Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Парадоксальная роль опухолевого супрессора для фактора обмена Rac1 Vav1 в Т-клеточной острой лимфобластной лейкемии

A Paradoxical Tumor-Suppressor Role for the Rac1 Exchange Factor Vav1 in T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5691892/

Факторы обмена гуанина Rho (GEFs), ферменты, которые стимулируют Rho GTPases, считаются потенциальными терапевтическими мишенями из-за их протуморигенных функций. Однако понимание спектра их патобиологических ролей в опухолях все еще очень ограничено. Мы сообщаем здесь, что GEF Vav1 неожиданно обладает функциями опухолевого супрессора в незрелых Т-клетках. Эта функция влечет за собой некаталитическое зарождение комплексов между ubiquitin лигазой Cbl-b и внутриклеточным доменом Notch1 (ICN1), которое способствует ингибированию ICN1 и деградации. Абляция Vav1 способствует передаче сигналов ICN1 и развитию острого лимфобластного лейкоза Т-клеток (T-ALL). Нижняя регуляция Vav1 необходима для патогенеза человеческого T-ALL клинического подтипа TLX +, что еще более подчеркивает супрессорную роль этого пути.


              Vav1-дефицитные мыши сильно подвержены раннему кортикальному, Notch1-зависимому T-ALL

Роблес-Валеро и др. что Vav1 облегчает связывание Cbl-b во внутриклеточном домене Notch1 (ICN1) и способствует деградации ICN1. Потеря Vav1 индуцирует острый лимфобластный лейкоз T-клеток (T-ALL), увеличивая передачу сигналов ICN1, а TLX ингибирует экспрессию Vav1, чтобы стимулировать передачу сигналов ICN1 в TLX + T-ALL.

Дефицит Vav1 способствует развитию незрелых опухолей T-клеток у мышей

(A) Скорости выживания мышей указанных генотипов при введении DMBA.

(B) Поверхностный иммунофенотип тимоцитов от контрольных и Vav1 — / — мышей (две верхние панели) и из типичных случаев основных патологических классов, обнаруженных у опухолевых Vav1 — / — мышей (другие панели). Числа в каждом квадранте указывают относительный процент каждой популяции клеток.

(C) Резюме типов опухолей, полученных во время смерти мышей.

(D) проточную цитометрию DN-gated thymocytes из здоровой (не обработанной DMBA) и опухолевой опосредованной ДНК (обработанной DMBA) Vav1 — / — мышей при окрашивании антителами к CD44 и CD25. Аналогичные данные были получены в 15 независимых определениях.

(E) проточная цитометрия, показывающая процентное соотношение клеток, окрашивающих положительные значения для внутриклеточного TCRβ (ic, синего) и мембранного TCRβ (м, красного) в DN2 (две левые панели) и общей популяции DN (правая панель) из здорового (не обработанного с DMBA) и DN-опухолевидной (DMBA-обработанной) Vav1-мыши. Аналогичные данные были получены в 15 независимых определениях опухолевых мышей DN.

(F) проточную цитометрию тиоцитов с CD8-защитой от здоровой (не обработанной DMBA) и опухолевой опосредованной лимфоцитами CD8 + (DMBA-обработанной) Vav1 — / — мыши при окрашивании антителами к CD24 и TCRβ. Аналогичные данные были получены при 40 независимых определениях мышей, несущих CD8 +. Imm, незрелые клетки ISP; Мат, зрелые цитотоксические Т-клетки.

(G) проточная цитометрия, показывающая процент незрелых одиночных положительных (ISP) и CD8 + цитотоксических T (Tc) клеток, окрашивающих положительные значения для icTCRβ (синий) и mTCRβ (красный) в указанных популяциях клеток здорового (не обработанного DMBA) и CD8 + опухолевидный (обработанный DMBA) Vav1 — / — мышь. Аналогичные данные были получены при 40 независимых определениях мышей, несущих CD8 +.

(H) Схема дифференцировки Т-клеток, показывающая стадии (красный) и блоки развития (кресты), обнаруженные в опухолях у мышей Vav1 — / -. Шаги, зависящие от канонических функций Vav1, находятся в зеленом цвете. DP, двухполюсные (CD4 + CD8 +) клетки; TH, CD4 + хелперных Т-клеток.

См. Также рисунки S1 и S2.

Vav1 — / — Опухоли показывают нечеткие функциональные особенности

(A) Транскрипты обычно повышались (красные) и снижались (синие) в опухолях DN и CD8 +, возникающих у мышей, обработанных DMBA Vav1 — / -. В качестве сравнительного контроля мы использовали тимоциты у необработанных мышей Vav1 — / — (без опухоли). Строки представляют собой независимые реплики. Общее количество транскриптов указано внизу.

(B) Растровая карта upregulated и downregulated «общие» оценки обогащения сигнатур генов Vav1 — / — опухоли, рассчитанные с использованием ssGSEA для транскриптомов тимоцитов у мышей WT или из нетумогенных (NT) и прелейкемических (PL) Zfp36l1 — / -; Zfp36l2 — / — мышей. Образцы с высокой подгонке подписи обозначены вертикальными черными полосками. Показатели обогащения изображены на темно-синей (самой низкой) до темно-красной (высшей) шкале.

(C) График участка «общей» сигнатуры гена опухолевого гена Vav1 — / — соответствует указанным экспериментальным группам. Коробки представляют собой центральные 50% данных (от нижнего 25-го процентиля до верхнего 75-го процентиля), строки внутри ящиков представляют медианную (50-й процентиль), а усы расширены до самой крайней точки данных, которая не превышает 1,5 раз межквартильный диапазон от края коробки. *** p ≤ 0,001 (согласно критерию Тьюки по достоверной значимости [HSD]).

(D и E) GSEA для «общей» матрицы экспрессии гена опухоли Vav1 — / — (D и E, левые графы), используя в качестве гена дифференцированные экспрессируемые гены из Zfp36l1 — / -; Zfp36l2 — / — мыши (D) и ICN1-трансформированные CD4 + CD8 + TCRα / β + клетки (E). Профиль экспрессии первых 25 генов переднего края в upregulated (D и E; правые верхние кластеры) и downregulated (D и E, правый нижний кластер) ген устанавливает в транскриптоме тимоцитов из здоровой (без опухоли) опухоли DN (опухоль DN) и опухоли CD8 + (CD8 + опухоль) Vav1 — / -. Нормированные оценки обогащения (NES) и ложные значения скорости обнаружения (FDR, используя значения q) указаны внутри каждого графика GSEA. q-val, q.

(F) Обилие указанных транскриптов (снизу) в нефракционированных клетках тимуса у контрольных и опухолевых мышей (выделенных по иммунофенотипу опухолевых клеток). Значения даны относительно выражения каждого транскрипта в образцах, полученных из контролей WT (n = 15 животных на каждый проанализированный класс).

(G) Определение проточной цитометрии содержания ICN1 в образцах из указанных когортных клеток. Каждая точка представляет собой измерение отдельной мыши (n = 13 [WT — DMBA], 13 [Vav1 — / — — DMBA], 9 [WT + DMBA, без опухоли], 7 [WT + DMBA, опухолевые положительные] и 13 [Vav1 — / — + DMBA, опухолевые положительные] животные).

(H) Вестерн-блот (WB), показывающий обилие ICN1 (верхний) и тубулин α (контроль загрузки, снизу) в общих экстрактах тимуса от указанных мышей и условий эксперимента.

(I) Определение проточной цитометрии содержания ICN1 в указанных популяциях клеток (снизу) и когортах животных (вставка). f.i., средняя интенсивность флуоресценции относительно контрольного антитела, сопоставленного с изотипом.

В (F), (G) и (I) данные представляют собой среднее ± SEM. Статистические значения, полученные с использованием t-критерия Стьюдента (F и I) или теста Манна-Уитни (G), приведены относительно необработанных контролей WT или указанных экспериментальных пар (в скобках). * P ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. См. Также Рисунок S3; Таблицы S1 и S2.

Vav1 — / — T-ALL зависит от Notch1

(A) Кривые выживания обработанных DMBA Vav1 — / — мышей с (n = 5) и без (n = 4) DAPT-введения (период лечения затенен серой).

(B) Пролиферацию указанных клонов опухолевых клеток (Cl1-Cl4, см. Вставку для цветового кода) от мышей Vav1 — / — в присутствии слоев клеток OP9-GFP или OP9-DL1. Иммунофенотип каждого клона указывается на вставке. Аналогичные результаты были получены с 3 и 6 независимыми клонами иммунофенотипа DN и CD8 +, соответственно.

(C) Схема экспериментов, проведенных в (D).

(D) Кривые выживания мышей WT при последовательных инъекциях указанных клонов Vav1 — / — T-ALL (n = 5 на клон). Клоны 1-4 — это те, которые показаны в (B). Клон 5 (Cl5) является дополнительным CD8 + клоном опухолевых клеток. Число (x) и цикл инъекции (y) каждого клона указаны с использованием обозначения Clx.y.

(E) Число и процентное соотношение клонов Vav1 — / — DN и CD8 + T-ALL, которые воссоздавали T-ALL в проходе 1 в соответствии с анализом проточной цитометрии, проведенным в указанных тканях неизлечимо больных животных-реципиентов.

(F) Обнаружение T-ALL у мышей, которым вводили опухолевые клетки DN (n = 9) и CD8 + (n = 11) в указанных тканях на основании экспрессии CD4 и CD8.

(G) Выживание клеточных клонов Vav1 — / — T-ALL, культивируемых на клетках OP9-DL1, либо в отсутствие (+ ДМСО), либо в присутствии соединения E (+ Comp. E). Вставка показывает обилие ICN1 в одном из этих клонов (Cl3) после выделения из мышей (1), культивирования на клетках OP9-DL1 (2) и после 5 дней лечения соединением E (3).

В (B) и (G) данные представляют собой среднее ± SEM. * P ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 относительно контролей времени-0 (t-критерий Стьюдента).

Vav1 регулирует деградацию ICN1

(A) Изобилие Vav1, ICN1 и тубулина α в полных клеточных лизатах (TCL) из указанных клеток. Спасенный стабильный пул VAV1 — / — ячеек Jurkat, в которых Vav1WT был повторно выражен.

(B) Изобилие отобранных мРНК в указанных клетках Jurkat (n = 3).

(C) активность RBPJκ-чувствительных (левых) и HES1 (правых) промоторов в указанных клетках. Значения приведены относительно клеток WT (n = 3).

(D) Изобилие эндогенных и эктопических ICN1 в TCL из клеток, используемых в (C) (верхняя панель). В качестве контроля загрузки (нижняя панель) использовали эндогенный тубулин α.

(E) Изобилие ICN1 (верхний) и тубулин α (внизу) в TCL из указанных клеток и состояний (n = 3).

(F) Количественное определение численности ICN1 в соответствии с данными, собранными в (E) (n = 3).

(G) Клеточные экстракты из клеток Jurkat, коэкспрессирующие HA-убиквитин и ICN1, были иммунопреципитированы (IP) антителами к HA для определения количества убиквитинилирования эктопических ICN1 (верхних) и эндогенных белков (в середине) иммуноблоттом. Равные количества экспрессии ICN1 в клетках подтверждали с помощью анализа WB с использованием TCLs (внизу) (n = 3). Верхняя и нижняя панели были промокали антителами к ICN1. Средняя панель была промотана антителами к НА-эпитопу. Ub, ubiquitinylated.

(H) активность Presenilin в указанных клетках Jurkat (внизу) и условиях анализа (вставка) (n = 3).

(I) Изобилие эндогенного ICN1 в TCL из CEM (верхние панели) и клетки Molt4 (нижние панели), экспрессирующие контрольную (Ctl.) Или две независимые (sh1 и sh3) VAV1 shRNAs (n = 3).

В (B), (C), (F) и (H) данные представляют собой среднее ± SEM. ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001, используя тест Стьюдента (B, C и F) и тест Манна-Уитни (H). См. Также Рисунок S4.

Vav1 модулирует ICN1 в Cbl-b-зависимом манере

(A) Используются муравьи Vav1 (точечные мутации, изображенные как открытые круги). Минимальная область для Vav1-зависимого регулирования маршрута Notch1 затенена синим цветом.

(B) промоторная активность HES1 клеток VAV1 — / — Jurkat, экспрессирующих указанные EGFP (снизу) (n = 5).

(C) активность промотора HES1 в нестимулированных (-α-CD3) и стимулированных (+ α-CD3) WT и TCRmut клетках Jurkat, экспрессирующих указанные EGFP (снизу) (n = 3).

(D) изобилие ICN1, тубулина α и Cbl-b в клетках Jurkat, экспрессирующих контрольную (Ctl.) И четыре независимые (sh1-sh4) CBLB-сРНК. Определение проводили WB с использованием либо TCL (ICN1, тубулин α), либо иммунопреципитированного Cbl-b. + Cbl-b, WT клетки Jurkat, эктопически выражающие Cbl-bWT (n = 3).

(E) Изобилие указанных транскриптов в клетках, используемых в этих экспериментах (n = 3). Клетки обозначаются как (D).

(F) Структура Cbl-b и локализация мутации Y363F. TKB, связывающий домен тирозинкиназы; RING, RING домен; UBA, ubiquitin-ассоциированной области.

(G) промотора HES1 в указанных клетках при трансфекции пустым вектором (None) или плазмидами, экспрессирующими указанные белки Cbl-b (n = 3). Клетки обозначаются как (D).

(H) ubiquitнилирования ICN1 в указанных клетках после подхода, описанного на фиг. 4G (n = 3). KD, нокдаун.

(I) Обнаружение эндогенных Vav1 (верхняя панель) и Cbl-b (средняя панель) в иммунопреципитатах ICN1 (нижняя панель) в указанных клетках Jurkat.

В (B), (C), (E) и (G) данные представляют собой среднее ± SEM. ** p ≤ 0.01 (тест ученика t). См. Также Рисунок S5.

Структурные требования к комплексообразованию Vav1-Cbl-b-ICN1

(A) CoIP белков Vav1 с Cbl-b в клетках Jurkat, эктопически выражающих указанные комбинации белков (сверху). Количество иммуноосажденного Cbl-b оценивали путем повторного захоронения того же фильтра с антителами к Cbl-b (третья панель сверху). Экспрессию эктопических белков Vav1 (четвертая и пятая панели сверху) и эндогенный тубулин α (контроль загрузки, нижняя панель) определяли WB с использованием аликвот TCL, используемых на стадии иммунопреципитации.

(B) Определение мутантов Cbl-b, используемых в этих экспериментах. Мутации показаны как открытые круги.

(C) CoIP Vav1 с указанными белками Cbl-b (сверху) в клетках Jurkat. Контролируют иммунопреципитацию и экспрессию белков, как указано в (А).

(D) CoIP белков Vav1 с ICN1 в клетках Jurkat, эктопически выражающих указанные комбинации белков (сверху). Количество иммуноосажденного ICN1 оценивали путем повторного захоронения того же фильтра с антителами к ICN1. Экспрессию эктопических белков Vav1 и эндогенного тубулина α (контроль загрузки) определяли как в (A). Звездочка знаменует α-полосу тубулина из предыдущего иммуноблота того же фильтра.

(E) Определение мутантов ICN1, используемых в этих экспериментах. TM, трансмембранный; NLS, сигнал ядерной локализации; TAD, область трансактивации. Домен, удаление которого приводит к потере привязки Vav1, затеняется светло-голубым.

(F) CoIP Vav1 с мутантными белками ICN1 в клетках Jurkat, экспрессирующими указанные комбинации белков (сверху). Контроль иммунопреципитации и экспрессии белков проводили, как указано в предыдущих панелях. Звездочки во второй и третьей панелях сверху указывают полосу иммуноглобулина G антитела на ICN1 и полосу ICN1, оставшуюся от предыдущего иммуноблота того же фильтра, соответственно.

(G) CoIP Cbl-b и указывали мутантные белки Vav1 с ICN1 в клетках WT и VAV1 — / — Jurkat. Контроль иммунопреципитации и экспрессии белков проводили, как указано в предыдущих панелях. lo и hi относятся к низкой и высокой экспозиции той же пленки, соответственно.

(H) CoIP Vav1 с ICN1 в нокауте WT и CBLB (клон # sh1) клетки Jurkat. Контроль иммунопреципитации и экспрессии белков проводили, как в предыдущих панелях.

(I) Краткое описание взаимодействий, обнаруженных в этих экспериментах. Прямые coIP и каталитические взаимодействия показаны с использованием черных и серых стрелок соответственно. Ub, убиквитинилирование.

См. Также Рисунок S6.

Vav1 сглаживается в TLX + T-ALL

(A) Карта нагрева указанных мРНК (слева) в наборе данных T-ALL 1. Идентификационный номер (слева) и молекулярный подтип пациентов (сверху) указаны. Охват отношения журнала сигналов изображен, как на рисунке 2A.

(B) Scatterplot, показывающий экспрессию VAV1 по указанным подтипам T-ALL человека (внизу) с использованием набора данных микрочипов 1. Точки представляют значения из отдельного образца. Бары представляют среднее значение выражения ± SEM для общего набора образцов. *** p ≤ 0,001 (тест HSD от Tukey).

(C) Scatterplot, показывающий изобилие VAV1 против суммарного количества выражения TLX1 / TLX3 с использованием набора данных 1. Точки представляют значения из отдельных выборок.

(D) генерируемая ssGSEA тепловая карта генов up- and downregulated «опухолеспецифической» сигнатуры Vav1 — / — / Zfp36l1 — / -; Zfp36l2 — / — в случаях T-ALL из набора данных 1. Представлены оценки обогащения ssGSEA на темно-синей (минимальной) до темно-красной (самой высокой) шкале. Образцы с умеренными и высокими подписями подписи выделяются соответственно серым и черным полоскам. TS, опухолеспецифические.

(E) График участка зависимости от опухоли Vav1 — / — / Zfp36l1 — / -; Zfp36l2 — / — подгонка подписи подписи для указанных образцов подтипа T-ALL (внизу) и наборов данных микрочипов (верхний). Данные представлены, как показано на рисунке 2C. ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 (тест HSD от Tukey).

(F) Корреляционная матрица экспрессии из образцов TLX + T-ALL, положительная для «опухолеспецифической» сигнатуры Vav1 — / — / Zfp36l1 — / -; Zfp36l2 — / -, использующая набор данных 1. Положительная и отрицательная корреляция показана красным и синим , соответственно. Размер кругов и интенсивность цвета пропорциональны коэффициенту корреляции Пирсона, найденному для каждой пары транскриптов. Корреляции с значениями p ниже порога значимости 0,05 (который связан с коэффициентом корреляции Пирсона выше 0,39 для набора данных 1) считаются статистически значимыми и помечены звездочками. Отрицательные регуляторы маршрута Notch1 и ICN1 показаны соответственно красными и синими буквами.

(G) коэффициент корреляции Пирсона мРНК HES1 с указанными транскриптами (вставка) и наборами данных микрочипов (сверху). Горизонтальные синие ломаные линии изображают пороговое значение p-значения, используемое (0,05), для учета статистически значимой корреляции. TLXSP, TLX + T-ALL подпись положительная; T-ALLSN, подпись T-ALL отрицательная.

(H и I) Экспрессия эндогенного Vav1 в TCL из указанных линий клеток T-ALL (H) и опухолевых клеток, полученных из пациента (I) (n = 3). TLX и HOXA статус ячеек показан сверху.

См. Также Рисунок S7.

Опосредованная TLX понижающая модуляция Vav1 важна для патогенеза TLX + T-ALL

(A) Влияние эктопической экспрессии EGFP-TLX1 на обилие Vav1, ICN1 и Cbl-b в клетках Jurkat. Обнаружение EGFP-TLX1 и EGFP контролировали с использованием антител к GFP (четвертая панель сверху).

(B) Влияние нокдауна TLX1 в изобилии Vav1, ICN1 и Cbl-b в клетках ALL-SIL.

(C) Эффект нокдауна TLX3 в изобилии Vav1, ICN1 и Cbl-b в клетках HPB-ALL. Красные звездочки указывают панели, сгенерированные с использованием электрофорезированных TCL, переносимых на независимый нитроцеллюлозный фильтр.

(D и E). Пример (D) и количественное определение (E) эффекта эктопической экспрессии указанных белков EGFP-Vav1 в изобилии ICN1 в клетках HPB-ALL (n = 3).

(F) Влияние указанных белков Vav1 на активность промотора HES1 (n = 3).

(G) Влияние указанных белков EGFP-Vav1 на рост клеток HPB-ALL (n = 3).

(H и I). Влияние указанных белков EGFP-Vav1 на пролиферацию (H) и апоптоз (I) клеток HBP-ALL в отсутствие или наличие эктопически выраженного ICN1 (n = 3).

(J) Влияние экспрессии EGFP-Vav1WT и ICN1 на рост клеток HPB-ALL (n = 3).

(K и L). Пример (K) и количественное определение (L) эффекта EGFP-Vav1WT на уровнях ICN1 в опухолевых клетках у пациента TLX1 + T-ALL (n = 3).

(M и N). Пример (M) и количественное определение (N) эффекта EGFP-Vav1WT при апоптозе опухолевых клеток у пациента TLX1 + (n = 3).

(O) Путь раскрыт в этой работе. Супрессор Vav1 и канонические маршруты показаны соответственно зеленым и черным. Комплекс Vav1-Cbl-b-ICN1 изображен как серый квадрат. Заболевания и условия эксперимента, нарушающие эту сигнальную ось, красны.

Данные, показанные в (E-J), (L) и (N), представляют собой среднее ± SEM. * P ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 (тест ученика t). См. Также рисунок S8.

X.R.B. (BIO / SA01 / 15, CSI049U16), Министерство экономики и конкурентоспособности Испании (MINECO) (SAF2015-64556-R, RD12 / 0036/0002), Всемирные онкологические исследования (14-1248) ), Фонд Рамона Арекса и Испанское общество против рака. L.E. (PI13 / 00448), A.B. (SAF2013-40922-R, RD12 / 0036/0054) и M.L.T. (SAF2013-44857-R, RD12 / 0036/0075) поддерживаются грантами MINECO. Испанское финансирование частично поддерживается Европейским фондом регионального развития. Мы благодарим М. Бласкеса за лабораторную работу, Р. Валиенте за анализы ChIP-seq, М. Досиль за комментарии к рукописи и персонал КИП за техническую помощь.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *