Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Исследование экспрессии CD99 в лейкемии, размножающейся клетками в детской Т-клеточной острой лимфобластной лейкемии

Investigating CD99 Expression in Leukemia Propagating Cells in Childhood T Cell Acute Lymphoblastic Leukemia
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5072597/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Концептуализация: AB.

Синтез данных: PD AB.

Формальный анализ: CVC PD AB.

Приобретение финансирования: AB.

Исследование: CVC PD JPM AB.

Методология: CVC PD AB.

Администрирование проекта: AB.

Ресурсы: JPM AB.

Надзор: AB.

Валидация: CVC PD AB.

Визуализация: CVC PD AB.

Написание — оригинальная черновик: AB.

Написание — просмотр и редактирование: CVC PD JPM AB.

Значительное число детей с острым лимфобластным лейкозом Т-линии (T-ALL) не реагируют на терапию и испытывают ранний рецидив. Было показано, что CD99 сверхэкспрессируется на клетках T-ALL и считается надежным детектором заболевания. Однако релевантность сверхэкспрессии CD99 во ВСЕХ не исследовалась в функциональном контексте. Целью этого исследования было исследование функциональной способности CD99 + клеток в детском возрасте ALL и определение пригодности CD99 в качестве терапевтической цели. Потоковые цитометрические анализы подтвердили более высокую экспрессию CD99 во всех бластерах (81,5 ± 22,7%) по сравнению с нормальными кроветворными стволовыми клетками (27,5 ± 21,9%) и Т-клетками (3,1 ± 5,2%, P≤0,004). Когда ВСЕ клетки сортировались и оценивались в функциональных анализах, все 4 субпопуляции (CD34 + / CD99 +, CD34 + / CD99-, CD34- / CD99 + и CD34- / CD99-) могли размножаться in vitro и устанавливать лейкемию у мышей NSG. Распространяющиеся по лейкемии частоты ячеек варьировались от 1 до 300 в 1 в 7,4 × 10 4, но были самыми высокими в субпопуляции CD34 + / CD99. Кроме того, у всех четырех субпопуляций была способность к самообновлению у вторичных мышей NSG. Клетки в каждой субпопуляции содержали специфические для пациента TCR перегруппировки и кариотипические изменения, которые сохранялись при прохождении через последовательные трансплантации NSG. Несмотря на высокий уровень антигена CD99 на большинстве клеток взрыва, лейкемия, инициирующая способность in vivo, не ограничивалась клетками, которые экспрессируют этот белок. Следовательно, нацеливание на CD99 само по себе не будет устранять все клетки T-ALL, способные поддерживать болезнь. Задача остается в разработке терапевтических стратегий, которые могут устранить все клетки лейкемии с возможностью самообновления in vivo.

Данные микрочипов, включенные в эту рукопись, общедоступны с http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ через номер доступа E-MTAB-4006.

Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (T-ALL) представляет собой генетически гетерогенный рак, у 20% пациентов с детства и большинство взрослых пациентов умирают от резистентного или рецидивирующего заболевания. [1] Лейкозные клетки (ЛПК) были предметом большого исследования в последние годы; они могут самообновлять, чтобы поддерживать болезнь, а некоторые устойчивы к текущим химиотерапевтическим агентам [2-6], поэтому эти клетки могут вызвать рецидив. LPC, идентифицированный с использованием иммунодефицитных моделей мыши, разнообразен с точки зрения экспрессии антигенов CD34, CD1a, CD4 и CD7 как в педиатрии, так и у взрослых T-ALL. [2-6] Поскольку ни один из этих маркеров не специфичен для LPC, отличая их от нормального клетки могут быть трудными.

Определение минимальной остаточной болезни (MRD) — это хорошо зарекомендовавший себя инструмент отслеживания для оценки терапевтического ответа. Уровни MRD во время индукции ремиссии стали наиболее важным прогностическим показателем во ВСЕХ [7-12]. Следовательно, они были включены в глобальные протоколы лечения для назначения риска и выбора подходящей терапии (например, UKALL 2011, AIEOP-BFM ALL 2009, TOT XVI). В последние годы были разработаны проточные цитометрические (FCM) панели для выявления остаточного лейкоза более быстрым и экономичным способом с хорошим соглашением (75-95%) с помощью анализа на основе ПЦР [13, 14]. Панели антител EuroFlow для стандартизированных Диагноз T-ALL и оценка MRD [15] направлены на то, чтобы различать взрывы T-ALL из нормальных кроветворных клеток. CD99, трансмембранный белок 32 кД, является маркером фенотипа, связанным с лейкемией, используемым для положительного диагноза T-ALL. Он используется с ядерными TDT, CD5, CD10 и CD1a в качестве панели, которая может различать клетки T-ALL из нормальных кроветворных клеток [15]. Поверхностная экспрессия CD99 высока на педиатрических клетках T-ALL [16, 17] и отсутствует на нормальных Т-клетках. Однако, в отличие от некоторых других маркеров в этой панели, релевантность сверхэкспрессии CD99 не исследовалась в функциональном контексте. Следовательно, его роль в лейкогенезе и потенциал как терапевтическая мишень неизвестны. Чрезмерная экспрессия клеточных поверхностных антигенов на клетках лейкемии была использована в терапевтических целях, например. Blinatumomab [18, 19] и CAR-T-клеточные антигены против CD19 в предшественнике B-клеток (BCP) ALL. [20-22] К сожалению, существует недостаток таких целевых терапий для T-ALL. В этом исследовании мы исследовали экспрессию CD99 на LPC, которую мы ранее показали как CD34 + / CD7 +, CD34 + / CD7- или CD34- [5, 6], и оценивали функциональную емкость клеток, отсортированных на основе поверхностного CD99-экспрессии in vitro и in vivo.

Клетки BM от детей (средний возраст, 6 лет, диапазон, 2-17 лет) с T-ALL при представлении или рецидиве были получены с письменного согласия родителей или опекунов и с одобрения университетских больниц Bristol NHS Trust и Национального комитета по этической этике Лондон-Brent. Подробные характеристики образцов пациентов показаны в таблице 1 ниже и в таблице A в файле S1. Образцы были отобраны на основе наличия материала для изучения. Образцы нормального BM (NBM) и периферической крови (PB) были получены у согласных здоровых доноров. Клетки разделяли с использованием Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich, Poole, UK), мононуклеарные клетки (MNC) суспендировали в модифицированной иковой среде Dulbeccos (IMDM, Invitrogen, Paisley, UK) с 90% фетальной телячьей сывороткой (FCS, Invitrogen) и 10% диметилсульфоксида (ДМСО, Park Park Pharmaceuticals, Бристоль, Великобритания) и хранили в жидком азоте. Средняя жизнеспособность образцов при таянии составляла 83 ± 17% для ВСЕХ образцов и 71 ± 17% для нормальных образцов.

N / A, недоступно.

Размороженные человеческие BM-клетки были помечены следующими антителами из BD Biosciences (Oxford, UK), если не указано иное; анти-CD34 (клон 8G12) -APC и анти-CD38 (клон HB7) -PE или анти-CD3 (клон BW264 / 56) -FITC (Miltenyi Biotec, Surrey UK) и 7AAD (Sigma-Aldrich, Poole UK). Thawed MNC из 9 первичных случаев T-ALL окрашивали анти-CD34-APC, анти-CD7 (клон M-T701) -FITC, анти-CD99 (клон TÜ12) -PE и 7AAD. Клетки анализировали и сортировали с использованием сортировщика клеток Becton Dickinson Influx и BD Sortware версии 1 (BD Biosciences), как показано на рисунке A в файле S1. Клетки первоначально были закрыты при низком прямом и боковом рассеянии, исключая дублеты и флуоресценцию минус один элемент управления, который использовался для установки сортировочных ворот.

Анализ экспрессии генов из 5 нормальных BM и 5 T-ALL первичных образцов проводили с использованием Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays (Miltenyi Biotec, Германия). Обычные субпопуляции CD34 + / CD38-гемопоэтических стволовых клеток (HSC) и CD34 + / CD7 +, CD34 + / CD7-, CD34- / CD7 +, CD34- / CD7-T-ALL были отсортированы для анализа цельного генома (WGA). Для анализа WGA также использовались несертифицированные BM MNC и объемные клетки T-ALL из одинаковых когорт образцов. Клетки были лизированы с использованием SuperAmp Lysis Buffer в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec). РНК-амплификацию, приготовление кДНК и гибридизацию выполняли Miltenyi Biotec, как последующий анализ экспрессии генов с использованием Agarent Whole Human Genome Oligo Microarrays. Сигналы флуоресценции были обнаружены с помощью Agilent Microarray Scanner System (Agilent Technologies) и проанализированы с помощью программного обеспечения Agilent Feature Extraction. Весь набор данных интенсивностей сигналов был нормализован путем деления значения интенсивности каждого образца на общую медианную форму, преобразованную в логарифмическую шкалу и срединную центрированную. Дифференциальный анализ экспрессии генов проводили при сравнении между T-ALL LPC и нормальным HSC и объемным T-ALL по сравнению с обычным BM. Данные Microarray доступны в базе данных ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) под номером присоединения E-MTAB-4006.

Культуры суспензии инициировали с несортированными клетками ALL или с отсортированными субфракциями до 5 × 105 клеток / мл в IMDM, дополненном интерлейкином (IL) -3 (20 нг / мл), IL-7 (10 нг / мл) и фактором стволовых клеток (50 нг / мл, все системы R & D, Abingdon UK). Культуры поддерживались на срок до 6 недель с недельными половинными изменениями в среде. Клетки, удаленные во время изменений в среде, использовали для определения жизнеспособности и абсолютного количества по проточной цитометрии и для цитогенетических анализов с помощью FISH, как описано ранее [2].

Эксперименты in vivo проводились в соответствии с Законом о животных (научных процедурах) в соответствии с лицензиями, предоставленными Министерством внутренних дел Соединенного Королевства (PPL 30/3113), и были предприняты все усилия для сведения к минимуму страданий, включая убийство по методу расписания 1 на первом признак симптомов болезни. Мышей NSG выращивали и поддерживали в Бристольском отделе обслуживания животных Бристоля. Перед инокуляцией мышей не предварительно предопределили. Клетки ресуспендировали в 0,3 мл IMDM + 5% человеческого сывороточного альбумина и вводили в латеральные хвостовые вены 6-8-недельных мышей. Неразрешенные клетки и сортированные клеточные популяции инокулировали в диапазоне доз. Животных проверяли еженедельно на наличие клеток человека в аспиратах ПБ, поддерживали в течение до 20 недель и убивали по выбору или как только они начали проявлять клинические симптомы заболевания. Проанализирована грубая анатомия и удалены белковые образцы BM для FCM и цитогенетического / гистологического анализа. Анализ FCM PB и BM с ксенотрансплантатов проводился с использованием антител против CD7, CD19, CD34, CD45, CD99 и CD99 человека (все BD Biosciences). Аликвоты клеток из NSG BM высевали на слайды для цитогенетического или морфологического анализа.

Клетки, собранные из BM некоторых привитых мышей, использовали для серийных экспериментов по трансплантации. Эти клетки не были обогащены для какого-либо конкретного фенотипа перед оценкой в ​​последовательных ксенотрансплантатах. Подробная информация о количестве ячеек, помещенных во вторичные получатели, приведена в таблице C в файле S1.

Сортированные ВСЕ субфракции и клетки, выделенные из BM трансплантированных мышей NSG, подвергали скринингу на наличие перегруппировок Т-клеточного рецептора (TCR) (TCRG, TCRD и TCRB). ДНК экстрагировали с использованием набора QIAamp DNA Micro kit (QIAGEN, Crawley, United Kingdom). Праймеры полимеразной цепной реакции (ПЦР) и используемые условия были такими, как описано ранее [2]. Продукты ПЦР подвергали гетеродуплексному анализу, клонировали и моноклональные продукты секвенировали. Каждая перегруппировка характеризовалась сравнением последовательностей с последовательностями зародышевой линии, содержащимися в онлайн-базе данных www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/.

Цитогенетический анализ с помощью флуоресценции in situ гибридизации (FISH) проводили на образцах при диагностике, на клетках, собранных из культур и клеток, собранных из костного мозга NSG Лабораторией генетики Бристоля, больнице Саутмид. По меньшей мере 50 ядер на образец оценивали на препаратах из культивируемых клеток и тех, которые собирали у мышей NSG.

Анализ дисперсии (ANOVA) с последующим пост-hoc-тестированием Tukey использовался для сравнения экспрессии антигена CD99 в разных источниках клеток и пролиферации субпопуляций в суспензионной культуре. Последовательные тесты ANOVA и Tukey также использовались для выявления значительных различий в экспрессии генов между группами образцов. Смещение изменения генной экспрессии между двумя образцами эквивалентно их коэффициенту интенсивности log2. Массовая экспрессия гена T-ALL была непосредственно сравнена с BM MNC, а для каждой субпопуляции LPC сравнивали с HSC. Частоты LPC определялись по статистике Poisson с использованием программного обеспечения L-Calc (StemCell Technologies Inc). Для сравнения уровней приживления между первичными и вторичными получателями NSG использовались согласованные парные Т-тесты.

Изучены образцы BM от 9 детей с диагнозом T-ALL и нормальных здоровых доноров (таблица 1). Первоначально экспрессию CD99, определяемую проточной цитометрией, сравнивали в нормальных BM MNC, CD34 + / CD38-HSC, CD3 + T-клетках и T-ALL-бластах (фиг. 1A). Доля CD99 + клеток была значительно выше у T-ALL (медиана 90,5%, диапазон 27,4-97%), чем BM MNC (22%, 6,8-51,9%), HSC (22%, 10-62,7%) и CD3 + T-клетки (0,55%, 0,14-15,9%, P≤0,004). В нормальных образцах доноров доля CD99 + клеток была значительно ниже в CD3 + Т-клетках по сравнению с HSC и MNC (P≤0,007). Впоследствии мы исследовали экспрессию CD99 в известных субпопуляциях LPC [5, 6] из этих случаев T-ALL. Самые высокие доли клеток CD99 + были обнаружены в CD34 + / CD7 + (медианы 91,7%, диапазон 52-99,6%) и CD34- / CD7 + LPC-популяции (97,3, 40-99,3%, рис. 1B). Значительно меньше CD99 + клеток были обнаружены в CD34 + / CD7- и CD34- / CD7-субпопуляциях со средними значениями 29,9 и 21,7% соответственно (P≤0,009). Однако, за исключением случаев 2 и 8, пропорции CD99 + клеток, обнаруживаемых в CD34 + / CD7- и CD34- / CD7-субпопуляциях, были выше 20%. Для сравнения отдельных образцов пациентов также показаны пропорции CD99 + клеток в каждой субпопуляции LPC (рис. 1C). Несмотря на очевидные различия между случаями, в целом доля CD99 + клеток в субпопуляции CD34 + / CD7 + была сходной по всей когорте. Аналогично, экспрессия CD99 была сходной в субпопуляции CD34- / CD7 +, за исключением очков 3 и 6. Для дальнейшего изучения этой сверхэкспрессии CD99 Анализ WGA проводился на отсортированных субпопуляциях из 5 случаев на основе выражения CD34 и CD7 и несортированных объемные клетки лейкемии. Результаты сравнивались с данными нормального BM MNC и CD34 + / CD38-HSC, (www.ebi.ac.uk/arrayexpress, номер доступа E-MTAB-4006). CD99 был экспрессирован на более высоких уровнях во ВСЕХ клетках и некоторых субпопуляциях LPC по сравнению с BM MNC и HSC (рис. 1D), хотя различия были незначительными. Другие гены, связанные с T-ALL, такие как CD2 и CD5, были в 2 и 7 раз сверхэкспрессированы, соответственно, по сравнению с обычным BM MNC.

(A) Экспрессия антигена CD99 оценивали проточной цитометрией в образцах BM из 9 случаев T-ALL и BM MNC, CD34 + / CD38-HSC и CD3 + Т-клеток у 5-9 здоровых доноров. Линии представляют медианные значения, ** P≤0,007, **** P <0,0001. (B) Выражение CD99 в отсортированных субпопуляциях LPC из этой когорты T-ALL. Линии представляют медианные значения, * P = 0,02, ** P≤0,009. (C) Сложенная гистограмма, показывающая выражение CD99 в субпопуляциях CD34 / CD7 LPC в отдельных случаях. (D) Экспрессию гена в образцах BM из 5 случаев T-ALL (баллы 2, 4, 7, 8, 9) и 5 ​​здоровых доноров анализировали с использованием микромагментов Agilent Whole Genome Oligo. Данные показывают параллельное сравнение срединно-центрированных нормированных интенсивностей сигнала log2. Коробки представляют собой диапазон выражения, а горизонтальные линии представляют собой медиану.

Поскольку анализ FCM показал, что CD99 был выражен во всех субпопуляциях, которые мы ранее показали, что они имеют емкость LPC, мы исследовали, важна ли его экспрессия для пролиферации in vitro и in vivo. Поскольку экспрессия CD99, совместно разделенная с CD7, в большинстве случаев, субпопуляции CD34 и CD99 были очищены для функциональных анализов. При сортировке субпопуляции CD34 + / CD99 + и CD34- / CD99 + представляли большинство бластов лейкемии (31,5 ± 43% и 62,2 ± 44% соответственно), тогда как субпопуляция CD34 + / CD99 была наименьшей (0,40 ± 0,7%, рис. 2А). Через 3 недели в культуре большинство пролиферирующих клеток получали из CD34 + / CD99- и CD34- / CD99-субпопуляций. Клетки, полученные из субпопуляции CD34 + / CD99, составляли большинство пролиферирующих клеток на 5-й неделе (68,2 ± 16%) и 6 (60,0 ± 15%, Р = 0,02). Наибольшее расширение наблюдалось в культурах CD34 + / CD99-клеток (4,6-1798 раз, P≤0,02) от 7,5 × 10 3 до 2,6 × 10 6 клеток на 6-й неделе (рис. 2B). Расширение наблюдалось также в культурах несортированных клеток от 1 × 10 5 до 7 × 10 5 и CD34- / CD99-клеток (4,7 раза на 3-й неделе, 2,5 раза на 6-й неделе). В культурах клеток CD99 + абсолютные подсчеты клеток первоначально снижались, но восстанавливались до 57% (CD34 + / CD99 + субпопуляция) или 70% (CD34- / CD99 + субпопуляция) начальных начальных чисел клеток к 6 неделям. Анализ FISH подтвердил культивируемые клетки из каждого отсортированного субпопуляция сохраняла специфические кариотипические аномалии у пациента, а частота аберрантных клеток (20-100% FISH +) была сходна с таковой при диагнозе, подтверждая пролиферацию клеток, полученных из клона лейкемии.

(A) клетки T-ALL (пункты 1, 4-6 и 9) окрашивали антителами против CD34, CD99 и CD7, субпопуляции сортировали на основе экспрессии CD34 / CD99 и пролиферативную способность оценивали в долгосрочной культуре. Культуры поддерживались с еженедельными изменениями в средствах массовой информации. Абсолютные подсчеты клеток, полученные из каждой отсортированной популяции и несортированных контролей, определяли с помощью проточной цитометрии на 1, 3, 5 и 6. недели (A). Проценции общих жизнеспособных клеток, представленных каждой отсортированной популяцией, вычисляли, используя абсолютные значения количества клеток в указанные моменты времени. Данные выражаются как среднее ± SD, * P = 0,02, ** P≤0,005, *** P = 0,0004. (B) Обслуживание и расширение несортированных клеток и каждой сортированной субпопуляции во время курса культуры. NC, зародышевые клетки.

Клетки из 5 случаев сортировали на основе экспрессии CD34 и CD99 (см. Таблицу 1) и инокулировали мышам NSG в диапазоне доз для оценки частоты LPC (таблица 2). LPC были обнаружены в каждой исследуемой субпопуляции. Частоты изменялись от 1 в 1300 до 1 в 7,4 × 10 4, но были самыми высокими в субпопуляции CD34 + / CD99. Поскольку количество отсортированных ячеек ограничено масштабом анализа разбавления, эти частоты LPC, вероятно, будут занижены.

Частоты LPC, рассчитанные с использованием программного обеспечения L-Calc

Приживление лейкемии у мышей NSG достигалось с использованием несортированных клеток (0,7-98%) и с каждой сортированной субпопуляцией: CD34 + / CD99 + (2-99%), CD34 + / CD99- (3-85%), CD34- / CD99 + (3- 99%) и CD34- / CD99- (2-93%, фиг. 3А). В большинстве случаев не было различий в скорости приживления между различными субпопуляциями, причем приживление достигало 3-12 недель после инокуляции. Это было несмотря на то, что было введено 2-3 log меньше CD99-клеток. В pt 4 приживление как CD34 + / CD99, так и CD34- / CD99-клеток было отложено на 3 недели по сравнению с реципиентами CD34 + / CD99 + и CD34- / CD99 + клеток. Тем не менее, до 2 log меньше CD99-клеток инокулировали. Все 4 подгруппы также обладали способностью к самообновлению, что подтверждается приживкой вторичных реципиентов NSG (рис. 3B). Более высокие уровни приживления лейкемии наблюдались у вторичных животных по сравнению с первичными реципиентами, несмотря на то, что в некоторых случаях вводили меньшее количество клеток (P≤0,04). Время начала лейкемии было снижено по сравнению с первичными животными (2-9 недель) и в pt 4, задержка приживления между CD99 + и CD99-субпопуляциями была уменьшена до 12 дней. В большинстве случаев, независимо от инокулированной субпопуляции, иммунофенотип собранных клеток NSG BM был аналогичен иммунологии пациентов с диагнозом (таблица A в файле S1)), с потерей CD34 и усилением CD99 в пунктах 2, 3 и 9 и усиление обоих маркеров в pt 6 (таблица B в файле S1). В pt 4 не было существенных изменений в иммунофенотипе с прохождением через мышей NSG, что отражает смешанную экспрессию этих антигенов у пациента при постановке диагноза. Специфические для пациента вариации TCR сохранялись при прохождении через мышей NSG (таблица C в файле S1), а анализ FISH показал, что клетки также имели специфические кариотипические аберрации пациента (66-100%), подтверждающие приживление клеток лейкемии и демонстрирующие каждую субпопуляцию, возможности обновления.

Клетки T-ALL из 5 случаев (pts 2, 3, 4, 6, 9) сортировали на основе экспрессии CD34 / CD99, и репопуляционную способность каждой сортированной популяции оценивали у мышей NSG (A). Каждый пациент представлен конкретным символом, и каждый символ изображает приживление, обнаруженное в BM отдельной мыши методом проточного цитометрического анализа, измеренное антителом против CD45 человека. (B) Клетки, собранные из BM некоторых приживленных первичных реципиентов, были инокулированы во вторичные получатели NSG. Оси X изображают количество клеток, инокулированных из каждой отсортированной субпопуляции (A) или из источника первичного ксенотрансплантата (B).

В то время как современные протоколы лечения значительно улучшают показатели выживаемости при лейкемии у детей, 5-летняя выживаемость для T-ALL (~ 85%) остается хуже, чем у BCP-ALL. [23] Большинство рецидивов происходит во время лечения, а прогноз для этих пациентов неудовлетворительный, при выживании <25% [23, 24]. Более полное понимание биологии заболевания может позволить разработать более целенаправленные, менее токсичные методы лечения. Чрезмерная экспрессия некоторых антигенов на клетках ALL позволяет точно диагностировать, классифицировать, контролировать болезни и, что важно, указывает на потенциальные цели для терапии. Хотя для BCP-ALL разработано несколько методов лечения на основе антител, варианты терапии T-ALL ограничены. Отсутствие специфичности некоторых маркеров и клональной гетерогенности в клетках пациентов является важным фактором при разработке целевых терапевтических средств. В настоящем исследовании мы стремились исследовать значимость сверхвыражения CD99 в детском T-ALL.

Данные из FCM и генетического анализа подтвердили экспрессию CD99 выше в случаях T-ALL, чем в нормальных клетках BM [16, 17]. Кроме того, результаты FCM согласуются с предыдущими отчетами, используя тот же самый клон моноклональных антител, идентифицируя CD99 как полезный дискриминатор T-ALL-бластов из нормальных Т-лимфоцитов [15, 16]. При развитии Т-клеток CD99 подавляется на нормальные Т-клетки с увеличением экспрессии поверхности CD3 [25]. CD99 был высоко выражен в текущей когорте пациентов независимо от прогностических показателей или состояния риска MRD. Один из 9 исследованных случаев, pt 3, образец рецидива, классифицированный как высокий риск MRD, имел сравнительно низкую экспрессию CD99 (27%). Это также соответствует зарегистрированным частотам более низкой экспрессии CD99 в ~ 15% случаев детского T-ALL. [16] Хотя экспрессия гена CD99 не была значительно выше, в меньшей когорте пациентов по сравнению с обычными образцами BM гены для других маркеров фенотипа, связанных с лейкемией, которые использовались в панелях MRD T-ALL EuroMlow FCM, включая CD2 и CD5, были сверхэкспрессированы в этих случаях . [15] Анализ экспрессии генов LPC чрезвычайно сложный из-за ограничения числа клеток, и это исследование представляет собой первый отчет по анализу WGA в популяциях T-ALL LPC.

Чтобы понять значимость этой сверхэкспрессии CD99 и определить, играет ли она роль в лейкемогенезе, важно оценить функциональную емкость этих клеток in vitro и in vivo. Ранее мы показали, что бласты из обоих случаев BCP- и T-ALL могут поддерживаться в культуре в течение продолжительных периодов времени без потери кариотипа или перегруппировок TCR. [2, 5] Данные из долгосрочных суспензионных культур и серийных NSG что экспрессия CD99 не является необходимым условием для пролиферации in vitro или для распространения лейкоза in vivo. В то время как уровни приживления варьировали среди образцов пациентов и инокулированных субпопуляций, приживление достигалось в каждом случае как с CD99 +, так и с CD99-клетками, хотя большинство бластных клеток в этих случаях выражали CD99. Аналогично, как CD34 +, так и CD34-клетки могут трансформироваться независимо от экспрессии CD99, несмотря на то, что 3 из 5 пациентов имеют CD34-иммунофенотип. Более низкие уровни приживления, наблюдаемые с CD99-клетками, скорее всего, будут результатом меньшего числа этих клеток в инокуляции, а не сниженной способности к приживлению. Фактически, анализ частоты LPC указывает, что он был выше в субпопуляции CD34 + / CD99 в этой группе пациентов. В каждом исследуемом образце фенотип инокулированных клеток изменялся in vivo с целью получения T-ALL у мышей NSG с иммунофенотипом, подобным иммунофенотипу, аналогичному таковому у пациента с диагнозом, с повышенной экспрессией CD99 у реципиентов CD99-субпопуляций. Такие иммунофенотипические изменения после ксенотрансплантации клеток T-ALL согласуются с предыдущими сообщениями с использованием мышей NSG и NOD / SCID. [2, 5]. Все отсортированные субпопуляции имели способность к самообновлению и приживление было выше, а лейкемия стала более быстрой у вторичных животных , Кроме того, специфические кариотипы пациента и ретрансляции генов TCR также были сохранены при прохождении через мышей NSG, подтверждая приживление клеток лейкемии. Эти данные свидетельствуют о том, что таргетинг только на CD99 или в сочетании с CD34 / CD7 не будет эффективным подходом к уничтожению клеток с лейкемией, инициирующей способность in vivo.

Кроме того, результаты показывают, что отсутствие CD99 + клеток во время терапии может не означать отсутствие остаточного заболевания. Тем не менее, сложившаяся практика многопанельных анализов МРС МФМ должна снизить риск ложных отрицательных результатов. В предыдущем исследовании сообщалось о потере как CD99, так и TdT во время терапии [17]. Авторы предположили, что это может быть связано с избирательной выживаемостью CD99-субпопуляций или понижением регуляции CD99 на выживающих клетках. Хотя наше исследование не исследовало антигенные изменения во время терапии, мы не наблюдали потери CD99 во время прохождения в NSG. По нашим данным, как CD99 +, так и CD99-субпопуляции способны к самообновлению, выживаемость только CD99-клеток после индукционной терапии, как было предложено Рошалем и др. [17], все равно оставит популяцию клеток, потенциально способных вызвать рецидив , Такое явление было отмечено у пациентов с рецидивом BCP ALL с CD19-лейкемией после введения CD19-CAR-T-клеток с лимфоидным миелоидным фенотипическим переключением в некоторых случаях [21, 22, 26]. Нынешние данные дополняют доказательства разнородности этого злокачественного новообразования и являются еще одним доказательством того, что в детстве T-ALL существуют несколько субпопуляций LPC, как описано для BCP ALL. [5, 27, 28]. Чтобы улучшить результаты для T-ALL, необходимо будет нацелить все клетки, которые обладают способностью распространяться лейкемией in vivo, а не только те, которые представляют собой большинство бластных клеток у пациентов.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Авторы выражают благодарность д-ру Джереми Хэнкоку, г-ну Полю Дего и сотрудникам Лаборатории генетики Бристоля, больница Саутмид, за отличную техническую помощь. Д-р Эндрю Херман для сортировки клеток и Университет Бристоля Факультет биомедицинской науки. Мы также благодарим д-ра Мишель Камминс и сотрудников онкологии в Королевской больнице Бристоля для детей. Мы благодарны пациентам и их семьям, которые дали разрешение на использование своих клеток для исследования.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *