водой и деионизированной водой перед сушкой в ​​электрической печи при 60 ° С для достижения постоянного веса. Все ОЗ, полученные от одного пациента, считались одним образцом. Внешние морфологические особенности камней регистрировались невооруженным глазом, и наибольший камень из каждого образца был разрезан на две половины для записи поперечного сечения. Первоначально GS были классифицированы в зависимости от вида поперечного сечения, согласно японской классификации [4]. Для анализа FTIR, XRD и AAS использовались образцы порошковых GS.

В FTIR-анализе 5 мг порошка GS смешивали с 100 мг бромида калия (KBr) для получения гранул диаметром 13 мм. Для анализа FTIR был использован один образец из GS с гомогенной морфологией и множественными образцами, представляющими различные слои GS с гетерогенной морфологией. Измерения проводились с использованием прибора Shimadzu IR Prestige 21 в средней частоте (4000-400 см-1) с разрешением 4 см-1. Спектры FTIR холестерина, билирубина, карбоната кальция, фосфата кальция и пальмитиновой кислоты были взяты из стандартных соединений (90% чистоты), приобретенных у Sigma Aldrich, Германия.

Был идентифицирован химический состав GS в каждом типе GS, сравнивающий образцы FTIR образцов с образцами стандартов. Пять образцов из каждой группы были выбраны случайным образом для проведения исследований XRD для подтверждения результатов FTIR.

Для рентгеновского анализа использовался рентгеновский дифрактометр Siemens (модель D50000) с рентгеновским лучом Cu-K (длина волны излучения -1,54056 Ǻ). Согласно уравнению Брэгга; n λ = 2d sin θ (n-целое число, λ-длина волны излучения, d-межплоскостное расстояние, угол θ-дифракции), значения d-интервала рассчитывались по двум значениям тета-степени, полученным XRD. Были взяты дифракционные рисунки стандартных химических соединений и проведена идентификация кристаллических соединений, присутствующих в каждом образце GS, сравнивая значения d-интервала, полученные для образцов GS, и идентификацию стандартных соединений.

Три GS с различными поперечными морфологиями подвергались SEM-анализу. Каждый камень нарезался на кусочки шириной около 3-5 мм, чтобы включить морфологически разные слои. Используя электропроводящий адгезив, каждый образец фиксировали на образце, где одна сторона была прикреплена к поверхности, а другая была обращена в противоположном направлении, а поверхность, подлежащая анализу, была отполирована. После сушки при 60 ° С в течение ночи образцы были покрыты золотом и наблюдались с использованием SEM (Hitachi SU 6600), и были сделаны фотографии для идентификации микроструктур различных типов GS. Элементарный состав этих GS был взят методом рентгеновской спектроскопии с энергией (EDS).

Образцы GS, вес которых превышает 500 мг, были использованы для анализа тяжелых металлов, в которых образцы порошка 500 мг расщепляли с использованием метода сухого озинга (пигмент GS n = 20, холестерин GS n = 14). Образцы выливали в трубчатую печь (Carbolite CTF12 / 100/900) при 200 ° C в течение 1 часа, 450 ° C в течение 2 часов и 500 ° C в течение 5 часов. Затем образцы аседа растворяли в 1 см-3 1 литьевой кислоты-3 азотной кислоты. Каждый образец фильтровали в мерные колбы размером 25 см-3 и составляли до 25 см-3 с деионизированной водой. Стандартные образцы для Pb2 + и Cd2 + были получены с использованием стандартных решений, приобретенных у Fluka Chemica, Швейцария.

В общей сложности 102 пациента, которые выполнили критерии включения, подверглись хирургическим вмешательствам холецистэктомии в течение периода исследования. Из них 77 (76%) были женщинами и 25 (24%) были мужчинами, в результате соотношение между женщинами и мужчинами составляло 3: 1. Возраст исследуемой группы составлял от 27 до 82 лет со средним значением 46,1 ± 11,6 года. Средние возрастные показания с симптоматическим GS показали значительную разницу (p = 0,004) между женщинами и мужчинами с 44,1 ± 10,8 и 52,2 ± 12,0 года соответственно.

Из 102 пациентов 82 (80%) имели ОГ в ГБ, а 20 (20%) имели ОО как в ГБ, так и в желчных протоках. Ни у кого не было первичных желчных протоков.

Диаграммы поперечного сечения, идентифицированные в GS, показаны на рисунке 1. Из общего количества 10 (9%) GS показали радиально распределенный гомогенный материал (фиг. 1A) и были классифицированы как чистый холестерин GS в соответствии с критериями японской системы классификации [ 4]. GS, которые имели crescentric слои темного (черного или коричневого) и светлого (бледно-белого) цветного материала от центра к периферии (рис. 1B), были названы смешанным холестерином GS (n = 38, 37%) [4]. Ядро всех GS, классифицированных как смешанный холестерин, было темного цвета. Все оставшиеся GS (n = 54, 54%), которые имели однородно распределенный черный материал (рис. 1C) в своих сечениях, были классифицированы как пигмент GS [4].

A-чистый камень холестерина, показывающий радиально расположенные кристаллы холестерина от центра к периферии. B-Смешанный холестериновый камень, демонстрирующий уровни холестерина и пигмента, расположенные в поперечном направлении по красцентному рисунку. C-Пигментный камень с однородным распределенным пигментным материалом.

Химический состав различных типов GS, выявленный FTIR, показан в таблице 1, и образцы спектров FTIR, полученные для разных типов GS, приведены на фиг. 2. Согласно анализу, большинство GS (n = 69, 68%), были составлены из множества химических соединений, тогда как только 33 (32%) GS были составлены только из одного соединения. Билирубинат кальция, карбонат кальция и фосфат кальция являются часто идентифицированными солями кальция в образцах GS, тогда как пальмитат кальция обнаруживается только у 6 (6%) пигмента GS (фиг. 2E). Далее, химический анализ ядра смешанного холестерина GS (рис. 2B), который имел гетерогенную морфологию в поперечном сечении, выявил присутствие билирубината кальция, карбоната кальция и фосфата кальция.

A-чистый камень холестерина и бледные области смешанного холестерина, состоящего из холестерина (1465, 1381 и 1056 см-1). B-Пигментированные области смешанного холестерина, состоящие из билирубината кальция (1658, 1631, 1573 и 1249 см-1), карбоната кальция (1462, 871 и 698 см-1) и фосфата кальция (1026, 606 и 505 см-1) , C-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция (1658, 1627, 1566 и 1249 см-1). D-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция (1658, 1627, 1566 и 1249 см-1), карбоната кальция (1450, 694 1658, 1627, 1566 и 1249 см-1) и фосфата кальция (1080, 1033, 609 и 547 см -1). E-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция (1666, 1620, 1573 и 1249 см-1) и пальмитата кальция (2916, 2846, 1543, 1103 и 756 см-1).

Дифракционные картины, полученные для разных типов GS, приведены на рис. 3. Анализ XRD чистого холестерина GS дал значения d-интервала (рис. 3A), совместимые с значениями d-значений, полученных для стандарта холестерина. Эти камни показали интенсивный пик при 5,90, 5,47, 4,89, 3,80 и 6,30 Å, что подтверждает наличие холестерина. d-интервалы, полученные в XRD для смешанного холестерина GS (фиг. 3B), дополнительно подтверждают наличие холестерина (17,30, 3,80, 5,84, 6,30 и 6,94), карбоната кальция (3,84, 3,03, 1,87, 2,49 и 1,93 Å) и фосфат кальция (3,40, 3,37, 4,17, 1,94 и 2,70 Å) в кристаллической форме. В XRD-анализе пигмента GS была получена дифракционная картина, указывающая на присутствие билирубината кальция, карбоната (3,03, 2,49, 2,28, 1,87 и 1,91 Å), фосфата (2,78, 2,70, 3,40, 1,94 и 3,37 Å) (рис. 3D) или пальмитата (4,10, 3,67, 3,49, 3,01 и 2,48) (фиг. 3Е).

A-Чистый холестериновый камень. B-Смешанный холестериновый камень. C-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция. D-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция, карбоната кальция и фосфата кальция. E-Пигментный камень, состоящий из билирубината кальция и пальмитата кальция.

SEM-изображения и распределение кальция, полученные для трех типов камней, показаны на фиг. 4, а элементная композиция, полученная с помощью EDS, суммирована в таблице 2. В чистом холестерине GS кристаллы холестерина появились в виде плотно упакованных пластинчатых или пластинчатых структур (фиг. 4A и 4B). Обнаружение углерода в качестве основного элемента (> 99% веса) с помощью ЭДС с последующим кислородом предполагает наличие кристаллов холестерина. Обнаружение кальция в очень незначительных процентах по весу и отсутствие азота и фосфора подтверждает, что этот камень является чистым холестерином GS. Подобно чистому холестерину GS, в смешанном холестерине GS (рис. 4C) были обнаружены пластинчатые и пластинчатые структуры, указывающие на холестерин. Неравномерные мелкие частицы, наблюдаемые в дополнение к кристаллам холестерина (фиг. 4C), идентифицировали как билирубинат кальция в соответствии с результатами ЭДС (фиг. 4D). Неравномерные мелкие частицы (рис. 4Е), замеченные в пигментном камне, были идентифицированы как частицы билирубината кальция по EDS (рис. 4F). Структуры, подобные строкам (рис. 4G), были подтверждены как белковые полосы из-за обнаружения азота по EDS (рис. 4H). Более того, процентные доли ЭДС для кальция (рис. 4J) и фосфора подтвердили, что луковичные структуры, показанные на фиг. 4I, представляют собой кристаллы фосфата кальция.

A, B-Pure холестерин, демонстрирующий пластину и кристаллы холестерина в форме ламеллы. C-смешанный холестериновый камень, показывающий преимущественно распределенные частицы холестерина в форме ламелей с частицами рассеянного кальциевого билирубината. Распределение D-кальция смешанного холестерина GS. E- Пигментный камень, показывающий нерегулярно расположенные билирубитаты кальция. Распределение F-кальция пигмента GS области, состоящей из билирубината кальция в пигменте GS. G-Пигментный камень, показывающий нерегулярно расположенные частицы билирубината кальция и белковые полосы. Распределение H-кальция пигментного камня области, состоящей из билирубината кальция и белка. I-Пигментный камень, показывающий луковичные кристаллы фосфата кальция. Распределение J-кальция пигментного камня области, состоящей из кристаллов фосфата кальция.

* — Процентный (%) элементный анализ (по весу)

Между двумя тестируемыми токсичными тяжелыми металлами Pb2 + был обнаружен во всех тестируемых образцах GS, в то время как Cd2 + был обнаружен только у 14 (70%) пигмента и 3 (21%) образцов холестерина GS. Средние концентрации Pb2 + и Cd2 + в двух типах GS показаны в таблице 3. Несмотря на то, что концентрация Pb2 + была значительно выше в пигменте GS, чем холестерин GS (p = 0,039), значительная разница не была обнаружена в концентрации Cd2 + в двух типах GS (p = 0,143).

* -Два образца t теста

Патогенез ГС является многофакторным, и обнаружение химического состава ГС в первую очередь важно для определения их механизма образования. Насколько нам известно, это первая попытка идентифицировать этиопатогенез GS среди Шри-Ланки. Из трех типов GS пигментные и смешанные холестериновые камни были наиболее распространенными типами, идентифицированными в этой когорте Шри-Ланки. Кроме того, большинство ГЦ, проанализированных в этой исследовательской когорте, состояло из нескольких химических соединений, а именно холестерина, билирубината кальция, карбоната кальция и фосфата кальция. Это подчеркивает важность изучения этиологии для осаждения кальциевой соли в желчи у этих пациентов. Наличие билирубината кальция в аморфной форме указывает на высокую вероятность осаждения билирубината в виде полимеров.

В настоящем исследовании FTIR использовался в качестве основного инструмента для анализа химического состава GS, поскольку он является аналитическим методом с более высокой точностью [13]. Одним из основных преимуществ FTIR в анализе GS является способность использовать только небольшое количество образцов для тестирования [13]. Идентификация химических соединений проводилась путем сопоставления волновых чисел, полученных для образцов со стандартами. Было обеспечено наилучшее совпадение для минимизации ошибок в интерпретации. Кроме того, полученные волновые числа были перекрестно проверены с использованием существующих литературных данных для повышения точности. Пики абсорбции при 1465, 1381 и 1056 см-1 были взяты в качестве отпечатков пальцев для холестерина [12,14,15], тогда как пики поглощения 1658, 1627, 1566 и 1249 см-1 использовали для обнаружения билирубината кальция [12,14,15 , 20]. Для идентификации фосфата кальция использовались два сильных широких пика при 1080 и 1033 см-1 и два небольших пика при 609 см-1 и 547 см-1 [12, 21]. Для определения карбоната кальция [12, 14, 15] и 2916, 2846, 1543, 1103 и 756 см-1 в качестве характерных волновых чисел для пальмитата кальция использовали пики абсорбции при 1462/1450, 871 и 698/694 см-1 [12, 22].

В настоящем исследовании XRD также использовался для определения химического состава GS, поскольку он является точным методом идентификации кристаллических соединений. Результаты XRD подтвердили наличие всех других химических соединений, идентифицированных FTIR, отличных от билирубината кальция. Билирубинат кальция не был обнаружен XRD в предыдущих исследованиях [23] и рассматривался как аморфный материал. Этот факт был совместим с результатами текущего исследования. Неисправность обнаружения билирубината кальция может быть признана основной причиной редкоиспользования XRD для характеристики химического состава GS. Будучи первой попыткой проанализировать состав GS в Шри-Ланке, результаты XRD являются подтверждающими доказательствами для анализа FTIR в настоящем исследовании. Кроме того, результаты SEM и EDS дали убедительные доказательства появления нескольких составляющих в наиболее распространенных двух типах GS, идентифицированных в этой группе исследований.

Данные текущего исследования показывают, что атеопатогенез GS в нашей популяции, вероятно, будет отличаться от такового у западного населения, где наиболее преобладает холестерин GS [24]. Тем не менее, общие этиологические факторы для развития ОО можно ожидать для региона Южной Азии с учетом данных из других стран Южной Азии, где большинство GS были смешанными или пигментированными GS [18, 25]. Поэтому изучение причин наличия повышенного неконъюгированного билирубина в желчи у большинства южноазиатских пациентов с ГС является необходимостью. Кроме того, ядро ​​всего смешанного холестерина GS в нашем исследовании было темного цвета и состояло в основном из солей кальция. Хроническая гемолитическая анемия, цирроз, кишечные заболевания и бактериальные инфекции являются обычно выявленными причинами осаждения билирубината кальция в желчи [1]. Однако в дополнение к общеизвестным этиологическим факторам также было выявлено возможное участие некоторых других факторов в патогенезе пигмента GS [3, 5, 26]. Недавно мы описали эффект известных этиологических факторов на патогенез смешанного холестерина и черного пигмента GS с использованием той же исследовательской когорты [27]. Исследование показало, что ожирение является прогнозирующим фактором для развития смешанного холестерина GS над черным пигментом GS. Однако он не смог обнаружить какого-либо значительного влияния известных факторов экологического риска для развития черного пигмента GS. Поэтому он подчеркивает необходимость дальнейших исследований для выяснения причин осаждения билирубината кальция у пациентов в Шри-Ланке, имеющих пигмент GS. В этом исследовании мы определили значительно большую концентрацию Pb2 + в пигменте GS. Однако статистическая значимость не была определена для концентрации Cd2 +. Это может быть связано с различиями в основных экскреторных путях этих двух тяжелых металлов, где Cd2 + в основном выводится из мочи, а Pb2 + выводится из желчи [28]. В настоящее время также оценивается роль следовых металлов при образовании ГС [5]. Таким образом, результаты открывают важную область для изучения в отношении атиопатогенеза пигмента GS. Токсичные тяжелые металлы при низких концентрациях вызывают воспалительные реакции, опосредуемые цитокинами [29] и индуцированное токсическим тяжелым металлом эпителиальное воспаление [29], также могут быть связаны с воспалением ГБ. Хотя это в основном идентифицировано в легких у курильщиков [29], подобные эффекты можно ожидать в желчных путях, что является одним из основных путей токсического выделения тяжелых металлов [28]. Кроме того, токсичные тяжелые металлы оказывают прямое влияние на систему сигнализации кальция [29]. Ядовитые тяжелые металлы могут проникать через клеточные мембраны через кальциевые каналы L-типа, а внутриклеточные токсичные тяжелые металлы, в свою очередь, вызывают изменения в гомеостазе кальция, который идентифицируется как причина гибели клеток [29]. Из-за конкурентного ингибирования поглощения кальция кальциевыми каналами токсичными тяжелыми металлами концентрация кальция в желчи может быть увеличена в пользу образования билирубината кальция [29]. Однако необходимы дальнейшие исследования для определения влияния тяжелых металлов на эпителий GB и их влияния на образование пигмента GS. Кроме того, широкомасштабные исследования по выявлению этиологических факторов для заболевания ГС в Шри-Ланке должны проводиться на основе химического состава GS, как показано в настоящем исследовании.

Болезнь GS в районе Канди, Шри-Ланка, распространена среди женщин среднего возраста, и в образовании GS участвует несколько химических соединений. Присутствие различных солей кальция (билирубината кальция, карбоната кальция и фосфата кальция) является общей чертой. Большинство GS были либо пигментным, либо смешанным холестерином с пигментным очагом, что указывало на возможную роль повышенного неконъюгированного билирубина в желчи при патогенезе GS. Поэтому крайне важно изучить это дальше, и это было бы особенно полезно для понимания этиопатогенеза GS среди Шри-Ланки.

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Нилвалу Коттегоду, консультанта, Института нанотехнологий Шри-Ланки, Гомагамы, Шри-Ланки за помощь в сканирующей электронной микроскопии и г-на М.В.К. Перера, технический сотрудник отдела химии, факультет естественных наук Университета Перадения, Шри-Ланка за помощь в рентгеновском дифракционном анализе.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *