Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Изоэкстракционные исследования раздела UCB между хлороформом и водным раствором

Isoextraction Studies of Partition of UCB Between Chloroform and Aqueous Solution
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4534934/

Билирубин является основным компонентом желчных камней, и показано, что растворимость неконъюгированного билирубина (UCB) играет важную роль в образовании желчных камней. Однако механизм образования желчи и солюбилизации UCB пока неизвестен.

Несколько исследователей попытались определить химическую природу билирубина, которые, как полагают, тесно связаны с его растворимостью. Однако существуют некоторые разногласия по константам ионизации и значениям рК карбоксильных групп UCB.

В настоящем исследовании изучалось влияние рН, типа и концентрации желчной соли на растворимость UCB и вычисляли значения pK билирубина.

Первые ионизационные константы карбоксильной группы UCB (pk1) составляли 7,2 в физиологическом растворе, 6,7 в TC (таурохолевая кислота) и 6,6 в TDHC (тауродегидрохолевая кислота).

PK2 составлял 9,2 в 50 м М TC. Таким образом, моноанион UCB (BH-) составлял более 90% ионизированного UCB при физиологических значениях рН.

Наши результаты показывают, что:
С помощью изоэкстракционного метода UCB из хлороформа избегаются эффекты поверхности кристалла, и равновесие раздела также может быть быстро достигнуто.

Существует больше растворимости с более высокими концентрациями соли желчи и с увеличением рН, а соль желчи играет важную роль в солюбилизации UCB в желчи.

Мономеры соли, димеры и мицеллы одинаково эффективны при солюбилизации билирубина.

Билирубин в желчи почти полностью находится в форме моноаниона (BH-) при физиологических значениях рН.

Авторы исследовали разделение UCB (неконъюгированного билирубина) между хлороформом (CHCl3) и водным раствором путем изоэкстракции. Цель этого исследования — определить взаимодействие UCB с желчной солью и определить значения pK для UCB в растворе желчных солей. Несколько исследователей попытались определить константы диссоциации билирубина, которые тесно связаны с его растворимостью. Но были некоторые проблемы; а) билирубин обладает свойством легко разлагаться под кислородом и является чрезвычайно фоточувствительным (конфигурационная изомеризация, окисление); б) определить правильное значение трудно из-за чрезвычайно малого продукта растворимости билирубина1-14).

Билирубин является основным компонентом желчного камня5-9), и показано, что водная растворимость UCB играет важную роль в формировании желчного камня10-11). Однако механизм образования желчи и солюбилизации UCB пока неясен. UCB чрезвычайно нерастворим в воде вблизи физиологических значений рН12-13), и эта слабая водная растворимость UCB, как полагают, отражает молекулярную конформацию, в которой все гидрофильные области молекулы были вовлечены во внутримолекулярную водородную связь14-15).

В UCB с полностью протонированной формой (BH2) каждая из 2-х карбоксильных групп образует внутримолекулярные гидениновые связи, которые стабилизируют молекулу билирубина в жесткой конформации, подавляют ионизацию карбоксильных групп и монополизируют все полярные группы в молекуле билирубина15- 16). В результате кристаллический UCB плохо растворяется в буферных водных растворах при физиологических значениях рН и имеет кажущееся значение pK в слабощелочном диапазоне2).

Теоретически билирубин может существовать как полностью протонированная двухосновная кислота (BH2), как моноанион (BH-) или как дианион (B =). Если билирубин уравновешен буфером, он образует насыщенный раствор, содержащий очень низкую концентрацию кислоты и более высокую концентрацию дианиона. Затем можно измерить общую концентрацию и, когда известны константы диссоциации, можно вычислить концентрацию кислоты, которая равна его растворимости. Однако исследователи не смогли договориться о константах ионизации карбоксильных групп или даже о том, имеют ли две группы одинаковые или разные значения рК17-19). Спор о значениях pK заключается в том, что внутримолекулярные водородные связи могут стабилизировать билирубиновую кислоту, а затем сдвинуть pK на более высокие значения.

Авторы изучили максимальную «равновесную» солюбилизацию кристалла UCB в растворе желчных солей, но не могли быть уверены в том, что истинное равновесие было достигнуто, потому что поверхностные эффекты и структурные изменения кристаллов UCB оказали влияние на скорости растворения кристаллов, и ухудшение UCB могло не полностью устраняются. Используя изоэкстракцию билирубина из хлороформа в буферный раствор, эти кристаллические эффекты были устранены путем диспергирования UCB в органических растворах до того, как равновесие раздела и раздела было быстро достигнуто.

Изучали влияние рН, типа и концентрации желчной соли на растворимость UCB и вычисляли значения pK билирубина.

Билирубин получали из Gallard Schlesinger, N.Y. и очищали по методу МакДонага20). Органические растворители (хлороформ и CCl4) очищали дистилляцией для удаления 0,5% этанола, который добавляли в качестве стабилизатора, промывали 0,1 М NaOH и 0,1 М серной кислотой с последующей деионизированной обработанной углем водой несколько раз для удаления химических веществ, которые являются консервантами и отслеживать загрязняющие вещества, а затем хранить в коричневых бутылках в темноте под слоем дистиллированной воды в течение 2 дней перед использованием.

Гидрофобные примеси желчной соли (например, липиды и неконъюгированные желчные соли) также удаляли из раствора соляной соли, промывая CHCl3 или CCl4 перед использованием.

Изофракционные исследования проводили с общей нижней фазой, из 90 или 250 мг билирубина в 300 мл хлороформа в специально разработанном сосуде с 10 дымоходами (рис.1), который был очищен между экспериментами промыванием хлорфром, метанолом, водой, щелочью , кислоты и затем воды. Любые полярные загрязнители, которые могли присутствовать в исходных кристаллах UCB, также удалялись путем предварительной промывки раствора CHCl3 UCB водой до изоэкстракции. Диапазоны рН составляли от 5,0 до 9,5, а водная фаза (3 мл) имела общую ионную прочность 0,15 М и содержала желчную соль и буфер. Используемыми буферами были цитрат с рН 5,0-6,0, фосфат от рН 6,5-8,0 и борат от рН 8,5-9,5.

Полный диапазон исследований проводили при 20 и 50 мМ Na taurocholate (TC) и без желчной соли; добавленные исследования проводились при 5 и 10 мМ таурохолата при рН от 6,0-10,0. Исследования с тауродегидроксихолатом (TDHC) также проводились для сравнения эффекта солюбилизации немицеллярной желчной соли.

Для исследований с камерой вытяжки из 10 дымовых газов растворы выдерживали при 25 ° С и перемешивали с внутренним покрытием из тефлонового стального стержня над вращающимся магнитом. Окисление UCB сводилось к минимуму путем газообразования растворов азотом и поддержания сосуда в темноте. Затем оптическую плотность (оптическая плотность: O.D.) при 453 нм определяли каждые 24 часа в течение 4 дней, и было обнаружено, что равновесие достигается в течение 48 часов. Итак, наконец, O.D. водной фазы измеряли при 48 и 72 ч, а соотношение между верхней и нижней фазами (Р) рассчитывали по диазо-анализу UCB21) в обеих фазах через 72 часа.

Стабильность UCB была продемонстрирована тем, что добавление 5 мМ ЭДТА в качестве стабилизатора не повлияло на результат. Дальнейшие доказательства стабильности UCB были получены методом экстракции и тонкослойной хроматографии (T.L.C.) водно-фазового пигмента 20, 22). (T.L.C. из уравновешенных фаз показали <2% III α и XIII α -изомеры и <1% -ную деградацию билирубина.

Концентрация билирубина в верхней водной фазе была стабильной через 48 часов. Первоначально абсорбцию при 453 нм определяли каждые 24 часа в течение 4 дней, но O.D. значения были постоянными с 48 часов и далее.

Поэтому анализ в окончательных исследованиях проводили после 48 часов инкубации. Значения рН, показанные через 48 часов, представляют собой начальные значения растворов, а значения рН, показанные через 72 часа, являются конечными измеренными значениями. 2 кривые практически накладываются друг на друга, и все кривые в 48 и 72 часа всегда совпадают с одинаковыми линиями регрессии. Изменения между 48 и 72 часами были связаны с изменением рН, а не с деградацией UCB. Не было существенных различий в растворимости UCB при общей ионной силе от 0,10 до 0,30 М при любых значениях рН.

На фиг.3 показано соотношение перегонки между водной и органической фазами в 50 мМ TC по отношению к рН. P означает отношение распределения между водной и органической фазами, а значения рН являются окончательными, измеренными значениями. Отношение перераспределения увеличивалось линейно с увеличением рН, показывая, что увеличение значений рН повышает растворимость UCB в буферных водных растворах.

Это указывает на то, что соли моноаниона (BH-) и дианиона (B =) UCB более растворимы, чем дикислота (BH2). Эта цифра также показывает, что отношение распределения было одинаковым в широком диапазоне концентраций билирубина в органической фазе при каждой концентрации. Предложив, что существует небольшая ассоциация UCB, было обнаружено, что насыщение может быть достигнуто с использованием 1,1 мМ UCB в CHCl3.

В отсутствие желчной соли растворимость UCB была аналогична растворимости от растворения кристаллов UCB с аналогичным наклоном кривой. Общая концентрация билирубина не может быть измерена при значениях рН ниже 5,0, поскольку в водной фазе недостаточно билирубина, чтобы дать диазо-реакцию, и это, вероятно, отражает диапазон, в котором билирубин полностью протонирован в двухосновной форме (BH2). Общая концентрация билирубина составляла 0,81 мкМ при рН 7,14, 3,49 мкМ при рН 8,09 и 28,68 мкМ при рН 8,95, но резко повышалась при рН ≥ 9,0 с более крутым увеличением наклона кривой и может быть связана с изменениями молекулярного состояния UCB из-за ионизации групп CONH на одном из концевых пиррольных колец.

Увеличение концентрации желчных солей увеличило растворимость UCB в водном растворе во всех диапазонах рН, что указывает на то, что все 3 формы UCB способны взаимодействовать с желчными солями, o и 4 мМ TC ниже критических значений мицеллярных значений, а 20 и 50 мМ TC выше критические мицеллярные значения. Исследования с немицеллярной желчной солью TDHC также проводились для сравнения эффекта солюбилизации с мицеллярной желчной солью, TC, а эффект TC был аналогичен TDHC. Билирубиновые взаимодействия практически одинаковы в ТС и ТДХК при каждой концентрации.

Солюбилизация UCB другими желчными солями, GC (гликохолат) и TCDC (тауроченодезоксихолат) также была почти такой же, как TC при значениях pH физиологического диапазона желчи. Неконъюгированная желчная соль не изучалась из-за ее ограниченной растворимости23).

Было обнаружено, что чистота билирубина оказывает важное влияние на растворимость UCB. Различные количества билирубина приводили к различным результатам, а примеси в билирубине увеличивали его разделение на водную фазу, особенно при значениях рН ≤8,0. Форма кривой и кажущиеся значения pK также были изменены. Билирубин очищали методом Mc Donagh и тестировали T.L.C. на силикагеле.

Кривые водной растворимости (S) на фиг.7 соответствуют уравнению:
S = S0 (1 + 10 (pH-pK1) + 10pH-pK1⋅10pH-pK2), где S0 — значение S для двукислотной билирубина (BH2) и pK1, а pK2 — кажущиеся константы ионизации первого и второго карбоксильные группы UCB. S были одинаковыми, когда UCB в CHCl3 составлял 0,48 ± 0,04 мМ (ненасыщенный) против 1,15 ± 0,03 мМ (насыщенный).

В таблице 1 приведены значения при насыщении, полученные компьютерным анализом этих кривых. Очевидное значение pK для ионизации первой группы СОИЛ билирубина составляло 7,2 в отсутствие желчной соли, а значения pK составляли 6,7 в 50 мМ TC и 6,6 в 50 мМ TDHC. Поскольку измеренные концентрации UCB при рН ≤ 4,0 были слишком низкими, чтобы быть надежными в буферных солевых растворах, значения S0 должны определяться экстраполяцией. Растворимость в растворе желчных солей при рН 8,0 была выше максимальных концентраций UCB, обнаруженных в нормальной печеночной желчи человека при сопоставимых концентрациях солей желчных кислот. Все остальные значения были ниже этого уровня.

Вторая ионизация не проявлялась при рН 6,0-8,0, что является физиологическим для желчи, вероятно, из-за внутренней водородной связи в UCB. Поэтому билирубин в желчи почти полностью находился в форме моноаниона (BH-).

UCB является основным компонентом пигментного желчного камня в виде билирубината кальция или черного пигментного полимера 24-26), и он обнаруживается в нормальной желчь желчного пузыря человека в концентрациях до 35 мкМ (2 мг / дл) 27), хотя UCB нерастворим в буферном водном растворе 12,13).

Концентрации и пропорции UCB, по-видимому, были увеличены в желчи многих пациентов5-8) или крыс28). Было высказано предположение, что UCB может быть солюбилизирован липидным компонентом желчи, особенно. желчных солей и что UCB по отношению к желчной соли может быть фактором в патогенезе желчных камней пигмента29,30). Был проведен ряд предварительных исследований растворимости UCB с или без желчных солей3,12,13,31,32), и авторы также изучили растворимость кристаллов UCB в растворах желчных солей.

В равновесной солюбилизации кристаллов UCB наблюдались две основные проблемы; а) влияние кристаллической поверхности повлияло на скорость растворения кристалла; б) деградация UCB не была полностью устранена, о чем свидетельствует развитие зеленого обесцвечивания из-за образования мезомобилидина внутренней прототропией UCB33). Mesobiliverdin может изменить равновесную растворимость UCB путем взаимодействия с желчными солями.

Чтобы решить эти проблемы, мы использовали метод изоэкстракции, используя 10 дымоотводную камеру (рис.1).

Изоэкстракция является равновесным методом, принцип заключается в определении равновесия раздела катиона и аниона между водной и органической фазами и основан на распределении между двумя фазами для изучения равновесия в одной фазе34,35). При изофракции эффект поверхности кристалла избегали диспергированием UCB в органическом растворе перед разделением, а также предотвращалось значительное ухудшение UCB. Это было подтверждено T.L.C. равновесных фаз, которые показали менее 1% окисления UCB, исключительно при значениях рН выше 9,0.

Стабильность UCB также была продемонстрирована тем, что добавление 5 мМ ЭДТА в качестве стабилизатора не повлияло на результат. С изоэкстракцией равновесие раздела также может быть быстро достигнуто. Мы обнаружили, что равновесие может быть достигнуто около 48 часов (рис.2), а UCB в водной фазе стабильна через 48 часов. Значения рН в 72 часа несколько изменились, но это было связано с диффузией менее поляризованных видов через фазу CHCl3, а не с деградацией UCB.

В этом исследовании мы рассмотрели влияние рН, ионной силы, типа и концентрации желчной соли, а также наличия или отсутствия мицелл. Первоначально исследования проводились с диапазоном рН от 3. 0-11.0, но позже мы обнаружили, что относительная ошибка может возникать при более низких концентрациях. В водной фазе ниже рН 4,5 не было измеренного цвета, что, вероятно, отражает диапазон, в котором UCB полностью протонирован в двухосновной форме.

Выше рН 10,0 также может произойти значительная ошибка, в водной фазе наблюдались красно-коричневые изменения цвета, которые, вероятно, отражают изменение конформации и поглощения в UCB за счет ионизации групп CONH в одном из концевых пиррольных колец. Таким образом, исследования были ограничены от рН 5,0 до 9,5.

Как и в других исследованиях, мы обнаружили, что увеличение значений рН повышает растворимость UCB в буферных водных растворах, что указывает на то, что соли моноаниона (BH-) и дианиона (B =) UCB более растворимы, чем двухосновные (BH2) (Фиг.3). UCB растворяется в виде дикислоты, а затем ионизируется в водной фазе в соответствии с рН. В буферизованных водных растворах без желчной соли (фиг.4) растворимость UCB была аналогична растворимости в растворе кристаллов UCB, но она была выше, чем значения, описанные Бродерсоном13), а также значениями Moroi3). Различия между нашим исследованием и их предыдущими исследованиями были, вероятно, потому, что их инкубации были завершены всего за несколько часов и, таким образом, не приблизились к равновесию.

Функции растворимости UCB следует понимать в терминах молекулярных взаимодействий между тремя видами билирубина (BH2, BH- и B =) и мономеров желчных солей, ужинов и мицелл. Как показано на фиг.5, увеличение концентрации желчных солей увеличивает растворимость UCB во всех диапазонах рН, что указывает на то, что все 3 формы UCB способны взаимодействовать с желчными солями. Этот результат подтверждается изменениями в спектре поглощения31,36) и сниженной восприимчивостью к ферментативному перекислению 37) UCB в присутствии желчных солей. TC ниже 5 мМ (0 и 4 мМ) ниже критических мицеллярных значений, а 20 и 50 мМ выше критических значений мицеллярных значений.

Для сравнения с мицеллярной желчной солью ТС (фиг.6) также проводили исследования изофракции с немицеллярной желчной солью, TDHC. В каждой концентрации наблюдалось сильное сходство между ТС и ТДХК. При 4 мМ обе соли желчных кислот находятся в мономерных формах, ожидалось сходство и результаты были одинаковыми при всех значениях рН. При 20 мМ, где TC находится в мицеллярной форме, и TDHC находится в мономерной форме, результаты также были аналогичными. Солюбилизация TDHC была несколько ниже, чем TC, но не очень. При 50 мм, где ТС находится в мицеллярной форме, а ТДХК находится в димерной форме, солюбилизация была немного лучше для ТДХК, чем ТС, при рН кислоты (рН <7,0), тогда как для щелочного рН (рН> 7,0) это немного лучше, ). Таким образом, BH- может взаимодействовать гидрофобно с одним или несколькими мономерами TC или TDHC для получения смешанных агрегатов, а мономеры соли соли, димеры и мицеллы одинаково эффективны при солюбилизации билирубина.

Эффект чистоты билируина был важен при разделении, и мы заметили тот факт, что разные количества билирубина дали разные результаты, и даже коммерческие неконъюгированные препараты пигмента были заражены переменными количествами билирубина III α и XIII α. Таким образом, мы очистили билирубин Mc. Донага21) с кипящей смесью CHCl3, промывкой 0,1 М NaHCO3 и дистилляцией. Тесты на чистоту, обсуждаемые Mc Donagh38) включают следующее: а) пигмент должен быть полностью растворим в CHCl3; б) обработка разбавленными растворами в CHCl3 с 0,1 М NaHCO3 не должна выделять никакого цвета; c) ТСХ на силикагеле и на полиамиде должно давать одно желтое пятно. Как показано на фиг.7, примеси в билирубине увеличивают перегородку в водную фазу, особенно. при значениях рН ≤8,0. Форма кривой и кажущиеся значения pK также были изменены.

Ряд исследователей17-19) попытались определить константу диссоциации билирубина. Однако они не смогли договориться относительно констант ионизации 2-карбоксильных групп. Они даже не согласны с тем, имеют ли 2 карбоксильные группы одинаковые или разные значения pK12,19,39,40).

Мы предполагаем, что BH2 является единственным видом, который разделяется между CHCl3 и органическими фазами, а затем ионизируется в водной фазе в соответствии с рН в мицеллярных и объемных компонентах этой фазы.

Затем наше исследование следует этой простой модели:
BH2CHCl3⇄BH2aq.⇄K1BH- + H + ⇄K2B = + 2H +, где K1 и K2 являются кажущимися константами ионизации первой и второй карбоксильных групп UCB.

Таким образом, S (Растворимость: общий UCB) = BH2 + BH- + B = + (B) 1, где BH- = (BH2) · K1 / H +, B = = (BH2) · K1 · K2 / (H +) 2 , и предполагая, что агрегация UCB в фазе CHCl3 отсутствует. Тогда S = BH2 + BH- + B = = (BH2) (1 + K1 / H + + K1 · K2 / (H +) 2) = (BH2) (1 + 10pH-pK1 + 10pH-pK1 · 10pH-pK2) , и если BH2 фиксирован и известно значение pH, мы можем вычислить pK.

В таблице 1 приведены значения pK, полученные компьютерным анализом кривых из рис.8. Химик ожидал бы pK около 4,0, как и для другой карбоновой кислоты, но наши результаты на 2,5-3,0 единицы выше, чем ожидалось, и это, вероятно, связано с тем, что внутримолекулярные водородные связи стабилизировали кислоту, а затем сдвинули pK до более высоких значений. Вторая константа ионизации не была очевидной при рН 6,0-8,0, которая является физиологической для желчи, вероятно, из-за внутренней водородной связи в билирубине, а кажущаяся pK2 составляла 9,2 в 50 мМ TC. Наши значения pK отличались от других репортеров. Broderson13,40) сообщали об одновременной ионизации 2-х карбоксильных групп UCB и Moroi3) сообщали, что значения 2 pK составляли 6,0 и 7,6 соответственно. Эти разные результаты могут быть связаны с их неспособностью приблизиться к равновесию. Используя эти значения pK, мы рассчитали пропорции BH2, BH- и B = в 50 мМ TC-растворах. BH- составлял более 90% UCB при рН 6,0-8,0, а B = становился доминирующим над pH 9,0. Таким образом, солюбилизация UCB является подходящей моделью для желчи, BH — более 90% ионизированного UCB при физиологических значениях рН.

Наши результаты показывают, что: a) изоэкстракция UCB из CHCl3 позволяет избежать эффектов кристаллической поверхности и следует модели:
BH2CHCl3⇄BH2aq.BH- + H + ⇄B = + 2H + b) Существует больше растворимостей с более высокими концентрациями соли желчи и с увеличением рН, а соль желчи играет важную роль в солюбилизации UCB в желчи, c) мономеры, димеры и соли соли желчных кислот мицеллы одинаково эффективны при солюбилизации билирубина, d) Билирубин в желчи почти полностью находится в форме моноаниона (BH-).

Изоэкстракционная установка.

Влияние продолжительности изоэкстракции. UCB в верхней водной фазе стабильна через 48 часов.

Влияние билирубина в хлороформной фазе. Разделение похоже на широкий диапазон концентраций UCB, что указывает на небольшую самоорганизацию UCB.

Растворимость UCB в буферном растворе хлорида натрия.

Влияние таурохолата в водной фазе. Разделение увеличивается с увеличением [желчной соли].

Влияние тауродегидрохолата в водной фазе. Разделение увеличивается с увеличением [желчной соли]. Значения сходны с таурохолатом.

Влияние чистоты билирубина на перегородку. Примеси увеличивают перегородку в водную фазу, особенно при значениях рН ≤ 8,0.

Билирубиновая насыщенность в 0 и 50 мМ желчных солях.

Значения насыщения билирубина в водной фазе

Ниже уровень точности; Предполагается экстраполяция

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *