Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Мутации IL-7-рецепторов и устойчивость к стероидам в педиатрической Т-клеточной острой лимфобластной лейкемии: исследование секвенирования генома

IL-7 Receptor Mutations and Steroid Resistance in Pediatric T cell Acute Lymphoblastic Leukemia: A Genome Sequencing Study
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5172551/

RCB и GJRZ являются учредителями и акционерами Нидерландского Центра трансляционных исследований B.V. Другие авторы заявили, что не существует конкурирующих интересов.

Концептуализация: JPPM.

Синтез данных: YL JGCAMB-G WKS JPPM.

Формальный анализ: YL JGCAMB-G KC-B APS EMV WKS MH RPK RCB GJRZ PJvdS JPPM.

Приобретение финансирования: JPPM.

Исследование: YL JGCAMB-G KC-B EMV WKS RvM WNMD RCB GJRZ JPPM.

Методология: YL JGCAMB-G KC-B EMV WKS RCB GJRZ RP JPPM.

Администрирование проекта: JPPM.

Программное обеспечение: YL.

Надзор: RP JPPM.

Проверка: YL JGCAMB-G WKS JPPM.

Визуализация: YL JGCAMB-G JPPM.

Письмо — оригинальная черновик: YL RP JPPM.

Написание — просмотр и редактирование: YL JGCAMB-G KC-B APS EMV WKS RvM WNMD MH RPK RCB GJRZ PJvdS RP JPPM.

Педиатрический острый лимфобластный лейкоз (ВСЕ) является наиболее распространенным раком детства и главной причиной смертности от рака у детей. T-клетка ALL (T-ALL) составляет около 15% всех случаев заболевания детского возраста и считается заболеванием высокого риска. T-ALL часто ассоциируется с резистентностью к лечению, включая стероиды, которые в настоящее время являются краеугольным камнем для лечения ВС; кроме того, исходный стероидный ответ сильно прогнозирует выживание и лечение. Тем не менее, клеточные механизмы, лежащие в основе устойчивости к стероидам у пациентов T-ALL, плохо изучены. В этом исследовании мы объединили различные геномные наборы данных, чтобы идентифицировать генетические механизмы кандидата, основанные на устойчивости к стероидам у детей, проходящих лечение T-ALL.

Мы провели целую секвенирование генома на парных дооперационных (диагностических) и послеоперационных (ремиссионных) образцах у 13 пациентов, а также нацеливали последовательность exome образцов предварительной обработки у 69 дополнительных пациентов T-ALL. Затем мы интегрировали данные мутации с данными о количестве копий для 151 мутировавших генов, и этот интегрированный набор данных был протестирован на ассоциации мутаций с клиническими исходами и реакцией на препарат in vitro. Наш анализ показал, что мутации в JAK1 и KRAS, два гена, кодирующие компоненты сигнального пути рецептора интерлейкина-7 (IL7R), были связаны со стойкостью к стероидам и плохим исходом. Затем мы секвенировали JAK1, KRAS и другие гены в этом пути, включая IL7R, JAK3, NF1, NRAS и AKT, у этих 69 пациентов T-ALL и еще 77 пациентов T-ALL. Мы идентифицировали мутации у 32% (47/146) пациентов, у большинства из которых был определенный подтип T-ALL (ранний тимус-предшественник ALL или TLX). Исходя из результатов этих пациентов и их чувствительности к преднизолону, измеренных in vitro, мы затем подтвердили, что эти мутации были связаны как с устойчивостью к стероидам, так и с плохим результатом.

Чтобы исследовать, как эти мутации в генах сигнального пути IL7R вызывают устойчивость к стероидам и последующий плохой результат, мы выразили молекулы сигнального типа дикого типа и мутанта IL7R в двух чувствительных к стероидам клеточных линиях T-ALL (клетки SUPT1 и P12 Ichikawa) с использованием индуцибельных лентивирусных экспрессирующих конструкций , Мы обнаружили, что экспрессирующие мутантные IL7R, JAK1 или NRAS, или NRAS дикого типа или AKT, специфически индуцируют устойчивость к стероидам, не влияя на чувствительность к винкристину или L-аспарагиназе. Напротив, IL7R дикого типа, JAK1 и JAK3, а также мутант JAK3 и мутантный AKT не влияли. Затем мы провели функциональное исследование для изучения механизмов устойчивости к стероидам и обнаружили, что вместо изменения способности стероидного рецептора активировать нисходящие мишени устойчивость к стероидам была связана с сильной активацией MEK-ERK и AKT, нижерасположенными компонентами сигнального пути IL7R , тем самым индуцируя устойчивый антиапоптотический ответ путем активизации экспрессии MCL1 и BCLXL. Оба пути MEK-ERK и AKT также инактивируют BIM, важную молекулу для гибели клеток, вызванной стероидами, и ингибируют GSK3B, важный регулятор proapoptotic BIM. Важно отметить, что лечение наших клеточных линий ингибиторами сигнализации IL7R восстановило чувствительность к стероидам. Для решения клинической значимости мы лечили первичные клетки T-ALL, полученные у 11 пациентов с помощью стероидов либо отдельно, либо в комбинации с ингибиторами IL-1-сигналов; мы обнаружили, что включение ингибитора MEK, AKT, mTOR или двойного ингибитора PI3K / mTOR сильно увеличивает смертность клеток, вызванных стероидами. Таким образом, объединение этих ингибиторов со стероидной обработкой может повысить чувствительность к стероидам у пациентов со ВСЕМИ. Основным ограничением нашего исследования был скромный размер когорты из-за очень низкой частоты T-ALL.

Используя беспристрастный подход к секвенированию, мы обнаружили, что специфические мутации в IL7R сигнальных молекулах лежат в основе устойчивости к стероидам в T-ALL. В будущих перспективных клинических исследованиях следует проверить способность ингибиторов MEK, AKT, mTOR или PI3K / mTOR восстановить или усилить чувствительность к стероидам и улучшить клинический результат.

Жюль Мейеринк и его коллеги изучают механизмы устойчивости к стероидам при остром лимфобластном лейкемии Т-клеток.

Несмотря на то, что современные протоколы лечения значительно увеличили скорость лечения среди пациентов с острым лимфобластным лейкемией Т-клеток (T-ALL), почти 40% пациентов нуждаются в наиболее агрессивном режиме лечения, что значительно увеличивает риск вредных эффектов лечения в будущем. Эти вредные эффекты могут включать дефекты роста, некроз костей, сердечную недостаточность и повышенный риск развития вторичных злокачественных новообразований. Более того, результат лечения рецидивирующих пациентов T-ALL крайне низок.

Стероиды являются краеугольным химиотерапевтическим препаратом для лечения острого лимфобластного лейкоза (ALL), включая T-ALL. Однако устойчивость к стероидам распространена среди пациентов и связана с плохим исходом и повышенным риском рецидива.

Механизмы, лежащие в основе устойчивости к стероидам у пациентов со СПИДом, плохо изучены.

Поэтому мы провели беспристрастный, комплексный генетический анализ педиатрического T-ALL, а также функциональные анализы in vitro для подтверждения ассоциаций между идентифицированными мутациями и устойчивостью к стероидам.

Мы выполнили цельный геном и нацеливали секвенирование exome у пациентов с T-ALL и идентифицировали мутации в 151 геном, многие из которых участвуют в передаче сигналов цитокинов, регуляции транскрипции, гибели клеток, клеточном цикле, модификации хроматина и клеточном транспорте.

Мутационные данные были интегрированы с изменениями в числе хромосомных копий и коррелировали с клиническими особенностями пациентов и основными биологическими характеристиками. Мутации в сигнальных компонентах IL7R JAK1 и KRAS коррелировали со стойкостью к стероидам и плохим исходом.

Последовательность сигнальных молекул IL7R в более широкой педиатрической когорте T-ALL выявила мутации у 32% пациентов.

Выражение специфических мутантных и / или сигнальных молекул IL7R дикого типа в двух чувствительных к стероидам клеточных линиях T-ALL индуцировало устойчивость к стероидам посредством надежной последующей передачи сигналов через MEK-ERK и AKT, тем самым уменьшая апоптоз, индуцированный стероидами. Кроме того, обработка этих клеток ингибиторами IL-1-сигнальной передачи восстановила чувствительность к стероидам.

Первичные T-ALL клетки, полученные от пациентов, лечились стероидами либо самостоятельно, либо в комбинации с IL7R сигнальными ингибиторами. Мы обнаружили, что включение этих ингибиторов значительно увеличивает смертность клеток, вызванных стероидами.

Эти результаты должны быть дополнительно проверены в перспективных группах пациентов, чтобы исследовать возможность того, что включение ингибиторов сигнализации IL7R в схемы лечения может восстанавливать или усиливать чувствительность к стероидам у пациентов со ВСЕМИ, тем самым улучшая клинические результаты.

Все данные секвенирования целого генома, согласованные с человеческим эталонным геномом (NCBI build 36), доступны в базе данных Европейского архива нуклеотидов (http://www.ebi.ac.uk/ena под номерами доступа ERS934791-ERS934816). Все данные целенаправленного упорядочения, согласованные с человеческим эталонным геномом (NCBI build 37), доступны в базе данных Европейского архива нуклеотидов (http://www.ebi.ac.uk/ena под номерами доступа ERS935731 — ERS935812). Все данные профилирования экспрессии генов доступны из Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ под номером доступа GSE26713).

У детей с острой лимфобластной лейкемией (ВСЕ) ответ на терапию, в том числе in vitro или in vivo, является сильным предиктором выживания и лечения [1-3]. ALL можно классифицировать как T-клетку ALL (T-ALL) или предшественник B-клеток ALL (BCP-ALL): T-ALL, в частности, имеет высокий риск рецидива и не поддается дальнейшему лечению из-за приобретенной терапевтической резистентности. Механизмы, лежащие в основе устойчивости к стероидам, плохо изучены. В отличие от клеточных линий, которые часто содержат мутации и / или делеции в стероидном рецепторе NR3C1 [4], мутации относительно редки среди пациентов с ALL [5,6]. При связывании с стероидами NR3C1 транслоцирует ядро ​​и управляет экспрессией генов-мишеней [7]. На сегодняшний день устойчивость к стероидам не связана с уменьшенной экспрессией NR3C1, экспрессией вариантов сплайсинга NR3C1 [8-10] или уменьшенной экспрессией шапероновых белков [11,12]. Следовательно, устойчивость к стероидам, по-видимому, не зависит от изменений самого гена NR3C1 у большинства пациентов с устойчивостью к стероидам T-ALL. Было предложено несколько механизмов для объяснения устойчивости к стероидам в T-ALL, включая активацию AKT1, который фосфорилирует серин 134 NR3C1, тем самым предотвращая ядерную транслокацию [13]. Кроме того, повышенные концентрации MYB и BCL2 могут способствовать выживанию после лечения стероидами [14]. Активированный NOTCH1 может давать устойчивость к стероидам, подавляя экспрессию NR3C1 и PTEN [15]. Показано, что мутации в РАН связаны со стероидным сопротивлением в BCP-ALL и распространены у рецидивирующих пациентов [16-18]. Недавно было показано, что CASP1 и его активатор NLRP3 связаны со стероидным сопротивлением во ВСЕХ [19].

В этом исследовании мы стремились обеспечить беспристрастный и всесторонний анализ молекулярных механизмов, приводящих к Т-ALL, и разрешить клеточные механизмы, лежащие в основе устойчивости к стероидам. Для этого мы выполнили целую последовательность генома (WGS) и целевое секвенирование exome (TES) в диагностических образцах пациентов, полученных от педиатрических пациентов T-ALL. Мутационные данные были интегрированы с изменениями количества копий, которые были определены методом сравнительной геномной гибридизации (aCGH) для захвата полной сложности геномных мутаций в T-ALL. Идентификация механизмов устойчивости к стероидам может обеспечить терапевтические варианты лечения, чтобы улучшить чувствительность к этому химиотерапевтическому препарату из краеугольного камня во всем лечении, улучшить показатели лечения и помочь уменьшить вредные побочные эффекты интенсивных графиков лечения путем снижения дозы.

В этом исследовании не было протокола или плана перспективного анализа. Схема этого исследования представлена ​​на рисунке 1. Вкратце, чтобы получить представление о генетическом ландшафте педиатрического T-ALL, мы провели WGS на парных образцах диагностической ремиссии у 13 пациентов, охватывающих все наиболее преобладающие генетические подтипы в T-ALL , Повторение идентифицированных мутаций затем устанавливали путем применения подхода TES к когорте диагностических образцов из 69 хорошо охарактеризованных педиатрических пациентов T-ALL, и эти данные мутаций были дополнительно интегрированы с данными о количестве копий для мутантных генов, полученных с помощью aCGH. Статусы мутации / аберрации 151 идентифицированного гена были затем сопоставлены с клиническими признаками пациентов и основными биологическими характеристиками, включая ответ на препарат in vitro, подтип T-ALL и исход. Мы обнаружили, что мутации в компонентах (KRAS и JAK1) сигнального пути IL7R коррелируют со стойкостью к стероидам и плохим исходом. Затем мы использовали подход секвенирования PCR-Sanger для идентификации мутаций в других сигнальных компонентах IL7R, включая гены IL7R, JAK1, JAK3, NF1, NRAS, KRAS и AKT, в расширенной когорте диагностических образцов пациентов, включая этих 69 пациентов и 77 дополнительных T-ALL. Связь между мутантными сигнальными компонентами и устойчивостью к стероидам затем была функционально исследована в двух чувствительных к стероиду линиях T-ALL (SUPT1 и P12 Ichikawa), и была проверена способность ингибиторов сигнализации IL7R к устойчивости к стероидам в этих моделях. Кроме того, способность этих ингибиторов восстанавливать или повышать чувствительность к стероидам была исследована в первичных лейкозных клетках, выделенных из 11 пациентов T-ALL.

Фаза обнаружения: целая последовательность генома (WGS) с последующим целенаправленным секвенированием exome (TES) и приоритизация мутантов с высокой степенью достоверности в 13 парных диагностических (Dx) -резонансных (Рем) Т-клеточных образцах пациентов с острой лимфобластной лейкемией (T-ALL). Фаза расширения: TES для 254 генов на диагностических материалах 69 пациентов T-ALL. Фаза интеграции: интеграция высокоустойчивой мутации TES и массивной сравнительной геномной гибридизационной потери наборов данных гетерозиготности (LOH) и ассоциаций с клиническими и биологическими данными. Подтверждение результатов проводилось с использованием расширенной когорты из 146 диагностических образцов T-ALL, включая 69 пациентов (оч) на фазе расширения и 77 дополнительных пациентов. Фаза проверки: функциональное моделирование в клеточных линиях T-ALL, определение эффективности целевых ингибиторов для восстановления фенотипа и тестирование в первичных образцах пациентов T-ALL. COALL, Кооперативная исследовательская группа для детской острой лимфобластной лейкемии; DCOG, голландская онкологическая группа детства.

Для этого исследования были использованы диагностические образцы первичной лейкемии из 162 педиатрических пациентов T-ALL (рис. 1, таблица S1). В фазе открытия мы использовали ДНК, выделенную из сопоставленных пар пациентов с предварительной обработкой (диагностикой) и после лечения (ремиссии) у 13 педиатрических пациентов T-ALL, которые зарегистрировались в протоколе ALL-10 Dutch Ononology Group (DCOG) между 2004 годом и 2012. На этапе расширения этого исследования мы использовали ДНК из диагностического материала для предварительной обработки пациентов из 69 пациентов, которые поступили в Германскую совместную исследовательскую группу по протоколу о детской лимфобластной лейкемии (COALL) между 1997 и 2003 годами (COALL -97). Первоначальные результаты были затем подтверждены в более широкой когорте диагностических материалов Pre-treatment T-ALL, включая ДНК из ранее упомянутых 69 пациентов COALL, плюс данные о пяти дополнительных пациентах, которые также зарегистрировались в протоколе COALL-97 и 72 дополнительных T-ALL пациентов, включенных в протоколы DCOG ALL-7/8 (n = 30) или ALL-9 (n = 42). Функциональная валидация проводилась на клетках лейкемии с предварительной заморозкой для предварительной обработки из периферической крови или костного мозга у восьми из 74 пациентов, которые зарегистрировались в протоколе COALL-97 (как упоминалось выше) плюс два дополнительных пациента, которые зарегистрировались в исследовании COALL-03 и один пациент, включенный в исследование DCOG ALL-10. Медианное наблюдение за пациентами, зарегистрировавшимися в протоколах DCOG ALL-7/8/9 (1988-2004) и COALL-97, составляло 67 и 52 мес соответственно. Родители или законные опекуны пациентов предоставили информированное согласие на использование остаточного диагностического материала для исследований с одобрения со стороны институционального наблюдательного совета Erasmus MC Rotterdam и в соответствии с Хельсинкской декларацией. Клетки лейкемии собирали из образцов крови или костного мозга и обогащали до чистоты по меньшей мере 90%, как описано ранее [20].

Последовательность 13 опухолевых пар T-ALL в когорте обнаружения (таблицы S1 и S2) была выполнена в Complete Genomics (Mountain View, California) с использованием неразрывной комбинаторной химии лигирования зонд-якорь на массивах самосборных ДНК-нанобаллов, производящих 35-парный пар -end читает [21]. Средний валовой картографический доход для 26 геномов составил 183 Гб. В среднем 96,5% генома вызывали с охватом 55 × или выше. Структурные варианты ДНК цельного генома 13 пациентов были обнаружены с использованием полнофункциональных cgatools (версия 2.0.2.17) и были сопоставлены с эталонным геномом NCBI 37. Для этого были идентифицированы соединения, которые не были смежными по эталонная последовательность. Впоследствии соматические соединения были обнаружены как узлы, обнаруженные в образцах опухолей, отсутствовавших в сопоставимых нормальных образцах. Наконец, мы отфильтровали для соматических высокоуровневых соединений, используя следующие критерии: (1) в несогласованном считывающем кластере имеется по меньшей мере десять пар маттов; (2) успешно завершена сборка узла de novo; (3) соединение проявляет большое разнообразие разнесения, то есть расстояние между первой позицией самого последнего младшего считывателя и последнее положение самого правого помощника, прочитанного в дискордантном считывающем кластере, составляет более 70 п.о.; (4) известные недопредставленные повторяющиеся последовательности не участвуют, например, ALR / Alpha; (5) вариант отсутствует в dbSNP build 132; (6) вариант не возникает из-за событий удаления перемещаемых элементов (подклассы AluY и L1); и (7) вариант отсутствует в 52 нормальных геномах, которые служили базовым набором ссылок (ftp://ftp2.completegenomics.com/Baseline_Genome_Set/SVBaseline/).

Для обнаружения мутации считывания были выровнены с эталонным геномом NCBI build 36, применяя локальный подход de novo к сбору, а вариации назывались с использованием программного обеспечения Complete Genomics v1.8 и v1.12. В каждом образце в среднем были обнаружены 3,4 × 106 одиночных нуклеотидных вариантов (SNV), 221,7 × 103 небольших вставок, 234,5 × 103 небольших делеций и 77,3 × 103 замещений. Для этого исследования мы сосредоточились на опухолеспецифических, несинонимических мутациях в экзонах, исключая полиморфизмы последовательности, которые присутствуют в базах данных NCBI dbSNP или в базах данных проекта 1000 геномов. Это выявило 460 SNV и 808 небольших вставок или делеций (INDELs) (S1 Fig) в экзонах из 13 пациентов T-ALL. Чтобы оптимизировать пороговые значения для параметров качества полной геномики, мы проверили 46 мутаций посредством секвенирования ПЦР и Сэнгера. Мы обнаружили два качественных параметра, информативных, чтобы отличить истину от ложно названных мутаций (S2A Fig). Один — общий балл (TS), представляющий уверенность в названной мутации. Другой — соматический балл (SS), представляющий уверенность в том, что мутация присутствует в опухоли и отсутствует в образце с образцом ремиссии. Эти два показателя были рассчитаны с использованием программного обеспечения Complete Genomics v1.8 и v1.12 и CGA Tools 1.4.0. На основе кривых рабочей характеристики приемника (ROC) (S2B Fig) SS ≥ 0,1 и TS ≥ 100 использовались в качестве пороговых значений для надежного вызова соматических мутаций с высокой достоверностью. Основываясь на этих пороговых значениях, было обнаружено, что 137 генов несут 178 высокоустойчивых SNV или INDEL мутаций (S1 Fig). Данные последовательности WGS из 26 геномов, выровненных по человеческому эталонному геному (сборка NCBI 36), были депонированы в Европейский архив нуклеотидов со номерами доступа ERS934791-ERS934816.

ПЦР-реакции проводили с использованием 25-50 нг геномной ДНК, 300 нМ праймеров, 200 мкМ dNTP, 2 мМ MgCl2 и 1,25 единиц AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) в 1 × PCR Buffer II (Applied Biosystems) в объеме 50 мкл. Продукты ПЦР очищали с помощью системы фильтров Millipore Vacuum Manifold и секвенировали (набор для циклического секвенирования BigDye Terminator v3.1, Applied Biosystems) на ДНК-анализаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems).

Чтобы сравнить WGS с вариантом варианта TES, а также для проверки и определения параметров качества для WGS и TES, соответственно, мы выполнили TES для 410 мутированных генов, которые были найдены WGS в диагностических образцах 13 пациентов-когорт обнаружения (таблицы S1 и S2). Эти гены включали все 137 генов с высокой достоверностью мутаций и 273 мутированных гена, которые имели более низкие оценки качества WGS.

Обогащение экзонических ДНК-последовательностей из геномной ДНК проводили с использованием массивов Agilent SureSelect MP4 (область захвата 2 Мб, с> 2 × средним охватом). Последовательность была выполнена на ServiceXS. (Leiden, The Netherlands) с использованием платформы Illumina HiSeq 2000, которая производила 100-пар. Анализ изображений, базовый вызов и проверка качества выполнялись с использованием конвейера анализа данных Illumina RTA v1.13.48 и / или OLB v1.9 и CASAVA v1.8.2. Перед выравниванием считывания фильтровали на основе следующих пороговых значений качества: читайте обрезку по баллам по значению 20 и минимальной длине считывания 36. Затем эти данные были выровнены с эталонным геном NCBI build 37, используя короткий корректор считывания на основе преобразования Barrows-Wheeler [22] с рассогласованием 4%. Мутации SNV и INDEL были идентифицированы с использованием внутреннего конвейера ServiceXS на основе байесовской статистики со следующими пороговыми значениями: минимальный охват 5 × для INDEL и 10 × для SNV с минимальной частотной частотой 30%.

Мутации, обнаруженные как на платформах WGS, так и на TES, можно рассматривать как истинные мутации и, следовательно, помогать определять качественные пороговые параметры для подхода TES. Более 60% предсказанных экзонических, не синонимичных SNV, идентифицированных TES, не были идентифицированы WGS (S3 Fig). Используя наложенные мутации, обнаруженные обеими платформами, мы подготовили классификатор одного класса для определения границ параметров качества для обнаружения мутаций TES. Параметры качества TES включают глубину считывания и общую оценку качества варианта. Для вызова SNV мы изучали классификатор одноуровневого гауссова с использованием ddtools [23] (S3A Fig). Производительность гауссовского классификатора представлена ​​кривой ROC на S3B. Граница была выбрана для вызова мутаций с ложной отрицательной скоростью (FNr) 0,10, что привело к ложной положительной скорости (FPr) 0,28. Учитывая распределение обучающего набора INDEL, как показано на S3C Fig, был построен простой классификатор дерева решений для вызова мутаций INDEL, который привел к FNr 0,10 и FPr 0,63, что подтвердило низкую согласованность мутаций INDEL с обеих платформ.

Для оценки рецидива 137 высоконадежных мутированных генов и семи проверенных мутированных генов с низкой достоверностью, как определено WGS (таблица S2), мы последовательно определили диагностические образцы 69 генетически и клинически хорошо аннотированных пациентов T-ALL TES для этих 144 гены вместе с дополнительным набором из 110 генов, которые периодически мутируют при лейкемии [24,25] (таблицы S1 и S3). Средний охват TES составил 561 ×, а 89% всех захваченных экзонов были охвачены более чем 100 чтениями. Строгая стратегия фильтрации, используемая для WGS (S4 Рис.), Затем применялась к результатам TES. Полиморфизмы, присутствующие в расширенной панели баз данных генетических вариаций (перечисленные в следующем разделе), были исключены, что обеспечило эффективный фильтр для исключения вариантов зародышевой линии в расширенной когорте из 69 пациентов T-ALL, у которых парные нормальные образцы были недоступны [26]. Данные последовательности TES 13 пациентов с когортными исследованиями и 69 когортных пациентов были приведены в соответствие с человеческим эталонным геномом (NCBI build 37) и депонированы в Европейский архив нуклеотидов со номерами доступа ERS935731-ERS935812.

Мы увеличили количество баз данных генетических вариаций, чтобы отфильтровать полиморфизмы из набора данных мутаций, как определено TES, включая dbSNP [27] версии 130, 131, 132 и 135; 1000 базы данных проектов геномов [28] версии 2010 Ноябрь и 2012 год апрель; база данных ESP6500 (http://evs.gs.washington.edu/EVS/); Группы основного и многообразия в Хувариоме [29] и собственный набор данных из 1302 источников из Медицинского центра Университета Радбуд, Неймеген, Нидерланды [30]. Кроме того, мы исключили мутации, которые также были идентифицированы в 13 образцах ремиссии WGS. Мы сохранили мутации, которые представляли собой полиморфизмы в соответствии с упомянутыми выше базами данных, когда вариации, включающие одни и те же аминокислоты, были аннотированы в базе данных COSMIC. Применяя строгую фильтрацию к широкому спектру баз данных генетических вариаций, мы стремились как можно больше удалить варианты зародышевых линий. Чтобы отделить зародышевые полиморфизмы от соматических мутаций в образцах пациентов в отсутствие парных нормальных контрольных образцов, вариации, наблюдаемые у тысяч неродственных лиц, обеспечивают эффективный фильтр [26].

Мы провели анализ количества копий на основе aCGH с использованием массивов SurePrint G3 Human CGH 2 × 400K (Agilent Technologies) в образцах диагностической лейкемии 53 из 69 пациентов с когомологией расширения, чьи геномы были секвенированы TES (таблица S3). Изображения массива обрабатывались для получения отношения log10 сигналов красного и зеленого каналов после коррекции фона и нормализации красителя с использованием программного обеспечения Agilent Feature Extraction (версия 10.5.1.1). Зонные хромосомные местоположения были аннотированы с использованием эталонного генома NCBI 36. После этого логарифмические отношения были подвергнуты алгоритму шумоподавления, алгоритму коррекции волн aCGH [31], чтобы уменьшить волновой артефакт, характеризующийся волнообразным профилем aCGH вдоль хромосома. Этот алгоритм корректирует смещения, вызванные различиями в интенсивностях мечения фрагментов ДНК, которые зависят от содержания GC и размера фрагмента, а также эффективности гибридизации меченых фрагментов с соответствующими гибридизационными зондами на матрице. Впоследствии отношения log10 (L) были преобразованы в число копий (CN) как CN = 2 × 10L. Затем были вызваны амплификации и делеции, если три последовательных набора зондов в гене имели значение CN за пределами среднего CN ± 2 × стандартное отклонение CN соответствующих наборов зондов среди всех образцов.

Определенный аллель номер копии диагностического образца у пациента № 10793 был получен с использованием Affymetrix SNP Array 6.0 с медианным интермаркерным интервалом 680-bp. Для этого в качестве входного сигнала использовали 500 нг геномной ДНК, выделенной из образцов диагностики и ремиссии. Интенсивность сырого сигнала анализировали с использованием пакета Partek Genomics Suite. Во-первых, интенсивности зонда были скорректированы для ряда свойств, которые коррелировали с интенсивностью, включая длину фрагмента, содержание GC и другие смещения гибридизации на основе последовательности. После нормализации квантилей проводился парный анализ для генерации аллель-специфических копий путем сравнения диагностического образца с образцом ремиссии.

Анализ обогащения пути проводился на 127 генах, которые имели мутации или аберрации числа копий в более чем одном образце пациента в когорте расширения. Были применены два подхода. Один из них использовал базу данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID) v6.7. Отчеты функциональной аннотации кластеризации обогащенных биологических путей и молекулярных функций, аннотированные геномной онтологией, можно найти в таблице S4. В другом подходе использовался анализ Path Ingenuity для выявления обогащенных канонических путей в этих 127 рекуррентных генах. Использовались настройки по умолчанию, за исключением того, что они были установлены только для человека. Указанные значения p рассчитываются с использованием точного теста двустороннего Фишера.

Набор данных профилирования экспрессии генов 117 педиатрических случаев T-ALL, полученных микрочипом [32], доступен в GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под номером присоединения GSE26713.

Для 69 когортных образцов CoALL в фазе расширения мы связывали мутационные состояния и аберрации числа копий в 151 генах (таблица S3) с тремя клинико-биологическими параметрами: подтип T-ALL (как определено ранее [32]), in vitro преднизолон Уровень LC50 и результат выживания. В этих анализах присутствие мутаций (Mut), делеций (Del), амплификаций (Amp) и комбинаций MutDel, MutAmp или MutAber (т. Е. Мутации и / или аберрации числа копий, включая делеции и амплификации) в каждом гене, было протестированы против клинико-биологических параметров. Каждый ген с определенным признаком (например, JAK1_Mut) тестировали индивидуально. Эти признаки являются двоичными (присутствующими / отсутствующими), что означает, что множественные случаи одной и той же функции в одном и том же гене для одного и того же образца пациента агрегируются. Например, JAK1_Mut = «присутствует» в образце пациента означает, что в образце имеется, по меньшей мере, одна мутация JAK1. Ассоциации между любыми из этих шести признаков и подтипом T-ALL были рассчитаны с использованием точного теста Фишера. Ассоциации с in vitro преднизолоном LC50 рассчитывали с использованием теста Kruskal-Wallis. Все p-значения являются двусторонними. Ассоциации с выживаемостью рассчитывали с использованием логарифмического теста. Для всех результатов теста значения p были использованы для определения приоритетов наших гипотез об ассоциациях и, следовательно, оставались номинальными без множественных корректировок. Для представления результатов, которые потенциально более релевантны, был использован порог номинального р <0,05. Используя этот порог, гены, которые связаны со сниженной чувствительностью к лекарственным средствам, плохой безрецидивной или безрецидивной выживаемостью или конкретными подтипами T-ALL, суммированы в таблице S5. Учитывая доступность данных для образцов пациентов (таблица S1), количество тестов варьируется для разных ассоциаций и указано в таблице S5.

На фазе интеграции мы проверяли ассоциации, идентифицированные на фазе расширения. Для этого мы выполнили секвенирование PCR-Sanger для генов IL7R, JAK1, JAK3, NF1, NRAS, KRAS и AKT (т.е. генов сигнального пути IL7R) в группе подтверждения 146 пациентов, включающих 69 пациентов с фазы расширения и 77 дополнительных педиатрических пациентов T-ALL. Наличие мутаций в этих генах, а также доступная информация о генетических аберрациях, влияющих на ген PTEN, использовались для разделения пациентов на три группы, то есть с мутациями в сигнальном пути IL7R, с мутациями в PTEN, а остальная часть пациентов. Ассоциация мутаций пути IL7R и подтипа T-ALL была проверена точным тестом Фишера. Ассоциацию мутаций пути IL7R и in vitro преднизолона LC50 тестировали с помощью теста Kruskal-Wallis у 97 пациентов, у которых были получены данные ответа преднизолона in vitro. Ассоциацию мутаций пути IL7R и выживаемость тестировали с использованием теста рангового теста.

Многосайтовая рекомбинация Gateway (Invitrogen) использовалась для одновременного клонирования нескольких фрагментов ДНК в наш переносимый шлюзом лентивирусный вектор назначения pLEGO-iC2 (Addgene). Во-первых, родительский вектор pLEGO-iC2 был преобразован в вектор назначения шлюза, заменив вставку pSFFV-MCS-IRES-mCherry на кассету A. Кассета A., содержащую гены устойчивости ccdB и хлорамфеникола, фланкированные сайтами рекомбинации attR, амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в ApaI / PciI-расщепленный вектор pLEGO-iC2. Лентивирусные экспрессирующие векторы собирали с использованием ретрансляции шлюза лентивирусного вектора назначения с четырьмя синтетически синтезированными входными векторами (Eurogentec): (1) attL1 / attR5-фланкированный доксициклин-индуцибельный промотор (третье поколение Clontech); (2) attL5 / attL4-фланкированная последовательность кДНК человека; (3) attR4 / attR3-фланкированный DDK-тэг, за которым следует стоп-кодон, последовательности WPRE и конститутивный промотор pSFFV; и (4) attL3 / attL2-фланкированный TETon-T2A (теаза-асинья-вирус 2A-пептид) -пуромицин-резистентная кассета или TETon-T2A-LNGFR (усеченный или ΔNGFR) репортер. Реакции LR-рекомбинации выполнялись в соответствии с инструкциями производителя. Для экспериментов по shRNA PLNA.1-puro lentiviral shRNA конструкции, направленные против человеческого NR3C1-гена, были выбраны из библиотеки MISSION T shRNA (Sigma-Aldrich). Для получения лентивирусов клетки HEK293T трансфицировали лентивирусной ДНК вектора экспрессии и pMD2.G (VSV-G), pMDLg / pRRE и pRSV-REV-носители (Addgene) с использованием реагента трансфекции ДНК X-tremeGENE HP (Roche). Трансфекцию проводили в DMEM с добавлением 10% инактивированной инактивированной телячьей сывороткой плода (FCS), 1 × глутамакса, 1% пенициллина / стрептомицина и 0,25 мкг / мл Fungizone, а клетки HEK293T культивировали в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2. После трансфекции продуцировали лентивирусные частицы и собирали в бессывороточной Opti-MEM1 (Thermo Fisher Scientific) в течение 48 часов. Культуральную среду, содержащую лентивирусные частицы, собирали, фильтровали через фильтр Minisart 0,45 мкМ (Sartorius) и концентрировали центрифугированием при 4 ° С с использованием колонны концентрации VIVASPIN 20 (Sartorius). Вирусные частицы хранили при -80 ° С.

Лентивирусную трансдукцию использовали для получения клеточных линий SUPT1 и P12 Ichikawa T-ALL, содержащих множество векторов экспрессии. Для этого вирусные партии серийно разбавляли в 96-луночных планшетах общим объемом 50 мкл среды Opti-MEM1 и добавляли 50 000 клеток в среде Advanced RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific), дополненной 2% тепловой инактивированной FCS, 1 × глутамакс, 1% пенициллин / стрептомицин и 0,25 мкг / мл фугизона. Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин на мягкой встряхивающей платформе и дополнительно инкубировали в течение нескольких часов во влажном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО2. Для инкубации в течение ночи FCS добавляли до конечной концентрации 10%, после чего среду обновляли. Эффективность трансдукции определяли спустя 4 дня. Чтобы избежать множественных интеграций на клетку, только клетки, которые были трансдуцированы с помощью оптимальных концентраций вируса (максимальная скорость трансдукции 50%), дополнительно культивировали в объеме и обогащали путем отбора в среде, содержащей 1-2 мкг / мл пуромицина. Для последующих экспериментов использовались клетки, выбранные в большом количестве.

Массовые трансдуцированные линии поддерживали в культуральной среде с концентрацией 0,25-1,5 × 106 клеток / мл и обновляли два раза в неделю. Чтобы индуцировать экспрессию из лентивирусного вектора, клетки выращивали в присутствии доксициклина 0,5 мг / мл перед проведением теста на цитотоксичность. Цитотоксичность тестировали в присутствии одной концентрации или последовательного разведения различных лекарств или ингибиторов, как указано: преднизолон (15 мг / мл-0,007 мкг / мл), L-аспарагиназа (100-0,032 МЕ / мл), винкристин (2,5-0,10 нг / мл), 2 мкМ ruxolitinib (ингибитор JAK1, Selleck Chem # S1378), 2 мкМ MK2206 (ингибитор AKT, Selleck Chem # S1078), 10 мкМ CI1040 (ингибитор MEK, Axon Medchem #Axon 1368) и 2 мкМ CAS 667463-62-9 (ингибитор GSK3 IX, Santa Cruz Biotechnology # sc-202634). Клетки инкубировали в течение 72 или 96 ч во влажном инкубаторе при 37 ° С и 5% СО2, как указано в легендах фигуры. Числа жизнеспособных клеток подсчитывались на основе параметров прямого и бокового рассеяния с использованием проточной цитометрии (MACSQuant, Miltenyi Biotec), и данные анализировались с использованием программного обеспечения FlowJo v10 (Treestar). Процент жизнеспособных клеток после воздействия лекарственного средства был нормирован на процент жизнеспособных необработанных контрольных клеток, тогда как процент жизнеспособных клеток после воздействия препарата в комбинации с ингибитором нормализуется к жизнеспособности контрольных клеток, обработанных ингибитором. Выбранная концентрация ингибиторов была такова, что жизнеспособность контрольных клеток, обработанных ингибитором, отклонялась не более чем на 20% по сравнению с жизнеспособностью необработанных контрольных клеток. Графики были сделаны с использованием программного обеспечения Graphpad PRISM 6.

Первичные антитела, используемые для вестерн-блот-детектирования белков, были получены из технологии клеточной сигнализации, если не указано иное: фосфо-AKT S473 (# 9271), фосфо-JAK1 (# 3331), фосфо-STAT5 (# 9351), фосфо-MEK1 / 2 (# 9154), фосфо-ERK1 / 2 (# 4370), фосфо-mTOR S2448 (# 2971), фосфо-p70S6-киназу T421 / S424 (# 9204), BAD (Abcam # AB32455), фосфо-BAD S136 (# 4366 ), BIM (Abcam # AB15184), фосфо-BIM S55 (# 4550), фосфо-BIM S69 (# 4581), фосфо-CREB S133 (# 9198), фосфо-ATF1 (# 9198), BCL2 (Santa Cruz Biotechnology # sc-130308), BCLXL (# 2764), MCL1 (Sigma # HPA008455), PUMA (Abcam # AB33906), cMYB (# 12319), фосфо-IKKab S176 / S177 (# 2978), фосфо-IKKab S176 / S180 (# 2697), GSK3AB (# 5676), фосфо-GSK3AB S21 / 9 (# 9331), фосфо-p38 / MAPK T180 / Y182 (# 4511), GCR (Santa Cruz Biotechnology # sc-1003), фосфо-GCR S211 (Abcam # AB3579), DYKDDDDK Tag Antibody (# 2368), CD127 (IL7R) (R & D Systems # MAB306), RAS (Millipore # 05-516) и β-актин (Abcam # AB6276). После окрашивания вестерн-блоттингов с использованием флуоресцентных вторичных антител IRDye флуоресцентные интенсивности сканировали и количественно определяли с использованием имиджера Odyssey (LI-COR) и нормировали на уровни экспрессии β-актина.

Анализы цитотоксичности с одним лекарственным средством или ингибитором проводили, как описано ранее в 384-луночных планшетах в течение 72 ч [33]. Вкратце, 10 000 первичных клеток T-ALL из умеренно замороженных запасов высевали в 45 мкл культуральной среды (Advanced RPMI 1640 medium [Thermo Fisher Scientific], содержащей 20% инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки, 1 × глутамакс, 1% пенициллина / стрептомицина , 25 мкг / мл гентамицина и 0,25 мкг / мл Fungizone) за 2 ч до введения лекарств или ингибиторов. Для определения IC50 каждый лекарственный препарат или ингибитор растворяли в 100% ДМСО приблизительно в 10000 раз по расчетной концентрации IC50, разбавляли в серии с девятью точками разбавления в двойном количестве в ДМСО, который затем 100 раз разбавляли в буфере HEPES (pH = 7,4). Для анализа 5 мкл каждого отдельного лекарственного средства или разбавления соединения добавляли к предварительно заполненным клеткам в конечной концентрации, которая варьировалась от 1 нМ до 10000 нМ для всех соединений в 0,1% ДМСО. В качестве косвенной меры общей жизнеспособности клеток после 72 ч инкубации измеряли содержание внутриклеточного АТФ. Планшеты охлаждали до комнатной температуры и клетки инкубировали с 25 мкл раствора АТФлит 1-й (PerkinElmer) на лунку. Люминесценция регистрировалась на многомодовом считывателе Envision (PerkinElmer), и результаты были нормализованы для измерений контрольных колодцев, содержащих только 0,1% ДМСО. Значения IC50 устанавливались вручную с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения XLfit5 (IDBS). Максимальные и минимальные сигналы были заблокированы, когда это необходимо, для обеспечения наилучшего соответствия, как указано F-тестом, как реализовано в XLfit5. Если значения IC50 не попадали в тестируемый диапазон концентраций, препараты или ингибиторы подвергались повторному тестированию после дальнейшего разбавления. Для экспериментов по синергии сдвига кривой комбинаций ингибиторов лекарственного средства запасы ингибиторов разбавляли в ДМСО в день эксперимента до концентраций в 10 000 раз по сравнению с их значениями IC50, как это определено в экспериментах с одним агентом. Были приготовлены разведенные лекарственные средства или ингибиторы, а также комбинации комбинаций лекарственных препаратов в соотношениях 1: 1, 4: 1 и 1: 4 и разбавлены в ДМСО в семиточечные серии доза-реакция в двух экземплярах. Дальнейшее разведение и добавление к клеткам проводили, как описано выше. Из-за соответствия IC50 все исходные растворы и смеси были бы эквипотенты в отсутствие синергии или антагонизма. Для экспериментов с одним препаратом или ингибитором конечные концентрации анализа были в пределах 10 и 0,01 от их значений IC50. Для кривых одиночного лекарственного средства или ингибитора значения IC50 были установлены на данных процентного эффекта с помощью нелинейной регрессии с использованием XLfit5. Чтобы исправить интервазную вариацию, значения IC50 для отдельных агентов в эксперименте синергии использовались для расчета синергии для экспериментов по комбинации ингибиторов лекарственного средства. Комбинированный индекс (CI) как количественный показатель синергии комбинаций ингибиторов лекарственного средства [34] был рассчитан, как описано ранее [35]. Значения CI ниже 1,0 указывают на синергию комбинаций ингибиторов лекарств; Значения CI ниже 0,3 указывают на сильную синергию. Значения CI выше 1,5 указывают на антагонистические эффекты комбинаций ингибиторов лекарственного средства.

Чтобы определить мутационный ландшафт педиатрических пациентов T-ALL, мы использовали комплексный подход, объединяющий данные мутации, данные о количестве копий и клиническую информацию, полученную от 82 пациентов педиатрического T-ALL (рис. 1, таблица S1). Во-первых, мы провели WGS на парных диагностических образцах ремиссии у 13 пациентов в полной геномнике [21]. Эти пациенты охватывали все известные генетические подтипы, включая два случая раннего тимуса-предшественника ALL (ETP-ALL); случаи, связанные с TLX3 (пять случаев), TLX1 (один случай), NKX2-1 (один случай), HOXA (один случай), KTM2A / MLL (один случай ETP-ALL) или TAL1 (один случай) хромосомные перегруппировки; и случаи, по которым неизвестные события онкогенных заболеваний (три пациента, включая один случай ETP-ALL) [32]. Была проведена широкая фильтрация (S1 Fig) и первая оптимизация параметров качества, которая была подтверждена секвенированием PCR-Sanger (S2 Fig). Мы установили пороговые значения оптимального качества для анализа WGS, чтобы настойчиво назвать мутации с высокой степенью достоверности как 0,1 и 100 для SS и TS соответственно. Мы также подтвердили эти пороговые значения TES, используя платформу Illumina HiSeq 2000 из 410 генов из диагностических образцов этих же 13 пациентов T-ALL (таблицы S1 и S2). Эти гены включали 137 генов, содержащих 178 высокоустойчивых мутаций (85 SNV и 93 INDEL) и 273 гена, содержащих 377 предсказанных мутаций с низкой достоверностью (139 SNV и 238 INDEL). Мы подтвердили 74 из 85 (87%) SNV с высокой степенью достоверности и две из 93 (2%) высокой достоверности INDEL мутаций, в отличие от семи из 139 (5%) SNV с низкой степенью достоверности и ноль из 238 низких -уверенность INDEL. Эти данные показывают, что выбранные пороговые значения параметров качества для WGS были подходящими для идентификации мутантов с высокой степенью достоверности. Более того, перекрытие между результатами WGS и TES было дополнительно использовано для оптимизации настройки порога параметра качества TES (S3 Fig).

В дополнение к мутациям мы идентифицировали по соматическим внутрихромосомным перекрестным контактам WGS 185 (в среднем 14 на пациента, диапазон 5-25) и 40 межхромосомных точек разрыва (в среднем три на одного пациента, диапазон 2-11), которые представляли 183 предсказанных перегруппировки, включая 78 делеций, 28 повторов, 16 инверсий, 16 транслокаций и 45 комплексных перестроек у этих 13 пациентов (таблица S2). В целом, из 225 хромосомных переходов из 182 было доказано включение случайных нуклеотидов (в среднем 18 нуклеотидов, диапазон 1-221), которые указывают на участие механизмов рекомбинации RAG. Это присутствие случайных нуклеотидов было также случаем для большинства хромосомных переходов, идентифицированных у двух пациентов ETP-ALL, оба из которых были арестованы на ранних стадиях предшественников тимуса, которые предшествуют RAG-опосредованным событиям регенерации генов рецепторов T-клеток. Точки останова для известных движущих онкогенных перестроек, как прогнозировалось с использованием флуоресцентной гибридизации in situ или количественной ПЦР в реальном времени, были идентифицированы в десяти из 13 пациентов T-ALL. Мы не смогли определить какое-либо конкретное событие, связанное с онкогенезом, из различных перегруппировок, выявленных в двух из трех случаев T-ALL, для которых неизвестные двигательные онкогенные перестановки (№ 9255 и № 9343). Один пациент ETP-ALL (№ 10793) имел признаки хромотрипсиса в хромосомах 7 и 14 (рис. 2А). Точки останова для делеций, вставок, дублирования, сложных перегруппировок и транслокаций были идентифицированы в обеих хромосомах, которые фланкируют области аллельных потерь или выигрышей в соответствии с анализом на основе микрочипов на основе SNP (рис. 2B). Множественные точки останова были идентифицированы рядом с кластером генов HOXA. Множественные кластерные точки останова часто влияли на локусы TCRAD и BCL11B и указывали на довольно организованную форму хромотрипсиса у данного конкретного пациента, а не на случайную повторную сборку дезинтегрированных хромосомных сегментов, что часто наблюдалось у пациентов с хромотрипсисом [36].

(A и B) Визуализация хромосомных контактных точек в диагностических лейкозных клетках пациента ETP-ALL № 10793. (A) Диаграмма участков соматических структурных изменений, обнаруженных в диагностическом образце (Dx) вместе со значениями плотности SNV (окно 1 Мб) и предсказанными данными LOH, как объяснено в сопроводительной легенде. Интерхромосомные переходы отображаются как красные линии, а внутрихромосомные переходы отображаются как серые линии. (B) Изменены аллель-специфичные вариации числа копий, как определено анализом арифметических SNP-массивов, и краткими точками хромосомных прерываний, предсказываемыми WGS, как следствие хромотрипсиса, влияющего на хромосомы 7 и 14. На графиках числа копий черные точки указывают на несогласованные номера копий, специфичные для аллелей. Красные точки — это сглаженные максимальные номера копий, специфичные для аллелей, с использованием скользящего окна из 30 зондов SNP, в то время как зеленые точки отражают сглаженные минимальные номера копий, специфичные для аллели. Для транслокаций (красные стрелки), инверсии (синие стрелки), удаления (зеленые стрелки), дублирования (пурпурные стрелки) и сложные перестановки (серые стрелки) отображаются хромосомные точки останова. Показаны пораженные (в черном) и фланкирующие (серые) гены для межхромосомных транслокаций. (C) Обзор большинства дерегулированных клеточных процессов среди 127 генов, несущих мутации / аберрации в диагностическом материале двух или более пациентов в когорте расширения из 69 пациентов T-ALL. Указывается количество пациентов с каждым подтипом T-ALL. Значение p для каждого процесса представляет собой уровень значимости для обогащения мутаций / аберраций, которые влияют на этот путь у пациентов с ETP-ALL по сравнению с другими подтипами T-ALL, и рассчитывали с помощью точного теста двустороннего Фишера. См. Также таблицу S4. ETP-ALL, ранний тимус-предшественник острый лимфобластный лейкоз; LOH, потеря гетерозиготности; SNV, однонуклеотидный вариант; T-ALL, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.

Затем мы расширили наш мутационный анализ, выполнив TES в когорте диагностических образцов из 69 хорошо охарактеризованных педиатрических пациентов T-ALL (рис. 1, таблица S1) [37]. В общей сложности 254 гена были секвенированы при среднем охвате 561 ×, включая 144 проверенных гена, идентифицированных в когорте обнаружения, и 110 дополнительных отобранных генов, которые часто мутируются во ВСЕХ (таблица S3) [24,25]. После строгой фильтрации (S4 Fig) 401 мутации были идентифицированы в 151 геном (таблица S3). Затем эти мутации были интегрированы с данными числа копий aCGH, которые были доступны для 53 из 69 пациентов (таблица S3). Среднее число генов, содержащих мутации и / или количество копий, составляло шесть на одного пациента (диапазон 0-51). У пациентов с ETP-ALL было больше аберраций, чем у других подтипов (p <0,001, медиана 12, диапазон 5-51) [32,38,39], тогда как у пациентов TALLMO было меньше аберраций (p = 0,003, медиана 4, диапазон 0-42) , Среднее число аберраций в TLX и пролиферативных подтипах составляло 8,5 (диапазон 4-10) и 6 (диапазон 3-27) соответственно. Шестьдесят шесть мутированных генов были ранее идентифицированы в T-ALL, и 83 мутированных гена были ранее обнаружены в других типах лейкемии или негематоэфирных опухолях. Два гена, RABL6 (GTP-связывающий член надсемейства Ras малых GTPases) и IGHV3-64, ранее не сообщались в мутированной форме при раке человека. Мутации в основном затрагивают гены, которые участвуют в передаче сигналов цитокинов, регуляции транскрипции, гибели клеток, клеточном цикле или модификации хроматина или которые кодируют транспортеры (рис. 2C, таблица S4).

Статусы мутации / аберрации 151 гена были затем сопоставлены с клиническими и биологическими параметрами этих 69 пациентов: ответ на препарат in vitro, подтип T-ALL и исход. Несколько мутаций и аберраций были связаны с плохим выживанием или лекарственной устойчивостью (таблица S5). Интересно, что мутации в IL7R сигнальных молекулах, включая JAK1 и KRAS, коррелировали с резистентностью преднизолона и сниженной выживаемостью (рис. 3A-3C). Чтобы проверить эти ассоциации, мы расширили наши мутационные анализы с помощью секвенирования ПЦР-Сейнгера на гены IL7R, JAK1, JAK3, NF1, NRAS, KRAS и AKT в диагностических образцах этих 69 пациентов и 77 дополнительных пациентов T-ALL. Мутации были идентифицированы у 47 из 146 пациентов (32%) и были связаны с подтипами ETP-ALL и TLX (p <0,001, см. Таблицы S1 и S6 для подробностей). Данные ответа преднизолона in vitro на эти диагностические образцы были доступны для 97 пациентов, а в 28 из 97 случаев IL7R сигнальные мутации были связаны со стойкостью к стероидам (p = 0,033, рис. 3D, таблица S6). У этих пациентов также был значительно худший результат, чем у пациентов, не имеющих этих мутаций (p = 0,009; на рис. 3E). Инактивирующие события в PTEN у 18 из 97 пациентов связаны с подтипом TALLMO [20,40], и у этих пациентов уровни чувствительности преднизолона были такими же, как у пациентов, лишенных IL7R-сигнализации или PTEN-мутаций. Поэтому эти данные указывают на потенциальную зависимость между сигнальными мутациями IL7R и устойчивостью к стероидам.

Мутации в (A и B) JAK1 или (C) KRAS, обнаруженные TES в диагностических образцах у 69 пациентов T-ALL, связаны с уменьшением стероидного ответа и / или с низкой выживаемостью. IL7R-сигнальные мутации в диагностических образцах у 146 пациентов T-ALL связаны со сниженной (D) чувствительностью к стероидам in vitro и (E) выживаемостью без рецидива. Пациенты, несущие делецию NR3C1 как следствие хромосомной делеции 5q, были исключены из этих анализов. См. Также таблицу S6. ETP-ALL, ранний тимус-предшественник острый лимфобластный лейкоз; T-ALL, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз; TES, целенаправленная последовательность exome.

Чтобы функционально исследовать, могут ли IL7R сигнальные мутации влиять на устойчивость к стероидам, мы тестировали, может ли экспрессия мутантных IL7R-сигнальных молекул по сравнению с их аналогами дикого типа — поддерживать устойчивость к стероидам в двух чувствительных к стероиду линиях T-ALL, а именно SUPT1 и P12 Ichikawa. Все мутантные сигнальные молекулы, экспрессируемые из индуцибельных доксициклином экспрессирующих конструкций, включая IL7RRFCPH, JAK1R724H, JAK1T901A, JAK3M511I, JAK3R657Q, NRASG12D и AKTE17K, смогли инициировать независимый от IL3 рост в клетках Ba / F3, в отличие от их изоформ дикого типа , подтверждая, что эти мутации могут трансформировать клетки [41]. В фоновых изображениях SUPT1 и P12 Ichikawa T-ALL экспрессия цистеинового мутанта IL7RRFCPH давала устойчивость к стероидам, тогда как IL7R дикого типа и мутантные рецепторы IL-1RGPSL нецистеина не были (S5 Fig). Обе мутантные молекулы JAK1, но не устойчивые к JAK1 дикого типа, устойчивые к стероидам (рис. 4A-4C). Удивительно, но мутации JAK3 не наносили сопротивления (рис. 4E и 4F), тогда как экспрессия NRAS дикого типа, NRASG12D и дикого типа AKT сильно отвечала устойчивости к стероидам (фиг. 4G и S5). Хотя AKTE17K ведет себя как активирующий мутант [42], который поддерживает независимый от IL3 рост в клетках Ba / F3 [41], он не придавал устойчивости к стероидам в клетках SUPT1 или P12 Ichikawa. Поэтому мы обозначили массовые линии, которые выражали IL7RRFCPH, JAK1R724H, JAK1T901A, NRASG12D или NRAS дикого типа или AKT в качестве «стойкой к стероидам панели», тогда как линии, которые выражали IL7R, JAK1 или JAK3 дикого типа или мутант JAK3M511I, JAK3R657Q, или AKTE17K как «чувствительная к стероидам панель». Выражение отдельных (мутантных) IL7R сигнальных молекул специфически сказалось на стероидном ответе, поскольку все линии проявляли сравнимую чувствительность к лечению винкристина и L-аспарагиназы (фиг.4H, 4I и S5).

(A-F) Кривые стероидного ответа (из трех повторений экспериментов ± стандартное отклонение) для клеток SUPT1, которые экспрессируют (A) JAK1, (B) JAK1R724H, (C) JAK1T901A, (D) JAK3, (E) JAK3M511I или (F) JAK3R657Q из доксициклин-индуцируемых лентивирусных экспрессирующих конструкций. Показаны кривые реакции стероидов для индуцированных (+ Dox) и неиндуцированных (-Dox) клеток, которые подвергались серийным разведениям преднизолона в течение 72 часов. (G-I) Средняя выживаемость клеток SUPT1 (трехкратные эксперименты ± стандартное отклонение), экспрессирующие сигнальные молекулы дикого типа или мутанта IL7R (+ Dox: открытые красные полосы) после 72-часовой экспозиции (G) преднизолона (Pred), ( H) винкристин (VCR) или (I) L-аспарагиназа (ASP). Черные полосы представляют собой среднюю выживаемость всех линий SUPT1 в неиндуцированных условиях после воздействия преднизолона, винкристина или L-аспарагиназы (-Dox-контроль). Стероид-чувствительная панель относится к линиям SUPT1, которые сохраняют аналогично чувствительный ответ на стероид после экспрессии IL7R, JAK1, JAK3, JAK3M511I, JAK3R657Q или AKTE17K по сравнению с неиндуцированными условиями контроля. Стероидостойкая панель относится к линиям, которые приобретают устойчивость к стероидам после экспрессии IL7RRFCPH, JAK1R724H, JAK1T901A, NRAS, NRASG12D или AKT. См. Также S5 Рис.

Затем мы исследовали, влияет ли экспрессия IL7R сигнальных молекул, которые вызывают устойчивость к стероидам, ядерное переключение стероидного рецептора NR3C1, что делает его неспособным активировать последующие гены-мишени при воздействии стероидов. Мы не обнаружили различий между стероид-резистентными и стероид-чувствительными линиями в их способности активировать гены-мишени NR3C1 после стероидного воздействия, включая NR3C1, TSC22D3 / GILZ, BCC3 / PUMA, KLF13, BCL2L11 / BIM и FKBP5 (S6 Fig). Следовательно, устойчивость к стероидам, вызванная экспрессией мутантных молекул IL7R, JAK1 или NRAS, или NRAS дикого типа или AKT, не зависит от ответа NR3C1 после воздействия стероидов.

Чтобы изучить основополагающий механизм, который обеспечивает устойчивость к стероидам, мы провели анализ Вестерн-блоттинга на стероид-резистентных и стероид-чувствительных линиях для измерения активности сигнальных путей ИЛ-1 и нижестоящих путей (рис. 5А и S7). Стероид-чувствительные и устойчивые линии имели равные концентрации общего NR3C1 и равного серинового 134 фосфорилирования (фиг. 5A и 5B). В отличие от стероид-чувствительных линий, устойчивые к стероидам линии имели более высокие уровни активации путей RAS-MEK-ERK и AKT (рис. 5C-5E). Стероид-устойчивые линии также отображали более высокие уровни фосфорилированного (активированного) p70-S6K и (инактивированного) GSK3B (рис. 5F) и более высокую активацию путей CREB и NFκB ниже по течению от AKT, что приводило к значительно более высоким концентрациям антиапоптотических MCL1 и BCLXL (Фиг. 5G). Таким образом, надежная активация путей IL-7 в стероид-устойчивых линиях вызывала сильную реакцию на выживание, которая, возможно, перекрыла проапоптотический ответ NR3C1 (рис. 5H). Хотя BIM имеет важное значение для стероидного индуцированного апоптоза [43-46], общие концентрации BIM были сопоставимы между чувствительными к стероидам и резистентными линиями. Все стероидно-устойчивые линии имели более высокий уровень фосфорилированного BIM, за исключением стероидостойкой линии AKT (рис. 5A). В соответствии с этим GSK3B, важный регулятор proapoptotic BIM [47,48], был сильно инактивирован во всех этих устойчивых линиях.

(A) Вестерн-блот-результаты для общего и / или фосфорилированного уровней IL-1-сигнальных молекул после индукции доксициклина (+ Dox) дикого типа или мутантных форм молекул IL7R, JAK1, JAK3, NRAS или AKT в клетках SUPT1. Показаны стероид-чувствительные и устойчивые панели. В качестве контроля использовали клеточный лизат родительских клеток SUPT1. (B-G) β-актин-нормированных белковых концентраций для (B) NR3C1, (C) pMEK, (D) pERK, (E) pAKT, (F) pGSK3B и (G) BCLXL в индуцированном доксициклином стероид-чувствительном и -резистивные линии SUPT1. Уровни значимости были рассчитаны с использованием теста Манна-Уитни U. В (E) уровни фосфо-AKT показаны для всех линий, за исключением линий, индуцированных экспрессией конструктивных AKT и AKTE17K. (H) Схематический обзор перекрестных помех между проапоптотическим ответом NR3C1 после стероидного воздействия и активации путей MEK-ERK и AKT ниже по потоку от IL7R сигнальных мутаций. Зеленые векторы указывают молекулы, которые приводят к проапоптотическому, чувствительному к стероидам реакции, тогда как красные векторы указывают молекулы, которые приводят к антиапоптотическому, устойчивому к стероидам реакции. См. Также S7 Рис.

Затем мы проверили, могут ли ингибиторы IL7R-сигнализации восстанавливать чувствительность к стероидам в клетках, устойчивых к стероидам. Ингибиторы JAK1 (2 мкМ ruxolitinib), MEK (10 мкМ CI1040) и AKT (2 мкМ MK2206) были протестированы на предмет их специфичности в блокировании передачи сигналов IL7R в стероидорезистентных линиях, экспрессирующих IL7RRFCPH, JAK1T901A, AKT или NRAS и их способности к вернуть устойчивость к стероидам. Ruxolitinib блокировал сигнализацию нисходящего потока IL7R как в линиях IL7RRFCPH, так и в JAK1T901A, но был неэффективен в блокировании сигнализации в линиях AKT или NRAS, как и ожидалось (рис. 6A, 6B и S8). Последовательно, лечение ruxolitinib увеличивало чувствительность к стероидам в IL7RRFCPH и мутантных линиях JAK1 (фиг. 6C и 6E), но не в линиях NRAS или AKT дикого типа (фиг.6D, 6E и S8). Ингибитор MEK CI1040 блокировал активацию ERK во всех четырех проверенных линиях, снижая активацию mTOR и p70-S6K в нисходящем направлении. CI1040 улучшала активацию GSK3B и приводило к сдвигу от фосфорилированных до нефосфорилированных BIM в этих линиях, за исключением линии AKT. Обработка CI1040 также приводила к повышенным уровням активной АКТ, возможно, благодаря механизму спасения клеточной обратной связи. CI1040 частично восстановила чувствительность к стероидам в большинстве устойчивых к стероидам линий SUPT1 и была наиболее эффективной в линиях NRAS дикого типа и мутантных NRASG12D (фиг. 6C, 6D и 6F). CI1040 эффективно улучшала чувствительность к стероидам в устойчивых линиях P12 Ichikawa, которые выражали IL7RRFCPH или NRAS дикого типа или AKT (S8 Fig). CI1040 также повышает чувствительность к стероидам в некоторых чувствительных к стероидам линиях (фиг. 6F и S8). Ингибитор AKT MK2206 блокировал передачу сигналов AKT и уменьшал фосфорилированные уровни нижерасположенных mTOR и p70-S6K (рис. 6A и 6B). MK2206 восстановил фенотип чувствительности стероидов во всех устойчивых к стероидам линиях (фиг. 6C, 6D, 6G и S8). Подобно обработке CI1040, лечение MK2206 также повышает чувствительность к стероидам в чувствительных к стероидам линиях, возможно, путем ингибирования эндогенной АКТ. Аналогичные эффекты наблюдались для лечения комбинацией ингибиторов MEK-AKT (фиг. 6H). Напротив, ингибитор IX, блокирующий активацию GSK3B, вызывал резистентность в большинстве стероид-чувствительных линий, а также некоторые устойчивые к стероидам линии (фиг. 6I), что свидетельствует о том, что GSK3B является ключевым регулятором чувствительности к стероидам.

Статус активности молекул сигнализации IL7R с помощью Вестерн-блот-анализа в клетках SUPT1, экспрессирующих (A) JAK1T901A или (B) AKT дикого типа, которые подвергаются воздействию ruxolitinib (2 мкМ), CI1040 (10 мкМ), MK2206 (2 мкМ) или CI1040 / MK2206 в течение 24 ч по сравнению с неиндуцированными и доксициклинами. (C и D) SUPT1 или P12 Ichikawa (D, средняя панель) Т-клеточные кривые ответа на клеточные лимфобластные лейкозы после 72-часового воздействия серийных разведений преднизолона (трехкратные эксперименты ± стандартное отклонение) без (-Dox, серые круги) или с (+ Dox, открытые красные круги) индукция (C) IL7RRFCPH или (D) AKT. Показаны эффекты 2 мкМ руксолитиниба (левые панели), 10 мкМ CI1040 (средние панели) и 2 мкМ MK2206 (правые панели) на стероидный ответ в условиях, вызванных доксициклином (открытые синие треугольники). (E-I) Средняя выживаемость (тройные эксперименты ± стандартное отклонение) линий SUPT1, экспрессирующих сигнальные молекулы дикого типа или мутанта IL7R после 72-часовой обработки преднизолоном (250 мкг / мл) в отсутствие (открытые красные полоски) или присутствие ( открытые синие полосы) (E) ruxolitinib, (F) CI1040, (G) MK2206, (H) комбинация CI1040 / MK2206 или (I) GSK3 ингибитора IX. Указаны стероид-чувствительные и устойчивые панели. Для каждого эксперимента показана средняя выживаемость для всех неиндуцированных (-Dox) линий SUPT1, которые подвергаются воздействию преднизолона (красный, заполненный серой полосой) или ингибитор преднизолона плюс (синий, заполненный серой планкой), как контроль. См. Также S8 Fig. Dox, doxycycline; ингибитор; Пред, преднизолон; Rux, ruxolitinib.

Затем мы также проверили, влияют ли клинически значимые ингибиторы сигнального пути IL7R на преднизолоновую чувствительность первичных лейкозных клеток, выделенных из 11 пациентов педиатрического T-ALL при диагностике (таблицы 1 и S1). Клетки лейкемии инкубировали с серийными разведениями преднизолона или отдельных ингибиторов, а также их комбинациями при различных соотношениях, основанных на оцененных концентрациях IC50. Уровень синергизма определяли путем расчета CI для серийных разведений трех комбинированных смесей лекарственных препаратов (1: 1, 1: 4 и 4: 1) при эффективных дозах, которые были летальными для 50% (ED50) или 75% ( ED75) лейкозных клеток (S9 Fig). У 3 из 11 пациентов были обнаружены мутации IL7R, тогда как у одного пациента была мутация KRAS. Лейкемические клетки у четырех других пациентов не содержали мутации в сигнальных компонентах IL7R, но имели другие мутации, тогда как статус мутации у трех дополнительных пациентов был неизвестен (табл. 1). Эти 11 образцов пациентов отличались ответами на преднизолон на основании их значений IC50 или процента от общего числа ответивших клеток (табл. 1), а пациенты № 2911 и № 10110 были резистентны к стероидному лечению. Неожиданно, в отличие от предыдущих результатов на клеточных линиях, ингибитор JAK ruxolitinib не влиял на реакцию преднизолона в восьми образцах пациентов T-ALL, для которых значения CI могли быть рассчитаны. Лечение ингибитором MEK AZD6244 или trametinib синергически улучшает реакцию преднизолона в 5/9 и 9/10 пациентах, соответственно. Ни ингибитор не повышал чувствительность к стероидам в клетках лейкемии у пациентов с устойчивостью к стероидам № 2911, тогда как trametinib синергически усиливал реакцию преднизолона в клетках лейкемии у пациентов с устойчивостью к стероидам № 2322. AKT-ингибитор MK2206 синергически повышал чувствительность преднизолона в лейкемических клетках у 8/11 пациентов, в то время как ингибиторы mTOR AZD8055 и everolimus действовали синергически в сочетании с преднизолоном в образцах 10/11 и 8/8 пациентов, соответственно, в том числе и у пациентов с устойчивостью к стероидам. Ингибитор PI3K NVPBEZ235 синергически усиливал чувствительность преднизолона в 10/11 пациентах.

Показаны перестановки и мутации для пациентов. Значение IC50 представляет собой ингибирующую концентрацию преднизолона или ингибитора, при которой 50% от общего количества ответов (в процентах, между скобками) лейкозных клеток умерли после 72 часов воздействия. Основываясь на значениях IC50, проводили синергические эксперименты для комбинаций ингибиторов преднизолона с соотношениями 1: 1, 4: 1 и 1: 4. Средние значения CI в качестве меры цитотоксической синергии указываются при эффективных дозах ED50 и ED75 (включая SD для трех повторных экспериментов) для комбинаций ингибиторов преднизолона по сравнению с одиночными кривыми ответа преднизолона или ингибитора. Для получения дополнительной информации см. Также S9 Рисунок CI = 1.00: аддитивный эффект; CI <1,00: синергия; CI <0,30: сильная синергия; CI> 1,50: антагонизм; синергии и сильных синергических значений CI, выделенных жирным шрифтом.

* SD не дается для значений CI, которые были рассчитаны на менее трех комбинациях ингибитора преднизолона.

CI, индекс комбинации; ETP-ALL, ранний тимус-предшественник острый лимфобластный лейкоз; NA, неприменимо; ND, не определено; ND (<20%), IC50 не определяется, когда тестируемый ингибитор имеет эффективность <20%; SD, стандартное отклонение; T-ALL, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз.

Здесь мы сообщаем об идентификации мутаций в IL7R-сигнальных молекулах у 32% педиатрических пациентов с T-ALL. Эти мутации связаны с пониженной чувствительностью к стероидам и плохим клиническим исходом. Кроме того, мы предоставляем функциональные доказательства того, что эти мутации уменьшают гибель клеток, вызванных стероидами, путем активации нижележащих сигнальных путей MEK-ERK и AKT. Активация этих путей вызывает (1) повышение активности антиапоптотических белков MCL1 и BCLXL; (2) инактивация проапоптотического белка BIM, существенного компонента в вызванной стероидом гибели клеток; и (3) инактивация GSK3B, ключевого регулятора BIM. Важно отметить, что в клеточных линиях и первичных образцах пациентов ингибиторы IL7R-сигнализации восстанавливаются и повышают чувствительность стероидов соответственно.

WGS — это мощный метод, используемый для идентификации перекрестных переходов хромосомных перестроек, которые приводят к активации онкогенов или созданию слитых белков. Он подтвердил хромосомные транслокации у всех десяти пациентов, которые были предсказаны флуоресцентной гибридизацией in situ или другими методами, и привели к идентификации различных хромосомных перегруппировок, которые ранее не были идентифицированы в T-ALL. В среднем у пациентов с T-ALL у детей три интервала (интервал 0-11) интерхромосом и 14 (интервал 5-25) внутрихромосомных переходов вследствие транслокаций, инверсий, делеций, дублирования или сложных перестроек. Множественные и кластерные хромосомные соединения были идентифицированы у двух пациентов, которые предоставили доказательства хромотрипсиса хромосом 7 и 14 (пациент ETP-ALL № 10793) или хромосомы 1 и 5 (пролиферативный T-ALL больной № 10943). Большинство внутри- и межхромосомальных соединений, в том числе обнаруженных у пациентов с ETP-ALL, содержат вставки не-матричных нуклеотидов, что в значительной степени подразумевает вовлечение RAG1 / 2-опосредованного рекомбинационного механизма в эти перегруппировки.

На основании данных WGS для 13 пациентов и данных TES из расширенной когорты из 69 случаев T-ALL, которые были интегрированы с данными LOH, мы идентифицировали 151 мутированный гены, из которых два гена не наблюдались ранее в раке человека (RABL6 и IGHV3 -64). Интеграция этого набора данных с клиническими и биологическими параметрами выявила мутации IL7R, связанные с устойчивостью к стероидам у педиатрических пациентов T-ALL; эти мутации могут служить в качестве биомаркеров для снижения стероидного ответа. Мутации, влияющие на сигнальный путь IL7R и последующие пути AKT и MEK-ERK, также были связаны с уменьшением выживаемости без рецидива для педиатрических пациентов T-ALL, которые получали лечение DCOG или COALL. Мало что известно о прогностическом значении мутаций в пути IL7R-JAK / STAT в T-ALL [49], и различные исследования не продемонстрировали неблагоприятных эффектов для педиатрических пациентов T-ALL, несущих мутации IL7R или IL7R / JAK [50- 52]. Наши результаты согласуются с плохим прогнозом для пациентов с мутациями JAK1, первоначально зарегистрированными для взрослых T-ALL [53], и с плохим прогнозом для пациентов с мутациями NRAS / KRAS, зарегистрированными для взрослых пациентов T-ALL, получавших лечение в GRAALL-2003 и GRAALL-2005 [54]. Одним из объяснений различных результатов исследований может быть то, что скорости мутаций для отдельных сигнальных компонентов являются низкими. Насколько нам известно, ни одно исследование не проводило всестороннего анализа прогностической значимости полного спектра сигнальных мутаций IL7R в T-ALL раньше. Эти сигнальные мутации влияют на 32% пациентов T-ALL и являются наиболее рецидивирующими у пациентов с ETP-ALL ([40,52] и это исследование) и пациентов с подтипом TLX T-ALL, который в основном содержит НХАА-активирующие аберрации или Трансляции TLX3 [32].

Эксперименты по функциональной валидации в двух линиях клеток T-ALL показали, что мутированные IL7R сигнальные молекулы надежно активируют молекулы AKT и MEK-ERK ниже по течению, тем самым вызывая устойчивость к стероидам. К ним относятся мутации в IL7R и JAK1, но не JAK3. Мутации в JAK3 лишь незначительно активируют сигнализацию, по-видимому, из-за их зависимости от JAK1 [55]. Мутации IL7R-сигнализации не влияют непосредственно на сигнализацию NR3C1, включая ее ядерную транслокацию или ее способность трансактивировать гены-мишени при воздействии стероидов. Эти данные согласуются с нашим предыдущим нахождением, что стероидная терапия активирует гены-мишени NR3C1 аналогично между стероид-чувствительными и устойчивыми к стероидам пациентами ALL [56], поддерживая представление о том, что механизмы резистентности ниже или независимы от трансактивации, вызванной стероидами NR3C1. Мы не обнаружили признаков дифференцированного фосфорилирования серинов 134 NR3C1 между стероид-чувствительными и устойчивыми к стероидам группами (серин 134 NR3C1 фосфорилируется AKT и предотвращает ядерную транслокацию NR3C1) [13]. Мы не обнаружили увеличенных концентраций MYB или BCL2, которые ранее были предложены в качестве механизмов устойчивости к стероидам в разных моделях ксенотрансплантата ALL [14].

Наши данные свидетельствуют о том, что проапоптотический ответ, управляемый NR3C1, снижается с помощью антиапоптотического ответа AKT / MEK-ERK, приводящего к устойчивости к стероидам. AKT управляет выражением антиапоптотических MCL1 и BCLXL. В нашей стойкой панели клеточных линий высокая сигнализация MEK-ERK ассоциировалась с наличием фосфорилированных (и инактивированных) GSK3B и BIM, которые необходимы для смерти, вызванной стероидами [43-46]. BIM фосфорилируется ERK [57,58], и, в соответствии с этим, BIM не фосфорилируется в стероид-резистентных линиях при лечении ингибитором MEK CI1040. GSK3B является важным регулятором проапоптотического BIM [48] и может препятствовать фосфорилированию BIM, тем самым сохраняя чувствительность к стероидам. В дополнение к активированному МЕК-ERK, AKT может фосфорилировать и ингибировать GSK3B, как это наблюдается в стероидостойкой панели клеточных линий. Поэтому GSK3B может играть важную роль в регуляции чувствительности к стероидам в целом. В соответствии с этим ингибитор GSK3B IX сильно спровоцировал устойчивость к стероидам в большинстве стероид-чувствительных клеточных линий. Поэтому наши данные свидетельствуют о том, что любой клеточный механизм, который может активировать MEK-ERK и AKT, может приводить к устойчивости к стероидам в T-ALL и может объяснять некоторые устойчивые к стероидам случаи T-ALL, которые не имеют видимой IL-1-сигнальной передачи или мутаций NR3C1. Недавно описанное расщепление NR3C1 CASP1 может стать альтернативным объяснением устойчивости к стероидам [19].

Обнаружение, что стероидное сопротивление возникает из активированных МЕК-ERK и AKT, предполагает, что терапевтический режим, сочетающий стероиды с ингибиторами MEK, AKT или mTOR, может увеличить чувствительность к стероидам. Важно отметить, что эти ингибиторы могут также увеличить стероидный ответ у пациентов, чувствительных к стероидам. Интересно, что, хотя три из наших образцов пациентов содержали мутации IL7R, мы не обнаружили доказательств эффективности руксилитиниба для обратной устойчивости к стероидам. Возможно, это связано с отсутствием клеточной пролиферации во время теста на чувствительность к лекарственным средствам in vitro и подразумевает, что руслоумитиниб не убивают неактивные лейкозные стволовые клетки. Ruxolitinib продемонстрировал некоторую эффективность при лечении ETP-ALL в моделях ксенотрансплантата [59,60], хотя основной эффект не был достигнут.

Наше обнаружение также может быть очень актуальным для пациентов с BCP-ALL, которые часто имеют мутации в IL7R сигнальных молекулах [61,62], хотя это еще предстоит доказать. Высокие уровни активности АКТ были связаны со стойкостью к стероидам и плохим результатом в BCP-ALL [63]. Мутации в NRAS и KRAS распространены во ВСЕХ и связаны со стойкостью к стероидам, вовлечением центральной нервной системы и плохим исходом [16,17]; эти мутации преимущественно приобретаются при рецидиве [18]. Сопоставление соединений, основанное на профилях экспрессии, устойчивых к стероидам ALL [64], предполагает, что ингибиторы mTOR восстанавливают чувствительность к стероидам за счет снижения уровней антиапоптотического MCL1 [65,66].

Одним из возможных ограничений нашего исследования является относительно небольшой размер когорты. Однако, учитывая чрезвычайно низкую частоту T-ALL (приблизительно 15 новых пациентов, выявленных в Нидерландах каждый год), было невозможно получить большее количество клинически и биологически документированных образцов пациентов. Второе ограничение заключается в том, что мы не смогли получить данные об эффективности ингибирования ингибиторов IL7R сигнализации in vivo в отношении восстановления чувствительности к стероидам в первичных лейкозных клетках, например, с использованием моделей мышиного ксенотрансплантата T-ALL, полученных из пациентов. В этом отношении важно отметить, что в недавнем доклиническом исследовании установлено, что ингибитор PI3K / mTOR NVPBEZ235 повышает чувствительность к стероидам в модели ксенотрансплантата T-ALL [67].

В заключение мы подтверждаем, что устойчивость к стероидам у педиатрических пациентов T-ALL связана с мутациями в IL7R сигнальных молекулах. Поскольку результаты лечения и клинические результаты в значительной степени зависят от чувствительности к стероидам в этих условиях, наши результаты показывают, что ингибиторы малых молекул MEK, PI3K, AKT и / или mTOR должны быть протестированы для восстановления или повышения чувствительности к стероидам у пациентов с ALL ,

Показаны фильтровальные блок-схемы для получения кандидатов с высокой степенью достоверности соматических белковых изменений SNV (A) и INDEL (B), обнаруженных WGS в 13 опухолях. INDEL, небольшая вставка или удаление; SNV, однонуклеотидный вариант; WGS, целая последовательность генома.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) Scatterplot of somatic score (SS) по сравнению с общим счетом (TS) для 46 мутаций, обнаруженных WGS в 13 опухолях и подтвержденных секвенированием PCR-Sanger. Мутации, обнаруженные секвенированием PCR-Sanger только в опухоли, а не в образце ремиссии, называются истинными позитивами (TP, зеленым). В противном случае они называются ложными срабатываниями (FP, красным цветом). Мутации, которые не были секвенированы с помощью последовательности PCR-Sanger, имеют серый цвет. Все пространство делится на четыре квадранта, используя пороги SS = 0,1 и TS = 100, среди которых квадрант I обогащен для истинных положительных результатов. Различные типы мутаций даются по форме. del, небольшое удаление; ins, небольшая вставка; суб, малая замена; snv, один нуклеотидный вариант. (B) кривые рабочей характеристики приемника (ROC) с использованием SS и TS отдельно и совместно для 46 мутаций WGS, подтвержденных секвенированием PCR-Sanger. Три точки данных отмечены там, где SS = 0,1 и TS = 100, отдельно и совместно.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) Комплект обучения и граница классификатора для надежного обнаружения SNV TES. Мутация называется истинным положительным (TP), если точная мутация была обнаружена как WGS, так и TES в одном и том же образце пациента. Мутация называется ложноположительной (FP), если она была обнаружена TES, но не WGS. Учебный набор содержит 570 экзонических несинуистических SNV, обнаруженных TES в 13 образцах опухоли из когорты обнаружения: 218 SN SNS SNS (зеленый) по сравнению с 352 FP SNV (красный). Гауссова граница классификатора одного класса в синем приводит к ложной отрицательной скорости (FNr) = 0,10 и ложной положительной скорости (FPr) = 0,28. (B) Кривая ROC гауссова одноклассового классификатора на обучающем наборе, содержащем 570 TES SNV из 13 образцов опухоли. Выбранная граница указана зеленым кругом на кривой, который имеет FNr = 0,10 и FPr = 0,28. (C) Комплект обучения и граница классификатора для надежного обнаружения INDELs TES. Учебный набор содержит 52 экзонических несинонимических INDEL, обнаруженных TES в 13 образцах опухолей из когорты обнаружения: 11 TP INDELs (зеленый) по сравнению с 41 FP INDELs (красный). Граница классификатора в синем выражается в FNr = 0,10 и FPr = 0,63.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Показана блок-схема фильтрации для получения надежных соматических белковых модификаций SNV (A) и INDEL (B), выявленных путем целенаправленного секвенирования экзоса (TES) для 254 генов в 69 опухолях.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A-C). Кривые стероидного ответа для чувствительных к стероиду SUPT1 клеток, которые содержат (A) IL7R, (B) нецистеиновые мутантные IL7RGPSL или (C) цистеиновые мутантные IL7RRFCPH доксициклин-индуцируемые лентививные экспрессирующие конструкции. Кривые ответа на стероиды показаны для индуцированных (+ Dox) или неиндуцированных (-Dox) клеток, которые подвергались серийным разведениям (250-0,007 мкг / мл) преднизолона в течение 72 часов. (D-F) Кривые стероидного ответа для чувствительных к стероиду клеток P12 Ichikawa, которые содержат (D) экспрессирующие экспрессионные конструкции AKTY17K или (F) дикого типа дикого типа. (G-I) Средняя выживаемость клеток P12 Ichikawa, экспрессирующих сигнальные молекулы дикого типа или мутанта IL7R (+ Dox: открытые красные полосы) после 72-часовой экспозиции с указанными концентрациями (G) преднизолона, (H) винкристина или ( I) L-аспарагиназа. Черные полосы представляют собой среднюю выживаемость всех неиндуцированных линий P12 Ichikawa после воздействия преднизолона, винкристина или L-аспарагиназы (-Dox-контроль). Стероид-чувствительная панель относится к линиям P12 Ichikawa, которые сохраняют одинаково чувствительную реакцию стероидов по сравнению с неиндуцированными условиями контроля, тогда как стойкая к стероидам панель относится к линиям, которые приобретают устойчивость к стероидам. Все данные взяты из трех экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

GAPDH-нормализованные относительные уровни экспрессии (A) NR3C1 (B) TSC22D3 / GILZ, (C) BCC3 / PUMA, (D) KLF13, (E) BCL2L11 / BIM и (F) FKBP5 количественной ПЦР в реальном времени в SUPT1 Сотовые линии. Выражение отображается для всех неиндуцированных клонов в отсутствие (-Dox, открытые черные круги) или присутствия (-Dox, серые заполненные черные круги) преднизолона, а также для линий, индуцированных доксициклином, чувствительных к стероидам и — (+ Dox, открытые красные круги) или присутствие (+ Dox, серые красные круги) преднизолона. Черные полосы показывают средние уровни экспрессии.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) Вестерн-блот-результаты общего и / или фосфорилированного уровней сигнальных молекул IL7R после индукции (+ Dox) дикого типа или мутантных форм молекул IL7R, JAK1, JAK3, NRAS и AKT в клетках SUPT1. Показаны стероид-чувствительные и устойчивые панели. Родительские ячейки SUPT1 служат в качестве контроля. (B-N). Концентрации белка (как определено интенсивностями полос, нормированных β-актином) (B) фосфо-S134 NR3C1, (C) общего RAS, (D) общего PUMA, (E) общего БАД, (F) фосфо -BAD, (G) отношение фосфо-GSK3B к фосфо-GSK3A, (H) общее BIM, (I) общее количество BCL2, (J) фосфо-CREB, (K) фосфо-ATF1, (L) общий MCL1, (M ) фосфо-p38 и (N) общего cMYB в индуцированных доксициклином стероид-чувствительных и устойчивых линиях SUPT1. Уровни значимости определяли с использованием теста Манна-Уитни U. Обратите внимание, что общие уровни RAS в (C) показаны для всех строк, кроме RAS и NRASG12D.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(А) Статус активации сигнальных молекул IL7R вестерн-блоттом клеток SUPT1, экспрессирующих NRAS, которые подвергались воздействию ruxolitinib (2 мкМ), CI1040 (10 мкМ), MK2206 (2 мкМ) или комбинации CI1040 / MK2206 в течение 24 ч по сравнению с неиндуцированных и доксициклин-индуцированных контролей. (B-H) SUPT1 или P12 кривые Ichikawa для серийных разведений преднизолона (250-0,007 мкг / мл, 72 ч экспозиции) без (-Dox, серые круги) или с (+ Dox, открытые красные круги) индукция (B ) JAK1R724H, (C-E) NRAS, (F) IL7R или (G и H) цистеиновый мутант IL7RRFCPH. Эффект (C, F и G) 2 мкМ ruxolitinib, (D) 10 мкМ CI1040 или (E и H) 2 мкМ MK2206 на стероидный ответ в условиях, вызванных доксициклином, показан открытыми синими треугольниками. (I-K) Выживание линий P12 Ichikawa, экспрессирующих сигнальные молекулы дикого типа или мутанта IL7R после 72 часов лечения 250 мкг / мл преднизолона в отсутствие (открытые красные полоски) или присутствие (открытые синие полосы) следующих ингибиторов: (I) ruxolitinib, (J) CI1040 или (K) MK2206. Показаны стероид-чувствительные и устойчивые панели. Для каждого эксперимента средний процент выживаемости для всех неиндуцированных линий (+ Dox) P12 Ichikawa после контакта с преднизолоном (красный, заполненный серой полосой) и ингибитором преднизолона плюс (синий, заполненный серой планкой) показан как контроль. Выживаемость индуцированных линий после воздействия стероидов и ингибиторов была исправлена ​​для цитотоксических эффектов ингибиторов в условиях неиндуцированного контроля. Все данные в (B-K) взяты из трех экспериментов и представлены как среднее ± стандартное отклонение.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(A) Отдельные лекарственные средства (то есть преднизолон) или кривые составного ответа для первичных лейкемических клеток пациента, подвергнутых воздействию 1-10 000 нМ диапазона лекарственного средства или ингибитора, как указано. Значения IC50 соответствуют концентрации препарата или ингибитора, при которой 50% ответивших клеток погибают в течение 72 часов после воздействия. (В) значения IC50, используемые для синергических экспериментов для указанных комбинаций ингибиторов преднизолона. Эти эксперименты проводили для серийных разведений смесей смеси преднизолона в соотношении 1: 1 (разведение 100 равно [0,5 × IC50 преднизолон] + [0,5 × IC50 ингибитор]), соотношение 1: 4 (разведение 100 равно [0,2 × IC50 преднизолон] + [0,8 × IC50 ингибитор]) и соотношение 4: 1 (разведение 100 равно [0,8 × IC50 преднизолон] + [0,2 × IC50 ингибитор]). (C) Комбинированный индекс (CI) в качестве меры для синергизма или антагонизма для каждой комбинированной смеси ингибиторов преднизолона, рассчитанной на уровнях эффективной дозы ED50 и ED75 (при которых 50 и 75% соответственно лейкозных клеток погибли в 72 ч экспозиции) по сравнению с соответствующими отдельными кривыми преднизолона и отклика ингибитора (для которых разведение 100 равно концентрации IC50 преднизолона или ингибитора). CI = 1,0 указывает на аддитивные эффекты; CI <1,0, синергетические эффекты; CI <0,3, сильные синергические эффекты; и CI> 1,5, антагонистические эффекты. Когда CI = 0,1, комбинация преднизолона-ингибитора достигает аналогичного цитотоксического эффекта при 10-кратном более низких концентрациях, чем оценка из кривых индивидуального ответа преднизолона или ингибитора.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Указаны протоколы лечения и доступные геномные и транскриптомические данные.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы хотим поблагодарить пациентов (и их родителей) за участие в этом исследовании. Мы благодарим Йероен де Роос и Джелле Дылус (Нидерландский центр трансляционных исследований) и Дирк Герц за экспериментальную поддержку, а также профессор Ханс Клеверс за полезные обсуждения и критическое чтение рукописи.

массивная сравнительная геномная гибридизация

острый лимфобластный лейкоз

Острый лимфобластный лейкоз В-клеток

индекс комбинации

Немецкая совместная исследовательская комиссия по детскому острой лимфобластной лейкемии

Голландская онкологическая группа детства

ранний тимус-предшественник острый лимфобластный лейкоз

ложная отрицательная ставка

ложноположительная ставка

небольшая вставка или удаление

потеря гетерозиготности

рабочая характеристика приемника

однонуклеотидный вариант

соматический балл

Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз

целенаправленное упорядочение exome

общий счет

целая последовательность генома

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *