Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Гиалуронан накапливается с высоким содержанием жиров и способствует резистентности к инсулину

Hyaluronan Accumulates With High-Fat Feeding and Contributes to Insulin Resistance
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3661617/

Увеличение осаждения компонентов внеклеточного матрикса (ECM) является характерным для инсулинорезистентной скелетной мышцы. Гиалуронан (HA) является основной составной частью ECM. Гипотезы о том, что 1) содержание HA увеличивается в ECM инсулинорезистентной скелетной мускулатуры и 2) снижение HA в мышечном ECM с помощью долгоживущей пегилированной рекомбинантной гиалуронидазы PH20 человека (PEGPH20), изменяет диету с высоким содержанием жиров (HF) мышечная резистентность к инсулину. Мы показываем, что мышечная HA была увеличена у мышей с ожирением на основе HF (DIO), и что лечение PEGPH20, которое дозозависимо уменьшало HA в мышечном ECM, уменьшало жировую массу, размер адипоцитов и резистентность к печеночной и мышечной инсулину у мышей DIO при 10 мг / кг. Сниженная мышечная резистентность к инсулину была связана с увеличением передачи сигналов инсулина, мышечной васкуляризацией и процентом сердечного выброса в мышцы, а не сенсибилизацией инсулина мышцы как таковой. Исследования дозозависимости показали, что PEGPH20 дозозависимо повышает чувствительность к инсулину у мышей DIO с минимально эффективной дозой 0,01 мг / кг. PEGPH20 в дозах 0,1 и 1 мг / кг уменьшали мышечную HA до уровней, наблюдаемых у мышей, получавших чау, уменьшали жировую массу и увеличивали поглощение глюкозы в мышцах. Эти данные свидетельствуют о том, что ECM HA является мишенью для лечения резистентности к инсулину.

Внеклеточная матрица (ECM) важна для клеточных функций (1,2). Увеличение удельных компонентов, которые составляют матрицу и основную мембрану, характерно для метаболических нарушений, включая резистентность к инсулину, ожирение и диабет (3-5). Collagens I, III и IV, наиболее распространенные структурные компоненты ECM (6), увеличиваются в резистентной к инсулину мышце (3,7). Коллаген VI, изоформа коллагена, обогащенный жировой тканью, увеличивается в жировой ткани тучных субъектов (4). Предыдущие исследования показывают, что гиалуронан (НА), анионный, несульфатированный гликозаминогликан увеличивается в поврежденной аорте инсулинорезистентных крыс (8) и островков поджелудочной железы у неевревых диабетических мышей (9). Увеличение HA также наблюдается в почках с диабетом (5,10). В совокупности повышенное осаждение ECM связано с нарушениями обмена веществ в различных тканях.

HA, как основной компонент ECM, имеет множество функций, включая создание пространства между ячейками и облегчение миграции клеток (11). HA синтезируется HA-синтазами и деградирует посредством гиалуронидаз. У людей существует шесть генов гиалуронидазы, выявленных до сих пор. Это HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, PH20 и HYALP1 (12). PH20 является единственной идентифицированной гиалуронидазой со значительной ферментативной активностью при нейтральном рН. Эта характеристика PH20 создала роль фермента для облегчения диспергирования фармацевтических агентов через междоузельное пространство (13). PH20 имеет короткий период полувыведения в сыворотке (<3 мин) (14), что делает его внутривенное применение нецелесообразным. Синтез пэгилированного варианта растворимой рекомбинантной гиалуронидазы PH20 человека (PEGPH20) продлевает период полувыведения фермента в течение> 10 ч (14-17).

Было показано, что увеличение уровня HA в сыворотке, аорте и почке связано с резистентностью к инсулину (5,8,18), роль HA в инсулинорезистентной скелетной мышце неизвестна. Гипотезы о том, что 1) содержание HA увеличивается в ECM инсулинорезистентной скелетной мускулатуры и 2) снижение HA в мышечном ECM методом PEGPH20, обращает внимание на резистентную к диете резистентность к инсулину мышц, были протестированы в настоящих исследованиях. В качестве модели резистентности к инсулину использовались мышам с высоким содержанием жиров (HF) с ожирением (DIO) (19), а гиперинсулинемико-эвгликемические зажимы (ICvs) в сочетании с изотопными методами (20) использовали для оценки действия инсулина в сознательном, без ограничений и без стресса. Результаты этого исследования впервые демонстрируют критическую роль НА в патогенезе резистентности к инсулину.

Самцам мышей C57BL / 6J кормили чау-чау или диету HF (DIO), которая содержала 60% калорий в виде жира в течение 16-20 недель. Комитет по уходу и использованию животных Vanderbilt одобрил все процедуры для животных.

Шестнадцатинедельным мышам, получавшим чау, получали внутривенную инъекцию PEGPH20 в дозе 10 мг / кг через хвостовую вену. Мыши имели свободный доступ к пище и воде на протяжении всего эксперимента и были убиты через 4-72 часа после болюса.

У восьмидесятинедельных мышей DIO была получена внутривенная инъекция носителя (10 ммоль / л гистидина, 130 ммоль / л NaCl при рН 6,5) или PEGPH20 при 10 мг / кг через хвостовую вену. Гиперинсулинемико-эвгликемический зажим (ICv) проводили через 3 дня после болюса.

Пятнадцатинедельные мыши DIO получали инъекции носителя или PEGPH20 в дозе 10 мг / кг внутривенно один раз каждые 3 дня в течение 24 дней (q3dx9). Вес тела и потребление пищи измерялись во время лечения. Расходы на энергию (ЭЭ) и физическую активность измеряли в течение 3 дней после первой инъекции. Состав тела мыши определяли с использованием ядерного магнитного резонанса. ICv проводили через 3 дня после последнего лечения.

Пятнадцатинедельные мыши DIO получали инъекции транспортного средства или PEGPH20 при 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мг / кг внутривенно (q3dx9). Масса тела, потребление пищи, ЭЭ и физическая активность измерялись, как описано выше. ICv проводили через 3 дня после последнего лечения.

Катетеры имплантировали в сонную артерию и яремную вену мышей для отбора проб и внутривенных инфузий за 5 дней до гиперинсулинемико-эвгликемического зажима (ICv) (20). ICv (4 мЕд / кг / мин) проводили на мышах с быстрым 5 ч (20). [3-3H] глюкозу вводили для определения потоков глюкозы (21). Кровь глюкозы была зажата при ~ 150 мг / дл с использованием переменной скорости инфузии глюкозы (GIR). Мыши получали промытые эритроциты от доноров для предотвращения падения гематокрита. ICv был достигнут путем оценки уровня глюкозы в крови каждые 10 мин с корректировкой GIR по мере необходимости. Кровь брали при 80-120 мин для определения [3-3H] глюкозы. Клеточный инсулин определяли при t = 100 и 120 мин. Через 120 мин зажим поддерживали и вводили 13 мл дизоксиглюкозы (14C) 2DG 13 мкСи [14С]. Кровь брали через 2-35 минут для определения [14C] 2DG. После последнего образца мышей анестезировали и ткани вырезали.

Плазменный инсулин и радиоактивность [3-3H] глюкозы, [14C] 2DG и [14C] 2DG-6-фосфат определяли, как описано ранее (22). Внешний вид глюкозы (Ra), эндогенный уровень глюкозы (EndoRa) и скорость исчезновения глюкозы (Rd) определялись с использованием уравнений нестационарного состояния (23). Показатель метаболизма глюкозы (Rg) рассчитывали, как описано ранее (24). Триглицерид печени измеряли с использованием набора триглицеридов GPO в ~ 100 мг замороженной печени.

Процент сердечного выброса в мышцы оценивали, как описано ранее (25). После конечного образца артериальной крови ICv в сонную артерию вводили 50 мкл микросфер 15 мкм. Затем Gastrocnemius вырезали. Микросферы выделяли и измеряли флуоресценцию, как описано ранее (25). Предполагается, что смешивание микросфер, если содержание микросферы в правой и левой почках находится в пределах 10%.

HA, коллаген IV (ColIV) и CD31 оценивали с помощью иммуногистохимии в парафиновых тканевых срезах с использованием следующих первичных антител: биотинилированного HA-связывающего белка, анти-ColIV или анти-CD31. Слайды слегка контрастировали с гематоксилином Майера. Система EnVision + HRP / DAB использовалась для получения видимого окрашивания. Изображения были сняты с помощью камеры Q-Imaging Micropublisher, установленной на вертикальном микроскопе Olympus. Immunostaining был определен количественно ImageJ Software.

Gastrocnemius гомогенизировали, как описано ранее (3). Белок (40 мкг) применяли к гелю SDS-PAGE. Фосфорилированный и общий Akt / PKB зондировали с использованием антител фосфо-Akt (Ser473) и Akt. Для иммунопреципитации 500 мкг белка инкубировали с 3 мкг антитела 1 рецептора инсулинового рецептора (IRS1) (26). Затем добавляли 20 мкл белка A / G PLUS-Агарозу и инкубировали. Смесь центрифугировали и супернатант удаляли. Бисер промывали четыре раза и повторяли центрифугирование. Бусины ресуспендировали и применяли к гелю SDS-PAGE. Иммуноблоты исследовали первичные антитела для фосфо-IRS1 (Tyr612) и субъединицы p85 фосфоинозитидной 3-киназы.

Пятнадцать недельных мышей DIO подвергали внутривенному лечению с помощью транспортного средства или PEGPH20 при 10 мг / кг в течение 24 дней (q3dx9). На 27-й день мышей анестезировали, а вырезали мышцы подошвы и экстензора digitorum longus (EDL). Поглощение глюкозы в изолированных мышцах измерялось по-прежнему (27). Короче говоря, soleus и EDL обрабатывали инсулином или без него при 10 мЕд / мл в течение 30 мин. [3H] поглощение 2DG измеряли через 10 мин после добавления холодного 2DG (1 ммоль / л), [3H] 2DG (0,25 мкКи / мл) и D- [14C] маннита (0,16 мкКи / мл).

Встраиваемые парафином сегменты жировой ткани перигонада окрашивали толуидином Blue O. Размер и диапазон распределения адипоцитов определяли ручными измерениями диаметров клеток не менее 100 адипоцитов для каждой мыши.

РНК была выделена из 100 мг жировой ткани перигонада с использованием миникита RNeasy. кДНК синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК iScript. Анализ ПЦР в реальном времени проводили на машине Bio-Rad iQ5 с использованием анализов экспрессии гена Taqman. 18S для каждого образца определяли количественно, а конечную относительную концентрацию определяли с использованием метода порогового цикла дельта-дельта (Ct) (28).

Данные выражаются как среднее ± SEM. Статистический анализ проводили с использованием теста Стьюдента или двухстороннего ANOVA, после чего проводили тесты Tukey post hoc, если это необходимо. Уровень значимости P <0,05.

Двадцать недель HF-диеты увеличивали мышечную HA в два раза (рис.1A). Чтобы определить, влияет ли присутствие НА на мышечную резистентность к инсулину, PEGPH20 вводили мышам для снижения НА. Одна инъекция PEGPH20 при 10 мг / кг у мышей, получавших чау, уменьшала НА на 80% через 4 ч после внутривенного введения (фиг.1В). Это снижение поддерживалось не менее чем через 72 часа после болюса. Измерения активности PEGPH20 в плазме показали, что PEGPH20 имел период полувыведения в начале фазы 2,2 ч и поздний фазовый период полураспада 23 часа с использованием анализа бисеквенциального распада (рис.1C). У мышей DIO повторные инъекции PEGPH20 при дозе 10 мг / кг в течение 27 дней удаляли 90% мышечной HA (фиг.1D).

Кормление HF увеличивает содержание HA в мышцах, а лечение PEGPH20 у мышей снижает HA в мышцах. A: Иммуногистохимическое обнаружение HA у икроножной мышцы мышей, содержащихся в чау и HF. Данные количественно оценивают, измеряя интегральную интенсивность окрашивания и нормируют на мышей, питающихся чау-чау. n = 5-6. * P <0,05 против чау. B: Мышам, кормящим чау, внутривенно вводили PEGPH20, а содержание HA в мышце икроножной мышцы оценивали с помощью иммуногистохимии с течением времени после болюса. Данные нормируются на время 0. n = 3. * P <0,05 против 0 часов. C: Активность плазмы PEGPH20 измеряли у мышей из B, чтобы определить период полувыведения. n = 3. D: Иммуногистохимическое обнаружение HA в мышце икроножной мышцы у мышей, диагностированных с помощью PEGPH20, или хронических PEGPH20. Данные нормализуются для мышей, обработанных HF-носителем. n = 6 * P <0,05 против транспортного средства HF. Все данные представлены как среднее ± SEM. (Высококачественное цветовое представление этой цифры доступно в онлайн-выпуске.)

Первая инъекция PEGPH20 у мышей DIO вызывала уменьшение массы тела на 10% (рис. 2А). Последующие инъекции не влияли на массу тела, и мышей набирали вес аналогично контрольным средствам, обработанным транспортным средством (0,12 ± 0,03 г / сут в транспортном средстве против 0,09 ± 0,03 г / сут в PEGPH20). Первоначальное снижение массы тела, вероятно, связано с уменьшением потребления пищи у мышей, получавших PEGPH20 (фиг.2B). После этого потребление пищи быстро увеличивалось. Потребление пищи измеряли после пятой инъекции PEGPH20 и были нормальными. Инъекции PEGPH20 уменьшали жировую массу на ~ 35% после девяти инъекций (рис.2C), но не меняли скудную массу (рис. 2D). EE во время светового цикла было одинаковым между группами в течение 3 дней после первой инъекции (рис. 2E). Напротив, EE в течение первых двух темных циклов была значительно ниже у мышей, обработанных PEGPH20. Амбулаторная активность была значительно ниже у обработанных PEGPH20 мышей в течение как светлых, так и темных циклов после первой инъекции (фиг.2F). Физическая активность у мышей, получавших PEGPH20, была заметно улучшена к третьей ночи.

Лечение PEGPH20 у мышей DIO вызывает временную потерю массы тела. Мышей DIO обрабатывали либо носителем, либо PEGPH20 в течение 24 дней. Вес тела (A), потребление пищи (B), жировая масса (C) и постная масса (D) оценивались с течением времени. n = 10. * P <0,05 против транспортного средства и #P <0,05 по сравнению с днем ​​0. EE (E) и физическая активность (F) оценивались у мышей в течение 3 дней после первой инъекции транспортного средства или PEGPH20. n = 6 * P <0,05 против транспортного средства. Все данные представлены как среднее ± SEM.

Для определения роли острого снижения HA в резистентности к инсулину ICv проводили у мышей DIO через 3 дня после первой инъекции PEGPH20. Вес тела не отличался от мышей, которым подвергались мышечные инфекции с помощью PEGPH20 (таблица 1). Одна инъекция PEGPH20 не влияла на концентрацию базального постсодержащего глюкозы, плазменного инсулина или неэтерифицированной жирной кислоты (NEFA). ICv-глюкоза составляла 150 мг / дл в обеих группах (таблица 1 и фиг.3А). Артериальный инсулин был эквивалентно повышен и артериальная NEFA была эквивалентно уменьшена в обеих группах во время ICv (таблица 1). GIR был сопоставим между группами, что указывает на незатронутую чувствительность к инсулину (фиг.3B). Аналогично, мышца Rg не была статистически различной между двумя группами (фиг.3C). EndoRa и Rd были одинаковы между двумя группами в базальном состоянии и во время ICv (рис. 3D).

Базальные и зажимные характеристики мышей C57BL / 6J, обработанных HF, обработанных транспортным средством или PEGPH20

Хроническое, но не острое лечение PEGPH20 повышает чувствительность к инсулину у мышей DIO. Мыши DIO получали одну (острую) или множественную (хроническую) внутривенную инъекцию транспортного средства или PEGPH20. ICv проводили через 3 дня после инъекции для определения уровня глюкозы в крови (A и E); GIR (B и F); Rg (C и G), показатель поглощения мышечной глюкозы; и эндогенную продукцию глюкозы (EndoRa) и скорость исчезновения глюкозы (Rd) (D и H). n = 4-8. * P <0,05 против транспортного средства. Все данные представлены как среднее ± SEM.

Затем мы исследовали влияние хронического снижения HA у инсулинорезистентных мышей DIO. Масса тела, базальная артериальная глюкоза и NEFA были одинаковыми между мышами, переносимыми с помощью транспортных средств и хроническими PEGPH20 (таблица 1). Однако базальный артериальный инсулин был уменьшен на ~ 50%, что отражает улучшение чувствительности к инсулину. ICv-глюкоза составляла 150 мг / дл в обеих группах (таблица 1 и фиг.3Е). В соответствии с более низким базальным инсулином, ICv-инсулин у пациентов с хроническим мышам, подвергнутым PEGPH20, был ~ 50% от того, что у мышей, обработанных транспортным средством (таблица 1). Артериальная NEFA во время ICv более подавлялась у хронических PEGPH20-обработанных мышей, несмотря на более низкий инсулин. Более того, GIR был выше у пациентов с хроническими PEGPH20-обработанными мышами, демонстрируя глубокое улучшение действия инсулина (рис.3F). Rg в gastrocnemius и поверхностном vastus lateralis также было увеличено у мышей, обработанных PEGPH20 (рис. 3G). Базальные эндо- и Rd были одинаковыми в обеих группах (рис.3Н). EndoRa во время ICv в большей степени подавлялся у пациентов с хроническими мышами, обработанными PEGPH20. Это уменьшало резистентность к печеночной инсулину при хронической терапии PEGPH20, не было связано с уменьшением содержания триглицеридов в печени (фиг.5D). Несмотря на увеличение мышечной массы Rg, Rd во время ICv не увеличивалось у пациентов с хроническими мышами, подвергнутыми PEGPH20, что указывает на то, что другие ткани компенсируют повышенные Rg-ответы (рис. 2C).

Увеличение мышечного Rg у пациентов с хроническим PEGPH20-обработкой было согласуется с увеличением передачи сигналов инсулина в мышцах (фиг.4A и B). Тирозиновое фосфорилирование IRS1 и IRS1-ассоциированной p85 субъединицы фосфоинозитид-3-киназы было увеличено у хронических PEGPH20-обработанных мышей. Фосфорилирование Akt, а также общего Akt было также увеличено у пациентов с хроническими PEGPH20-обработанными мышами.

Влияние хронического PEGPH20 на мышцы у мышей DIO. A: Гастроклюдиус был собран в конце ICv. Тирозиновое фосфорилирование IRS1 и IRS1-ассоциированных p85 оценивали с помощью иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга. B: Экспрессия белка Akt и фосфорилированного Akt оценивали с помощью Вестерн-блоттинга в мышечных гомогенатах. C: белковая экспрессия коллагена IV (ColIV) и CD31 измерялась иммуногистохимией в мышце икроножной мышцы, собранной в конце ICv. Экспрессия ColIV измерялась интегрированной интенсивностью окрашивания. Мышечную сосудистую систему определяли путем подсчета CD31-позитивных структур. D: сердечный выброс в мышцу оценивали с помощью микросфер, которые вводили в артериальный катетер после ICv. Данные были нормализованы для транспортного средства. n = 4-8. * P <0,05 против транспортного средства. E-G: мышцы Soleus и EDL были выделены от мышей, хронически обработанных транспортным средством или PEGPH20 в течение 24 дней. Всасывание глюкозы in vitro измеряли с использованием 2- [3H] дезоксиглюкозы на 27 день. N = 7-9. * P <0,05 против транспортного средства и #P <0,05 по сравнению с базальным. Все данные представлены как среднее ± SEM. GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. (Высококачественное цветовое представление этой цифры доступно в онлайн-выпуске.)

Хроническое истощение HA не влияло на мышцы ColIV (фиг.4C). Мы показали, что разворот мышечной резистентности к инсулину во время кормления грудной клетки ассоциировался с увеличением мышечной васкуляризации (3). Аналогичным образом, увеличение мышечного действия инсулина у мышей DIO, обработанных PEGPH20, было связано с повышенной экспрессией сосудистого маркера CD31 (фиг.4С). Увеличение мышечной васкуляризации также соответствовало 1,5-кратному увеличению доли инъецированных микросфер, осажденных в скелетной мышце мышей, обработанных PEGPH20 (фиг.4D).

Чтобы дополнительно определить, были ли эффекты хронического сокращения HA вызваны сенсибилизацией инсулина мышцы как таковой, поглощение глюкозы оценивали в изолированных мышцах. [3H] 2DG поглощение в изолированном медленном подергивании, богатая окислительно-восстановительным салатом была выше в базальном состоянии и во время стимуляции инсулина у мышей, обработанных PEGPH20 (фиг.4E). Однако стимулированное инсулином приращение поглощения [3H] 2DG было одинаковым в обеих группах (фиг.4G). [3H] поглощение 2DG было одинаковым между группами в преимущественно быстродействующем, гликолитическом EDL как в базальном, так и в стимулированном инсулином состоянии (фиг.4F и G).

Чтобы понять, почему хроническая обработка PEGPH20 уменьшает жировую массу мышей DIO, мы изучили влияние на жировую ткань. HA экспрессировали в ECM жировой ткани у обработанных носителем мышей, а повторные инъекции PEGPH20 истощали его присутствие (фиг.5A). Толуидин Blue O-окрашивание выявило значительное снижение размера адипоцитов у мышей, получавших PEGPH20 (фиг.5A и B). Мы также изучили экспрессию генов, связанных с воспалением и макрофагами, в жировой ткани. Хотя не было разницы в экспрессии генов маркеров макрофагов F4 / 80, CD11c и CD68, экспрессия генов некоторых провоспалительных маркеров, IL-12 и IL-1b, была уменьшена хроническим PEGPH20. Экспрессия гена противовоспалительных маркеров IL-10, CD163, Mgl1 и Arg1, а также адипоцитарных маркеров ADRP и PPARγ не была затронута (фиг.5C).

Хроническая терапия PEGPH20 уменьшает размер адипоцитов и экспрессию генов воспалительных маркеров. A: Иммунохимическое определение окрашивания HA и Toluidine Blue O в перигонадальной жировой ткани носителя и хронических PIOPH20-обработанных мышей DIO. B: Размер адипоцитов определяли путем ручных измерений диаметров адипоцитов не менее 100 адипоцитов на мышь. C: экспрессия гена в перигонадальной жировой ткани. Данные были нормированы на выражение 18S. Mθ, макрофаг; M1, провоспалительные маркеры; M2, противовоспалительные маркеры. D: Содержание триглицеридов печени в мышах, обработанных PERP20, и хронических PEGPH20. n = 6-8. * P <0,05 против транспортного средства. Все данные представлены как среднее ± SEM. (Высококачественное цветовое представление этой цифры доступно в онлайн-выпуске.)

Затем мы оценили эффективность более низких доз PEGPH20 в повышении активности инсулина. Вес тела мышей DIO не отличался между группами по сравнению с обработкой (фиг.6A). Однако увеличение массы тела в течение 24-дневной терапии было ниже у мышей, получавших 0,1 и 1 мг / кг PEGPH20 (фиг.6В). Коэффициент увеличения массы жира снижался PEGPH20 дозозависимым образом, а мыши, получавшие PEGPH20 1 мг / кг, фактически теряли 1,5 г жира. Несмотря на зависимое от дозы снижение массы тела и увеличение массы жировой ткани, снижение массы мяса было дозозависимо увеличено с помощью PEGPH20. Потребление пищи снижалось доза после первой инъекции PEGPH20 (фиг.6C). Доза зависимости потребления пищи была временной. EE также временно снижалась у мышей, получавших PEGPH20 1 мг / кг (фиг.6D). PEGPH20 в других дозах не уменьшал ЭЭ после первой инъекции. PEGPH20 при 0,001 и 0,01 мг / кг увеличивал ЭЭ в день 2. EE оставался тем же или был увеличен PEGPH20 после шести инъекций. Физическая активность была временно снижена у мышей, получавших 0,1 и 1 мг / кг PEGPH20 и полностью восстанавливалась на второй день (фиг.6Е). Физическая активность была одинаковой между мышами, переносимыми транспортным средством и PEGPH20, после шести инъекций. Для оценки минимально эффективной дозы PEGPH20 в улучшении действия инсулина проводились ICv. ICv-глюкоза составляла 150 мг / дл во всех группах (фиг.6F). GIR был дозозависимо увеличен PEGPH20. Минимально эффективная доза составляла 0,01 мг / кг (фиг.6G). Мышцы Rg увеличивали у мышей, получавших 0,1 и 1 мг / кг PEGPH20 (фиг.6H). Увеличение GIR и мышцы Rg с увеличением концентрации PEGPH20 было связано с дозозависимым снижением содержания HA в мышцах (рис.6I). Хотя 0,001 мг / кг PEGPH20 не уменьшало мышечную НА и 10 мг / кг PEGPH20, почти полностью истощенный HA, PEGPH20 при 0,01, 0,1 и 1 мг / кг нормализованных уровней HA до тех, что наблюдались у мышей, питавшихся чау-чау.

Дозозависимый эффект хронического PEGPH20. Мышей DIO обрабатывали транспортным средством или PEGPH20 при 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мг / кг в течение 24 дней. Вес тела (A), изменения состава тела (B), потребление пищи (C), EE (D) и физическая активность (E) измерялись по сравнению с обработкой. n = 4-6. * P <0,05 против транспортного средства. ICv проводили через 3 дня после последней инъекции. Определяли уровень глюкозы в крови (F), GIR (G) и мышцы Rg (H) во время ICv. n = 4-6. ξP <0,05 против транспортного средства; * P <0,05 против транспортного средства. I: Дозозависимый эффект хронического PEGPH20 на содержание HA в желудочно-кишечном тракте мышей DIO. Пунктирные линии указывают содержание HA на мышах, которые кормили чау-чау, или мышах, кормящих HF. Заполненные области указывают SEM отдельных значений линий. n = 4-5. y = -0,44log (x) + 0,622. r2 = 0,9581. Все данные представлены как среднее ± SEM. SVL, поверхностный vastus lateralis.

Ремоделирование ECM в инсулинорезистентной скелетной мышце имеет потенциальное значение для метаболизма мышц (3,7). В настоящем исследовании мы впервые продемонстрировали, что HA в мышечном ECM связана с мышечной резистентностью к инсулину, так как устойчивое снижение НА на PEGPH20 отменяет индуцированную HF мышечную резистентность к инсулину. Тот факт, что хроническое, но не острое снижение уровня HA улучшает мышечное действие инсулина, свидетельствует о том, что HA в мышечном ECM — это не просто физический барьер, а вызывает долговременную адаптацию мышц, включая повышенную мышечную васкуляризацию и улучшенную доступность мышц к метаболическим такие вещества, как глюкоза и инсулин. Отмена HF-индуцированной резистентности к инсулину при хроническом снижении HA не ограничивается скелетной мышцей. Способность инсулина подавлять липолиз адипоцитов и производство глюкозы в печени также значительно улучшилась при хронической терапии PEGPH20. Эти результаты показывают важность оборота HA в регуляции потока глюкозы всего тела. Следуя доказательству принципа, что HA обратно зависит от действия инсулина, мы решили определить минимально эффективную дозу PEGPH20, которая улучшает действие инсулина. Это чрезвычайно важно для разработки безопасной и переносимой дозы для введения инсулинорезистентным людям.

Ранее было показано, что однократная внутривенная доза PEGPH20 при дозе 10 мг / кг вызывает потерю массы тела на 10% у молодых взрослых мышей (14). Мы наблюдали тот же ответ у мышей DIO. Мы также показали, что эта первоначальная потеря массы тела, вероятно, объясняется уменьшением потребления пищи и произошла, несмотря на снижение ЭЭ после однократной инъекции PEGPH20. Физическая активность мышей DIO также снижалась при начальной инъекции. Поскольку мыши получали больше инъекций 10 мг / кг PEGPH20, потребление пищи быстро восстанавливалось в количествах, наблюдаемых у контрольных мышей. EE и физическая активность, которые были уменьшены после первоначальной инъекции PEGPH20, также были временными. Возможные медицинские осложнения при инъекции PEGPH20 включают воспаление и боль в суставах (29). Это может объяснить первоначальное снижение активности и связанных с ней ответов. Тем не менее, результаты настоящих исследований, а также других работ (14) свидетельствуют о том, что хронические инъекции PEGPH20 хорошо переносятся у мышей, так как нет явных отрицательных эффектов.

Резкое снижение HA с помощью одной инъекции PEGPH20 не влияло на действие инсулина у мышей DIO. Как отмечалось выше, острый ответ на PEGPH20 сопровождался временным снижением потребления пищи и уменьшением физической активности. Хотя ограничение калорийности повышает чувствительность к инсулину (30,31), снижение активности противодействовало увеличению активности инсулина (32). Альтернативное объяснение отсутствия острого увеличения действия инсулина заключается в том, что переходные реакции на острый PEGPH20 маскируют улучшение действия инсулина.

Влияние хронического лечения PEGPH20 на действие инсулинов скелетных мышц было четко выражено увеличением [14C] 2DG в мышце обработанных PEGPH20 мышей in vivo во время ICv. Это увеличение не наблюдалось в изолированных мышцах in vitro. Изолированная мышца in vitro не обладает интактными физиологическими взаимодействиями между мышечными волокнами и окружающей матрицей и капиллярами. Эти результаты свидетельствуют о том, что основной сайт действия PEGPH20 является внеклеточным. Окружающий ECM и капилляры в мышцах контролируют доставку гормонов и глюкозы (и других питательных веществ) в мышцы in vivo. In vitro, когда внеклеточный барьер поглощения глюкозы удаляется и мышечные клетки свободно доступны для инсулина и глюкозы, положительные эффекты PEGPH20 отсутствуют. Эти результаты наглядно демонстрируют, что улучшение интерстициальной доставки или сосудистого доступа гормонов и глюкозы (и других питательных веществ) отвечает за повышенное действие инсулина в ответ на PEGPH20. Мы видели эту диссоциацию между in vivo и поглощением глюкозы in vitro факторами, которые влияют на внемиецеллюлярный барьер. Bonner et al. (26) показали, что делеция сосудистого эндотелиального фактора роста ингибирует поглощение глюкозы in vivo, но не in vitro. Важность экстрамиоцеллюлярного ответа на увеличение мышечного инсулина с помощью PEGPH20 in vivo согласуется с увеличением мышечной васкуляризации и увеличением процента сердечного выброса в мышцы. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями (3) и еще раз подчеркивают, что эндотелиальная / сосудистая адаптация, которая возникает при хроническом ремоделировании мышечного ECM, является ключевым событием в патогенезе резистентности к инсулину. Увеличение выделения базальной мышцы глюкозы наблюдалось в изолированной подошве, но не в EDL, что свидетельствует о том, что хроническая терапия PEGPH20 оказывает неинсулино-стимулированное действие на медленно дергающиеся, окислительные волокна, но не быстро-дергающиеся, гликолитические мышечные волокна.

Хроническая терапия PEGPH20 также перевернула HF, индуцированную диетой резистентность к инсулину, в других чувствительных к инсулину тканях, в дополнение к скелетной мышце. Подавление выработки глюкозы в печени с помощью инсулина также было увеличено у пациентов с хроническими мышами, получавшими PEGPH20. Подавление концентрации NEFA в плазме усугублялось во время ICv у мышей, получавших PEGPH20, что указывало на усиление подавления липолиза инсулином. Отношения между большими подавлениями липолиза и продуцированием глюкозы в печени согласуются с гипотезой о едином шлюзе, предложенной Bergman et al. (33). Эти данные показывают важность оборота HA в регуляции потока глюкозы всего тела и согласуются с важностью HA для метаболизма в чувствительной к инсулину ткани (дополнительная фиг.1).

Ожирение является важным фактором риска развития резистентности к инсулину между прочим. Массовая масса тела и размер адипоцитов отрицательно коррелируют с чувствительностью к инсулину (34,35). Воспаление жировой ткани связано с резистентностью к инсулину (36,37). Здесь мы обнаружили, что повышенное действие инсулина у обработанных PEGPH20 мышей связано с уменьшением массы тела, уменьшением размера адипоцитов и снижением экспрессии генов провоспалительных маркеров, включая IL-12 и IL-1b в жировой ткани. Интересно, что экспрессия противовоспалительных маркеров и маркеров общего макрофага, таких как F4 / 80, CD11c и CD68, не изменилась. Неизмененная экспрессия F4 / 80, CD11c и CD68 соответствовала неизменному числу коронообразных структур, определяемых окрашиванием толуидин-синим О жировой тканью в транспортном средстве и мышами, обработанными PEGPH20 (дополнительный рисунок 2). Эти результаты показывают, что, несмотря на то же количество макрофагов, просачивающихся в жировой ткани мышей DIO, классическая активация, но не альтернативная активация этих макрофагов, может быть уменьшена при хронической терапии PEGPH20 (38).

HA связывается с белками и тем самым влияет на клеточные функции (39). Хотя механизмы, которые связывают увеличение ECM HA с HF диетой индуцированной резистентностью к инсулину, не полностью поняты, мы предполагаем, что CD44, основной рецептор клеточной поверхности для HA, связан в процессе, так как генетическая делеция CD44 улучшает индуцированный HF инсулин резистентность и воспаление жировой ткани (40). CD44 экспрессируется в большом количестве типов клеток млекопитающих, включая эндотелиальные клетки (41, 42). Было показано, что CD44 участвует в регуляции ангиогенеза и пролиферации эндотелиальных клеток (43,44). Вполне вероятно, что повышенное взаимодействие HA-CD44 регулирует чувствительность к инсулину, влияя на функцию эндотелия / сосудистой системы. Более того, мы показали, что мыши DIO, обработанные PEGPH20, уменьшали воспаление в жировой ткани, так же как и мыши, лишенные CD44 (40). Эти результаты показывают, что взаимодействие HA-CD44 также может регулировать воспалительный ответ в жировой ткани, что влияет на действие инсулина. Помимо связывания с CD44, HA также связывается с HA-опосредованным рецептором подвижности (RHAMM) и активирует внутриклеточную сигнализацию (45) и обладает многими другими функциями, такими как пролиферация, агрегация, миграция и активация клеток. Роль этих событий в регуляции гомеостаза глюкозы еще предстоит определить.

Инсулинорезистентность является фактором риска для многих метаболических нарушений, включая диабет 2 типа и сердечно-сосудистые заболевания (46-48). Идентификация экономически эффективных терапевтических целей для резистентности к инсулину имеет большое значение с учетом высокой распространенности метаболического синдрома в современных обществах. Мы обнаружили, что терапия PEGPH20 проявляет дозозависимое увеличение чувствительности к инсулину всего тела у мышей DIO с минимальной дозой воздействия 0,01 мг / кг и максимальной дозой ответа 1 мг / кг. При дозе 0,01 мг / кг временные побочные эффекты, наблюдаемые при более высоких дозах, включая снижение потребления пищи, ЭЭ и физической активности, отсутствовали. Важно отметить, что PEGPH20 эффективен в дозах, которые нормализуют мышечную HA до уровня у мышей, питающихся чау-чау. Эти данные свидетельствуют о том, что повышенная мышечная HA является причиной резистентности к мышечной инсулине у мышей DIO. Пообещаю, мы подтверждаем, что PEGPH20 доза-зависимо уменьшает жировые отложения и увеличивает массу мяса, что указывает на то, что PEGPH20 способствует улучшению метаболизма. Эти исследования доза-ответ у мышей важны при разработке оптимальных терапевтических режимов.

Таким образом, наши исследования показывают, что увеличение ECM HA связано с HF-индуцированной резистентностью к инсулину. Фармакологическое лечение PEGPH20 улучшает мышечную сосудистую систему и отменяет резистентность к инсулину. Кроме того, с помощью PEGPH20 улучшается жировая и печеночная резистентность к инсулину в ВЧ-питании. Эти данные согласуются с предыдущими выводами от нас (3) и другими (2), что указывает на то, что ремоделирование ECM, связанное с избыточным потреблением калорий, является важным компонентом патогенеза резистентности к инсулину. Ранее мы показали, что компоненты ECM, которые действуют через рецепторы интегрина, улучшают действие инсулина. Здесь мы впервые показываем, что HA повышается у мышей DIO и что это увеличение является основным фактором, влияющим на резистентность к инсулину. Лечение пэгилированным вариантом гиалуронидазы эффективно нормализует содержание HA в мышцах и улучшает действие инсулина.

Эта статья содержит дополнительные данные в Интернете по адресу http://diabetes.diabetesjournals.org/lookup/suppl/doi:10.2337/db12-1502/-/DC1.

См. Сопроводительный комментарий, стр. 1816.

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK-054902 (D.H.W.), DK-059637 (Центр метаболического фенотипирования мышей, D.H.W.) и DK-020593 (Исследовательский и учебный центр диабета Vanderbilt).

Эта работа была частично поддержана грантом от Halozyme Therapeutics, Inc. L.H.B. был сотрудником Halozyme Therapeutics, Inc. C.B.T. является сотрудником Halozyme Therapeutics, Inc. Никаких других потенциальных конфликтов интересов, имеющих отношение к этой статье, не сообщалось.

L.K. разработал эксперименты, исследовал данные, внес свой вклад в обсуждение и написал рукопись. L.L., A.K., J.S.B., W.H.M., D.P.B. исследуемые данные. L.H.B., A.H.H. и C.B.T. способствовали обсуждению, рассмотрели и отредактировали рукопись. D.H.W. разработали эксперименты, внесли свой вклад в обсуждение, рассмотрели и отредактировали рукопись. L.K. является гарантом этой работы и, таким образом, имеет полный доступ ко всем данным в исследовании и берет на себя ответственность за целостность данных и точность анализа данных.

Части этого исследования были представлены в виде плаката на 71-й Научной сессии Американской ассоциации диабета, Сан-Диего, Калифорния, 24-28 июня 2011 года.

Авторы выражают благодарность Кори Д. Уэббу (Университет Вандербильта) за помощь в окраске толуидинового синего О жировой ткани.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *