Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Ожирение Триггеры Повышенное накопление MDSC в опухолях почки почки через повышенное местное производство CCL2

Obesity Triggers Enhanced MDSC Accumulation in Murine Renal Tumors via Elevated Local Production of CCL2
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4358922/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: MH FI CMB GW LAN. Выполнены эксперименты: MH FI CMB GW MB LAN. Проанализированы данные: MH FI CMB GW LAN. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: ЛВС. Написал документ: MH FI CMB GW MB LAN.

Ожирение является одним из ведущих факторов риска развития карциномы почек, иммуногенной опухоли, которую лечат клинически иммуностимулирующей терапией. В настоящее время, однако, механизмы, связывающие ожирение с заболеваемостью раком почек, неясны. Используя модель ожирения, вызванного диетой, мы обнаружили, что мышечные мышечные BALB / c с ортотопическими опухолями почек увеличили общие частоты супрессорных клеток миелоидов (MDSC) при опухолях почек и селезенках после d14 послеопухолевого заражения по сравнению с сухими аналогами , Опухоли почек у мышей, страдающих ожирением, имели повышенные концентрации известного миелоидного клеточного хемоаттрактанта CCL2, который производился локально путем увеличения процента дендритных клеток, макрофагов, В-клеток и CD45-клеток в опухолях. Экспрессия MDSC рецептора CCL2 CCR2 не изменялась при ожирении, но больший процент CCR2 + MDSCs присутствовал в опухолях почек у тучных мышей. Следует отметить, что уровни внутриклеточной аргиназы и супрессивные способности внутриклеточных опухолевых и селезеночных MDSC не изменялись у мышей с ожирением по сравнению с бережливым контролем. Таким образом, наши результаты показывают, что ожирение способствует прогрессированию опухолей почек за счет развития надежной иммуносупрессивной среды, которая характеризуется повышенной локальной и системной распространенностью MDSC. Целенаправленное вмешательство пути CCL2 / CCR2 может облегчить опосредованное иммунной системой почечную опухоль в области ожирения.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах дополнительной информации.

В Соединенных Штатах почти 35% взрослых страдают ожирением, и почти 20% всех видов рака считаются связанными с ожирением [1,2]. Ожидаемые индивидуумы (индекс массы тела или «ИМТ»> 30) имеют 50-75% повышенный риск развития карциномы почек (РСС), что делает ожирение одним из ведущих факторов риска развития этого типа рака [3,4]. Кроме того, в нескольких исследованиях было установлено, что у людей с ожирением с RCC есть более худший прогноз и повышенная смертность по сравнению с неживыми людьми, хотя в других отчетах получены противоречивые результаты [5-8].

Несмотря на документированные связи между ожирением и повышенным риском РСС, механизмы, лежащие в основе этих отношений, остаются неясными. Одна потенциальная связь связана с хроническим воспалением, связанным с ожирением, в качестве промотора прогрессирования опухоли. С началом ожирения адипоциты и макрофаги жировой ткани продуцируют различные провоспалительные цитокины, включая IL-6, IL-1β и TNFα [9,10]. Концентрации этих цитокинов увеличиваются по мере развития ожирения, что отражает изменения в биологии адипоцитов и изменение состава лейкоцитов в жировых тканях. Хроническое воспаление было вовлечено в развитие множественных патологий, связанных с ожирением, включая повышенную скорость опухолевого генеза у мышей с ожирением [11].

Даже при отсутствии ожирения солидные опухоли характеризуются хроническим воспалением, и это длительное воспалительное состояние, как было показано, уменьшает защитный иммунитет [12]. Одним из механизмов опосредованного воспалением опухоли является накопление миелоидных супрессорных клеток (MDSCs). MDSCs являются незрелыми клетками миелоидной линии, которые набираются в солидные опухоли путем местного производства провоспалительных цитокинов и хемокинов [13-15]. Многочисленные исследования показали, что MDSC являются ключевыми факторами, способствующими подавлению опухолей, и мы и другие идентифицировали их в периферической крови и опухолях людей с RCC [16-18].

Связи между ожирением, ростом опухоли и противоопухолевым иммунитетом плохо изучены, а эффекты ожирения на накопление и функционирование MDSC у мышей, несущих опухоль, не были тщательно изучены. В одном из предыдущих отчетов было установлено, что мышечные белки без опухолей накапливают клетки с фенотипом MDSC, хотя супрессивная способность этих клеток не исследовалась [19], а во втором докладе было обнаружено, что тучные мыши накапливали MDSC в опухолях почек, но не изучали потенциальные причины накопления MDSC [20]. Ранее мы обнаружили, что мышечные мыши имели эквивалентный рост опухолей почек по сравнению с мышами-мышами, но уменьшали ответы на иммунотерапию, что приводило к фатальному росту опухоли почки [21]. Снижение иммунотерапевтической эффективности у мышей с ожирением было связано с различными дефектами дендритной клетки и CD8 Т-клеток [21]. Здесь мы использовали ту же модель ожирения с диетой (DIO) и ортотопической опухоли почек, чтобы исследовать гипотезу о том, что сопутствующий рост опухоли и ожирение способствуют изменениям хемокина в локальной опухолевой среде, что приводит к увеличению накопления MDSC по сравнению с тем, что наблюдается в оседлых опухолевых животных. Наши результаты обеспечивают улучшенное понимание иммунной среды, которая возникает, когда ожирение сопровождает рост опухоли и еще больше способствует нашему пониманию иммунотерапевтической неудачи у тучных животных. В конечном счете, наши результаты могут быть информативными в разработке эффективных иммунотерапевтов для пациентов с ожирением, поскольку они предполагают, что MDSC-опосредованное иммунное подавление может быть более выраженным у этих людей.

Женские BALB / c мыши были приобретены (NCI) в возрасте 7-8 недель, которые поддерживались на стандартной чау в течение одной недели после получения, а затем случайным образом назначались либо для стандартной диеты с высоким содержанием жиров или с высоким содержанием жиров (HFD) (Research Diets # 12492, 60% ккал из жира) в течение 20 недель. Мышей размещали 5 в клетке в условиях отсутствия патогенов в Университете Айовы по уходу за животными, полностью аккредитованной Ассоциации по аккредитации лабораторного средства по уходу за животными. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по организации и уходу за животными в Университете штата Айова (лицензия № A3021-01) и проводились в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных национальных институтов Здоровье. Через 20 недель после кормления всех мышей взвешивали, а среднее и s.d. от стандартной чау или группы «нормального веса» (NW). Мышей в группе HFD определяли как ожирение с диетой (DIO), если их вес тела составлял> 3 с. выше средней группы NW [21]. Ранее сообщалось о представительных весах для мышей DIO и бедных / NW BALB / c в нашей колонии [21].

Была описана культура и использование клеточной линии мышиной почечной аденокарциномы Renca [22,23]. Внутрипочечная (IR) опухолевая задача была выполнена, как описано [22]; некоторые мыши в каждом эксперименте оставались без контроля без опухолей. В предыдущих исследованиях было установлено, что воспаление, вызванное самой хирургической процедурой, оказывает незначительное влияние на последующие иммунные реакции [21]. Операция на животе проводилась под анестезией кетамином / ксилазином, и все усилия были предприняты для уменьшения страданий животных во время и после операции. Внутрипочечная опухолевая проблема в этой модели приводит к появлению опухолей почек у 100% мышей [21,22]. Чтобы облегчить страдания животных, все мыши были подвергнуты эвтаназии к 21-му дню через асфиксию двуокиси углерода, за которой следует дислокация шейки матки, поскольку большинство мышей становятся умирающими в течение нескольких дней после этого момента из-за чрезмерного роста опухоли. Животных регулярно эвтаназировали для экспериментального использования между 9-11 утра, чтобы свести к минимуму биологическую изменчивость из-за светлых / темных циклов живого животного.

Через 7, 14 или 21 день после заражения опухоли, опухолевые почки, безрецидивные контралатеральные почки [22], селезенки, печень и жировые стромальные клетки (ASC) из пупочных эпидидимальных и почечных салфеток были собраны и обработаны для потока цитометрия [21, 24]. Клетки окрашивали и результаты получали с использованием многопараметрической проточной цитометрии на BD LSR II (BD Biosciences) перед анализом с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar Inc.). Для MDSC: CD11c-APC / Cy7, CD11b-PE / Cy7, Ly6C-FITC, Ly6G-PErCP-Cy5.5, I-Ad-PE и Hoechst; в некоторых экспериментах использовались CCR2-PE или CCL2-PE или изотипы. Антитела были получены от BioLegend (Сан-Диего, Калифорния) или Millipore (Billerica, MA). Аргиназа I (РЕ конъюгированная антиаргиназа I, R & D Systems, Миннеаполис, MN) была обнаружена путем внутриклеточного окрашивания после окрашивания поверхности, как указано выше. Ворота для аргиназоположительных событий были основаны на флуоресцентно-минус одном контроле окраски, в котором отсутствовала антиаргиназа.

MDSC собирали из нескольких органов в указанные моменты времени. Вкратце, органы обрабатывались, как описано [21, 24]. MDSC обогащали микрошариками Miltenyi anti-CD11b, затем сортировали по очистке на BD Aria II или FacS DiVa на основе экспрессии следующих маркеров после стробирования на живых клетках через исключение Hoechst 33258: Моноцитарный MDSC: CD45 + / CD11clow / CD11b + / Ly6C + Ly6Glow ; Гранулоцитарный MDSC: CD45 + / CD11clow / CD11b + / Ly6G + / Ly6Cdim.

Т-клетки собирали из трансгенных мышей DUC18 TCR [25], инкубировали с микрошариками CD8 (Miltenyi) и очищали на двух последовательных столбцах MACS. Процент живых Т-клеток DUC18 определяли с помощью проточной цитометрии на основе поверхностной ко-экспрессии CD8α и Vβ8.3. Т-клетки использовались в анализах пролиферации [24] с очищенной от кости опухоли MDSC или селезеночной MDSC от мышей, несущих опухоль NW или DIO. MDSC-ингибирование пролиферации Т-клеток оценивали путем культивирования наивных Т-клеток DUC18 (5 × 104 клеток на лунку) с tERK-импульсным spDC [24,25] из контрольных мышей BALB / c без опухолей (5 × 103 клеток на лунку) и сорт-очищенный опухоль-проникающий MDSC или селезеночный MDSC от опухолевых мышей (5 × 103 клеток на лунку). 3H-тимидин добавляли к d3 в течение окончательного 18 ч культивирования. Ингибирование Т-клеток рассчитывали как% снижения пролиферации Т-клеток с почечным MDSC, присутствующим по сравнению с тем, что наблюдалось для Т-клеток DUC18, культивируемых с контролем, только с пептидным импульсным spDC [24].

Образцы гомогената опухоли получали от мышей NW или DIO и замораживали при -80 ° C до использования. Супернатантные концентрации следующих цитокинов и хемокинов определяли с помощью мультиплексного анализа (Milliplex MAP kit, Millipore) на планшетном ридере BioRad BioPlex: IL-1β, IL-6, IL-9, TNFα и MCP-1.

Статистическую значимость между экспериментальными группами определяли с помощью парных или непарных t-тестов Стьюдента, с поправками Уэлша для неравных дисперсий, если это необходимо. (Prism, GraphPad Software Inc.). Во всей рукописи значение при p <. 05 обозначается одной звездочкой, а p <. 01 обозначается двумя звездочками.

MDSC являются хорошо описанными супрессорами защитного противоопухолевого иммунитета и накапливаются у хозяев в ответ на воспаление, травму и рост опухоли [13]. Поскольку ожирение связано с хроническим состоянием системного воспаления [10], мы спросили, были ли базовые различия в клетках с фенотипом MDSC присутствовали в NW против мышей DIO. Мы проанализировали безбаллочных мышей BALB / c через 20 недель на стандартном чау или диете с высоким содержанием жиров (HFD). В это время мыши DIO BALB / c продемонстрировали несколько классических признаков ожирения: увеличенный висцеральный жир в процентах от общей массы тела, повышенные уровни лептина в сыворотке и профиль цитокинов воспалительной сыворотки [21].

Наше предыдущее исследование показало, что функционально подавляющий MDSC от мышей, несущих опухоль, был CD11cneg [24], поэтому мы закрывали CD11cneg / CD11b + / I-Ad neg / Ly6C + (моноцит) или CD11cneg / CD11b + / I-Ad neg / Ly6G + (гранулоцитарный ) Клеток фенотипа MDSC (фиг.1A и S1). Мы не обнаружили существенных различий в относительной частоте MDSC (комбинированные подмножества Ly6C + и Ly6G +) или MDSC в почках, селезенке, печени или эпидидимальной / почечной жировой клетке жировой стромальной клетки (ASC) (S1 рис.). Поскольку этот вывод был противоположным предыдущему отчету о накоплении MDSC у мышей с мышами C57BL / 6 [19], мы исследовали частоты MDSC у мышей NW или DIO C57BL / 6 после 8 недель на диете, как Xia et al. сделал. При этом мы обнаружили увеличенные проценты и числа MDSC в селезенке этих мышей, что согласуется с этим отчетом (S2 рис.). Однако мы не обнаружили различий в экспрессии CD115 или CD244.2, двух белков, описываемых как потенциальные отличительные маркеры гранулоцитарного MDSC против нейтрофилов [26], на клетках от мышей DIO или NW C57BL / 6 (S2 рис.). Таким образом, у мышей, несущих опухоль, начало DIO не повсеместно сопровождается накоплением клеток, обладающих фенотипом MDSC, и существуют специфические штаммы.

(A) Стратегия стробирования проточной цитометрии для MDSC. (B) Частоты комбинированных моноцитарных и гранулоцитарных MDSC в опухолевых почках (TK) и безреберных контралатеральных почках (CK) со временем у мышей DIO и NW. (C) Частоты комбинированных моноцитарных и гранулоцитарных MDSC в селезенке, печени и жировых стромальных клетках (ASC) у мышей, несущих опухоль, в панели B. (D) Относительные частоты гранулоцитарного до моноцитарного MDSC показаны для указанных органов при d14 post — вызов. (B-D) Для всех n = 4-8 мышей / группы, объединенные из трех экспериментов. Бары показывают среднее значение +/- s.d. Коробки обозначают диапазон со средней (горизонтальная полоса). * = p <0,05.

Затем мы спросили, привело ли DIO к усилению накопления MDSC в первичных опухолях почек, поскольку это будет способствовать как иммунотерапевтической неудаче, которую мы наблюдали ранее у мышей с ожирением, так и увеличению клинической распространенности опухолей почек у взрослых с ожирением. Мышей NW или DIO BALB / c вводили внутримышечно в день 0 с опухолевыми клетками Renca, что приводило к возникновению ортотопического рака почки, процесс, который мы показали, приводит к выявляемым опухолям почек к 7-му дню и прогрессивному росту опухоли у 100% мышей в отсутствие терапии [22]. В этой модели кинетика выроста опухоли минимально влияет на ожирение [21].

Частоты комбинированных подмножеств Ly6C + и Ly6G + MDSC оценивались на 7, 14 и 21 дни. Опухоли не оценивались после 21 дня из-за быстрого роста опухоли и снижения здоровья животных [22]. Мы обнаружили увеличение процентного содержания MDSC в опухолевых почках как мышей DIO, так и NW на 14-й и 21-й день после опухолевого заражения по сравнению с соответствующими контрольными днями 0 (рис.1B). Мыши DIO имели поразительные и значимые возвышения в процентах MDSC в это время, помимо того, что наблюдалось у NW-аналогов. Скопление MDSC, специфичное к ожирению, не наблюдалось в опухолеподобных [22] контралатеральных почках. Эти результаты согласуются с недавним докладом, в котором обнаружены повышенные проценты MDSC при опухолях почек и селезенках тучных и худых мышей на 12-й день после опухолевого заражения [20].

Чтобы определить, привело ли комбинация ожирения и роста опухоли к изменениям накопления MDSC в других местах, мы исследовали селезенки, печени и эпидидимальные / почечные жировые отложения ASC в течение опухолевого роста. В селезенке мыши DIO снова имели значительное увеличение частоты MDSC на 14-й день по сравнению с аналогами NW (фиг.1C), в отличие от печени, в которой больные MDSC-проценты были обнаружены у мышей с NW. Наше исследование ASCs не выявило различий, связанных с ожирением, между днями 0-14; у большинства мышей не было обнаруженной висцеральной жировой ткани, оставшейся на 21-й день (6 из 7 у мышей NW и 5 из 8 у мышей DIO) (фиг.1С и данные не показаны).

Поскольку гранулоцитарные (Ly6G +) и моноцитарные (Ly6C +) MDSC были приписаны к различным функциям in vivo [13,26,27], мы затем определили, вызвало ли ожирение сдвиг в составе подмножества MDSC. Статистические различия не наблюдались в отношении гранулоцитарных: моноцитарных MDSC в опухолевых почках, контралатеральных почках или селезенках DIO против мышей NW на 21-й день (фиг.1D), хотя наблюдалась тенденция к увеличению гранулоцитарных MDSC в опухоле- опосредованных почек мышей DIO. Таким образом, ожирение ассоциировалось с повышенными процентами MDSC только в первичных опухолях и селезенке мышей с опухолями почек и не сопровождалось значительными сдвигами по отношению к гранулоцитарному или моноцитарному подтипу.

Предыдущие исследования показали, что сайт-специфическое накопление MDSC регулируется цитокинами и хемокинами. В частности, CCL2 (моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 или MCP-1), TNFα, интерлейкин-1β (IL-1β) и IL-6 были идентифицированы как позитивные медиаторы траления и накопления MDSC [28,29]. Учитывая поразительное увеличение распространенности MDSC в опухолях у мышей DIO между 7 и 14 днями, мы изучили гомогенаты опухолей для присутствия каждого из вышеуказанных факторов в оба момента времени у мышей DIO и NW. Из этих факторов только CCL2 показал значительное увеличение от мышей DIO по сравнению с мышами NW на 14-й день (рис. 2A и S3 рис.). Как предсказано из-за отсутствия роста опухоли [22] или накопления MDSC в контралатеральных почках (рис.1), концентрации CCL2 оставались низкими в контралатеральных почках как у мышей DIO, так и у NW.

(A) мышей DIO и NW подвергали сомнению, как на фиг.1. Опухолевые почки (TK) или безрецидивные контралатеральные почки (CK) собирали в указанное время. Гомогенаты тестировали через мультиплексный массив для CCL2. n = 4-8 мышей на группу, объединенные из трех экспериментов. Бары показывают среднее +/- sd. * = p <0,05. (B) Гистограммы, показывающие внутриклеточный CCL2 для указанных популяций клеток. (C) внутриклеточный CCL2 из пула DIO против мышей NW для указанных популяций клеток с n = 3-5 мышей на группу. Бары показывают среднее +/- sd. * = p <0,05.

Чтобы определить, изменили ли ожирение типы клеток, которые продуцировали CCL2 или изменили процент клеток, которые секретировали CCL2, мы провели внутриклеточное окрашивание CCL2 на клетках из диссоциированных опухолей почек у мышей с ожирением и NW на 14 день. Мы обнаружили, что опухоли у тучных мышей увеличение процентного содержания CD45 + / CD11c + / MHC II + DC, CD45 + / CD11b + / MHC II + макрофагов, CD45 + / B220 + В-клеток и CD45neg клеток (не лейкоцитов), которые экспрессировали CCL2 (фиг.2B). Анализ данных, собранных у нескольких животных, показал, что эти различия были статистически значимыми (рис. 2C). Таким образом, ожирение привело к усилению секреции CCL2 несколькими популяциями лейкоцитов и не лейкоцитарными клетками в массе опухолей, что привело к локальному повышению концентрации CCL2 в первичных опухолях почек.

Предыдущие исследования нашей группы и другие показали, что концентрации CCL2 повышаются в сыворотке пациентов с RCC [18,30] и что CCL2 продуцируется на высоких уровнях связанными с опухолью макрофагами, которые проникают в опухоли почек человека [31]. Наши результаты на мышах согласуются с этими данными и предполагают, что дополнительные клеточные популяции следует исследовать в опухолях почек человека для их получения CCL2. Недавно было обнаружено, что CCL2 способствует прогрессированию рака молочной железы и ангиогенезу через его влияние на связанные с опухолью макрофаги [32]. Было обнаружено, что в этой модели DIO C57BL / 6 выражает высокие уровни CCL2 в молочных железах и трансплантацию мышей с гуманизированными клетками сосудистой фракции жировой клетчатки, которые над выраженным CCL2 идентифицируют новые взаимодействия адипоцитов / макрофагов, опосредуемые CCL2 / IL-1β / CXCL12, которые способствовали прогрессированию опухоли через усиленный ангиогенез [32]. В нашей модели мы обнаружили, что у тучных мышей повышенный уровень CCL2, но не IL1β в опухолях почек к 7-му дню после трансплантации опухоли (S3 рис.). Следовательно, возможно, что различные опосредуемые CCL2 оси способствуют прогрессированию опухоли и / или ангиогенезу в опухолях почек и молочной железы.

В другом недавнем исследовании было обнаружено, что адипоциты от мышей DIO секретируют повышенные уровни CCL2 и M-CSF после совместной культивирования с клетками меланомы [33]. Считалось, что эти изменения in vitro обеспечивают механизм увеличения накопления макрофагов M2-фенотипа, наблюдаемых при подкожных меланомных поражениях тучных и худых мышей [33]. Наше исследование дополняет эти результаты, показывая, что опухоли почек у тучных мышей также повышают местный CCL2, который продуцируется широким разнообразием типов клеток (дендритных клеток, В-клеток и макрофагов) в микроокружении опухоли, возможно, из-за перекрестных помех между лейкоцитами и опухолевыми клетками. В совокупности результаты нашей лаборатории и другие демонстрируют связь между подавляющим накоплением миелоидных клеток у тучных опухолевых мышей и продуцированием CCL2, что указывает на то, что это общий путь, который может быть направлен на терапевтическое улучшение иммунотерапевтической эффективности при ожирении.

Известно, что даже при отсутствии роста опухоли человеческое ожирение сопровождается повышенными концентрациями CCL2 в периферической крови; поджелудочная железа; и подкожной, висцеральной и ометальной жировой ткани [34-36]. Показано, что высокий CCL2 способствует резистентности к инсулину у тучных, поскольку блокирующие сигналы через его рецептор CCR2 уменьшают увеличение веса и резистентность к инсулину у мышей DIO [37], а принудительная экспрессия CCL2 способствует резистентности к инсулину [37,38]. Кроме того, показано, что CCL2 способствует инфильтрации макрофагов в жировую ткань у мышей с генетически ожирением и DIO [37]. По этим причинам активно исследуются терапевтические стратегии, которые нейтрализуют CCL2 с помощью введения антител или блока CCR2 с помощью ингибиторов малых молекул (см. [34]). Однако в это время нейтрализация CCL2 показала ограниченный успех [34], предполагая, что нацеливание CCR2 может дать лучшие терапевтические результаты.

Увеличенный процент MDSCs при почечных опухолях тучных мышей может быть результатом повышения регуляции CCL2-рецептора CCR2 в дополнение к повышенным локальным концентрациям белка CCL2. Поэтому мы исследовали экспрессию CCR2 на MDSCs из опухолеподобных почек и безрецидивных контралатеральных почек при d14 послеопухолевом заражении, так как в этот момент времени были увеличены как CCL2-белок, так и накопление MDSC (рис.2). Мы снова собрали на Ly6C + моноцитные или Ly6G + гранулоцитарные субпопуляции MDSC (как на рис.1A) и исследовали экспрессию поверхностного CCR2 (фиг.3). Белок CCR2 был обнаружен на обоих подмножествах MDSC из опухолеподобных почек у мышей DIO и NW без изменения интенсивности окрашивания CCR2 (фиг.3A). Эквивалентные проценты моноцитарного и гранулоцитарного MDSC выражали CCR2 у мышей DIO и NW как в опухолевых, так и в контралатеральных почках (рис. 3B). Однако, когда были подсчитаны проценты CCR2 + MDSCs в виде доли от всех живых живых клеток, мы снова обнаружили значительное увеличение общей частоты как моноцитарного, так и гранулоцитарного CCR2 + MDSC в опухолеподобных почках у мышей DIO (фиг.3C). Контралатеральные почки, не содержащие опухоли, содержали несколько MDSC (изменение шкалы заметок), а мыши DIO уменьшали проценты моноцитарного MDSC CCR2 + по сравнению с аналогами NW (фиг.3C). Мы пришли к выводу, что увеличение процента MDSC в опухолях почек у мышей с ожирением обусловлено прежде всего повышенным местным продуцированием миелоидного хемоаттрактанта CCL2, а не изменениями экспрессии CCR2.

(A) мышей DIO и NW подвергали сомнению, как на фиг.1. Опухолевые почки (TK) или безрецидивные контралатеральные почки (CK) собирали в указанное время. Гистограммы показывают репрезентативную поверхностную экспрессию CCR2 на Ly6C + или Ly6G + MDSC от мышей DIO или NW. Открытые гистограммы = контроль изотипа; заштрихованные гистограммы = окрашивание CCR2. (B) Объединенные данные, показывающие% MDSCs, которые экспрессируют CCR2 в опухолевых почках (TK) и контралатеральных почках (CK). Гейтинг на Ly6C + или Ly6G + MDSC показывает сильное и эквивалентное выражение CCR2 на субпопуляциях MDSC от мышей DIO и NW. (C) Увеличение общих частот CCR2 + MDSC из обоих подмножеств Ly6C + и Ly6G + при расчете в процентах от общих живых клеток в опухолевых почках. Для B и C, n = 4-6 мышей на группу из двух экспериментов. Бары показывают среднее +/- sd. * = p <0,05.

Наконец, мы спросили, имеет ли MDSC от мышей DIO измененную подавляющую способность на основе каждой клетки относительно MDSC от мышей NW. Мышей DIO и NW снова вызывали внутримышечно на d0 клетками Renca, затем опухоли и селезенки собирали между 21-24 днями, когда опухоли почек были большими и были макроскопически видимыми. Моноцитарные и гранулоцитарные субпопуляции MDSC были очищены по отдельности от обоих органов и исследованы на супрессивную способность ex vivo. Гранулоцитарная опухоль-инфильтрация-MDSC (TI-MDSC) от мышей DIO и NW показала почти идентичные супрессивные способности ex vivo (фиг.4A, левая панель). Моноцитарный TI-MDSC от мышей DIO показал тенденцию к увеличению подавляющей способности, но эта разница не была статистически значимой. Кроме того, мы не обнаружили различий в супрессивной способности клеток селезенки Ly6C + или Ly6G + MDSC от опухолевых DIO против мышей NW (рис.4A, правая панель).

Опухолевые почки и селезенки у одних и тех же мышей собирали между 21-23 днями. (A) Моноцитарные (Ly6C +) и гранулоцитарные MDSC (Ly6G +) были очищены от каждого органа, затем помещены в культуру с наивными Т-клетками DUC18 и стимулирующим селезеночным DC от мышей, свободных от опухолей. MDSC и стимулирующий DC были пульсированы с помощью DUC18 cognate peptide tERK. n = 6-8 мышей на группу, в сочетании с тремя экспериментами. Бары показывают среднее +/- sd. * = p <0,05. TI = инфильтрация опухоли: sp = селезенка. (B) Массовая опухоль и гомогенаты селезенки были окрашены в поверхность, как описано в Методах для выделения моноцитарных или гранулоцитарных субпопуляций MDSC, затем окрашивали внутриклеточно для экспрессии аргиназы-1. Точки указывают результаты от отдельных мышей. Статистических различий в процентах от субпопуляций аргиназы + MDSC от подобных органов у мышей с ожирением и мышей нет.

Затем мы спросили, изменило ли ожирение внутриклеточную экспрессию аргиназы, белка, который, как известно, опосредует супрессивные функции MDSC через истощение L-аргинина в локальной микроокруге опухоли [39]. L-аргинин условно необходим для поддержки пролиферирующих всплесков Т-клеток, а Родригес и др. ранее обнаружил, что MDSC у людей с РСС был высоким продуцированием аргиназы, которая ингибировала экспрессию Т-клеток CD8, экспрессию цепи CD3 и продукцию IFNγ [40]. В соответствии с нашей функциональной оценкой очищенного сорта MDSC мы не обнаружили различий во внутриклеточной экспрессии аргиназы между гранулоцитарным или моноцитарным TI-MDSC от тучных и худых мышей (фиг.4B). Хотя экспрессия аргиназы была увеличена в субпопуляциях TI-MDSC по сравнению с субпопуляциями MDSC селезенки, экспрессия внутриклеточной аргиназы не изменялась при ожирении. Таким образом, наши результаты показывают, что в этой модели ортотопического рака почек ожирение связано с более устойчивой иммуносупрессией в микроокружении опухоли, характеризующейся повышенными концентрациями CCL2 и увеличением процента функционально ингибирующих MDSC.

Блокада антител MCP-1 / CCL2 в настоящее время тестируется на терапевтическую эффективность у пациентов с метастатическим раком предстательной железы. Мы и другие обнаружили, что CCL2 повышен в ответ на рост опухолей почек у больных раком [18,30,31]. Наши результаты здесь свидетельствуют о том, что блокада CCL2, возможно, с помощью небольшого ингибирования молекулы CCR2, может быть особенно полезна у пациентов с ожирением, так как она может нормализовать процент иммуносупрессивного MDSC и разрешить иммуностимулирующие терапии для получения более устойчивых противоопухолевых иммунных реакций.

Наша предыдущая работа с этой ортотопической опухолевой моделью почек почки продемонстрировала, что ожирение связано с множественными дефектами функции дендритных клеток: оно уменьшает способность дренированных дендритных клеток стимулировать наивное расширение CD8 + Т-клеток, что приводит к увеличению частоты регуляторных дендритных клеток [24 ] в опухолях почек и уменьшало продукцию IL-12 и TNFα дендритными клетками в опухолях почек [21]. Эти факторы привели к уменьшению частоты IFNγ + эффекторных CD8 + Т-клеток в опухолях почек у мышей с ожирением и неспособности Т-клеточно-зависимой иммунотерапии вызвать индуцирование опухоли, что привело к фатальному росту опухоли у тучных мышей. Напротив, после введения той же иммунотерапии почти 80% мышей с мышей очищали их опухоли почек и имели долгосрочную выживаемость [21].

Наши результаты здесь дополняют сложную картину иммунологических изменений, которые возникают, когда ожирение и рост опухоли присутствуют одновременно. Так как никаких различий в частоте клеток MDSC-фенотипа не было до заражения опухоли в любом органе у мышей с ожирением и у мышей BALB / c, мы пришли к выводу, что индуцированное опухолье производство CCL2 является основным фактором, приводящим к накоплению MDSC при тучных опухолевых мышей, а не исходных, системного воспаления, присутствующих в результате ожирения. Хотя ранее проведенные исследования продемонстрировали, что CCL2 повышен с ожирением даже в отсутствие роста опухоли [34,37], наши результаты как у мышей DIO BALB / c, так и у C57BL / 6 без опухолей свидетельствуют о том, что этих изменений недостаточно для накопления MDSC в здоровых почках. У мышей, несущих опухоль, высокая локальная концентрация CCL2, продуцируемая различными типами клеток в микроокружении почечной опухоли, представляется необходимой для накопления почечного MDSC.

Мы определили здесь, что ожирение способствует накоплению MDSC в опухолях почек почек и системно в селезенке. Наши кумулятивные результаты этой доклинической модели мыши предполагают, что пациенты с ожирением почечной опухоли могут иметь уменьшенные ответы на иммуно-стимулирующие методы лечения. Учитывая тот факт, что ожирение является основным фактором риска развития и смертности от РСС [3,4,6,41], эта возможность имеет клинические последствия. Многочисленные предшествующие исследования показали, что RCC человека сопровождается увеличением местного и системного процента MDSC [18,39,40,42] и что эти изменения связаны с худшими клиническими результатами (см. [42]). Поскольку гранулоцитарные MDSC фенотипически сходны с нейтрофилами, возможно, что предшествующие исследования человека, которые обнаружили увеличение нейтрофилов до уровня лейкоцитов как показатель плохого прогноза в RCC [43,44], фактически обнаруживали повышенные частоты гранулоцитарных MDSC. В нашем текущем исследовании мы обнаружили тенденцию к увеличению гранулоцитарной до моноцитарной частоты MDSC в опухолях почек у тучных мышей, хотя это изменение не достигло статистической значимости. Мы также не обнаружили изменений в подавляющей способности клеток или внутриклеточной аргиназы в гранулоцитарных MDSC в опухолях почек у мышей с ожирением и мышами (рис.4). Однако, поскольку общие проценты от общего MDSC были увеличены при опухолях почек и селезенке у тучных мышей, результатом является более сильная иммуносупрессия, вызванная опухолью.

Основываясь на наших выводах в этой модели комбинированного ожирения и роста опухолей почки, возможно, что блокада CCL2 / CCR2 или введение известных MDSC-истощающих средств, таких как 5-фторурацил [45], может оказаться полезной как часть комбинаторного подхода к иммунотерапия у лиц с ожирением с опухолями почек. Хотя существуют важные биологические различия между агрессивно растущими, трансплантированными опухолями почек почек и опухолями человека, которые могут занять годы для развития, наши результаты подтверждаются растущим числом исследований на мышах, которые изучали комбинированные эффекты ожирения и опухолевого заражения при подавляющем накоплении миелоидных клеток и функции [20,32,33]. Таким образом, представляется, что эта тенденция является надежной и широко применимой к различным типам опухолей. В совокупности мышиные результаты нашей лаборатории и другие предлагают сценарий, в котором пациенты с ожирением могут страдать от более выраженного индуцированного опухолью иммунного подавления, что может снизить эффективность введенных противоопухолевых иммунотерапий. Если это так, это может потребовать подбора иммунотерапевтических подходов к раковым больным на основании их статуса ИМТ, что необходимо будет изучить в будущих исследованиях человека.

7-8-недельных мышей BALB / c помещали на HFD или стандартную чау в течение 20 недель. Тучные мыши определяли, как описано в Методах. Данные показаны для клеток с фенотипом MDSC:% (верхние панели) и число (нижние панели) на основе комбинированной распространенности живого CD11cneg / CD11b + / I-Ad neg / Ly6C + (моноцитарного) и CD11cneg / CD11b + / I-Ad neg / Ly6G + (гранулоцитарные) клетки. Для всех графиков n = 3-5 мышей на группу, объединенные из двух независимых экспериментов. Бары показывают среднее +/- sd. Никаких статистических различий между мышами DIO и NW в любом органе не обнаружено.

(EPS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

7-8-недельных мышей C57Bl / 6 помещали на HFD или стандартную чау в течение 8 недель. Тучные мыши определяли, как описано в Методах. (А). Органом показано частоту (верхние панели) и число (нижние панели) всех клеток с фенотипом MDSC. Для всех графиков n = 4-5 мышей на группу. Бары показывают среднее +/- sd. (B) Выражение CD115 и CD244.2, как предполагаемые маркеры для дифференцировки гранулоцитарных MDSC против нейтрофилов, показано для стробированного моноцитарного и гранулоцитарного MDSC из DIO и селезенки NW. Гистограммы — от одной мыши, представляющей 4-5 на группу. * = p <0,05.

(EPS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мыши DIO и NW были оспорены, как показано на рисунке 1. Опухолевые почки (TK) или безрецидивные контралатеральные почки (CK) собирали в указанное время. Гомогенаты тестировали с помощью мультиплексной матрицы для указанных цитокинов. n = 4-8 мышей на группу, объединенные из трех экспериментов. Бары показывают среднее +/- sd. Не было обнаружено существенных различий между мышами NW и DIO в ТЗ для любого тестируемого аналита.

(EPS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы выражают благодарность Энн Томанек-Чокли за техническую поддержку, Диану Морман за административную поддержку, а также сотрудников службы поддержки экспертов в Управлении ресурсов животных и Основного механизма проточной цитометрии для технической поддержки.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *