Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Система CRISPR / Cas9 эффективно восстанавливает опухолегенную способность BCR / ABL in vitro и в модели ксенотрансплантата хронического миелоидного лейкоза

The CRISPR/Cas9 system efficiently reverts the tumorigenic ability of BCR/ABL in vitro and in a xenograft model of chronic myeloid leukemia
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5432235/

Соавтор первых авторов, эти авторы внесли одинаковый вклад в работу

Эти авторы внесли одинаковый вклад и разделяют старшее авторство

Технология CRISPR / Cas9 использовалась для отмены экспрессии онкопротеинов p210 в клеточной линии Boff-p210, линии pro-B, полученной из интерлейкина-3-зависимого Baf / 3, которая демонстрирует независимость от IL-3, возникающую из конститутивной экспрессии BCR- ABL p210. Используя этот подход, были получены пулы клеток, отредактированных Boff-p210, и отдельные отредактированные клеточные клеи и были функционально изучены in vitro. Потеря экспрессии p210 в клетках Boff-p210 приводила к потере способности расти в отсутствие IL-3, как родительская линия Baf / 3, демонстрируя значительно повышенные уровни апоптоза. Примечательно, что в одном отредактированном клеточном клоне, несущем мутацию с сдвигом кадров, которая предотвращает экспрессию онкопротеина р210, эффекты были еще более резкими, что привело к гибели клеток. Эти отредактированные клетки инъецировали подкожно у мышей с ослабленным иммунитетом и наблюдали рост опухоли в течение трех недель. BCR / ABL-отредактированные клетки развивали меньшие опухоли, чем те, которые происходят из неотредактированных родительских клеток Boff-p210. Интересно, что единственный отредактированный клеточный клоун не смог развить опухоли, аналогичные тому, что наблюдается с родительской клеточной линией Baf / 3.

Технология геномного редактирования CRISPR / Cas9 позволяет абляцию слитого гена BCR / ABL, вызывая отсутствие экспрессии онкобелка, и блокирует его опухолеобразные эффекты in vitro и in vitro ксенотрансплантационную модель CML. Будущее применение этого подхода в моделях CML in vivo позволит нам более точно оценить ценность технологии CRISPR / Cas9 в качестве нового терапевтического инструмента, который преодолеет устойчивость к обычным методам лечения пациентов с ХМЛ.

Известно, что слитые белки, являющиеся результатом хромосомных перегруппировок, способствуют патогенезу различных гематологических новообразований, таких как хроническая миелоидная лейкемия (ХМЛ). ХМЛ представляет собой злокачественное миелопролиферативное расстройство, вызванное кроветворными стволовыми клетками, которые приобретают обратную транслокацию между длинными плечами хромосом 9 и 22: t (9; 22) (q34; q11) [1-3]. Эта транслокация генерирует онкогенный слитый белок BCR-ABL, который содержит конститутивную активность тирозинкиназы. Характерная экспрессия этого онкобелка трансформирует гемопоэтические клетки-предшественники путем активации бегущих сигнальных белков, которые увеличивают выживаемость и пролиферацию клеток [4].

Обработка CML основана преимущественно на использовании ингибиторов тирозинкиназы (TKI), особенно мезилата иматиниба, которые были очень эффективны для увеличения ожидаемой продолжительности жизни пациентов с ХМЛ в последние десятилетия. Тем не менее, уничтожение CML все еще затруднено появлением резистентных к TKI клеток [5-7]. Механизмы устойчивости иматиниба могут быть BCR-ABL-зависимыми (генная амплификация или точечные мутации) или BCR-ABL-независимыми [8]. Поэтому для этих пациентов все еще необходима окончательная и эффективная терапевтическая стратегия [9].

В последнее время Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) / технология Cas9 инициировала новую эру редактирования генома, преодолевая ограничения предыдущих методов [10, 11], которые являются неэффективными, трудоемкими и трудоемкими процессами, препятствуя их общему приложения [12, 13]. Система CRISPR / Cas9 широко используется для генерации генетических мутаций в клетках человека [14-18] и для коррекции мутированных генов [19-22]. Система CRISPR / Cas9 создала новые возможности для моделирования заболеваний in vitro и in vivo, но в немногих исследованиях CRISPR / Cas9 была изучена возможность редактирования или коррекции генов слияния в результате хромосомных транслокаций [23-25].

Слияние BCR / ABL, которое отвечает за патогенез CML, является идеальной мишенью для генной терапии, основанной на CRISPR-Cas9. Более того, система CRISPR / Cas9 в подавляющем большинстве была принята в качестве мощного инструмента для создания моделей in vivo и in vitro и новых терапевтических возможностей для лечения заболеваний человека, включая гематологические состояния [26]. Таким образом, в настоящем исследовании показано применение CRISPR-Cas9 для усечения конкретного гибрида BCR-ABL (p210) на генетическом уровне в клеточной модели. Кроме того, были проведены функциональные исследования для оценки влияния p210 на клеточный цикл и апоптоз. Эксперименты in vivo проводили для определения того, была ли его опухолегенная способность блокирована с помощью мышиных ксенотрансплантатов. Насколько нам известно, это первый раз? Система геномного редактирования CRISPR / Cas9 использовалась для модификации гибридного гена BCR / ABL, успешно предотвращающего его возможные онкогенные эффекты.

Boff-p210 является онкоген-зависимой клеточной линией, в которой экспрессия онкогенного слияния BCR / ABL человека дает возможность выживать и размножаться в отсутствие ИЛ-3 [27]. Анализ клеточного цикла Boff-p210, культивируемый в отсутствие ИЛ-3, подтвердил эту способность, в отличие от неконтролируемой родительской клеточной линии Baf / 3, которая нуждается в ИЛ-3 для выживания и пролиферации [28]. Геном Boff-p210 был отредактирован с использованием технологии CRISPR-Cas9 для обрезания онкогена BCR / ABL и инактивации его злокачественного потенциала.

Чтобы оценить редактирование генов человека с использованием технологии CRISPR / Cas9 в клеточной линии, зависящей от p210, клетки Boff-p210 трансдуцировали лентивирусом, экспрессирующим конститутивный Cas9, тем самым установив клеточную линию Boff-p210 Cas9. Активность нуклеазы Cas9 затем оценивали путем трансдукции Boff-p210 Cas9 и ее родительской клеточной линии с плазмидой, кодирующей как GFP, так и sgRNA против GFP [29]. Через десять дней анализ FACS показал при трансдукции с этим вектором уменьшение на 80% частоты GFP-положительных клеток в активной линии экспрессии CAT9 по сравнению с родительскими клетками Boff-p210 (рисунок 1A), что указывает на эффективную экспрессию активной нуклеазы Cas9 в клетках Cas9 Boff-p210.

(A) Генерация линии клеток Boff-p210 Cas9. (Левая панель) FACS, показывающие более низкую частоту GFP-положительных клеток в экспрессирующих Cas9 клетках по сравнению с родительскими клетками, оба трансдуцированные с pXPR011. (Правая панель) Количественная оценка выражения GFP (среднее ± SD). (B) Схематическое изображение трансгенного гибрида BCR / ABL и последовательности sgRNAs для редактирования. Схематическое представление трансгенного гибрида BCR / ABL и последовательности трех sgRNAs, предназначенных для редактирования BCR / ABL. Одна из них, Bcr-Abl sgRNA (выделенная красным ящиком) имела 10 bp, комплементарные последовательности BCR, и 10 bp, комплементарные к ABL-геном, обеспечивая высокую специфичность с помощью последовательности гена слияния. Tk-Abl 1 и Tk-Abl 2 sgRNA комплементарны последовательности ABL. Стрелка указывает на ожидаемый участок расщепления Cas9. PAM (выделено в черном ящике) является ориентированным на протоспасера ​​мотивом, необходимым для активности нуклеазы Cas9.

Для генетического инактивации онкогена BCR / ABL использовали три специально разработанные однонаправленные РНК (sgRNAs). Эти специфические sgRNAs направляют Cas9 на последовательность слияния BCR / ABL (Bcr-Abl sgRNA) или на последовательность тирозинкиназы Abelson (Tg-Abl 1 sgRNA и Tk-Abl 2 sgRNA), 40 нуклеотидов ниже точки плавления (фиг.1B) , Три отдельных теста на лентивирусную инфекцию проводили с каждой sgRNA для генерации трех разных клонов Boff-p210 с отредактированным онкогеном BCR / ABL, создавая три отредактированных пула клеток Boff-p210 Cas9.

Секвенирование Sanger продемонстрировало наличие мутаций indel в ожидаемых местах во всех анализах CRISPR-Cas9 с каждой рг10-sgRNA, в то время как изменения mgRNA не наблюдались (рисунок 2A). Анализ отслеживания индексов методом декомпозиции (TIDE) идентифицировал SgRNA BCR-ABL как наиболее эффективную sgRNA испытуемых, при этом 85% пула клеток Boff-p210 Cas9 были отредактированы (Bcr-Abl-EP в дальнейшем) (рисунок 2B, таблица 1) , Аналогичным образом, алгоритм предсказывал различные закономерности восстановления генома, главным образом, делеции в 11 основаниях, смежных с точкой расщепления. Наиболее часто предсказываемыми мутациями были делеция 8 п.о. (18,5%), вставка 1 п.о. (17,5%), делеция 11 п.о. (10,2%) и делеция 1 п.о. (9,1%) (рисунок 2В, табл. 1).

(A) Секвенирование Sanger области слияния BCR / ABL в клетках Boff-p210. Клетки Boff-p210, экспрессирующие mock sgRNA, используемые в качестве контроля, имели последовательность дикого типа, тогда как клетки, экспрессирующие scrRNA Bcr-Abl (Bcr-Abl-EP), Tg-Abl1 sgRNA (Tk-Abl1-EP) и Tk-Abl2 sgRNA (Tk-Abl1-EP) показала смесь последовательностей вокруг ожидаемой точки расщепления Cas9. (B) Анализ алгоритма декомпозиции TIDE отредактированной последовательности в клетках Bcr-Abl-EP, показывающий высокую эффективность редактирования в ожидаемой точке расщепления. Нижняя панель иллюстрирует сигнал аберрантной последовательности в ячейках Boff-p210 (черный) и Boff-p210 (зеленый) и ожидаемый сайт расщепления (вертикальная пунктирная линия). (C) ДНК-последовательностей колоний клонирования ДНК после ПКР модифицированной Boff-p210 клеточной ДНК. Мы сравниваем три индуцированные мутации с исходной последовательностью. (D) Секвенирование следующего поколения в области трансгенной мишени. На верхней панели показаны проценты каждой базовой пары в секционированной области. На нижней панели показаны обычно секвенированные варианты для CRISPR-нацеленного трансгена Bcr / Abl в клетках Boff-p210. Сайт sgRNA-target отображается красным цветом, последовательность PAM в виде текста подчеркнута красным цветом, а сайт расщепления обозначен треугольником. Показаны количество показаний для каждого варианта и предсказанный эффект мутации. (E) В силиконовом анализе клона на основе одной клетки. Clone 1 показал удаление 8 п.н., что привело к стоп-кодону и преждевременному завершению перевода. Он был выбран для установления клеточной линии Bcr-Abl-SC.

Аналогичные индели были получены с помощью SgRNA TK-Ab l 1 и TK-Abl 2, хотя общая прогнозируемая эффективность редактирования (54,6% и 68,8% соответственно) была ниже, чем у ScrRNA Bcr-Abl (таблица 1). Таким образом, Bcr-Abl sgRNA выбирали для подтверждения мутаций indel, генерируемых системой CRISPR / Cas9. Целевую ДНК из клеток Bcr-Abl-EP субклонировали с помощью ПЦР. Колонии были секвенированы методом Сангера, чтобы подтвердить, что мутации, переносимые клонов, соответствовали изменениям, предсказанным алгоритмом TIDE: 1-bp-вставка, 1-bp или 8-bp делеции (рисунок 2C). Эти данные свидетельствуют о том, что эти мутации часто возникают, когда клетка восстанавливает вызванное Cas9 расщепление. Более того, последовательность последовательности следующего поколения (NGS) выполнялась для последовательности целевой области клеток Bcr-Abl-EP (охват = 3386X). Было обнаружено несколько индексов вокруг ожидаемой точки расщепления Cas9 (рисунок 2D). Наиболее частыми индивидуумами (> 5%) были мутации смены кадра, вызывающие стоп-кодон, за исключением TTC-3bp-делеции (52 чтения), что вызывало потерю лейцина, но не изменяло рамку считывания нисходящего потока (рис. 2D). Поэтому большинство отредактированных клеток Bcr-Abl-EP показали мутации, которые производят усеченный p210-онкопротеин (рисунок 2D).

Следует отметить, что никакие измененные последовательности не были обнаружены ни в одном из пяти лучших потенциальных мишеней-мишеней Bcr-Abl sgRNA (таблица 2), что свидетельствует о высокой специфичности активности системы CRISPR / Cas9, разработанной в наших экспериментальных процедурах.

Для генерации клона клеток Boff-p210 с укороченным онкопротеином BCR-ABL отдельные клетки из клеточной линии Bcr-Abl-EP сортировали по FACS. 41 одноцепочечные клоны были проанализированы секвенированием Секнера, что показало, что большинство из них (32/41) имели отредактированную последовательность (дополнительная таблица 1). Четыре из этих 32 клонов, показывающие мутации indel, которые генерировали преждевременный стоп-кодон вблизи точки расщепления Cas9, выбирали функциональный анализ (дополнительный рисунок 2A). Один из них (Clone 1), который переносил делецию в 8 п.о. в ожидаемой точке расщепления, был выбран для установления клеточной линии, известной как Bcr-Abl-SC (однократно отредактированный клеточный продукт Boff-p210-Cas9), рамка -shift была предсказана алгоритмом TIDE и подтверждена как ПЦР-субклонированием, так и NGS (рисунок 2E). В кремниевом анализе мутации в клоне 1 приводилось к образованию стоп-кодона ниже точки расщепления Cas9, что приводило к изменению открытой рамки считывания и последующего преждевременного конца перевода (рисунок 2E).

Чтобы подтвердить, что система CRISPR-Cas9 эффективно обрезает онкоген BCR / ABL, присутствие онкопротеина BCR-ABL тестировали вестерн-блот-анализом. В Baf / 3 (фиг. 3A) была обнаружена одна полоса, соответствующая белку ABL (140 кДа), а Boff-p210 также показала полосу 210 кДа, соответствующую слиянию BCR-ABL. Никаких изменений не наблюдалось ни в экспрессии BCR-ABL, ни в ABL в пулах отредактированных клеток (рисунок 3A). Аналогичные результаты были получены для клеточных линий sgRNAs TK-Abl (дополнительный рисунок 1A). Напротив, экспрессия белка BCR-ABL не обнаруживалась в клетках Bcr-Abl-SC (фиг. 3A, дополнительный рисунок 2B).

(А) Вестерн-блот-анализ экспрессии BCR-ABL. Экспрессия Abl (140 кДа) наблюдалась во всех клетках. Полоса 210 кДа, соответствующая экспрессия BCR-ABL наблюдалась в неотредактированных клетках Boff-p210 (контрольные образцы родительского и sgRNA) и в клетках Bcr-Abl-EP. Напротив, клетки Bcr-Abl-SC и Baf / 3 не проявляли экспрессии BCR-ABL. (B) Маркирование ацетамином V / пропидия йодидом клеток Boff-p210 через четыре дня в культуре в присутствии или отсутствии IL-3. Неотредактированные и макетные sgRNA-экспрессирующие клетки показали IL-3-независимый рост. Baf / 3 в качестве клеток Bcr-Abl-EP проявляли большую маркировку аннексина V после отмены ИЛ-3. Этот эффект был сильнее в клеточных линиях, полученных из однонаправленной клетки. (C) проточный цитометрический анализ клеток Bcr-Abl-EP. Никаких изменений не наблюдалось в фазах клеточного цикла Boff-p210 или ложных клеток, выращенных с IL-3 или без него. Высокие частоты клеток в фазе subG0 были обнаружены в отдельных модифицированных производных клетках, культивированных без IL-3, как в клетках Baf / 3. (D) Количественная оценка маркировки аннексина V (левый график, представленный как среднее ± SEM; *** p <0,001) и процент от Boff-p210-позитивных клеток (правый график).

Чтобы изучить последствия облитерирования in vitro онкогена BCR / ABL системой CRISPR-Cas9, процессы прогрессирования клеточного цикла и апоптоза были проанализированы в клетках, отреставрированных Boff-p210, в присутствии или отсутствии IL-3 для 4 дней.

Примером априонина V и PI были использованы для измерения апоптоза в клетках Boff-p210 с помощью проточной цитометрии через 4 дня в культуре в присутствии или отсутствии IL-3 (фиг. 3B). Мы одновременно анализировали распределение клеток в разных фазах клеточного цикла путем пермеабилизации с последующим окрашиванием PI (рис. 3C). Non-tumorigenic Baf / 3 клетки быстро умерли через 4 дня в ИЛ-3-изъятой среде (рис. 3А). После 4 дней лишения IL-3 73,3% клеток Baf / f3 проявляли окрашивание аннексином V (рис. 3B, 3D), и было четкое доказательство деградации олигонуклеосомной ДНК (содержание ДНК субГ0), характерное для апоптоза (рисунок 3C) , В отличие от этого, только 10-20% клеток sgRNA Boff-p210 или Boff-p210 Cas9 mokRNA, растущих с IL-3 или без них, были положительными для окрашивания аннексина V (рисунок 3B, 3D). Аналогично, различия в распределении фаз клеточного цикла не наблюдались в Boff-p210 и макетных клетках в присутствии или отсутствии IL-3 (фиг. 3C), при этом не было обнаружено признаков клеток в суб-G0. Однако выделение IL-3 в культурах клеток Bcr-Abl-EP приводило к увеличению окрашивания аннексина V (7,89% в среде с IL-3, 38,04% в отсутствие IL3), что указывает на то, что отредактированные клетки являются зависимыми от IL3 (рисунок 3B, 3D). Соответственно, мы наблюдали уменьшение фаз G1, S и G2 / M клеточного цикла в клетках Bcr-Abl-EP в отсутствие IL-3, тогда как присутствие IL-3 поддерживало жизнеспособность клеток этих клеток. Boff-p210 и неизданные клетки Boff-p210 (макет sgRNA assay) дали аналогичные результаты в распределении фаз клеточного цикла с средой с кондиционированием IL3 или без нее (рис. 3C). Аналогичный эффект наблюдался в клетках TK-ABL1-EP и TK-ABL2-EP в отсутствие IL-3 (дополнительный рисунок 1B).

Чтобы подтвердить, что потеря способности расти в отсутствие IL-3, наблюдаемого в пуле отредактированных клеток, была обусловлена ​​исключительно нарушением трансгена BCR / ABL, мы оценили эффект отмены IL-3 в отредактированной клеточной линии полученных из одной клетки (клетки Bcr-Abl-SC). Как и контрольные макеты и клетки Bcr-Abl-EP, клетки Bcr-Abl-SC показали низкую экспрессию аннексина V (11,23% клеток) и высокую жизнеспособность в присутствии IL-3 (фиг. 3B, 3C, 3D). Однако через 4 дня в культуре, лишенной ИЛ-3, большинство клеток (97,7%) показали высокий уровень окрашивания аннексином V (рисунок 3В, 3D), сопровождаемый фрагментированной ДНК (фиг. 3С). Драматический эффект, наблюдаемый в клеточной линии Bcr-Abl-SC, аналогичный таковой для клеток Baf / 3, указывает на то, что существует полное отсутствие функционального онкобелка BCR-ABL. Эти результаты были подтверждены в трех клонах, полученных из однонаправленной клетки, несущей усеченную последовательность BCR / ABL, в которой удаление ИЛ-3 вызывало аналогичный резкий эффект (дополнительный рисунок 2С).

Для определения эффектов разрушения онкогена Bcr / Abl in vivo фланки мышей SC17C SCID подкожно вводили Baf / 3, Boff-p210, Bcr-Abl-EP клетками и Boff-p210 Cas9 mock sgRNA (Boff- p210 mock). Мыши, которым вводили клетки Boff-p210 и клетки-мыши Boff-p210, развивали сходные обнаруживаемые опухоли (средняя масса: 663 мг и 445 мг соответственно). Напротив, мыши, инъецированные клетками Bcr-Abl-EP, вызывают значительно меньшие (около 60%) подкожные опухоли, чем те, которые были произведены нередактированными клетками (средняя масса: 172 мг, фиг. 4А и 4В). Как и ожидалось, клетки Baf / 3 не показали роста опухоли в этот период.

(A) Рост опухоли (мм3) в течение 24 дней после инъекции подкожных клеток. Подобный рост опухоли наблюдался в клетках Boff-p210 (серая полоса) и Boff-p210 Cas9 mock sgRNA (черные точки). Опухоли, образованные клетками Bcr-Abl-EP (линия черных квадратов), были в два раза меньше тех, которые были вызваны ранее. Рост опухоли наблюдался при введении отдельных отредактированных клеточных клеток (серая пунктирная линия), а также клеток Baf / 3 (темно-серые полосы). Сюжет показывает медианы и диапазоны; *** р <0,001). (B) Через 24 дня мышей умерщвляли и измеряли их массу опухоли. Конечная масса опухоли была уменьшена наполовину в случае отредактированных клеток пула (черные квадраты) относительно контролей (черные точки). Bcr-Abl-SC (серые точки) и Baf / 3 (черные треугольники) не смогли сформировать подкожную опухоль. Сюжет показывает медианы и диапазоны; ** p <0,05). (C) Внешний вид мышей и развитые опухоли через 24 дня после инъекции подкожных клеток.

Клетки Bcr-Abl-SC, несущие делецию в 8 п.н. (клон 1, дополнительный рисунок 2), были выбраны для проверки их опухолегенной способности путем инъекции во фланг мышей SC17 CB17C. Неизданные клетки Boff-p210 и клетки Baf / 3 также вводили в качестве контролей. Через 24 дня после инъекции рост опухоли отчетливо обнаруживался у мышей, которым вводили неизданные клетки Boff-p210. Напротив, рост опухоли не наблюдался у мышей, инъецированных клетками, полученными из однонаправленной клеточной линии, или с клетками Baf / 3 (фиг. 4A).

В этом исследовании мы изучили возможность использования технологии CRISPR / Cas9 для уничтожения слияния BCR-ABL, чтобы определить его влияние на лейкемические процессы in vitro и на модели ксенотрансплантатов CML. Система CRISPR / Cas9 недавно стала мощным инструментом редактирования генома [14, 30]. Нуклеазу Cas9 от Streptococcus pyogenes можно направлять с помощью простой комплементарности парных пар между первыми 20 нуклеотидами сконструированной sgRNA и целевой геномной ДНК-последовательности, представляющей интерес [31, 32]. Недавно эта технология была использована для коррекции генов точечных мутаций в клетках [20, 21, 33]. Однако, насколько нам известно, это первое исследование, в котором CRISPR / Cas9 был использован для предотвращения опухолегенной способности онкогенного слияния, такого BCR / ABL, путем индуцирования мутаций смены кадров.

Хорошо известно, что решающим генетическим событием в развитии ХМЛ является генерация обратной связи (9; 22) (q34; q11), обратная хромосомная транслокация [34], приводящая в основном к генерации онкопротеина BCR-ABL (p210) с конститутивной киназной активности [35-37]. Здесь в качестве клеточной модели используется опухолегенная линия клеток Boff-p210, которая особенно подходит для анализов BCR-ABL. Это интерлейкин-3- (IL-3) независимая клеточная линия, полученная из линии клеток Baf / 3 гематопоэза [38]. Boff-p210 экспрессирует онкоген BCR-ABLp210 в качестве трансгена, регулируемого тетрациклином, и может быть генетически модифицирован, расширен и затем повторно вводится в иммунокомпрометированные мыши. В отсутствие тетрациклина или доксициклина экспрессия BCR / ABL является конститутивной и дает клеткам Boff-210 способность выживать и пролиферировать в отсутствие ИЛ-3 [39].

Линию клеток Boff-p210, экспрессирующую конститутивно активный Cas9, генерировали для генетического инактивации онкогенов BCR / ABL человека, тем самым, чтобы избежать его патологического воздействия на клеточную линию Boff-p210. Три специфические sgRNAs против гибридного гена BCR / ABL были разработаны как направляющие РНК для Cas9. Один из них вызывает нуклеазу Cas9 против последовательности BCR / ABL-перехода, а другие два приводят ее к последовательности тирозинкиназы ABL. Система CRISPR-Cas9 была очень эффективной при индуцировании инделей в их целевых последовательностях со всеми используемыми sgRNA. Примечательно, что Bcr-Abl sgRNA был наиболее эффективным, и до 80% отредактированных ячеек.

Поскольку нуклеаза CRISPR / Cas9 может вызывать расщепления от цели, из-за неспецифического распознавания нецелевых последовательностей [40] была проверена целостность основных нецелевых последовательностей. Стоит отметить, что никакие внецелевые последовательности не наблюдались ни в одном из отредактированных пулов ячеек. Эти данные свидетельствуют о том, что система CRISPR / Cas9 является высокоспецифичной, о чем свидетельствуют более ранние исследования секвенирования целого генома [41-43].

Эффекты конститутивной активности BCR / ABL являются плейотропными и способствуют лейкемогенезу путем приобретения опухолевых способностей. Эти способности включают увеличение выживаемости клеток [4], предотвращение апоптоза [39, 44, 45] и продвижение геномной нестабильности путем снижения регуляции механизмов восстановления ДНК [46, 47]. В этой клеточной модели экспрессия онкобелка BCR-ABL индуцирует IL-3-независимую пролиферацию и выживаемость, тогда как клетки Baf / 3 требуют, чтобы IL-3 выживал и размножался (рисунок 3B-3D). Для изучения эффекта разрушения онкогена в этой клеточной модели были проведены исследования CRISPR-Cas9. Система CRISPR-Cas9 эффективно индуцировала различные мутации в ожидаемой точке ожидаемого расщепления, что привело к созданию сотового пула с несколькими измененными последовательностями BCR / ABL. Значительное увеличение гибели клеток наблюдалось в клетках Bcr-Abl-EP в отсутствие ИЛ-3, по сравнению с родительскими клетками Boff-p210 или ложными клетками Boff-p210. Однако в клетках Bcr-Abl-EP не наблюдалась массивная гибель клеток, что указывало на наличие отредактированных клеток с выживаемостью в отсутствие ИЛ-3. Это открытие было подтверждено тем фактом, что Bcr-Abl-EP не обнаружил значительных изменений в уровне экспрессии p210, как показано вестерн-блот-анализом. Как подтвердили NGS, система CRISPR-Cas9 вызвала несколько различных мутаций indel в наших отредактированных клеточных линиях. Некоторые из них были мутациями с изменением частоты, которые приводили к укороченным белкам, тогда как другие вызывали увеличение / потерю аминокислот, которые приводили к функциональному белку. Эти функциональные восстановленные белки p210 могут защитить клетки от апоптоза, вызванного изъятием IL-3, способствуя выживанию клеток нескольких клонов. Этот результат согласуется с предыдущими сообщениями о антиапоптотическом эффекте BCR / ABL [44, 45]. Чтобы избежать этого недостатка, из отредактированного пула была изолирована одна ячейка с определенной отредактированной последовательностью BCR / ABL. В частности, для дальнейших экспериментов был выбран конкретный одноклеточный клон с удалением 8 п.н. в точке расщепления. Выбранный клон клетки имел отредактированную последовательность p210, что давало начало преждевременному концу перевода. Фактически, экспрессия онкопротеина BCR-ABL не наблюдалась вестерн-блоттингом. Интересно отметить, что этот отредактированный клеточный клон показал самый высокий уровень апоптоза (более 97% клеток), когда он вырос в отсутствие ИЛ-3, по сравнению с тем, который наблюдался в клетках, которые не выражали р210.

Чтобы дополнительно проверить туморигенную способность клеток, отредактированных BCR-ABL, модель ксенотрансплантата была получена путем инъекции этих отредактированных клеток в мышей. Во всех случаях пул отредактированных Boff-p210 клеток вызывал подкожную опухоль через 24 дня после инъекции. Эти данные показывают, что клетки с функциональными онкопротеинами BCR-ABL сохраняют свои опухолевые свойства. Напротив, клоны клеток, полученные из однонаправленной клетки, не могли индуцировать опухоли во всех случаях. Этот результат демонстрирует, что CRISPR-Cas9 может эффективно предотвращать опухолегенный потенциал онкопротеина p210.

Несмотря на значительные улучшения в терапевтических стратегиях у пациентов с ХМЛ в последние десятилетия, вследствие использования ингибиторов тирозинкиназы, искоренение ХМЛ остается проблемой из-за появления лекарственной устойчивости. В контексте трансплантации стволовых клеток [48] использование технологии CRISPR-Cas9 может стать перспективным новым терапевтическим вариантом для пациентов с ХМЛ, которые развили резистентность к тирозинкиназе. Лейкозные стволовые клетки костного мозга могут быть отредактированы с помощью технологии CRISPR-Cas9 для обрезания слияний BCRL / ABL и усеченных клеток, специально отобранных до инфузии. Однако тот факт, что sgRNAs может переносить определенные несоответствия и что Cas9 интегрирован и постоянно производится, является ключевым пределом этой технологии. Использование интегративно-дефицитных лентивирусных векторов или комплексов рибонуклеопротеинов (9) -трансферазы, содержащих касцин (RNP) в первичные клетки, может представлять собой преимущество безопасности в терапии человека [49-51]. Дальнейшие исследования с первичными клетками человека должны проводиться для проверки этой гипотезы.

Наше исследование является первым шагом к предоставлению доказательств принципа генома, редактирующего основное генетическое событие у пациентов с ХМЛ. Таким образом, это первый отчет, описывающий использование редактирования генома CRISPR / Cas9, чтобы полностью урезать слияние человеческого онкопротеина человека BCR-ABL, чтобы предотвратить его опухолевые способности как in vitro, так и в модели CML in vivo.

Boff-p210 является мышиной интерлейкин-3 (IL3) -независимой клеточной линией, полученной из гематопоэтической клеточной линии Baf / 3 [38], которая экспрессирует BCR / ABL в качестве трансгена, регулируемого тетрациклином (экспрессия BCR / ABL является конститутивной в отсутствие тетрациклина или доксициклин) [52-54]. Boff-p210 поддерживали в модифицированной среде Dulbecco Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Life Technologies), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (Life Technologies) в 5% CO2 при 37 ° C. IL-3-зависимые клетки Baf / 3, используемые в качестве родительской клеточной линии, выращивали в той же среде, дополненной 10% средой, содержащей WEHI-3, в качестве источника IL-3.

Для получения лентивирусов использовали клетки HEK 293T. Они поддерживались в RPMI 1640 (Life Technologies), дополненной 10% FBS и 1% пенициллином / стрептомицином (Life Technologies).

Конкретный экспрессирующий вектор Cas9 (плазмида LentiCas9-Blast, подарок от Feng Zhang, Addgene plasmid # 52962) [55] использовали для генерации клеточной линии Boff-p210 со стабильной экспрессией Cas9.

pLKO5.sgRNA.EFS.GFP (адгезивная плазмида № 57822) [56], содержащая кодирующую последовательность GFP и сайт клонирования для последовательности sgRNA, расщепляли Esp3I (BsmBI) (NEB). Чтобы клонировать sgRNAs в вектор pLKO5, были разработаны два комплементарных олигонуклеаза для каждой sgRNA, включая две последовательности 4bp-overhang (таблица 3). Последовательности sgRNAs были разработаны с использованием программного обеспечения Broad Institute CRISPR (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design). Одна sgRNA (Bcr-Abl sgRNA) была разработана для специфической нацеленности на последовательность слияния. Для контроля за изменчивостью эффективности таргетинга и потенциальными побочными эффектами две sgRNAs были разработаны для нацеливания на последовательность ABL-тирозинкиназы (Tg-Abl1 sgRNA и Tk-Abl2 sgRNA) (рисунок 1B). СгРНК, разработанная не для нацеливания на геном, использовалась как отрицательный контроль (макет). Два дополнительных олигонуклеотида денатурировали при 95 ° С в течение 5 мин, рампу охлаждали до 25 ° С в течение 45 мин, чтобы дать возможность отжигать, и, наконец, лигировали с линеаризованным pLKO5. Компетентные клетки трансформировали 2 мкл лигированной плазмиды, а отдельные колонии разводили до экстракции плазмидой с использованием набора QIAprep Spin Maxiprep (Qiagen). Правильная вставка последовательностей sgRNA была подтверждена с помощью секвенирования Sanger.

Активность Cas9 тестировали с использованием ранее сообщенной системы на основе плазмиды pXPR-011 (подарок от John Doench и David Root, Addgene plasmid # 59702), который обеспечивает GFP и sgRNA, нацеливая GFP [29].

Лентивиральные частицы продуцировали путем переходной трансфекции клеток HEK 293T с использованием Lipofectamine 2000® (Life Technologies). Вирусные конструкции были совместно трансфицированы pMD2.G (адгениновая плазмида 12259) и psPAX2 (адгезивная плазмида 12260) (оба из них были предоставлены Дидьером Троно, EPFL, Лозанна, Швейцария). Лентивиральные частицы собирали через 24 и 48 ч и, наконец, концентрировали с использованием концентратора Lenti-X® (Clontech). Клетки инфицировали в 24-луночном планшете с каждой лункой, содержащей 2 × 105 клеток, культивировали в средах с добавлением 4 мкг / мл полибрена.

Для получения стабильных клеток Boff-p210, экспрессирующих Cas9, лентивирусные частицы, содержащие LentiCas9-Blast, плазмидную экспрессирующую резистентность Cas9 и бластицидина (подарок от Feng Zhang, Addgene plasmid # 52962) [55], трансдуцировали в клетки Boff-p210 и выбирали бластидин (10 мкг / мкл), в течение десяти дней.

Активность Cas9 оценивали с использованием вектора активности Cas9, как сообщалось ранее [29]. Касс-экспрессирующую клеточную линию Boff-p210 и ее соответствующую родительскую клеточную линию Boff-p210 трансдуцировали плазмидой pXPR-011, кодирующей GFP и sgRNA против GFP (подарок от John Doench и David Root, Addgene plasmid # 59702) [29 ]. Добавляли 48 ч после инфицирования, добавляли 2 мкг / мл пуромицина и клетки отбирали в течение трех дней. GFP-позитивные клетки обеих клеточных линий анализировали BD FACScalibur через 10 дней после инфицирования.

Геномную ДНК экстрагировали с использованием набора QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя. Чтобы амплифицировать область слипа BCR-ABL, ПЦР проводили с использованием следующих праймеров: вперед 5′-TCGTGTGTGAAACTCCAGACTGTC-3 ‘и обратного 5′-TTGGGCTTCACACCATTCCCC-3’. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов высокой чистоты ПЦР (Roche) и секвенировали методом Сангера с использованием каждого прямого и обратного праймеров ПЦР.

Эффективность редактирования sgRNAs и потенциально индуцированных мутаций оценивали с использованием программного обеспечения Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) (https://tide-calculator.nki.nl, Нидерландский институт рака), в котором требовалось только два цикла секвенирования Sanger из диких -типы и мутированные клетки.

Чтобы идентифицировать специфически различные сгенерированные мутации, полная ДНК клеток, отредактированных в Cas9, была амплифицирована ПЦР, субклонирована и трансформирована в бактерии. ДНК из отдельных клонов экстрагировали комплексом QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) и секвенировали секвенированием Sanger.

Параллельно технология Next Sequencing Sequencing (NGS) использовалась с теми же праймерами Sanger с добавленными соответствующими адаптерами, чтобы каждый отредактировать последовательность в отдельности. Библиотеки ампликона были секвенированы на платформе GS Junior (454 Life Sciences, Roche, Branford, CT, США) [57].

Экспрессию белка BCR-ABL оценивали с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга с использованием мышиного анти-ABL-антитела (1: 1000, SC-23, Santa Cruz). В качестве вторичного антитела использовали конъюгированное с пероксидазой хрена α-мышиное антитело (1: 10000, NA931V, GE Healthcare). Антитела были обнаружены с использованием реагентов для обнаружения Вестерн-блоттинга ECLTM (RPN2209, GE Healthcare).

Через 72 часа после инфицирования лентивирус-экспрессирующими sgRNAs с GFP из клеточных линий Bose-p210 Cas9, GFP-положительные клетки были выбраны с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) с использованием FACS Aria (BD Biosciences), установив клеточные линии, известные как Bcr- Abl-EP, Tk-Abl1-EP и Tk-Abl2-EP. Отдельные клетки высевали в 96-луночный планшет с помощью FACS, устанавливая четыре клона с мутациями с сдвигом кадров, которые нарушают последовательность BCR / ABL. Клон 1 был выбран для установления клеточной линии, известной как Bcr-Abl-SC.

Чтобы исследовать расщепление от цели, потенциально генерируемое Cas9 в клетках Bcr-Abl-EP и Bcr-Abl-SC, пятерку вне целевых сайтов (полученных с сайта crispr.mit.edu) анализировали с помощью секвенирования ПЦР и Сэнгера, как раз перед тем, чтобы начать эксперименты по функциональному и ксенотрансплантату. Праймеры, используемые для амплификации пятерки прогнозируемых областей вне мишени, описаны в таблице 2. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки продуктов высокой чистоты ПЦР (Roche) и секвенировали с использованием каждого прямого и обратного ПЦР-праймеров.

Апоптоз измеряли проточной цитометрией с помощью набора для обнаружения апоптоза аннексина V-Dy634 (ANXVVKDY, Immunostep) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 5 × 105 клеток собирали и дважды промывали в PBS и помещали аннексином V-DY-634 и невитальным иодидом пропидия красителя (PI), что позволяло различать живые интактные клетки (аннексин-отрицательный, PI-отрицательный ), ранние апоптотические клетки (аннексин-положительные, PI-негативные) и поздние апоптотические или некротические клетки (аннексин-положительный, PI-позитивный). Параллельно распределение клеток в фазе клеточного цикла также анализировали путем измерения содержания ДНК (маркировка PI после клеточной пермеабилизации).

18 четырех-пятинедельных женщин CB.17 использовали мышей SCID (Charles River, Barcelona, ​​Spain) (шесть мышей на группу). Ксенотрансплантаты опухолей индуцировали подкожной инъекцией клеточных суспензий, содержащих 8 × 106 клеток в 0,2 мл клеточной среды на бок мыши.

Клетки подсчитывали с использованием камеры Neubauer (VWR) и клеточной жизнеспособности, контролируемой окрашиванием трипановым синим (Sigma). Это исследование следовало руководству Испании и Европейского союза для экспериментов на животных (RD 1201/05, RD 53/2013 и 86/609 / CEE, соответственно). Исследование получило предварительное одобрение Комитета по биоэтике нашего учреждения.

В первой группе мыши в левый фланг вводили клетки sgRNA Boff-p210 Cas9 mock, а в правом фланге — клетки Bcr-Abl-EP; во второй группе в левом фланге были введены сывороточные sgRNA клетки Boff-p210Cas9 и клетки Bcr-Abl-SC в правом фланге; и, наконец, в третьей группе (контроле) клетки Boff-p210 вводили в левый фланг и Baf / 3 в правом фланге. Диаметры опухоли измеряли каждые 2-3 дня с помощью суппорта. Объем опухоли был рассчитан, как описано в другом месте [58] по формуле a2bπ / 6 (a и b, соответственно, наименьший и самый большой диаметры). Мышей умерщвляли путем передозировки анестезией через 24 дня после инъекции клеток, после чего опухоли собирали и взвешивали.

Статистический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 6 (GraphPad Software). Различия в маркировке аннексина V были протестированы с использованием одностороннего теста ANOVA и Tukey с множественными сравнениями. Различия в объеме опухоли с течением времени были протестированы с помощью двухстороннего теста ANOVA и теста множественных сравнений Tukey. Различия в средних опухолевых массах были проверены с помощью тестов Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни U и теста множественных сравнений Данна. Было отмечено статистическое значение при значениях р <0,05 (**) и р <0,001 (***).

Авторы выражают искреннюю благодарность доктору Мартину-Занке за научные советы и полезную помощь. Мы выражаем глубокую благодарность доктору Кэтрин У и д-ру Микаэле Грубер, которая распространяется на всех членов лаборатории Ву из Института рака Дана-Фарбера за всю поддержку и их научную консультацию в экспериментах с системой CRISPR / Cas9. Мы также признательны Люси Мендес, Ирине Родригес, Сара Гонсалес, Тереза ​​Прието, Мария Анхелес Рамос, Альмудена Мартин, Ана Диас, Ана Симон, Мария дель Позо, Изабель М Исидро, Ванесса Гутьеррес, Сандра Пуджанте и Сандра Сантос из центра Investigación del Cáncer, Саламанка, Испания за техническую помощь

Вклад авторов

IGT и MHS ​​разработали систему CRISPR и эксперименты по редактированию генома клеток. IGT и JLO провели эксперименты по ксенотрансплантату. VAP и MQ клонировали sgRNAs и продуцировали вирусные плазмиды. RB и JMHR помогли интерпретировать результаты и написать рукопись. CG предоставил линии клеток и помог интерпретировать результаты и написать рукопись. МСМ разработал все эксперименты и интерпретировал результаты. IGT и MSM писали статью вместе с другими авторами.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Эта работа была частично поддержана грантом Университета Конседерации образования, Хунты де Кастилия и Леон, Фондос ФЕДЕР (SA085U16 до JMHR и JCYL-EDU / 346/2013 PhD) в IHSIII-FEDER Испанская раковая сеть (RD12 / 0036/0069) и Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) Министерства экономики и конкурентоспособности Испании и Европейского фонда регионального развития (ERDF) «Una manera de hacer Europa» (грант PI15 / 01471).

Хронический миелоидный лейкоз

Кластерированные регулярно пересекаются короткие палиндромные повторы

Однонаправленная РНК

Редактированный пул

Единичная редактируемая ячейка

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *