Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Изменения в микробиоте кишечника клонированных и не клонированных контрольных свиней при развитии ожирения: кишечная микробиота при развитии ожирения у клонированных свиней

Changes in the gut microbiota of cloned and non-cloned control pigs during development of obesity: gut microbiota during development of obesity in cloned pigs
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3610253/

Ожирение, вызванное высококалорийной диетой, ранее ассоциировалось с изменениями микробиоты кишечника у мышей и у людей. В этом исследовании свиней клонировали для минимизации генетических и биологических изменений среди животных с целью разработки контролируемой модели метаболизма, подходящей для исследования диеты. Клонирование свиней может быть привлекательным способом снижения генетических влияний при исследовании влияния диеты и ожирения на различные физиологические объекты. Целью этого исследования было оценить и сравнить изменения в составе микробиоты кишечника клонированных и не клонированных свиней во время развития ожирения с помощью высокожирной / высококалорийной диеты. Кроме того, мы исследовали связь между ожирением, вызванным диетой, и относительным распространением филадельфийцев и бактериотетов в фекальной микробиоте. В течение 136 дней исследовали фекальную микробиоту из клонированных с ожирением (n = 5) и не клонированных контрольных свиней (n = 6) в течение 136 дней с помощью полиморфизма длины концевого рестрикционного фрагмента (T-RFLP) и количественной ПЦР в реальном времени (qPCR ).

Наблюдалась положительная корреляция между массой тела в конечной точке и процентом жировых отложений в клонированных (r = 0,9, P <0,0001) и у не клонированных контрольных свиней (r = 0,9, P <0,0001). Shannon Weaver и основной компонентный анализ (PCA) терминальных рестрикционных фрагментов (T-RFs) не выявили различий в бактериальной композиции или изменчивости фекальной микробиоты между клонированными свиньями или между клонированными и не клонированными контрольными свиньями. Вес тела коррелировал положительно с относительным обилием Firmicutes как в клонированных (r = 0,37, P <0,02), так и не-клонированных свиньях (r = 0,45, P <0,006) и отрицательно с обилием бактерионитов у клонированных свиней ( r = -0,33, P <0,04), но не у не клонированных контрольных свиней.

У клонированных свиней не было снижения межличностных изменений по сравнению с не клонированными свиньями в отношении их микробиоты в кишечнике ни в ожирении, ни в постном состоянии. Диетическое ожирение было связано с увеличением относительной численности Firmicutes с течением времени. Наши результаты свидетельствуют о том, что клонированные свиньи не являются более подходящей моделью для исследования кишечной микробиоты-ожирения, чем не-клонированные свиньи. Это исследование является первым, кто оценивает, показывают ли клонированные свиньи лучшую модель для животных, чем обычные свиньи, в исследованиях диеты, ожирения и кишечной микробиоты.

Ожирение и связанные со здоровьем болезни становятся все более серьезной проблемой во многих странах мира. В то время как традиционно рассматривается в первую очередь вопрос о сидячем образе жизни, в котором потребление энергии превышает затраты энергии, новые исследования также указывают на состав микробиоты кишечника как потенциально способствующий фактор. В исследованиях ожирения, вызванного диетой, и его ассоциации с микробиотой кишечника, может быть предпочтительным исключить влияние генотипа хозяина на состав микробиоты кишечника путем выбора генетически идентичных животных. Некоторые ранние исследования, сравнивающие состав микробиоты у монозогитовых двойников человека (MZ) с двузубчатыми двойниками (DZ), сообщили, что геном хозяина влиял на микробную композицию в кишечнике
[1,2]. Аналогичное исследование, основанное на анализе гена 16S рРНК, показало, что бактериальное сообщество в близнецах MZ человека было несколько больше, чем у неродственных лиц
[3], предполагая, что генетически идентичные индивидуумы имеют подобную микробиоту кишечника. В более недавнем исследовании, посвященном взаимосвязи между микробиотой кишечника, диетой и генетическими влияниями у мышей, авторы заявили, что изменения в микробиоте кишечника не были связаны с генетически индуцированным ожирением и были обусловлены исключительно высоким содержанием жиров (HF)
[4]. Поэтому влияние гена хозяина на микробиоту кишечника в настоящее время остается спорным.

При выборе животной модели для изучения заболеваний человека важно выбирать животных, которые физиологически напоминают людей. Свиньи — хорошие модели для людей, прежде всего из-за близкого сходства их анатомии и физиологии пищеварительной системы, и поскольку свиньи всеядны, как люди
[5,6]. Следовательно, свиньи широко используются в исследованиях заболеваний, связанных с образом жизни человека, таких как диабет, сердечно-сосудистые заболевания и метаболический синдром
[7,8]. Использование клонированных свиней в исследованиях, связанных с ожирением, могло бы обеспечить более однородную экспериментальную модель, поэтому клонирование в этом исследовании проводилось для минимизации генетических влияний и тем самым уменьшения межличностных вариаций
[9].

Одним из основных направлений микробиологических исследований, связанных с ожирением, было определение групп бактерий, которые коррелируют с состоянием ожирения, и изначально относительное количество бактериотетов и твердых веществ в кишечной микробиоте было связано с ожирением. У свиней, как у людей
[10] и других млекопитающих
[11], две основные филлы бактерий в кишечной микробиоте — это бактероиды и твердые вещества [12,13]. Предыдущие исследования показали большую долю Firmicutes у тучных мышей
[14] по сравнению с их более компактными аналогами и уменьшенным соотношением Firmicutes к Bacteroidetes в небольшой группе людей с ожирением в режиме потери веса
[15]. Аналогичный результат при изучении бедных и тучных свиней показал отрицательную корреляцию между процентом бактериотетов и массой тела
[16]. Кроме того, исследование на основе флуоресценции in situ гибридизации (FISH) на фоне ожирения подростков во время схем потери веса показало уменьшение количества филимумов [17]. Однако в нескольких исследованиях показано снижение отношения Фирмы к бактероидетам у пациентов с ожирением и избыточным весом
[18] и предложить диету, чтобы быть фактором, способствующим формированию микробного сообщества кишечника, а не бактериальным пропорциям
[19,20]. Другие наблюдения у людей указывают на то, что ожирение связано с более низким бактериальным разнообразием
[3], в то время как в других исследованиях не было обнаружено различий в распространенности бактерий в кишечной микробиоте между острой и ожирением индивидуумами, которые были на вес, поддерживая диету
[21]. Следовательно, эта предполагаемая связь между ожирением, диетой и специфической филой бактерий в кишечной микробиоте по-прежнему вызывает споры, и есть несколько исследований по ассоциации между кишечной микробиотой и ожирением во время развития ожирения. Поэтому в центре внимания этой статьи было исследование микробиоты кишечника у клонированных свиней по сравнению с не клонированными контрольными свиньями и дальнейшее выяснение того, связано ли ожирение с течением времени с изменением микробиоты кишечника. Мы предположили, что состав кишечной микробиоты будет более сходным среди клонированных свиней по сравнению с не клонированными средствами контроля. Вторая гипотеза заключалась в том, что увеличение веса будет связано с увеличением отношения Firmicutes к Bacteroidetes, а также с уменьшением разнообразия микробиоты кишечника. Поэтому мы исследовали изменения микробиоты кишечника клонированных и контрольных свиней, начинающиеся с худых свиней в течение 136 дней на высокожирной / высококалорийной (HF / высококалорийной) диете.

Животными для этого эксперимента были свиньи аналогичного генотипа Датского Ландраса и Йоркшира. Шесть женщин-братьев из обычного подстилки (контрольная группа) (75% Landrace x 25% Yorkshire) были получены после стандартного искусственного осеменения с последующим кесаревым сечением. Эксперименты по клонированию проводили с использованием донорных клеток, полученных из 65% йоркширской овчарки Landrace x 35%, как описано ранее
[9]. Затем клонированные эмбрионы переносили хирургическим путем в суррогатных свиноматок (получателей) через 5-6 дней после клонирования
[9]. Два суррогатных свиноматки родили пять живых клонов кесаревым сечением. Свиньи выращивались на экспериментальных конюшнях в Университете Орхуса (Тьеле, Дания). Все экспериментальные исследования на животных были одобрены Датским экспериментальным комитетом животных.

Свиньи в эксперименте отнимали от груди в возрасте 28 дней, а затем кормили стандартную свиную диету с распределением энергии 18,5% белка, 7,9% жира, 72,4% углеводов и 1,2% волокна в течение примерно 61 дня. Во время этого периода отлучения животные из одного и того же помета размещались вместе в одной и той же конюшне. Через 96 дней (клонированные свиньи) и 89 дней (не клонированные контрольные образцы) возраста (базовый уровень) свиньи переносили на объекты для индивидуального жилья и кормили высокомолочной диетой на основе HF / высококалорийной пшеницы на основе пшеницы, состоящей из 19,5% белка, 27 % жира, 53% углеводов и 0,5% волокна
[22] с доступом ad libitum к корму для того, чтобы вызвать ожирение. Корм был взвешен до и после кормления, и свиньи содержались на этой диете в течение 136 дней, пока они не были подвергнуты эвтаназии. Клонированные и не клонированные контрольные свиньи взвешивались раз в две недели, начиная за день до перехода на HF / высококалорийный корм, а состав жира в организме животных измеряли с помощью компьютерной томографии (КТ) в конце эксперимента. В течение этого периода свежие фекалии, собранные раз в две недели, замораживали в жидком азоте и хранили при -20 ° C до последующего анализа.

Фекальную микробиоту всех свиней анализировали с помощью профилей отпечатков пальцев концевого рестрикционного фрагмента (T-RFLP), как описано ранее
[23]. Короче говоря, ДНК извлекали из 200 мг фекалий, используя QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя, с дополнительной стадией избиения бисера, чтобы нарушить клеточную стенку грамположительных бактерий. Концентрации ДНК измеряли в каждом образце с помощью спектрофотометра и доводили до 5 нг мкл-1 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Амплификацию ДНК гена 16S рРНК проводили в дубликатах с использованием бактериальных специфических праймеров ДНК 16S рРНК, Eub-8fm (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3 ‘), помеченных 5’-FAM и Eub-926r (5-‘CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3’), (ДНК-технология, Орхус, Дания)
[23]. Каждая ПЦР-смесь содержала 5 мкл 10-кратного буферного раствора Ферментаса, 4 мкл MgCl2, 2,0 мкл дезоксирибонуклеотидтрифосфата (dNTP), 0,5 мкл ферментации Taq-полимеразы, 0,5 мкл каждого праймера и 35,5 мкл свободной от нуклеазы воды и 5 нг мкл-1 ДНК (конечная концентрация 0,2 нг). Условия циклирования: начальная денатурация при 94 ° С в течение 6 минут (мин), а затем 32 цикла денатурации при 94 ° С в течение 45 секунд (ов), отжиг при 56 ° С в течение 45 с, этап расширения при 72 ° С в течение 2 мин и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин. Продукты ПЦР впоследствии проверяли с помощью гель-электрофореза и очищали с помощью набора для чистки высокой чистоты ПЦР (Roche Applied Sciences, Mannheim, Germany). Очищенный продукт ПЦР (200 нг) расщепляли 2,0 мкл рестрикционного фермента HhaI (Promega Corporation, Мэдисон, США) при 37 ° C в течение 3 часов. Два мкл расщепленных продуктов ПЦР, 10 мкл формамида и 0,50 мкл Megabase ET900-R Standard Standard (GE Health Care, Buckinghamshire, UK) смешивали и повторяли в дубликатах на генетическом анализаторе капиллярного электрофореза (Genetic Analyzer 3130 / 3130xl, Applied Biosystems , Carlsberg, CA). Были получены концевые рестрикционные фрагменты (T-RFs), представляющие бактериальные фрагменты в базовой паре (bp), и анализ профилей T-RF и выравнивание T-RF по внутреннему стандарту выполняли с использованием программного обеспечения BioNumerics версии 4.5 (Applied Maths, Kortrijk, Бельгия).

Фрагменты T-RF (диапазон 60-800 пар оснований) с разницей менее двух пар оснований считались идентичными. Только полосы, присутствующие в обоих дубликатах, были приняты в качестве бактериальных фрагментов, из которых дублирующий луч с максимальной интенсивностью был выбран для микробного профилирования. Полученные интенсивности всех T-RF были импортированы в Microsoft Excel, и все интенсивности ниже 50 были удалены. В каждом образце относительная интенсивность любого данного T-RF рассчитывалась путем деления интенсивности T-RF на общую интенсивность всех T-RF в образце. Наиболее преобладающие Т-RF со средней относительной интенсивностью более одного процента были отобраны для всех дальнейших анализов и процедур (кроме расчета разнообразия и сходства), а их идентификация была предсказана в силиконе, выполненная в онлайн-программном обеспечении MiCA
[24] и Ribosomal Database Project Classifier (322.864 Good Quality,> 1200)
[25].

Все T-RF от 60 до 800 пар оснований были импортированы в статистические программы Stata 11.0 (StataCorp, College Station, TX), Unscrambler версии 9.8 (CAMO, Осло, Норвегия) и листы Microsoft Excel были использованы для дальнейшего анализа. Анализ основных компонентов (PCA) использовался для изучения групповых различий в общих микробных сообществах как для сравнения между клонированными свиньями и не клонированным контролем в разных точках отбора проб, так и для исследования, если образцы свиней с наибольшим коэффициентом усиления в течение периода исследования сгруппированные вместе, независимо от их генетического фона. Последнее также было исследовано путем сопоставления всего сообщества микроорганизмов с коэффициентом усиления веса в разных точках выборки, включающим все преобладающие Т-RF одновременно в моделях. Для этого использовалась частичная наименьшая квадратная регрессия (PLS-R), которая является контролируемой моделью, что означает в этом случае, что изменение в весовых (коэффициентах) данных используется для активного разложения вариации в данных бактерий. В обоих анализах T-RF были стандартизированы (с центрированием и 1 / SD) до этапа моделирования, чтобы гарантировать, что все они будут одинаково влиять на модели, а возможные выбросы были проверены визуально и с Hotell T2.

Индекс разнесения рассчитывали, как описано ранее
[26]. Короче говоря, индекс разнообразия (H ‘) Шеннона-Уивера, основанный на всех исходных Т-RF, использовался для определения разнообразия бактериальных фрагментов. Групповые сравнения индекса разнообразия в клонированных и не клонированных контролях были рассчитаны в каждой из точек выборки. Так как индекс Шеннон-Уивер обычно не распределялся, применялись тест Манна Уитни У и корреляция Спирмена. Значения H ‘представлены в виде средних и баров ошибок, представляющих стандартные отклонения (SD). Точечное сходство между группами на основе всех Т-RF было рассчитано в BioNumerics (Applied Maths, Kortrijk, Belgium), и результаты представлены как средние значения. T-RFs на рисунках представлены как средняя и стандартная ошибка среднего (SEM). Значительная разница была рассмотрена, когда значение Р было меньше 0,05 (Р <0,05).

Выделенная ДНК из фекальных образцов, используемых для анализа T-RFLP, также была проанализирована с помощью qPCR, но для анализа qPCR были выбраны только образцы, взятые ежемесячно. Однако дополнительные точки выборки за две недели до пробных точек были также проанализированы с помощью qPCR. Три бактериальных штамма (Clostridium perfringens (NCTC 8449), Odoribacter splanchnicus (изолят DJF_B089) и Escherichia coli (ATCC 25922), представляющие филаменты и бактерии и бактерии, соответственно, и шесть случайно выбранных образцов ДНК (разделенных поровну на клоны и контроля) были использованы для оптимизации условий ПЦР.

ДНК-праймеры 16S рРНК-генов для Bacteroidetes и Firmicutes, используемые в этом исследовании, были разработаны Baccetti De Gregoris и др. [27] и были оптимизированы условия для используемого термоциклера (циклический циклический регенератор Rotore-Gene Q в реальном времени (Qiagene)). Универсальный праймер, используемый в этом исследовании, имел длину ампликона 147 п.о. (S-D-Bact-0907-a-S-20 5′-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3 ‘; S-D-Bact-1054-a-A-20 5-‘ ACGAGCTGACGACAGCCATG-3 ‘)
[12]. Специфические наборы праймеров для Bacteroidetes (798cfbF 5 ‘CRAACAGGATTAGATACCCT’3 и cfb967R 5’ GGTAAGGTTCCTCGCGTAT ‘3) и Firmicutes (928F-Firm 5’ TGAAACTYAAAGGAATTGACG ‘3; 1040firmR, 5’ ACCATGCACCACCTGTC ‘3) имели длину ампликона 240 bp и 200 соответственно, bp
[27]. Все реакции qPCR содержали 12,5 мкл SYBR® Green JumpStart ™ Taq ReadyMix ™ без MgCl2 (Sigma-Aldrich, Копенгаген, Дания), 0,3 мкмоль-1 каждого праймера и 5 мкл матричной ДНК, доведенной до 5 нг мкл-1. Была выполнена оптимизация MgCl2 и была выбрана конечная концентрация 2,5 мМ MgCl2. Температура отжига была оптимизирована с использованием ДНК гена 16S рРНК, экстрагированной из фекальных образцов и ДНК, выделенной из разных бактерий. Впоследствии все праймеры и другие условия ПЦР были проверены с помощью обычного ПЦР и гель-электрофореза. В каждом прогоне был включен элемент управления без шаблонов (NTC). qPCR проводили с начальной стадией денатурации 10 мин при 95 ° С, 95 ° С в течение 30 с, 35 циклов 56 ° С в течение 20 с и стадией удлинения 72 ° С в течение 20 с. Анализ кривой плавления выполнялся после каждого прогона для обнаружения любых праймеров-димеров в каждом образце. Пороговый цикл (КТ) и расчетные концентрации (копии мкл-1) определялись автоматически программным обеспечением Rotor Gene (Rotor-Gene Q 2.0.2 (Qiagene)).

qPCR проводили для количественной оценки относительного обилия фила Bacteroidetes и Firmicutes, соответственно, присутствующих в каждом образце. Измеренные номера бактериальных копий гена 16S рРНК из бактерий, принадлежащих к бактериям Bacteroidetes и филумным фирмам, были рассчитаны по генам 16S рРНК, полученным из всех бактерий, и последующее вычисление относительной численности двух фил в каждом образце было подсчитано и статистически оценено Манном Уитни U тест. Дальнейшие корреляционные анализы были выполнены с использованием коэффициента корреляции Спирмена, а P <0,05 считалось статистически значимым. Стандартная кривая была сконструирована для специфических и универсальных наборов праймеров и анализов с использованием десятикратных серийных разведений экстрагированной ДНК от C. perfringens, O. splanchnicus и E. coli. Все образцы ДНК в диапазоне от 2,5 × 10 нг-1 до 2,5 × 10-6 ng мкл-1. Кроме того, серийные разведения, соответствующие ранее описанным разведениям геномной ДНК из двух случайных образцов, были использованы для построения стандартных кривых, чтобы дополнительно проверить, присутствуют ли ингибиторы ПЦР в экстрагированной ДНК из образцов фекалий.

На исходном уровне, незадолго до того, как животные были переведены на высококалорийную (HF) / высококалорийную диету ad libitum, клонированные (96 дней) и не клонированные контрольные (89 дней) свиньи весили 38 ± 4,1 кг (среднее ± SEM) и 37,9 ± 2,3 кг соответственно. Ежедневное увеличение веса у клонированных свиней (n = 5) составляло 0,78 ± 0,04 кг, а у контрольных свиней (n = 6) 1,05 ± 0,03 кг, что соответствовало более низкому ежедневному потреблению кормов клонированными свиньями, чем контрольные. Клоны взвешивали 143,6 ± 8,8 кг в момент их эвтаназии (конечная точка) по сравнению с контрольными свиньями, которые весили значительно больше (179,5 ± 4,0 кг) в конце исследования (разница 35,9 кг, Р = 0,004). КТ-сканирование жировых отложений показало, что тучные не клонированные контрольные свиньи имели более высокий средний процент жировых отложений (41,1 ± 1,3%), чем тучные клонированные свиньи (28,4 ± 2,3%, Р = 0,004). Была положительная корреляция между процентным содержанием жира в организме и массой тела в конце исследования диетического вмешательства у не клонированных контрольных свиней, а также у клонированных свиней (r = 0,85, P = 0,0001) (рис.
1).

Корреляция между процентом жировых отложений и массой тела (кг). Корреляция между процентом жировых отложений и массой тела (кг) у всех свиней рассчитывалась по корреляции Спирмена (r = 0,85, P = 0,0001). Красные круги указывают на клонированных свиней, а не клонированные свиньи обозначены черными точками.

Анализ PCA на общий состав микробиоты кишечника у всех животных не выявил отдельной кластеризации профилей T-RF между клонированными свиньями и не клонированными контрольными группами. Чтобы проверить, была ли микробиота кишечника между клонированными свиньями более сходной, чем с не клонированными контрольными свиньями, подсчитали оценку сходства в кости, показав, что микробиота у клонированных свиней не была более однородной в группе и не была более разнообразной по сравнению с не клонированными контрольными свиньями (Рисунок
2А). Кроме того, не было никакой разницы в индексе Шеннон-Уивер между клонированными и не клонированными контрольными свиньями в начале диеты-интервенции (базовый уровень), с индексом Шеннон-Уивер (H ‘), H’ = 2,6 (2,3-2,8) и H ‘= 1,7 (1,5-2,8) соответственно. В пределах контрольной группы наблюдалось небольшое увеличение (P = 0,01) в разнообразии микробиоты кишечника от базовой линии до конца диетического вмешательства (конечная точка) (H ‘= 3, 2,3-3,4), при этом различий не наблюдалось в группе клонированных свиней (H ‘= 3,3, 2,3-3,4) (фиг.
2B). Кроме того, не было никакой корреляции между разнообразием микробного сообщества, которое было обнаружено индексом Шеннона-Уивера и увеличением веса (рис.
2B).

Сходство (A) и разнообразие (B) микробиоты кишечника. Сходство и разнообразие были рассчитаны на основе T-RFs (bp) в разном возрасте для не клонированных контрольных свиней (●) и клонированных свиней (зеленый квадрат) по индексу подобия Dice и индексу Шеннон-Уивер. Результаты представлены в среднем, а бары ошибок представляют собой стандартные отклонения (SD).

Бактериальная нагрузка (включая все начальные Т-RF от 60 до 800 пар оснований) в фекальной микробиоте клонированных свиней и не клонированных контрольных свиней была одинаковой на протяжении всего периода вмешательства как на исходном, так и на конечном уровне (P = 0,08 и P = 0,3 , соответственно). В общем, профили T-RF были похожими на клонированных свиней и не клонированных свиней (рис.
3А и В). Как клонированные свиньи, так и не клонированные контрольные свиньи имели 11 T-RF с относительным уровнем обилия более одного процента в исходном состоянии и 17 T-RFs на конечной точке (рис.
3А и В). Было несколько различий в T-RF между клонированными свиньями и не клонированными контрольными свиньями, однако они не были значимыми (P = 0,08).

Обилие бактерий на исходном и конечном уровне. Среднее относительное обилие наиболее преобладающих T-RFs (> 1%, bp) в фекальных образцах клонированных свиней на исходном уровне (зеленый квадрат) и конечной точке (□) и у не клонированных контрольных свиней на исходном (■) и конечном уровне ( □). Полосы ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).

В не клонированной контрольной группе один отдельный T-RF с длиной 102 bp был найден выше на исходном уровне по сравнению с конечной точкой (P = 0,04) (рис.
3B), а внутри группы клонированных свиней одна Т-RF (93 bp) была выше на конечной точке, чем на исходном уровне (P = 0,01) (рис.
3A). На исходном уровне в не клонированной контрольной группе относительное количество T-RF 93 bp было менее одного процента, и наблюдалось значительное увеличение T-RF 93 bp от базовой линии до конечной точки (P = 0,005). Анализ силиконов полученных Т-RF показал, что T-RF 93 bp и T-RF 102 bp могут быть бактериальным фрагментом, принадлежащим к типу Bacteroidetes (см. Дополнительный файл
1).

На исходном уровне в клонированной микробиоте клонированных свиней присутствовало 47 Т-RF, тогда как в конце было 85 Т-RF присутствующих, что указывает на более богатое сообщество на конечной точке. На исходном уровне 27 Т-RF с интенсивностью более 1% представлены на рисунке
3A. Вместе эти 27 Т-RF составляют 92% всех Т-RF, присутствующих на исходном уровне.

У не клонированных контрольных свиней на базовом уровне присутствовало всего 42 Т-РЧ, а на конечной точке присутствовало 85 Т-RF, что опять-таки указывает на увеличение T-RF от базовой линии до конечной точки. На начальном этапе только 18 Т-RF имели интенсивность более 1%. Однако эти 18 Т-RF составляли 96% всех Т-RF на базовом уровне. На конечной точке в фекальной микробиоте не клонированных свиней было 82 Т-RF, из которых только 22 Т-RF имели интенсивность более 1% (рис.
3B). Возможная идентификация этих Т-RF, найденная в силиконовом анализе, может быть найдена в дополнительном материале (см. Дополнительный файл
1).

Не было различий в относительном содержании Bacteroidetes между клонированной и не клонированной контрольной свиньей на исходном уровне (P = 0,1) или в конечной точке (P = 0,9), и то же самое наблюдалось для Firmicutes (исходный уровень, P = 0,8, конечная точка, P = 0,7).

У клонированных свиней наблюдалась отрицательная корреляция между весовым коэффициентом и относительным количеством бактериотетов (r = -0,33, P <0,04) (рисунок 4A). Непрерывное и значительное снижение (Р <0,008) наблюдалось у бактерий Bacteroidetes от исходного уровня и на протяжении всего периода увеличения веса (рис. 4А), который затем снова начал повышаться к тому времени, когда свиньи имели средний вес 118,9 ± 3,2 кг, пока животные не были подвергнуты эвтаназии в конце.

Корреляция между приростом массы и относительным обилием бактерионитов и твердых веществ. Корреляция между приростом массы и относительным распространением бактериотетов, рассчитанная по корреляции Спирмена у клонированных свиней (открытые зеленые квадраты) (A) (r = -0,33, P <0,04) и не клонированных контрольных свиней (○) (B) и корреляции между (r = 0,37, P <0,02) и не клонированных контрольных свиней (○) (D) (r = 0,45, P <0,006).

У не клонированных контрольных свиней наблюдалось уменьшение относительной численности бактериотетов от исходного уровня (вес: 37,9 ± 2,3 кг) до тех пор, пока свиньи не весили 95,5 ± 3,9 кг, после чего относительное количество бактериотетов снова увеличивалось до тех пор, пока конечная точка (рисунок
4B). Впоследствии не было существенной разницы в относительном обилии бактериотетов на исходном и конечном уровне у не клонированных свиней (рис.
4B).

У клонированных свиней наблюдалось увеличение относительной численности Firmicutes от базовой линии до конечной точки (P <0,009) (рис. 4C) и то же самое наблюдалось у не клонированных контрольных свиней от базовой линии до конечной точки (P <0,0001) (рис. 4D). Эта положительная корреляция между весовым коэффициентом и относительным обилием Firmicutes в течение периода исследования наблюдалась как у клонированных свиней (r = 0,37, P <0,02), так и у не клонированных контрольных свиней (r = 0,45, P <0,006) (рис. 4C и D соответственно). На следующем рисунке показаны изменения относительной численности Firmicutes и Bacteroidetes во время увеличения веса (см. Дополнительный файл 2).

Чтобы лучше понять основные причины ожирения и эффект ожирения на разных участках тела, клонированные свиньи и не клонированные контрольные свиньи, используемые для нашего исследования, также были исследованы в отношении их иммунологических
[28], метаболомика
[22] и фенотипические символы
[9]. В этом исследовании мы исследовали микробиоту кишечника как клонированных, так и не клонированных контрольных свиней с помощью T-RFLP и обнаружили, что микробиота кишечника в группе из пяти туземных клонов не была ни более сходной, ни более разнообразной, чем микробиота в группе из шести страдающих ожирением, не клонированных контрольных свиней одного пола и генетического фона. Фенотипирование метаболомией
[9] этих тучных клонированных и не клонированных контрольных свиней показали, что фенотип клонированных свиней отличается от фенотипа не клонированных контрольных свиней
[9] и что межличностное изменение среди этих клонированных свиней было не меньше, чем межличностное изменение не клонированных контрольных свиней, которые были братьями и сестрами
[22]. Следовательно, исходя из этих и результатов, представленных в нынешней работе, оказалось, что клонированные свиньи не имеют идентичных фенотипов или менее индивидуальных различий, чем обычные не клонированные свиньи. Одним из объяснений этих результатов может быть то, что при клонировании ядерным переносом соматических клеток животные наследуют материнскую митохондриальную ДНК, и хотя у них есть одна и та же соматическая ДНК, клонированные свиньи обладают изменяющимися фенотипами из-за эффекта материнской митохондриальной ДНК
[9]. Это ставит вопрос о том, являются ли клонированные животные более подходящими животными моделями, чем обычные не клонированные животные.

Наследуемый компонент индивидуума и его влияние на микробное сообщество были исследованы ранее в нескольких исследованиях человека; в частности, двойники MZ были исследованы для сведения к минимуму генетического влияния, чтобы лучше понять роль ожирения на кишечной микробиоте
[3]. При разработке экспериментальной модели исследований, связанных с микробиотом кишечника, важно устранить большую изменчивость в микробном сообществе у отдельных лиц, что делает необходимым использовать большее количество животных для достоверного статистического анализа и интерпретации. Таким образом, клонированные животные могут обладать потенциалом стать хорошими моделями, уменьшая количество животных, необходимых для экспериментального исследования и предоставляя менее переменную популяцию, однако для улучшения качества клонированных животных требуется большая оптимизация.

Что касается связанной с ожирением кишечной микробиоты, мы не наблюдали никакой ассоциации между увеличением веса и изменением в разнообразии бактерий, хотя было больше бактериального богатства у тучных свиней. Вместе взятые; эти результаты указывают на специфические изменения в сообществе бактерий с течением времени как у клонированных, так и не клонированных контрольных свиней.

Чтобы получить более качественный профиль сообщества микроорганизмов кишечника в связи с ожирением, мы сравнили относительное обилие фила Bacteroidetes и Firmicutes у свиней от исходного уровня и в течение периода интервала диеты до конечной точки. В случае Firmicutes мы наблюдали увеличение относительного обилия этого типа от базовой линии до конечной точки, как у клонированных, так и не клонированных свиней, и обнаружили положительную корреляцию с Firmicutes и увеличением веса. Это увеличение численности Фирумцев с увеличением веса согласуется с наблюдениями, сделанными в других исследованиях
[15]. Одно исследование
[29], указывают на связь между изменениями потребления энергии и изменениями микробиоты кишечника, такими как увеличение численности Firmicutes. Jumpertz и его коллеги
[21] обнаружили, что 20% -ное увеличение численности Firmicutes привело к увеличению урожая энергии, соответствующего примерно 150 килокалориям. Это говорит о том, что цветение бактерий, принадлежащих к Фирумму Филюма, способствует развитию ожирения и поддержанию состояния ожирения.

Относительная распространенность бактерионитов у клонированных свиней непрерывно снижалась через период интервенции диеты, но затем постепенно начинала расти до тех пор, пока животные не были подвергнуты эвтаназии. То же самое наблюдалось в не клонированной контрольной группе свиней, и, в конечном счете, относительное количество бактериотетов в конечной точке не отличалось от исходного. Это было неожиданно, так как ранее было показано, что у тучных испытуемых меньше бактериотетов по сравнению с их более компактными аналогами
[10,16,30]. Кроме того, одно исследование на людях в полках потери веса показало
[15] увеличение Bacteroidetes. Одно из объяснений наблюдений, сделанных в нашем исследовании, может заключаться в том, что бактерии, принадлежащие к типу Bacteroidetes, каким-то образом адаптируются к HF / высококалорийной диете, а их количество в конечной точке в конечном итоге достигает значений, наблюдаемых на исходном уровне. Хильдебрандт и др. [29] продемонстрировали снижение Bacteroidetes и увеличение Firmicutes в кишечной микробиоте мышей, не зависящих от ожирения, но по отношению к рациону HF у мышей
[29], в то время как другие исследования указывают на связь ВЧ-диеты и изменений в численности Firmicutes у мышей
[4]. Вместе эти исследования показывают, что изменения в кишечной микробиоте могут быть вызваны HF / высокой калорийностью, а не состоянием ожирения. Несмотря на то, что мы нашли положительную связь между увеличением веса и изменениями относительного обилия Фирмы, мы не можем исключить возможность того, что изменения были также связаны с HF / высококалорийной диетой. Таким образом, кишечная микробиота может быть потенциальной терапевтической целью для борьбы с ожирением.

Здесь мы заключаем, что клонированные свиньи, по-видимому, не имеют меньших межличностных изменений по сравнению с не-клонированными свиньями-братьями, относящимися к их микробиоте кишечника, и потому что они являются трудоемкими и дорогостоящими, они не более подходят, чем обычные свиньи для исследований, связанных с кишечным микробиота-ожирением.

Наши результаты согласуются с гипотезой о том, что ожирение, вызванное диетой, связано с изменениями относительного обилия Firmicutes и Bacteroidetes и особенно увеличением доли бактерий, принадлежащих к филадельфическим фирмам. Мы также указываем на HF / высококалорийную диету как фактор, способствующий изменению микробного сообщества кишечника. Насколько нам известно, это первое исследование, которое исследовало влияние ожирения, вызванного диетой на кишечную микробиоту у клонированных свиней. Необходимо провести дополнительные исследования, чтобы оптимизировать клонирование экспериментальных животных, которые в конечном итоге могли бы предложить более контролируемую экспериментальную модель.

Все авторы не заявляют никаких финансовых или иных конкурирующих интересов.

MB, LM и RP разработали экспериментальные эксперименты. РП провела экспериментальную работу, данные и статистический анализ и написала рукопись. A.D.A выполнил статистический анализ разнообразия T-RFLP Shannon-Weaver и PCA и внес вклад в написание рукописи. JS разработала и провела эксперименты с животными и диетой. Все авторы читали, исправляли и утверждали окончательную рукопись.

Обзор T-RF (bp) у клонированных и не клонированных свиней и возможная таксономия бактерий, по оценкам
            
              в силиконе
            
            через онлайн-базу данных MICA.

Нажмите здесь для файла

Корреляция между приростом массы и относительным обилием бактерионитов и твердых веществ. Корреляция между весовым коэффициентом и относительным обилием бактериотетов, рассчитанная по корреляции Спирмена у клонированных свиней (r = -0,33, P <0,04) и не клонированных контрольных свиней и корреляции между коэффициентом усиления веса и относительной распространенностью Firmicutes у клонированных свиней (r = 0,37, P <0,02) и не клонированных контрольных свиней (r = 0,45, P <0,006). Каждый цвет представляет собой свиньи в этой группе, то есть свиньи 1 обозначают красную точку и так далее.

Нажмите здесь для файла

Эта работа была поддержана грантом Датского совета по стратегическим исследованиям (FØSU 2101-06-0034) и Датским исследовательским советом FTP (09-6649307). Мы хотели бы поблагодарить Софию Расмуссен и Джоанну Аменувор за отличную техническую помощь.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *