Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Мышечное эктопическое отложение жира способствует анаболической резистентности у тучных саркоценовых старых крыс с помощью активации eIF2α

Muscle ectopic fat deposition contributes to anabolic resistance in obese sarcopenic old rats through eIF2α activation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4326920/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу

Ожирение и старение характеризуются сниженной чувствительностью к инсулину (IS) и синтезом мышечных белков. Внутримышечное накопление церамидов было вовлечено в резистентность к инсулину во время ожирения. Мы стремились измерять уровень IS, уровень целлюмида в клетках, синтез белка и активацию внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в инициации трансляции у самцов Wistar young (YR, 6-месячный) и старых (OR, 25-месячных) крыс, получавших низкий (LFD) ) или диету с высоким содержанием жиров (HFD) в течение 10 недель. Был взят соответствующий клеточный подход с использованием митобутов C2C12, обработанных пальмитатом, для индуцирования внутриклеточного осаждения церамида. Сниженная способность жировой ткани сохранять липиды вместе с уменьшенным диаметром адипоцитов и развитием фиброза наблюдалась в OR после HFD. Следовательно, OR, получавший HFD, был устойчив к инсулину, показал сильное увеличение внутримышечного уровня церамида и снижение синтеза мышечных белков, связанное с увеличением фосфорилирования eIF2. Накопление внутримышечных липидов положило липидную нагрузку на митохондрии и создало разрыв между метаболическими и регулирующими путями в скелетных мышцах ОР. В клетках C2C12 индуцированное пальмитатом накопление церамида ассоциировалось с уменьшенным синтезом белка вместе с повышенным фосфорилированием eIF2. В заключение, сниженная способность к расширению жировых тканей была обнаружена в OR, что отражает более низкую буферную способность липидов. Мышечная митохондриальная активность была затронута в OR, дающей пониженную способность окислять жирные кислоты, поступающие в мышечную клетку. Следовательно, OR были более склонны к накоплению эктопических мышечных липидов, чем YR, что приводило к уменьшению анаболизма мышечного белка. Это метаболическое изменение является потенциальной терапевтической целью для борьбы с саркопенным ожирением.

Жировая масса увеличивается от 20% до 40% в возрасте от 20 до 80 лет, а осаждение липидов изменяется, с увеличением инфильтрации печени и скелетных мышц. Этот возрастной ожирение действует синергетически с саркопенией, ухудшая инвалидность через «саркопенное ожирение». Повышенное накопление липидов во многих тканях связано с появлением резистентности к инсулину (Slawik & Vidal-Puig, 2007). И наоборот, стимулирование хранения жира предпочтительно в жировой ткани с использованием трансгенных мышей с адипонектином ob / ob или обработкой агонистом активированного рецептора пероксисом-пролифератора (PPARgamma) улучшает чувствительность к инсулину (Kim et al., 2007). Помимо увеличения емкости жира в адипоцитах, увеличение окисления жирных кислот в мышцах также может препятствовать липотоксичности (Henique et al., 2010). Очень старые трансгенные PGC1α (мышам, активирующими пролифератор пероксисом-активаторов рецептора 1α) показали повышенную активность митохондриальной мышцы и улучшенные метаболические реакции, как показано уменьшенными уровнями циркулирующего липида и повышенной чувствительностью к инсулину (Tiraby et al., 2007; Wenz et al., 2009) ).

Повышенное содержание липидов внутри мышц у пожилых людей независимо связано с резистентностью к инсулину (Ryan & Nicklas, 1999; Zoico et al., 2010), а умеренная потеря веса улучшает инфильтрацию липидов мышц и резистентность к инсулину у женщин в постменопаузе (Mazzali et al. , 2006). Накопление мышечного жира у пожилых людей связано не только с нарушениями метаболизма, но также с уменьшенной прочностью и более низкими показателями в тестах производительности и инвалидности с подвижностью при движении (Goodpaster et al., 2001; Zoico et al., 2010). Кроме того, увеличение внутримышечных жиров совпадает в продольном направлении с прогрессирующим мышечным ослаблением, наблюдаемым при старении (Delmonico et al., 2009).

Таким образом, помимо эффекта накопления мышечного жира на чувствительность к инсулину, накопление липидов в мышцах может также способствовать специфическим изменениям метаболизма мышечных белков. Некоторые косвенные доказательства подтвердили эту гипотезу. Синтез мышечного белка притупляется у молодых людей с ожирением (Guillet et al., 2009) и старше (Katsanos & Mandarino, 2011) по отношению к жирности тела, что указывает на то, что увеличение массы жировой ткани или эктопическое осаждение липидов может ухудшить синтез белка скелетных мышц. Андерсон и коллеги (Anderson et al., 2008b) отметили значительное снижение способности мышц от мышей, которым вводили диету с высоким содержанием жиров, чтобы стимулировать синтез белка после еды, но внутримышечное содержание липидов не измерялось. Эти данные свидетельствуют о том, что накопление липидов после хронической диеты с высоким содержанием жиров препятствует сигнальным путям, участвующим в реакции мышц, на анаболические стимулы, притупляя активацию синтеза белка.

Мы предположили, что метаболические изменения в ответ на диетические липиды во время старения были связаны с потерей мышечной массы через инфильтрацию липидов и измененной трансляционной регуляцией у старых крыс. Мы впервые протестировали влияние накопления липидов мышц на скорость синтеза белка у старых саркопных крыс, которым кормили диету с высоким содержанием жиров. Во-вторых, мы измерили влияние инфильтрации липидов, модулируя содержание церамида, скорость синтеза белка и его трансляционную регуляцию в мышечных клетках C2C12.

Молодые крысы развивали диетическое ожирение (ДИО) с диетой с высоким содержанием жиров, о чем свидетельствуют увеличение массы тела и отложений жировых отложений (таблица 1). Не было очевидной разницы в весе тела между старым контролем и старыми жировыми группами, хотя количество жировой ткани было немного увеличено у старых крыс с высоким содержанием жира. Следует отметить, что молодые крысы стали более оживленными, чем старые. При дальнейшей поддержке наших предыдущих результатов (Zangarelli et al., 2006) масса мышцы задней конечности была значительно снижена по возрасту, в частности, по весу мышцы волокна 2 (таблица 1). Кроме того, по сравнению с контрольной группой 10 недель диеты с высоким содержанием жиров (HFD) были причиной значительного снижения массы мышц задней конечности у старых крыс. Поэтому, как с возрастом, так и с DIO, мышечная масса уменьшалась, тогда как у крыс повышалась жировая масса. Эта обратная связь привела к концепции саркопенного ожирения, подразумевая зависимость от возраста молекулярной связи между накоплением жира и мышечного жира, резистентностью к инсулину и снижением мышечной массы.

Характеристики крыс

Значения ± SEM для восьми животных на группу.

YLF, молодые крысы кормили диету с низким содержанием жиров, YHF, молодые крысы кормили диету с высоким содержанием жиров, OLF, старыми крысами, питавшими диету с низким содержанием жиров, OHF, старые крысы кормили диету с высоким содержанием жиров, FFA, свободные жирные кислоты.

P <0,05 против диеты

Р <0,05 возрастной эффект (та же диета)

Р <0,05 диетический эффект (в том же возрасте).

Несмотря на то, что гликемия и инсулинемия натощак не изменялись, данные теста на толерантность к внутрибрюшинной глюкозе показали, что нарушение толерантности к глюкозе сопровождалось ожирением у старых крыс (табл. 1 и фиг.1А). У пожилых людей (25-месячных крыс) ожирение у крыс, которым кормили HFD, было болезненным и ассоциировалось с резистентностью к инсулину, в частности в скелетной мышце, что иллюстрируется сниженной активацией Akt (рис. 1B). В соответствии с этими данными концентрация старых свободных жирных кислот (FFA), холестерина и маркеров воспаления, то есть цитокинов, значительно повышалась у старых крыс, которым кормили диету с высоким содержанием жиров (таблица 1).

Индексы чувствительности инсулина всего тела и скелетных мышц у молодых и старых крыс кормили диету с низким содержанием жиров или с высоким содержанием жиров в течение 10 недель. (A) Индекс устойчивости к инсулину всего тела, измеренный методом внутрибрюшинной толерантности к глюкозе. Сопротивление инсулину оценивали по продукту области под кривой (AUC) глюкозы и AUC инсулина после внутрибрюшинной инфузии глюкозы. (B) Состояние фосфорилирования Akt в передней мышце тибиалиса. Фосфорилированный Akt до полного содержания белка в белках измеряли с помощью Вестерн-блоттинга. Значения ± SEM для восьми животных на группу. * Р <0,05 возрастной эффект (та же диета), $ P <0,05 диетический эффект (в том же возрасте). LFD, диета с низким содержанием жиров; HFD, диета с высоким содержанием жиров.

Химическое определение концентрации жирореактивных видов в мышечной ткани выявило более внутримышечные липиды у старых крыс, чем у молодых, особенно после ДИО (рис. 2). Более примечательно, однако, что различия в метаболизме липидов в мышечной ткани отличались значительным увеличением триглицеридов (ТГ) и церамидов и кажущейся стабильностью концентрации диацилглицерина (ДАГ) в мышцах старых тучных крыс. Предыдущие исследования (Hulver et al., 2003, 2005; Petersen et al., 2003) свидетельствуют о том, что развитие резистентности к инсулину во время старения связано с увеличением метаболитов внутриклеточной жирной кислоты, которые могут быть результатом связанного с возрастом снижения окислительной активности митохондрий. Старение влияло на активность митохондриальной 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы (HAD), ключевого фермента цикла β-окисления, предоставляя старым крысам восстановленную способность окислять жирные кислоты, поступающие в мышечную клетку (табл. 2). Поскольку для нормальной цепи электронного транспорта необходимы сбалансированные пропорции митохондриальной комплексной активности митохондрий, вычисление отношений комплексных активностей считается хорошим показателем активности митохондрий (Miro et al., 2000; Zangarelli et al., 2006) ). Предыдущие отношения Тилиалиса комплекса I к комплексам II и III были заметно снижены у старых крыс DIO по сравнению с контрольными старыми и молодыми тучными крысами (табл. 2). Кроме того, отношения группы II и III комплексных IV-активности были увеличены в той же группе старых крыс. В целом, эти данные были связаны с конкретным 30% -ным снижением активности комплекса I и IV у животных с высоким содержанием жиров. По соглашению с дезорганизацией митохондриальных комплексных активностей у старых крыс DIO наблюдалось снижение уровней транскрипции PGC1α, транскрипционного коактиватора, играющего многогранную роль в регуляции энергетического метаболизма митохондрий и биогенезе. В частности, PGC1α влияет на использование липидов в мышечных клетках (Anderson et al., 2008a). Следует отметить, что митохондриальные комплексы I и IV являются мишенями транскрипционной активности PGC-1.

Изменение в митохондриальной активности в передних мышцах тибиалиса у молодых и старых крыс, получавших контроль или диету с высоким содержанием жиров в течение 10 недель

Значения ± SEM для восьми животных на группу.

Р <0,05 возрастной эффект (та же диета)

Р <0,05 диетический эффект (в том же возрасте). Митохондриальная активность была HAD и CS-активностью, коэффициентами активности ETC и экспрессией мРНК митохондриальных транскрипционных факторов. YLF, молодые крысы кормили диету с низким содержанием жиров, YHF, молодые крысы кормили диету с высоким содержанием жиров, OLF, старые крысы получали диету с низким содержанием жиров, OHF, старые крысы получали диету с высоким содержанием жиров, HAD, 3-гидроксиацил- CoA-дегидрогеназа, CS, цитрат-синтаза, TFAM, митохондриальный транскрипционный фактор A, PGC1α, PPAR гамма-коактиватор 1-альфа, NRF1 и 2α, ядерные респираторные факторы 1 и 2 альфа.

Содержание триглицеридов, диацил-глицерина и церамида в передней мышце тибиалиса у молодых и старых крыс, получавших диету с низким содержанием жиров или с высоким содержанием жиров в течение 10 недель. Концентрации триглицеридов (А), диацилглицерина (В) и церамида (С) в передней мышце тибиалиса анализировали с помощью газожидкостной хроматографии после полной экстракции липидов. Концентрации церамида, диацилглицерина (ДАГ) и триглицеридов (ТГ) выражаются в виде нмоль / мг белков. Значения ± SEM для пяти животных на группу. * Р <0,05 возрастной эффект (та же диета), $ P <0,05 диетический эффект (в том же возрасте). LFD, диета с низким содержанием жиров; HFD, диета с высоким содержанием жиров.

Гистологический анализ брюшной жировой ткани показал увеличение накопления иммунных клеток у старых крыс не только у крыс DIO, но и у контрольных животных (рис. 3A). Это наблюдение подтвердилось при анализе уровней транскрипции трех основных воспалительных промежуточных продуктов жировой ткани, то есть выражений гена TNFα, IL1β и MCP1 (рис.3D-F). Морфологические изменения в жировой ткани также характеризовались меньшим диаметром клеток и увеличением фиброза у старых крыс с высоким содержанием жира (рис.3B, C). Дефект в адипогенезе у старых крыс DIO подтвержден снижением экспрессии ключевых генов адипогенных ферментов, то есть ацетил-СоА-карбоксилазы (АКК), и факторов транскрипции, участвующих в регуляции адипогенеза, то есть PPARgamma и SREBP1c (фиг.3G ,ЗДРАВСТВУЙ).

Гистологический анализ макрофагов CD68 + и окрашивание внеклеточного матрикса, диаметры адипоцитов и уровни транскрипции маркеров воспаления и адипогенеза в брюшной жировой ткани молодых и старых крыс, получавших диету с низким содержанием жиров или с высоким содержанием жиров в течение 10 недель. Иммуногистохимическое обнаружение CD68 + макрофагов (А) проводили с использованием метода авидин-биотин пероксидазы. Слайды брюшной жировой ткани окрашивались пикросириусом красного цвета для обнаружения участков фиброза (B). Диаметры адипоцитов измеряли с помощью программного обеспечения perfectimage (Claravision, France) (C). уровни транскрипции мРНК TNFα, IL1β MCP1, PPARgamma, SREBP1c и ацетил-CoA-карбоксилазы (ACC) в брюшной жировой ткани измеряли в режиме реального времени Q-PCR (D-> I). Данные выражаются как отношение экспрессии гена к экспрессии гена GAPDH. Значения ± SEM для восьми животных на группу. * Р <0,05 возрастной эффект (та же диета), $ P <0,05 диетический эффект (в том же возрасте). LFD, диета с низким содержанием жиров; HFD, диета с высоким содержанием жиров.

Скорость синтеза мышечных тотальных и митохондриальных белков и миозина и актина, двух основных сократительных белков, резко снизилась у старых крыс DIO, то есть на ~ 18-23%, по сравнению с контрольными старыми крысами (рис. 4A-D). У молодых крыс не было различий в скорости синтеза мышечных белков, за исключением синтеза миозина, что было значительно увеличено у тучных молодых крыс (+ 30%). Физиологически увеличение синтеза мышечного белка после кормления представляет собой компонент отмеченного постпрандиального анаболизма, который приводит к росту и обновлению ткани. Здесь мы наблюдали более низкую чувствительность синтеза мышечного белка к состоянию питания у старых крыс DIO (рис. 4F).

Скорость синтеза белка и активация внутриклеточных путей, связанных с регуляцией трансляционного инициирования в передней мышце тибиалиса молодых и старых крыс, питали диету с низким содержанием жиров или с высоким содержанием жиров в течение 10 недель. Были выделены общий мышечный белок (A) и фракции мускульных белков, то есть миозин (B), актин (C) и митохондриальные белки (D), а скорость синтеза белка была рассчитана как отношение изотопного обогащения в белков к обогащению пула предшественников свободных аминокислот. Скорости синтеза белка в передней мышце тибиалиса выражены как% / d. Активация специфических внутриклеточных путей, регулирующих трансляционное инициирование в передней мышце тибиалиса, оценивалась у старых крыс путем измерения состояния фосфорилирования ключевых промежуточных продуктов (E). Соотношение фосфорилированного белка и общего содержания белка измеряли вестерн-блоттингом. Скорость синтеза мышц также измерялась после приема пищи у старых крыс (F). Скорости синтеза постпрандиального белка в передней мышце тибиалиса выражены как% изменения по сравнению с позаборсортивными значениями. Значения ± SEM для восьми животных на группу. * Р <0,05 возрастной эффект (та же диета), $ P <0,05 диетический эффект (в том же возрасте). LFD, диета с низким содержанием жиров; HFD, диета с высоким содержанием жиров.

Воздействие факторов роста мышц на рост или стресс может изменить инициацию трансляции белка через mTOR и его нисходящие пути S6k и 4E-BP1, eIF2B и eIF2α (Kennedy & Kaeberlein, 2009; Kapahi et al., 2010; Kaeberlein & Kennedy, 2011).

Общие уровни экспрессии белка и уровни фосфорилирования были сходными между молодыми контрольными и молодыми крысами, страдающими ожирением (данные не показаны). В старой группе фосфорилирование mTOR, S6k, 4E-BP1 и eIF2B не влияло на DIO. Тем не менее, уровень фосфорилирования белка eIF2α был значительно увеличен у старых крыс при DIO, на 32% увеличение отношения фосфорилированного eIF2α к общему eIF2α было обнаружено у старых крыс HF (фиг.4E). Достаточно 20-30% фосфорилирования eIF2α достаточно для секвестрации eIF2B в неактивном комплексе, так что рециркуляция eIF2 в значительной степени ингибируется (Kimball et al., 2002; Kapahi et al., 2010).

Как и в предыдущих докладах (Chavez et al., 2003), миотубы, обработанные пальмитатом, генерировали большое количество реакционноспособных липидов, в 1,9-7 раз больше базальных уровней для внутриклеточных TG, DAG и церамидных концентраций (рис.5). Концентрация пальмитата, используемая в этом исследовании, сопоставима с найденной физиологически и аналогична концентрации, используемой в более ранних исследованиях, оценивающих эффекты FFA как в увековеченных мышечных клетках (Schmitz-Peiffer et al., 1999; Storz et al., 1999; Chavez et. al., 2003) и изолированные полосы скелетных мышц (Thompson et al., 2000). Профилактика митобутов C2C12 фуманизином B1 (FB1), грибковым токсином, который ингибирует церамидсинтазу, полностью предотвращает индуцированное пальмитатом повышение уровня церамида, но не влияло на накопление TG и DAG (рис.5).

Триглицерид, диацил-глицерин и содержание церамида в митобумах C2C12, инкубированных в присутствии или в отсутствие жирных кислот и ингибитора синтеза церамида. Митобуты C2C12 инкубировали в присутствии или в отсутствие пальмитата (0,375 мм), олеата (0,375 мм) или фумонизина В1 (FB1, 50 мкм) в течение 16 ч перед экстракцией липидов. Концентрации триглицеридов (А), диацилглицерина (В) и церамида (С) анализировали газожидкостной хроматографией. Концентрация церамида, диацилглицерина и триглицеридов выражается в виде нмоль / мг белков. Данные взяты из шести независимых экспериментов. Значения ± SEM. * P <0,05 против контрольных клеток, $ P <0,05 против клеток, обработанных пальмитатом.

30% -ное снижение скорости синтеза белка наблюдалось после инкубации дифференцированных миотубов с пальмитатом (рис. 6А). Напротив, после обработки олеатом, митоциты C2C12 генерируют количество белков, эквивалентное количествам из классически культивируемых контрольных клеток. Как и ожидалось, блокирование метаболизма церамида при одновременном добавлении пальмитата полностью предотвращало индуцирование пальмитатом ингибирования синтеза белка в миотубах. Наконец, использование короткоцепочечных церамидов повторило эффекты пальмитата на ингибирование синтеза белка в дифференцированных мышечных клетках (рис. 6A).

Скорость синтеза белка и активация внутриклеточных путей, связанных с регуляцией трансляционного инициирования в митобуках C2C12, инкубированных в присутствии или отсутствии жирных кислот и фармакологических медиаторов содержания внутриклеточного церамида. Миотубы C2C12 инкубировали в присутствии или в отсутствие пальмитата (0,375 мм), олеата (0,375 мм) и фумонизина В1 (FB1, 50 мкм) в течение 16 ч или С2-церамида (100 мкм) в течение 30 мин до стимуляции инсулина (100 нм). Белки выделяли, и скорость синтеза белка (А) определяли, как на фиг.4. Скорости синтеза белка в миоцитах C2C12 выражены как% / ч. Данные взяты из шести независимых экспериментов. Активацию специфических внутриклеточных путей, регулирующих трансляционное инициирование, оценивали путем измерения состояния фосфорилирования ключевых промежуточных продуктов (B, C). Соотношение фосфорилированного белка и общего содержания белка измеряли вестерн-блоттингом. Импликация eIF2α в регуляции трансляции белка в митоцитах C2C12, обработанных жирными кислотами, была подтверждена измерением экспрессии мРНК гена CHOP (D), одной из целей eIF2α. Все данные взяты из шести независимых экспериментов. Значения ± SEM. * P <0,05 против контрольных клеток, $ P <0,05 против клетки, обработанной пальмитатом, и #P <0,05 против клеток, обработанных пальмитатом и FB1.

Как сообщалось в другом месте (Merrill, 2002; Chavez et al., 2003), пальмитат заметно ингибировал стимуляцию инсулина фосфорилирования Akt (рис. 6B). Напротив, ни предварительная обработка олеатом, ни FB1 не имела никакого эффекта. Следует отметить, что тот же эффект, который мы отметили с пальмитатом, наблюдался, когда церамид был непосредственно использован для лечения миоцитов C2C12. Таким образом, увеличение уровня эндогенных церамидов с помощью альтернативного механизма рекапилировало ингибирующее действие пальмитата на состояние фосфорилирования Акта.

В соответствии с нашими данными in vivo снижение синтеза белка, наблюдаемое в миоцитах C2C12 после инкубации пальмитатов, не было связано с какой-либо разницей в состоянии фосфорилирования mTOR и его субстратов S6K и 4E-BP1 по сравнению с контрольными значениями (данные не показаны) , Состояние фосфорилирования eIF2B также сохранялось в клетках C2C12 во всех условиях (данные не показаны). Напротив, следует отметить, что пальмитат, по-видимому, повышал уровень фосфорилирования eIF2 в миотауках, т. Е. EIF2α был сильно фосфорилирован в миотаумах после лечения пальмитатом (рис. 6C). Наблюдалось значительное защитное действие олеата на фосфорилирование eIF2 в сравнении с обработкой пальмитатом или контрольными клетками (фиг.6C). Обработка FB1 значительно притупила эффект пальмитата на фосфорилирование eIF2 (рис. 6C). В дополнение к его репрессивному действию инициации трансляции белка нижестоящий эффект eIF2α является индукцией генов, таких как гомологичный белок CHOP (CCAAT / энхансер-связывающий белок (C / EBP)) (Salminen & Kaarniranta, 2010). Интересно отметить, что в настоящей работе эволюция экспрессии гена CHOP после лечения FFA полностью соответствовала изменениям фосфорилирования eIF2 в митобумах C2C12 (фиг.6D).

Ожирение было предложено как фактор риска при саркопении. Однако основная патогенная концепция саркопенного ожирения в основном основана на фенотипических данных клинического наблюдения (Bollheimer et al., 2012). В настоящем исследовании описывается модель животных-грызунов, которая открывает перспективы для проведения трансляционных исследований саркопенного ожирения в экспериментальной обстановке. Наши наблюдения подтверждают дефектную пластичность жировых тканей с возрастом, как показано более низким диаметром адипоцитов у старых крыс DIO. Эти данные свидетельствуют о снижении с возрастом в расширяемости и сохраняемости жировой ткани при положительном энергетическом балансе. Соответственно, преадипоциты, выделенные из старых животных, накапливают липиды менее широко, чем клетки от молодых животных, даже после недель в культуре в идентичных условиях (Djian et al., 1983; Kirkland et al., 1990). В настоящем исследовании генная экспрессия различных адипогенных ферментов, а именно ацетил-СоА-карбоксилазы (АКК), и транскрипционных факторов, участвующих в регуляции адипогенеза, то есть PPARgamma и SREBP1c, были уменьшены в брюшной жировой ткани старых крыс DIO. Kirkland et al. предположили, что избыточное преадипоцитирование со старением вызывает клеточное старение, что приводит к нарушению адипогенеза, неспособности секвестрировать липотоксические жирные кислоты и воспалительному образованию цитокинов и хемокинов (Tchkonia et al., 2010). В качестве воспаления, например, изолята TNF, является антиадипогенным (Karagiannides et al., 2001, 2006; Kirkland et al., 2002), мы предположили, что снижение адипогенеза со старением может приводить, по крайней мере частично, к воздействию DIO на Провоспалительное производство цитокинов в жировых тканях старых крыс. В настоящей работе повышенное воспаление животной жировой ткани у старых животных ДИО было связано с большим количеством макрофагов, вероятно, из-за увеличения экспрессии MCP1. Кроме того, ранее сообщалось, что в условиях культивирования, при которых макрофаги отсутствовали, преадипоциты у старых животных продуцировали достаточное количество TNFα для ингибирования их собственного адипогенеза, что видно из экспериментов siRNA от TNF (Tchkonia et al., 2010). В сочетании с большим количеством макрофагов и провоспалительных цитокинов жировая ткань с потенциально высокой концентрацией цитотоксических FFA может быть особенно суровой средой. Эта среда может повредить преадипоциты и увеличить производство компонентов внеклеточного матрикса, что приводит к ускоренному фиброзу жировой ткани (Keophiphath et al., 2009; Divoux & Clement, 2011), как это наблюдается здесь. Было продемонстрировано, что совместная культура макрофагов с адипоцитами заставляла макрофаги принимать более альтернативно активированный (М2) фенотип, который, как ожидается, будет способствовать развитию фиброза (Spencer et al., 2010). Поэтому во время старения диспропорциональное накопление компонентов внеклеточного матрикса из-за высокого воспаления и отсутствия ремоделирования внеклеточного матрикса жировой ткани может способствовать неспособности к увеличению массы жировой ткани во время состояний избыточного потребления калорий.

Из-за этого эффекта и последующего отказа от адекватного приема и буферизации циркулирующих FFAs концентрация FFA в плазме повышалась у старых крыс DIO, что приводило к перераспределению липидов и накоплению эктопических липидов в бедных тканях. Предыдущие данные показали накопление жировых складов в скелетных мышцах у пожилых пациентов, что привело к метаболической дисфункции через липотоксичность и резистентность к инсулину (Petersen et al., 2003; Zoico et al., 2010). Как и у людей, у старых контрольных крыс наблюдалось перераспределение жиров, с повышенной реактивной инфильтрацией липидов в скелетных мышцах. Интересно, что накопление мышечного жира было сильно усилено у старых крыс DIO. У этих крыс жирные кислоты были частично секвестрированы как менее реакционноспособные TG в мышцах, защищая их от их липотоксичности. Однако большая доля была превращена в керамиды. Известно, что это последующее накопление липидов в скелетных мышцах связано с несколькими вредными последствиями для здоровья, такими как резистентность к инсулину (Consitt et al., 2009). Аналогично, резистентность к инсулину наблюдалась у старых крыс DIO и была связана с накоплением эктопического жира. Системная дисрегуляция гомеостаза глюкозы была связана со сниженной способностью регулировать мышечный инсулиновый путь, то есть низкое состояние фосфорилирования Akt, у старых крыс, которым кормили диету с высоким содержанием жиров. Поскольку скелетные мышцы в основном ответственны за инсулин-стимулированное поглощение глюкозы (DeFronzo et al., 1985), увеличенный внутримышечный жир может отвечать за снижение толерантности к глюкозе, о котором сообщалось в настоящей работе, как показано ранее (Pan et al., 1997) , Несколько предыдущих исследований, в которых использовались разные модели животных, указывают на то, что хроническое воздействие диеты с высоким содержанием жиров вызывает сильную резистентность к инсулину за счет увеличения инфильтрации жира внутри мышечной ткани (Blachnio-Zabielska et al., 2010; De Vogel-van den Bosch et al., 2010; Ritchie et al., 2011). Поскольку синтез церамида стимулируется цитокинами, полученными из адипоцитов, включая TNFα, системное и тканевое провоспалительное состояние, связанное с DIO, может способствовать инфильтрации липидов мышц у старых крыс.

Были предложены различные внутриклеточные механизмы для объяснения эффекта, индуцированного церамидом, на резистентность к инсулину в скелетных мышцах. В настоящем исследовании пальмитат увеличивал содержание церамида, ингибируя фосфорилирование Akt, стимулируемое инсулином в миоцитах C2C12. Интересно отметить, что ингибирование синтеза de novo ceramide отменяет восстановление фосфорилирования Akt в миотубах после предварительной обработки пальмитатом, а использование короткоцепочечных церамидов рекапилирует эффекты этой жирной кислоты. Таким образом, как показано в модели митобутов C2C12, накопление церамидов в мышечной ткани было, вероятно, одной из прямых причин, влияющих на чувствительность к инсулину у старых крыс DIO.

Известно также, что диета с высоким содержанием жиров и накопление FA в мышечной ткани вызывают митохондриальные изменения (Bonnard et al., 2008; Lambertucci et al., 2008). В этом исследовании мы показали, что активность HAD, ключевого фермента для митохондриального β-окисления, зависит от возраста. Это наблюдение свидетельствует о недостатке способности окислять жирные кислоты и, вероятно, является одним из механизмов, способствующих накоплению жирных кислот в скелетной мышце у старых крыс DIO. Аналогичным образом, диета с высоким содержанием жиров приводила к уменьшению как активности I и IV активности дыхательной цепи, так и уровня мРНК PGC1α у старых крыс. PGC1α регулирует митохондриальный энергетический метаболизм и биогенез и влияет на использование углеводов и липидов путем активации членов семейства ядерных рецепторов (Anderson et al., 2008a). Старые мыши, сверхэкспрессирующие PGC1α в скелетной мышце, были защищены от снижения функции митохондрий и не развивали возрастной резистентности к инсулину (Wenz et al., 2009). Интересно, что повышенная экспрессия мышц PGC1α не только предотвращает возрастной рост веса и накопление ТГ организма, но также оказывает значительное положительное влияние на возрастные мышечные потери у мышей. Таким образом, поддержание содержания липидов мышц, предотвращая снижение функции митохондрий, улучшало действие инсулина и сохраняло мышечную массу во время старения (Wenz et al., 2009). Интересно, что мы ранее сообщали, что ограничение калорий у старых крыс связано с улучшенной способностью окислять липиды в скелетной мышце, то есть повышать митохондриальную окислительную активность, а также значительно увеличивать скорость синтеза мышечного белка в мышечной массе и в мышечной силе (Zangarelli et al., 2006; Walrand et al., 2011).

В этом отчете мы демонстрируем, что предоставление проницаемого для клеток церамида для митоцитов C2C12 приводит к значительному ингибированию скорости синтеза клеточного белка. Этот эффект был имитирован пальмитатом, физиологическим субстратом для синтеза de novo ceramide. Кроме того, фармакологическое вмешательство для уменьшения производства церамида привело к восстановлению скорости синтеза белка после лечения пальмитатом в миоцитах C2C12. Результаты, описанные здесь, указывают на керамид как новый регулятор синтеза белка в клетках C2C12. Скорость синтеза белка регулируется рядом клеточных контролей, включая сигнализацию по каналам mTOR и eIF2 (Kennedy & Kaeberlein, 2009; Kapahi et al., 2010; Kaeberlein & Kennedy, 2011). В отличие от наблюдений in vitro (Deldicque et al., 2010), но в соответствии с данными in vivo (Khamzina et al., 2005) активность mTOR-пути, при котором наличие инсулина и аминокислоты оказывает положительное влияние, в настоящем исследовании не было затронуто. Тем не менее, церамид уменьшал как синтез белка, так и передачу сигналов по пути eIF2α, то есть повышенному состоянию фосфорилирования eIF2, в митобутах C2C12. Более интересно то же ингибирование скорости синтеза мышечного белка вместе с улучшенным состоянием фосфорилирования eIF2 наблюдалось у старых крыс DIO. Поэтому мы заявляем о причинной связи между накоплением церамидов мутаций, гиперфосфорилированием eIF2 и сниженной скоростью синтеза мышечного белка, вызванной высоким содержанием жиров у старых крыс. eIF2α фосфорилируется в ответ на экологические стрессы, чтобы облегчить повреждение клеток. Хорошо известно, что фосфорилирование α-субъединицы eIF2 снижает глобальный перенос, позволяя клеткам экономить ресурсы и инициировать реконфигурацию экспрессии генов для эффективного управления стрессовыми условиями (Wek et al., 2006). Сопровождая этот общий контроль синтеза белка, фосфорилирование eIF2 стимулирует трансляцию выбранных мРНК, таких как кодирующие факторы транскрипции, например CHOP, которые помогают регулировать гены, участвующие в метаболизме. Интересно, что здесь был увеличен уровень транскрипции гена CHOP, что привело к дополнительным доказательствам участия этого конкретного пути в действии церамида в отношении скорости синтеза клеточного белка у старых крыс DIO.

В нескольких исследованиях (Anderson et al., 2008b; Sitnick et al., 2009) было показано, что постпрандиальная активация синтеза мышечных белков и гипертрофия скелетных мышц, индуцированных нагрузкой, нарушаются у животных с высоким содержанием жира. Настоящее исследование демонстрирует, что синтез мышечного белка становится менее чувствительным к питательному состоянию у старых крыс с высоким содержанием жиров. Взятые вместе, эти предыдущие данные и настоящее исследование подчеркивают, что DIO у грызунов, по-видимому, изменяет нормальную динамику белка в анаболических условиях, то есть потребление пищи и нагрузку на мышцы, а также во время старения. Как показано здесь, этот эффект, по-видимому, объясняется уменьшением активации пути Akt, вероятно связанного с инфильтрацией липидов мышц. Как следствие, диета с высоким содержанием жиров может ускорить эффект старения на мышечную массу и функцию, а также препятствовать выздоровлению от травм.

Наше исследование имеет определенные ограничения. Во-первых, данные для иммуногистохимии являются лишь описательными. Было бы интересно провести количественную оценку гистологических наблюдений путем измерения количества активированных макрофагов и оптической плотности областей, положительных для фиброза. Тем не менее, участки жировой ткани, наблюдаемые в этом исследовании, воспроизводимы с систематическим увеличением инфильтрации макрофагов и областей фиброза у старых крыс, которым кормили диету с высоким содержанием жиров. Во-вторых, несколько факторов окружающей среды могут различаться между молодыми и старыми крысами и нормальной диетой и диетами с высоким содержанием жиров, такими как уровень физической активности. Физическая активность может, вероятно, отличаться между молодыми и старыми животными, а также между ДИО и контрольными группами из-за более тяжелой массы тела животных ДИО. Индивидуальная физическая активность животных должна учитываться в дальнейших исследованиях как возможный основатель (Bollheimer et al., 2012). В-третьих, было бы информативным оценивать потенциальную заинтересованность стратегий питания, способных противодействовать мышечной липотоксичности у старых крыс DIO, например краткосрочных калорийных ограничений, для поддержания или улучшения анаболизма мышечного белка. В-четвертых, это исследование является исследовательским исследованием, проведенным у грызунов. Небольшое доказательство в литературе показывает, что те же самые явления происходят у более старых людей и объясняют появление саркопенного ожирения. Клинические исследования необходимы для оценки потенциального участия адипогенной способности и мышечной липотоксичности в патогенезе саркопенного ожирения у людей.

В заключение, как и люди, крысы демонстрируют отложение эктопического жира при старении, особенно при использовании модели DIO. Поэтому старая высококалорийная крыса оказалась пригодной для экспериментального исследования саркопенного ожирения и обеспечивала явные патогенные точки соединения. Сниженная способность жировой ткани хранить липиды способствует накоплению внутримышечных липидов, которые наносят липидную нагрузку на митохондрии и могут создавать разрыв между метаболическими и регулирующими путями в скелетных мышцах старых крыс. Хотя точная связь между митохондриальной активностью и резистентностью к инсулину все еще обсуждается, наши данные показывают, что увеличение накопления побочных продуктов липидного обмена связано с нарушением действия инсулина в обработанных пальмитатом C2C12-миотубами, а у старых крыс — с высоким содержанием жиров. Кроме того, в настоящем исследовании показано, что внутримышечное отложение липидов у старых крыс DIO вместе с опосредованным пальмитатом липидным накоплением в клетках C2C12 влияет на скорость синтеза белка посредством фосфорилирования eIF2. Использование фармакологических ингибиторов производства церамидов или использование церамида подтверждает эти эффекты, показывая, что вредное действие реактивных липидов на синтез мышечного белка во время старения, вероятно, обусловлено накоплением церамидов внутри мышечных клеток. Следовательно, снижение способности жировой ткани реагировать на DIO с возрастом может отрицательно повлиять на метаболизм белков в скелетных мышцах из-за токсичности видов липидов и тем самым ускорить последствия старения, то есть саркопения. Этот процесс может способствовать снижению мышечной функции, наблюдаемой у пациентов с саркопенным ожирением.

Средства и протокол для животных были одобрены местным комитетом по этике животных. Самцы крыс Wistar в возрасте 5 месяцев (молодые) и 25 месяцев (старые) были приобретены у Джанвье (Le Genest St Isle, Франция).

После 1-недельной акклиматизации со стандартной диетой крысы были случайным образом разделены на четыре группы следующим образом: молодые крысы получали стандартную диету (YC, n = 8), молодые крысы получали высокоэнергичную диету с высоким содержанием жиров (YHF, n = 8), старые крысы получали стандартную диету (OC, n = 8), а старые крысы получали высокоэнергичную диету с высоким содержанием жиров (OHF, n = 8). Дополнительные крысы использовали для изучения постпрандиального эффекта диеты с высоким содержанием жиров на скорости синтеза мышечного белка. Экспериментальная диетическая композиция представлена ​​в виде таблицы S1 (вспомогательная информация). В конце 10 недель диеты крыс анестезировали и убивали путем прокалывания сердца. Мышцы (подошва, передне, передняя, ​​посадочная, гастронемия, экстензор digitorum longus, quadriceps) и жировые ткани удаляли, взвешивали и замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до анализа.

Дифференцированные миотубы C2C12 культивировали в течение 16 ч с пальмитиновой кислотой (0,375 мм) и олеиновой кислотой (0,375 мм) в присутствии или в отсутствие фумонизина B1 (FB1), специфического ингибитора церамидсинтазы. Для изучения специфического эффекта церамидов миотубы инкубировали в присутствии короткоцепочечных церамидов (C2-ceramides, 100 мкм, 30 мин). Аликвоты клеточных лизатов были сохранены для выделения содержания белка в каждом образце. Скорость синтеза белка оценивали, как описано ниже.

Для выделения общей белковой фракции, миозина, актина и митохондриальных белков, как было описано ранее, использовали 50-миллилитровый кусок передних или белков клеток Cibcillis или Z2C12 (Zangarelli et al., 2004, 2006). Изотопное обогащение белками измеряли с помощью газовой хроматографии — масс-спектрометрии с соотношением горения и изотопа (μGas System, Fisons Instruments, VG Isotech, Middlewich, UK). Изотопные обогащения в тканевой жидкости оценивали с использованием газовой хроматографии-масс-спектрометрии (Hewlett-Packard 5971A, Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA, USA) и использовались в качестве обогащения пула прекурсоров для расчетов скоростей фракционного синтеза (FSR) ,

FSR белков рассчитывали с использованием уравнения: где Ei представляет собой обогащение как процентное содержание азота в процентах от белков в момент времени t (минус основное обогащение), Ep — среднее обогащение в пуле предшественников (тканевая жидкость), а t — включение время в часах. Данные выражаются в% / день для экспериментов in vivo и в% / час для экспериментов in vitro.

Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT) проводился за 2 недели до убоя и через 12 ч после отмены пищи. В перитонеальную полость вводили раствор глюкозы (1 г глюкозы / кг массы тела). Образцы крови собирали перед введением глюкозы и через 15, 30, 60 и 120 минут. Концентрацию глюкозы в крови измеряли с использованием глюкометра (коэффициент вариации анализа: 5%, OneTouch Glucotouch, LifeScan, Milpitas, CA, USA). Уровни инсулина в сыворотке измеряли с помощью набора Elisa (CV: 2%, инсулина крысы / мышей Elisa, Linco Research, St. Charles, MO, USA). Чувствительность к инсулину оценивали по продукту области под кривой (AUC) глюкозы и AUC инсулина.

На автоматическом анализаторе (Konelab 20, Thermo Electron, Waltham, MA) были измерены концентрации общего холестерина в плазме натощак (CV: 3%), триглицериды (CV: 4%) и FFA (CV: 4%). На основе плазменных концентраций sTNF-R1 (CV: 5%), sTNF-R2 (CV: 4%), лептина (CV: 5%) и адипонектина (CV: 5%) измеряли с помощью иммуноферментного анализа с использованием фермента (ELISA , BioCat, Гейдельберг, Германия).

Денатурированные белки (50 мкг) из передних или передних или двуокиси цианида разделяли SDS-PAGE на 10% или 4-12% градиентном полиакриламидном геле и переносили на поливинилиденную мембрану (Millipore). Иммуноблоты были исследованы с помощью первичных антител: антифосфопротеинкиназа B (Akt, Ser473), антитотальный Akt, antiphospho mTOR (Ser2448), антитотальный mTOR, антифосфо-S6 киназа (S6k, Thr389) и антитотальный S6k, антифосфоэуариотный фактор инициации 4-связывающий белок 1 (4E-BP1, Ser65), антитотальный 4E-BP1, фактор инициации антифосфоэуарикоза 2-α (eIF2-, Ser51), антитотальный eIF2-α, антифосфоэуариотный фактор инициации 2b-ε (eIF2b-ε Ser9) и антитотальный eIF2b -ε. Все антитела были приобретены у Cell Signaling Technology (дистрибьютор Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, Франция), за исключением антифосфо-eIF2b-ε (Genetex, дистрибьютор Emmedex, Mundolsheim, Франция). Иммуноблоты инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена (DAKO, Trappes, France). Иммуно-реактивные полосы визуализировали с помощью хемолюминесценции (ECL Western Blotting Substrate, Pierce, USA). Люминесцентную визуализацию вторичных антител проводили с использованием светлой пленки Biomax (Kodak Scientific, New Haven, CT, USA). Активационные состояния оценивали по соотношению фосфорилированного белка и общей экспрессии белка.

Суммарную РНК экстрагировали из 50 мг передней части талии, брюшной жировой ткани или лизата клеток C1C12 с 1 мл TRIzol (TRIzol® Reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). ДНК-зонды получали с использованием комплекта H-РНКазы SuperScript II (Invitrogen). Относительные уровни РНК определяли путем анализа изменений флуоресценции зеленого I SYBR (Kit Fast Start DNA Master SYBR Green I, Roche, Rotkreuz, Switzerland) во время ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Экспрессию генов GAPDH, HPRT и Cyp A усиливали, и результаты были использованы для нормализации экспрессии генов в жировой ткани, скелетных мышцах и митозах C2C12 соответственно.

Липиды экстрагировали из клеточного лизата тилиейса или клеточного лизата C2C12 в соответствии с Блай и Дайер (Bligh & Dyer, 1959) в присутствии внутренних стандартов. Липиды анализировали газожидкостной хроматографией на системе FOCUS Thermo Electron с использованием капиллярной колонны из плавленой кварцевой трубки Zebron-1 Phenomenex (толщина пленки 5 мкм × 0,32 мм, толщиной 0,50 мкм).

Иммуногистохимическое обнаружение макрофагов с использованием CD68 (Neomarker Microm, Francheville, France) проводили с использованием метода авидин-биотин пероксидазы (ABC). Обработанные изображения слайдов были получены системой микроскопов с увеличением × 40 (Nikon, Франция).

Слайды брюшной жировой ткани также окрашивались пикрозириусом красного цвета. Анализ фиброза проводили с использованием платформы Alphalys (программное обеспечение histolab, Plaisir, France) с увеличением × 100 с постоянными цветовыми порогами.

Образцы адипозной ткани фиксировали в течение ночи при 4 ° С в 4% параформальдегиде и обрабатывали для стандартного введения парафинов. Разделы толщиной 5 мкм окрашивали, как описано ниже, и исследовали под микроскопом Zeiss 20 Axiostar Plus (Zeiss, Германия). Цифровые изображения были захвачены камерой (triCCD, Sony, Франция). Диаметры адипоцитов измеряли с помощью программного обеспечения perfectimage (Claravision, France).

Проанализированы два раздела на образец. Две секции были разнесены на 25 микрометров, то есть на пять секций. Наблюдение было сделано слепо двумя независимыми наблюдателями.

Цитрат-синтазу (CS), 3-гидроксиацил-CoA-дегидрогеназу (HAD) и активность комплексов I-IV анализировали спектрофотометрически в митохондриальной суспензии с передней стороны тибиалиса (Zangarelli et al., 2004, 2006). Все меры выполнялись в трех экземплярах. Активность ферментов экспрессировали в митохондриальных белках nmol min-1 мг-1 или в отношении активности (Zangarelli et al., 2004, 2006).

Обилие отобранных мРНК в мышечных митохондриях измеряли с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, как описано выше.

Все данные представлены как средство ± SEM. Был проведен двухсторонний анализ дисперсии (ANOVA) для проверки влияния экспериментальных условий питания и влияния возраста. Когда был обнаружен значительный эффект, был применен апостериорный тест Фишера для определения локальных различий между группами. Данные обычно распределялись. Для статистического анализа использовалось программное обеспечение statview (версия 4.02, Abacus Concepts, Berkeley, CA, USA). Значения P <0,05 считались значимыми.

Николас Тардиф и Джером Саллес участвовали в определении дизайна исследования и анализе образцов. Christelle Guillet помогла в разработке исследования. Джоан Торджман проанализировала маркеры воспаления и фиброза в жировых тканях. Софи Реджио проанализировала маркеры воспаления и фиброза в жировых тканях. Jean-François Landrier проанализировал экспрессию генов в жировой ткани. Кристоф Жироде и Вероник Патрак участвовали в анализах. Жюстин Бертран-Мишель проанализировал содержание липидов в скелетных мышцах и клетках C2C12. Кэрол Миньэ выполнила масс-спектрометрический анализ. Жан-Мишель Шардиньи участвовал в определении дизайна исследования. Ив Бойри участвовал в определении дизайна исследования. Стефан Уолранд разработал исследование и принял участие в анализе образцов и данных и подготовил проект.

Это исследование финансировалось Национальным исследовательским агентством Франции (ANR, LIPAGE Project).

Конфликт интересов не связан с этим исследованием.

Дополнительную вспомогательную информацию можно найти в онлайн-версии этой статьи на веб-сайте издателя.

Таблица S1. Состав диеты.

Таблица S2. Грунтовые последовательности для количественного анализа экспрессии генов.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *