Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

EphA2 является терапевтической целью в EphA2-положительных лейкозах, но не является существенным для нормального гемопоэза или лейкемии

EphA2 Is a Therapy Target in EphA2-Positive Leukemias but Is Not Essential for Normal Hematopoiesis or Leukemia
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4470658/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: SC AWB SWL. Выполнены эксперименты: SC KB FMS. Проанализированы данные: SC. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: SC FA ASM CB. Написал бумагу: SC AWB. Отредактировано рукопись: SWL FA CB.

Было показано, что члены семейства Eph рецепторных тирозинкиназ и их мембранных связанных эфриновых лигандов играют важную роль во многих процессах развития, а в последнее время участвуют как в нормальных, так и в патологических процессах в после эмбриональных тканях. В частности, исследования экспрессии Eph-рецепторов и ограниченные функциональные исследования продемонстрировали роль системы Eph / ephrin при гематопоэзе и лейкогенезе. В частности, EphA2 сообщалось о гемопоэтических стволовых клетках и стромальных клетках. Имеются также сообщения об экспрессии EphA2 во многих различных типах злокачественных новообразований, включая лейкемию, однако имеется недостаточная осведомленность в понимании роли EphA2 в гематопоэзе и лейкогенезе. Мы исследовали роль EphA2 в гемопоэзе, анализируя мышей с нокаутом дикого типа и EphA2. Были проанализированы зрелые, дифференцированные клетки, предшественники и гемопоэтические стволовые клетки, полученные от нокаутных и контрольных мышей, и никаких значительных аномалий не было обнаружено. Эти исследования показали, что EphA2 не играет обязательной роли в нормальном гемопоэзе. Сравнительные исследования с использованием EphA2-негативных лейкозов MLL-AF9, полученных от EphA2-нокаутных животных, показали, что для EphA2 не было обнаруженной функциональной роли при инициации или прогрессировании лейкемического процесса. Однако экспрессия EphA2 при лейкемии, инициированная MLL-AF9, показала, что этот белок может быть возможной терапевтической мишенью при этом типе лейкемии. Мы показали, что лечение моноклональным антителом EphA2 только IF7 не влияло на туморогенность и латентность лейкозов MLL-AF9, тогда как нацеливание EphA2 с использованием моноклонального антитела EphA2 с радиоактивной полезной нагрузкой значительно ухудшало лейкозный процесс. В целом эти результаты идентифицируют EphA2 как потенциальную радиотерапевтическую мишень при лейкозах с транслокацией MLL.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Eph / ephrin образуют наибольшее семейство рецепторных тирозинкиназ (RTK) и делятся на две группы на основе их гомологии последовательностей, специфичности лиганда и структурных особенностей. Четырнадцать членов Eph-рецепторов (EphA и EphB-рецепторы) связываются с восемью членами лигандов эфрина (лиганды эфрин-А и эфрин-B) [1, 2]. В гематопоэтической системе экспрессия Eph / ephrin была обнаружена на очищенных популяциях гемопоэтических стволовых клеток (HSCs) как у человека, так и у мышей [3-5]. В реальном времени количественный ПЦР и проточный цитометрический анализ очищенных HSCs в костном мозге мыши демонстрируют экспрессию всех EphA-рецепторов, за исключением EphA6 и EphA8, наряду с экспрессией членов лиганда эфрин-А, причем эфрин-A4 и эфрин-A5 являются наиболее высоко выраженный [6]. Экспрессия Eph / ephrin сообщается в клетках-предшественниках, включая эритроидные предшественники, В-клетки и Т-клетки. Они также были вовлечены в агрегацию тромбоцитов и развитие лимфоидов [5, 7, 8].

Члены семейства Eph / ephrin аберрантно экспрессируются в раковых клетках и микроокружении опухоли, где они влияют на рост и распространение опухоли [9-12]. Интригующе, Eph-рецепторы могут обладать способностью подавлять опухоль или стимулировать опухоль в зависимости от типа рака [13]. В частности, повышенная экспрессия членов системы Eph / ephrin была обнаружена при лейкемии у человека. EphA3 был первоначально идентифицирован в линии клеточной линии острой лимфобластной лейкемии LK63 (ALL), и дальнейшие исследования показали ее экспрессию в других лейкозных клеточных линиях [14, 15]. Совместная экспрессия ephrin-B2 и EphB4 (HTK) была обнаружена во многих лейкозных клеточных линиях [8]. Исследования, проведенные Nakanishi и др., Выявили регуляцию EphA7 в лейкемии, связанной с ALL1 (ALL1 / AF4 и ALL1 / AF9) [16]. Они также сообщили об экспрессии других транскриптов EphA, включая EphA1, EphA2, EphA3, EphA4 и EphA6 в трансфицированных MLL-AF9 и MLL-AF4 клетках K562 [16]. Совсем недавно, Eph-рецепторы были исследованы как потенциальные мишени для лечения рака, причем самые современные методы лечения были нацелены на EphA2, EphA3 и EphB4 [11]. Несмотря на сообщения об экспрессии Eph в кроветворных клетках, роль Eph / ephrins в гематопоэзе еще предстоит определить.

Доступная литература указывает на экспрессию транскрипции EphA2 на значительных уровнях в HSCs [6] и различных злокачественных новообразованиях человека, однако имеются ограниченные знания о конкретной роли этого члена семейства Eph RTK в HSC и лейкозах [6]. В этом отчете мы исследуем потенциальную роль белка EphA2 в контроле над нормальным гемопоэзом и лейкемией. Чтобы указать конкретную роль EphA2 в нормальном гемопоэзе, мы исследовали гематопоэз у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с их однопометниками дикого типа. Мы также рассмотрели экспрессию EphA2 в мышиной модели лейкемии и отметили, что лейкоз MLL-AF9, индуцированный лейомией, имеет повышенную экспрессию EphA2. Терапия моноклональным антителом EphA2 ранее использовалась при различных типах рака, которые экспрессируют EphA2 в этом отчете, мы исследовали влияние нацеливания на EphA2 с использованием моноклонального антитела EphA2 и моноклонального антитела EphA2 с радиоактивной меткой в ​​лейкозах, инициированных MLL-транслокациями.

Все образцы человеческих клеток, использованные для этого отчета, были собраны с письменного информированного согласия донора в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрены Комитетом по этике медицинских исследований им. Кембриджа Бергхофера и Комитетом по этике детей-медицинских институтов Квинсленда. Вся документация хранилась надежно, как утверждается Комитетом по этической этике.

Исследования животных проводились по согласованию с Комитетом по этике животных им. Кемра Бергхофера. Мышей анестезировали 2-3% изофлурана в кислороде и губализировали с помощью цервикальной дислокации или асфиксии, одобренной Комитетом по этике.

Мышей-нокаутов EphA2 любезно предоставили д-р Нарусе-Накадзима (Токийский университет) [17] и поддержал фон C57BL / 6 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Самки мышей конгенных штаммов C57BL / 6 (Ly 5.2) и PTPRC (Ly 5.1) были приобретены в Animal Resource Center (Перт, Австралия). Эти мыши были сшиты с образованием гетерозиготных мышей CD45.1 / 45.2. Все мыши, используемые в этих исследованиях, находились в возрасте от 6 до 8 недель. В соответствии с протоколами института мышей содержали в КИМР Бергхоферский медицинский научно-исследовательский институт патоген, свободный от животных.

После обезболивания мышей периферическую кровь собирали с использованием подчелюстного отбора крови и анализировали на анализаторе Hemavet (Drew Scientific, Oxford, CT).

Клетки, очищенные от костного мозга и селезенки мышей после лизиса эритроцитов (BD Biosciences, San Jose, CA), были подсчитаны на счетчике Coulter (Beckman Coulter, Miami, FL). Эти клетки окрашивали в зрелые клетки крови, клетки-предшественники и гемопоэтические стволовые клетки [18, 19]. Клетки были окрашены CD3 (eBioscience, San Diego, CA 12-0031-82) для Т-клеток, Gr1 (Biolegend, San Diego, CA, 108412) для гранулоцитов и B220 (Biolegend, 103204) для B-клеток. Для анализа эритроидного созревания использовали антитела CD71 (eBioscience, 12-0711-82) и Ter-119 (eBioscience, 17-5921-82).

Для выделения гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) клетки костного мозга окрашивали коктейлем биотинилированных антител против мышиных антител против антигенов, экспрессированных на клетках, выделенных на линии, с помощью панели биотинилированных моноклональных антител к Ter119 (553672, BD Biosciences), CD3 (Clone 145-2C11, 553060, BD Biosciences), CD5 (клон 53-7,3, 553019, BD Biosciences), B220 (Clone RA3-6B2, 553086, BD Biosciences), Mac-1 (Clone M1 / ​​70, 553308, BD Biosciences) и Gr-1 (Clone RB6-8C5, 553125, BD Biosciences). Линейные клетки + были обнаружены стрептавидином (Biolegend, 405208) для обогащения ранних гемопоэтических клеток. Эти клетки линии окрашивали комбинацией c-kit (eBioscience, clone 2B8, 17-1171-82) и Sca-1 (eBioscience, клон D7, 25-5981-82). Эта популяция клеток содержит две субпопуляции, известные как клетки Lineage-c-Kit + Sca-1 + (LKS +) и клетки Lineage-c-Kit + Sca-1-предшественники. Клетки-предшественники окрашивали CD34 (eBioscience, clone RAM34, 11-0341-82), FcγRII / III (eBioscience, clone 93, 12-0161-82) для фракционирования этой популяции в предшественники гранулоцитов-моноцитов (GMP), обычных миелоидных предшественников (CMP) и предшественников мегакариоцитов-эритроцитов (MEP). Клетки LKS + окрашивали либо CD34 (клон RAM34, 11-0341-82) и Flk2 (клон A2F10.1, 12-1351-82), либо CD150 (клон TC15-12F12.2, Biolegend 115912) и CD48 (клон HM48- 1, Biolegend 103418) антитела к дальнейшему фракционированию этих клеток в долгосрочные HSC (LT-HSC), краткосрочные HSC (ST-HSC) и мультипотентные предшественники (MPP).

Экспрессию клеточной поверхности белков Eph определяли 10 мкг / мл внутренних моноклональных антител против EphA1, -EphA2, -EphA3 и-EphA7 или слитого белка ephrinA5-Fc и окрашивали SYTOX-Blue (Life Technologies, Gaithersburg, MD ) маркер мертвой ячейки. Все клетки анализировали на проточном цитометре LSRFortessa (BD Biosciences).

Эксперименты с конкурентной трансплантацией проводились путем инъекции нокаутов EphA2 или донорных клеток CD45.2 дикого типа вместе с равным количеством двойных положительных CD78.1 / 45.2 клеток-конкурентов в хвостовую вену облученных (11 Гр) CD45.1-реципиентов-мышей. Химеризм крови анализировали каждые 4 недели в течение 16 или 24 недель, а на прошлой неделе определяли химеризм костного мозга и селезенки.

РНК была выделена из костного мозга с использованием набора RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA), а комплементарная ДНК (кДНК) была синтезирована с использованием SuperScript III (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Относительная количественная оценка транскрипции выполнялась с помощью SYBR Green QPCR Mastermix (Applied Biosystems, Foster City, CA) с использованием системы PCR в режиме реального времени RotorGene 3000. Экспрессия гена была рассчитана относительно 18S рРНК или β-актина.

Для первичной трансплантации мышиные гематопоэтические стволовые клетки получали с использованием флуоресцентно активированной клеточной сортировки (FACS) и культивировали в течение ночи на фибронектине в средах StemSpan (Stem Cell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) со 100 нг / мл стволовыми клетками (SCF, PeproTech, Rocky Hill, Нью-Джерси, США), 50 нг / мл тромбопоэтина (TPO, PeproTech.), 100 нг / мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) и 100 ед / мл пенициллин-стрептомицина (Life Technologies, Gaithersburg, MD) , Культурные клетки инкубировали в течение 48 часов с супернатантами ретровирусных векторов MSCV-MLL-AF9-GFP и MSCV-BCR-ABL-GFP, как описано ранее [19]. Очищенные гемопоэтические стволовые клетки (LKS +) трансдуцировали MLL-AF9-GFP или BCR-ABL-GFP, содержащим ретровирус. Трансдуцированные зеленые флуоресцентные белковоположительные (GFP +) клетки трансплантировали сублетально облученным мышам-реципиентам (5,5 Гр) через инъекцию хвостовой вены. Для вторичной трансплантации 2 × 104 GFP + лейкемические клетки первичной трансплантации вводили через хвостовую вену подлеченому облучателю (5,5 Гр) реципиентным мышам (C57BL / 6). Этих мышей контролировали и оценивали по признакам лейкемии каждый второй день, и мышей с клиническими признаками заболевания умерщвляли сразу [19].

Для оценки потенциального терапевтического эффекта анти-EphA2-антитела на лейкемических мышах MLL-AF9 мышей обрабатывали внутрибрюшинно 0,1 мг моноклонального антитела против мышиного EphA2 (mAb IF7) в PBS или контроле только PBS (PBS) в альтернативные сроки до мышей подвергали эвтаназии из-за прогрессирования заболевания.

Первичные образцы костного мозга или периферической крови были получены у пациентов с острой миелоидной лейкемией, вызванной MLL (AML, n = 3) и ALL (n = 3 pre-B ALL, 1 T-ALL), после информированного согласия в соответствии с Декларацией Хельсинки. Мононуклеарные клетки были выделены с использованием градиента плотности градиента Ficoll. Средний процент бластов в каждом образце составил 92,5% (диапазон 65-96%).

Моноклональное антитело EphA2 (IF7 mAb) и моноклональное антитело EphA3 (IIIA4 mAb) были радиоактивно мечены Lutetium-177 (177Lu, PerkinElmer, MA), как описано ранее [20]. Конкретная радиоактивность составляла 8,1 и 8,5 мКи / мг (то есть 300 и 316 МБк / мг) для 177Lu- IF7 и 177Lu-IIIA4 соответственно. После трансплантации были начаты лечение с помощью PBS, немеченых антител IF7, 177Lu-IF7 и 177Lu-IIIA4. Средний процент клеток GFP + в крови мыши определяли с использованием проточной цитометрии, и лечение вводили внутривенно путем инъекции хвостовой вены.

Статистический анализ выполнялся с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 6.01. Все данные проточной цитометрии были проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo (TreeStar).

Развитие крови у взрослых нокаутных мышей EphA2 по сравнению с обычными мышами C57BL / 6 не выявило различий в исходных параметрах крови, включая гематокрит (HCT), лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC), нейтрофил, лимфоциты, моноциты или количество тромбоцитов в крови (рис. 1А). Никаких существенных различий в весе селезенки и печени у мышей с нокаутом EphA2 не наблюдалось. Количество зародышевых клеток костного мозга и селезенки также не обнаруживало существенных различий (рис. 1B).

(A) Полный анализ крови не показал значительных различий у мышей с нокаутом EphA2 по сравнению с мышами дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента). (B) Количество зародышевых клеток костного мозга и селезенки и массы селезенки и печени у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с однопометниками дикого типа не выявило существенных различий (n = 5). (C) Анализ созревания эритроидов, эритроид-1, соответствующий проэритробластам (CD71high, Ter119mid), эритроид-2, соответствующий базофильным эритробластам (CD71high, Ter119high), эритроид-3, соответствующий поздним базофильным и полихроматофильным эритробластам (CD71mid, Ter119high) и эритроид-4, соответствующий поздним базофильным и полихроматофильным эритробластам (CD71low, Ter119high) в костном мозге, представленном как процент жизнеспособных клеток костного мозга, не выявил различий в созревании эритроидов в нокауте EphA2 по сравнению с контрольными клетками дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента ). (D) B-лимфоциты (B220), T-лимфоциты (CD3) и гранулоциты (Gr-1) не выявили различий в B-лимфоцитах, Т-лимфоцитах или гранулоцитах в костном мозге, селезенке и крови нокаутных мышей EphA2 по сравнению с контрольными мышами дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента). Данные представляют среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего значения). Непарный t-тест проводился для статистических анализов (n), представляющих числовых мышей, используемых в каждом эксперименте. Для статистического анализа был проведен непарный t-тест.

Анализ этапов созревания эритроидов в костном мозге EphA2 не выявил нарушения эритропоэза по сравнению с мышами дикого типа (рис. 1C). Кроме того, анализ костного мозга, селезенки и иммунофенотипирования крови не показал значительного влияния из-за отсутствия экспрессии EphA2 на конкретных клеточных линиях, включая популяции гранулоцитов (GR-1), B-лимфоцитов (B220) или T-лимфоцитов (CD-3) Фиг. 1D).

Затем мы проанализировали количество определяемых иммунофенотипом гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC) у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с однопометниками дикого типа (рис. 2А). Этот анализ не выявил значительных различий в процентах от Lineage-c-Kit + Sca-1 + (LKS +), предшественников и зрелых миелоидных клеток-предшественников, включая обычных миелоидных предшественников (CMP), предшественников мегакариоцитов и эритроцитов (MEP) и гранулоцитов, моноцитные предшественники (GMP) (рис. 2B). Для дальнейшего анализа HSC использовали маркеры CD34 и FLK2 (CD135) для выделения групп LT-HSCs (LKS + CD34-Flk2-), ST-HSCs (LKS + CD34 + Flk2) или MPP (LKS + CD34 + Flk2 +). Значительное увеличение частоты ST-HSC (P = 0,0012) наблюдалось в нокаутном костном мозге EphA2; однако существенных различий ни в МПП, ни в LT-HSC не было видно (рис. 2C). Маркеры CD150 и CD48 также использовались в качестве другого метода фракционирования HSC, с (LKS + CD150 + CD48-) клеточной популяцией, представляющей LT-HSC и (LKS + CD150-CD48 +), представляющие МПП. Как и в предыдущих результатах, существенных различий в частоте LT-HSC или MPP у мышей с нокаутом EphA2 по сравнению с мышами контроля дикого типа (рис. 2D). В целом, эти данные свидетельствуют о том, что EphA2 не является существенным для нормального развития крови.

(A) Gating для прародителей (lineagelowcKithighSca-1), клеток LKS + (lineagelowcKithighSca-1 +, обогащенных для гемопоэтических стволовых клеток), CMP (lineagelowcKithighSca-1-CD34 + FCGRII / IIIlow), MEP (lineagelowcKithighSca-1-CD34-FCGRII / III-) и GMP (lineagelowcKithighSca-1-CD34 + FCGRII / IIIhigh), представленный в процентах от клеток Lineagelow. CD34 / CD135 для MPP (LKS + CD34 + CD135 +), ST-HSC (LKS + CD34 + CD135-) и LT-HSC (LKS + CD34-CD135-). CD48 / CD150 для LT-HSC (LKS + CD150 + CD48-) и MPP (LKS + CD150-CD48 +). (B) Не было существенных различий в популяции предшественников, LKS +, CMP, MEP или GMP у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с мышами контрольного типа дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента). (C) Не было выявлено существенных различий в популяции LT-HSC и MPP с помощью антигенов CD34 / CD135 у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с контролем дикого типа. Было значительно больше (P = 0,0012) ST-HSCs в нокаутном костном мозге EphA2 по сравнению с контролем дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента). (D) Не было выявлено существенных различий в популяции LT-HSC и MPP с использованием антигенов CD48 / CD150 у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с контролем дикого типа (n = 15, 3 независимых эксперимента). Каждая точка соответствует одной отдельной мыши. Данные представляют среднее значение ± SEM. Непарный t-тест проводился для статистического анализа.

Наблюдалось увеличение частоты ST-HSCs у нокаутных мышей EphA2, которые могли бы указывать на измененную динамику стволовых клеток. Чтобы проверить эти результаты, мы провели конкурентные эксперименты по трансплантации костного мозга, используя нокаут EphA2 и BM типа дикого типа. Никаких существенных различий между мышами-нокаутами EphA2 и конгеническими контролями не наблюдалось через 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации (рис. 3А). Анализ химерзиса костного мозга и селезенки также не показал статистической разницы между нокаутом EphA2 и контрольными мышами на 16 неделе (рис. 3B). Была проведена вторичная конкурентная трансплантация для оценки того, могут ли быть более тонкие эффекты нокаута EphA2 на самообновление долгосрочных стволовых клеток. Во вторичной трансплантации, хотя у некоторых мышей наблюдался очень низкий процент химеризма, возможно, из-за ограничения количества LT-HSC в популяции трансплантированных клеток не было никаких существенных различий между нокаутом EphA2 и контрольными мышами (рис. 3C и 3D).

(A) Химеризация цельной крови через 4, 8, 12 и 16 недель после трансплантации нокаута EphA2 или клеток костного мозга дикого типа в легочно облученных реципиентов CD45.1 (n = 5). (B) Анализ химеризма костного мозга и селезенки через 16 недель после первичной трансплантации. (C) Химеризация цельной крови вторичной трансплантации через 4, 8, 12, 16, 20 и 24 недели после трансплантации нокаута EphA2 или первичных клеток костного мозга дикого типа в получателя легочного облучения CD45.1 (n = 5). (D) Анализ химеризации костного мозга и селезенки через 24 недели после вторичной трансплантации. Каждая точка на панелях А и С соответствует среднему значению и ошибке от всех химеризма крови дикого типа или нокаута. Каждая точка на панели B и D соответствует одной отдельной мыши. Данные представлены в процентах от крови, костного мозга и химеризации селезенки. Данные представляют среднее значение ± SEM. Непарный t-тест проводился для статистического анализа.

Хотя мы показали, что экспрессия EphA2 не является существенной для нормального гемопоэза, повышенная экспрессия этого гена в трансфицированных MLL клетках K562 и взаимодействие Eph-тирозинкиназ с тирозинкиназой Abl / Arg повышают вероятность того, что EphA2 может быть функционально важным в MLL и / или лейкозы типа BCR-ABL [16, 21]. Чтобы проверить это, экспрессию мРНК с помощью RT-PCR исследовали на EphA2 относительно 18S рРНК в костном мозге GFP-контрольных лейкозных мышей BCR-ABL и MLL-AF9. Этот анализ показал значительно более высокую экспрессию EphA2 в костном мозге (P = 0,0277) лейкозных мышей MLL-AF9 по сравнению с GFP-контролем (фиг. 4A). Дальнейший анализ экспрессии EphA2 проточной цитометрией показал значительно более высокую экспрессию поверхности EphA2 в костном мозге и селезенке MLL-AF9 по сравнению с мышами BCR-ABL и GFP (фиг. 4C и 4D).

(A) уровни экспрессии мРНК EphA2 относительно 18sRNA в костном мозге GFP-контроля, мыши MLL-AF9 и BCR-ABL, проанализировали на 1000000 18s-РНК с использованием RT-PCR. Значительно выше экспрессия EphA2 (P = 0,0267) в костном мозге MLL-AF9 по сравнению с мышами, контролирующими GFP. (B) Репрезентативный проточный цитометрический анализ наложения экспрессии EphA2 в GFP-контроле, MLL-AF9 и BCR-ABL костного мозга. (C) Проточный цитометрический анализ экспрессии EphA2 в костном мозге GFP-контроля, мыши MLL-AF9 и BCR-ABL, измеренные как средняя интенсивность флуоресценции, показали значительно более высокую экспрессию EphA2 в костном мозге MLL-AF9 по сравнению с костным мозгом GFP-контроля (P <0,0001) и сравнивали с BCR-ABL лейкозным костным мозгом (P = 0,0019) (n = 5 GFP-контроль, n = 4 MLL-AF9, n = 3 BCR-ABL, 1 биологический репликат, 2 технических повторения). (D). Цитометрический анализ потока экспрессии EphA2 в селезенке GFP-контроля, мышей MLL-AF9 и BCR-ABL, измеренных как средняя интенсивность флуоресценции, показал значительно более высокую экспрессию EphA2 в селезенке мышей MLL-AF9 по сравнению с мышами GFP-контроля (P = 0,0143) и более высокой экспрессии по сравнению с лейкозными мышами BCR-ABL (n = 5 GFP-контроль, n = 4 MLL-AF9, n = 3 BCR-ABL, 1 биологические повторы, 2 технических повторения). Каждая точка соответствует одной отдельной мыши. Данные представляют среднее ± SEM. Непарный t-тест проводился для статистического анализа.

Для дальнейшего изучения экспрессии EphA2 в MLL-перестроенных лейкозах мы добыли базу данных Hemaexplorer (http://servers.binf.ku.dk/hemaexplorer/) [22]. Как показано в дополнительном S1 Fig в соответствии с нашими анализами, EphA2 является вариабельным, но значительно чрезмерно выраженным при лейкозах с перегруппировкой MLL (11q23) по сравнению с нормальными кроветворными стволовыми клетками, ранними клетками-предшественниками (ХПК), CMP, MEP и GMP ( P <0,0001).

Повышенный уровень экспрессии EphA2 в лейкозах MLL-AF9 повысил вероятность того, что этот белок может играть роль в лейкемогенезе MLL-AF9. Чтобы исследовать эту возможность, была проведена серия экспериментов по лейкемической трансплантации MLL-AF9 (рис. 5А). Клетки костного мозга из нокаута дикого типа C57BL / 6 или EphA2 инфицировали онкогеном MLL-AF9 и трансплантировали мышам дикого типа C57BL / 6. Результаты этой трансплантации показали, что отсутствие экспрессии EphA2 у донорских мышей не пригодно для генерации лейкемии (рис. 5B и 5C).

(A) Последовательная модель трансплантации лейкемической MLL-AF9. (B) Выживаемость лейкозных мышей, трансплантированных нокаутом EphA2 MLL-AF9-трансдуцированные гематопоэтические стволовые клетки (LKS +) по сравнению с транскрибированными лейкоцитарными стволовыми клетками, продуцируемыми MLL-AF9 дикого типа (LKS +), не выявила существенных различий между двумя группами (n = 4 диких тип, n = 3 нокаут EphA2, 2 независимых эксперимента). (C) Процент клеток GFP + в костном мозге, селезенке и крови нокаута EphA2 и костного мозга MLL-AF9 дикого типа, селезенки и крови во время отбирания не выявил существенных различий между этими двумя группами. (D) Выживание вторичных мышей MLL-AF9, трансплантированных нокаутом GFP + EphA2 или GFP + дикого типа MLL-AF9 из первичной трансплантации, не выявило существенных различий между двумя группами (n = 16 диких типов, n = 19 EphA2 нокаут, 4 независимых эксперименты). (E) Процент клеток GFP + в костном мозге, селезенке и крови вторичных пересаженных диких или EphA2 нокаутных мышей MLL-AF9 не выявил существенных различий между этими двумя группами. Каждая точка соответствует одной отдельной мыши. Данные представляют среднее ± SEM. Непарный t-тест проводился для статистического анализа. Выживаемость представлена ​​в виде кривых выживаемости Каплана-Мейера (для статистического анализа использовался критерий рангового ранжирования).

Последовательные трансплантации выполнялись для определения того, отличается ли самообновление лейкемической стволовой клетки MLL-AF9 EFA2 (LSC), отличной от LSC дикого типа MLL-AF9 LSC. Лейкозные клетки GFP + как у нокаутов EphA2, так и у мышей MLL-AF9 дикого типа вызывали лейкемию с аналогичными задержка заболевания (рис. 5D). Не было существенных различий в костном мозге, селезенке и приживлении крови, а также в массе селезенки и печени в нокауте EphA2 и мышах MLL-AF9 дикого типа во время отбраковки во вторичном эксперименте по трансплантации (рис. 5Е). Эти результаты показывают, что отсутствие EphA2 не влияет на самообновление LSC MLL-AF9 in vivo.

Возможное объяснение отсутствия эффекта делеции EphA2 в лейкемии MLL-AF9 заключается в том, что другие белки Eph с перекрывающимися аффинностью связывания эфрина, такие как EphA7, о которых сообщалось ранее о лейкемии MLL-AF9 [16], могут свидетельствовать об компенсационном увеличении экспрессии , Чтобы исследовать эту возможность, EphA7 и общее экспрессия EphA на нокауте EphA2 и лейкемических клетках MLL-AF9 дикого типа анализировали с использованием проточной цитометрии. Общая экспрессия EphA определялась связыванием ephrinA5-Fc с высокой аффинностью связывания с членами подсемейства EphA. В лейкемических клетках MLL-AF9 EphA2 экспрессия EphA7 не была значительно повышена по сравнению с MLL-AF9 дикого типа. Однако уровни связывания ephrinA5-Fc в нокауте MLL-AF9 EphA2 существенно не отличались от клеток MLL-AF9 дикого типа, предполагая, что, несмотря на потерю EphA2, комплемент EphA-рецепторов на лейкемических клетках лейкозных мышей MLL-AF9 был подобно контрольным лейкемическим клеткам MLL-AF9 (фиг. 6A). Это подтвердило возможность того, что некоторое увеличение компенсации в других генах Eph присутствовало в лейкозных клетках EphA2. С этой целью мы провели RT-PCR-анализ лейкозных клеток костного мозга MLL-AF9 для экспрессии EphA-рецепторов у нокаутов EphA2 и мышей дикого типа. Это снова не показало существенных изменений экспрессии EphA7 в поддержку проточных цитометрических данных; наблюдалось увеличение экспрессии EphA5 в нокауте MLL-A9 EphA2 по сравнению с лейкемическими клетками MLL-AF9 дикого типа, хотя это было переменным и не достигало статистической значимости (рис. 6B).

(A) Потоковый цитометрический анализ связывания EphA2, EphA7 и ephrinA5-Fc в нокауте EphA2 и клетках костного мозга дикого типа не показал экспрессии EphA2 у нокаутных мышей EphA2 и значительно высокой экспрессии EphA2 у мышей дикого типа, как ожидалось (P = 0,0165 ). Сравнительные уровни экспрессии EphA7 (P = 0.3099) и ephrinA5-Fc (P = 0,8710) наблюдались в нокауте EphA2 и лейкозных клетках дикого типа. (B) RT-PCR-анализ EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphA5 и EphA7 в нокауте EphA2 и клетках костного мозга дикого типа не показал транскрипта EphA2 у нокаутных мышей EphA2 по сравнению с MLL-AF9 дикого типа (P = 0,0776) и сопоставимый уровень транскрипта EphA1 (P = 0,3458), EphA5 (P = 0,7020) и EphA7 (P = 0,6167) у нокаутов EphA2 и мышей дикого типа. Не было выражено EphA3 и EphA4, наблюдаемое у любого из мышей MLL-AF9 (n = 4). (C) Репрезентативная накладка проточного цитометрического анализа связывания EphA1, EphA2, EphA3, EphA7 и ephrinA5-Fc на образцах пациентов и клеточных линиях человека. (D) Таблица, суммирующая уровень экспрессии рецепторов Eph на образцах пациентов (пациенты 1-7) и линии клеток лейкоза человека (THP-1 и MV4-11). Каждая точка соответствует одной отдельной мыши. Данные представляют среднее ± SEM. Непарный t-тест проводился для статистического анализа.

Для дальнейшей оценки экспрессии семейства РТК Eph на лейкемии MLL были отобраны семь клинических образцов пациентов с лейкемией, вызванной MLL, и две линии клеток человека (THP-1 и MV4-11), несущие слитые гены MLL MLL-AF9 и MLL-AF4, были используются соответственно. Экспрессия EphA1, EphA2, EphA3, EphA7 и общего Eph, как определено связыванием ephrinA5-Fc, анализировали с использованием проточной цитометрии. Результаты показали значительную, но изменяющуюся экспрессию EphA1 и EphA3, а также умеренную экспрессию EphA2 и EphA7. Важно отметить, что экспрессия общих Ephs, определяемая окрашиванием ephrinA5-Fc, была значительной для всех образцов (рис. 6C и 6D). Вместе эти данные показали переменный уровень выражений Eph на образцах пациентов и лейкемических клеточных линиях с перегруппировкой MLL. В частности, EphA2 был экспрессирован на разных уровнях в отдельных образцах лейкемии, но значительная экспрессия в пропорции клинических образцов, несущих хромосомную перестройку 11q23 (MLL), предположила, что EphA2 может быть терапевтической мишенью в лейкемии, вызванной MLL-лейкемией.

Хотя экспрессия EphA2 не была критична для лейкемического процесса, в большинстве случаев мышей лейкемии MLL-AF9 отмечался значительный уровень, указывающий на то, что этот белок может быть потенциальной радиоактивно меченной терапевтической мишенью при лечении лейкемий MLL-AF9. Чтобы проверить эту возможность, мы использовали моноклональное антитело EphA2 (mAb IF7) [23], которое связывается с наномолярной аффинностью с мышью и EphA2 человека и достигает уровня сыворотки> 1 мг / мл в течение по меньшей мере 48 часов после введения 0,1 мг / мышь , уровень, предсказанный для обеспечения связывания насыщения EphA2. Мы обработали EphA2-экспрессирующую вторичную трансплантированную лейкозную модель мыши MLL-AF9 с 0,1 мг mAb IF7 или только с помощью транспортного средства (PBS) каждый второй день, когда процент GFP + клеток в крови мыши достигал 20-30% жизнеспособных клеток крови. Мышей наблюдали за внешними (сгорбленная спина, взъерошенный мех, потеря веса и снижение движения) и внутренние (лейкоциты) признаки лейкемии. Был рассчитан клинический балл, основанный на симптомах, включая подсчет WBC (0-2), вес мыши (0-2), положение мыши и текстуру меха (0-2) и движение (0-2), мышей отбирали после того, оценка достигла 7 и более баллов. Как и ожидалось, результаты не показали статистических различий в выживаемости и приживлении лейкозных мышей, получавших mAb IF7 по сравнению с только PBS (фиг.7A и 7B). Как мы показали ранее, недостаток EphA2 не влиял на лейкозный процесс, и лечение антителом IF7 само по себе не оказывало существенного влияния на лейкогенез, поэтому мы исследовали, можно ли использовать это антитело для доставки радиоактивной «полезной нагрузки» в лейкозные клетки. MAb IF7, меченный радиоактивным изотопом с Lutetium-177 (Lu-IF7), использовали для лечения лейкемических мышей MLL-AF9. Мышей, несущих лейкоз GFP + MLL-AF9 20-30% GFP +, обработали 3 МБк / 21 мкг mAb Lu-IF7, немеченого mAb mAb, mAb IIIA4 анти-EphA3 [14] (Lu-IIIA4) (как лейкоз MLL-AF9 не выражают EphA3) или контроль PBS. Эти результаты показали длительную выживаемость в группе, обработанной mAb Lu-IF7, по сравнению с контролем PBS (P = 0,0140), mAb IF7 (P = 0,0100) и Lu-IIIA4 mAb (P = 0,0100). Не было обнаружено существенных различий между PBS, IF7 без метки и группами лечения mAb Lu-IIIA4 (фиг. 7C). Кроме того, мы лечили мышей, когда были 3% -ные лейкозные клетки GFP + MLL-AF9 с одной или двумя дозами 3 МБк / 27 мкг Lu-IF7. Наблюдалось значительное улучшение выживаемости мышей, получавших одну дозу и две дозы Lu-IF7. В группе лечения с одной дозой наблюдалось значительное увеличение выживаемости mAb Lu-IF7 по сравнению с контролем PBS (P = 0,0084) и немеченой-Lu (P = 0,0140). Больший эффект наблюдали, когда мышей лечили двойной дозой Lu-IF7, в которой наблюдалось значительное увеличение выживаемости Lu-IF7 по сравнению с контролем PBS (P = 0,0039) и немеченом-Lu (P = 0,0046) (фиг. 7D). Эти данные подтверждают, что EphA2-радиоконъюгат может идентифицировать и уничтожать клетки AML в некоторых случаях лейкемии, вызванной MLL.

(A) Выживание лейкозных мышей MLL-AF9, обработанных mAb IF7 или PBS, не выявило существенных различий между этими двумя группами. (B) Процент клеток GFP + в костном мозге, селезенке и крови показал значительно более высокие GFP + клетки в костном мозге мышей, обработанных mAb IF7, по сравнению с контролем PBS (P = 0,0055). Не было обнаружено существенных различий в селезенке и крови обработанных IF7 мышей MLL-AF9 по сравнению с мышами контроля дикого типа во время отбраковки (n = 5 PBS, обработанных n = 6 IF7). (C) Выживание лейкозных мышей MLL-AF9, обработанных PBS, IF7 mAb, Lu-IIIA4 или Lu-IF7 антителом. Несмотря на отсутствие значительных различий между группами, получавшими антитела PBS, IF7 и Lu-IIIA4, наблюдалось значительное увеличение выживаемости группы, обработанной mAb Lu-IF7, по сравнению с PBS (P = 0,0140), mAb IF7 (P = 0,0100) и Луна IIIA4 mAb (P = 0,0100) (n = 3 PBS, обработано n = 3 IF7 mAb, n = 3 Lu-IIIA4 антитела и n = 4 Lu-IF7). (D) Выживание лейкозных мышей MLL-AF9, обработанных PBS, антителом немеченого-Лу и Lu-IF7-антителом, не выявило существенных различий между PBS и обработанными антителами к антителам без рецепта-Lu. Напротив, наблюдалось значительное увеличение выживаемости мышей, получавших однократную дозу mAb Lu-IF7 (P = 0,0084), и более того, с двумя дозами Lu-IF7 (P = 0,0039) по сравнению с контролем PBS. Увеличение выживаемости после лечения однократной дозой mAb Lu-IF7 (P = 0,0140) и двух доз Lu-IF7 (P = 0,0046) по сравнению с контролем немеченого-Лу (n = 4 PBS, n = 3 без метки-Lu , n = 4 Lu-IF7 антитела для одной дозы и n = 5 Lu-IF7 антитела две дозы, 3 биологических повторения). Каждая точка соответствует одной отдельной мыши. Данные представляют собой среднее ± SEM и непарный t-тест для статистического анализа. Кривые Каплана-Меира были построены в тестах GraphPad, а для определения статистических различий использовались тесты Log-rank (Mantel-Cox).

Экспрессия членов семейства Eph / ephrin была связана с гемопоэзом и лейкогенезом. В этом исследовании мы исследовали роль EphA2, который ранее был вовлечен в гемопоэз. Мышам с нокаутом EphA2 использовали для определения того, имела ли EphA2 решающую роль в гематопоэзе. Мы показали, что отсутствие EphA2 не приводит к каким-либо значительным различиям в параметрах крови, и анализ дифференцированных линий + клеток не выявил нарушения частоты этих популяций у нокаутных мышей. Не было также существенных различий в частоте предшественников, LT-HSC или MPP у мышей с нокаутом EphA2. Хотя у этих мышей наблюдалось значительное увеличение числа ST-HSC, дальнейший анализ функции стволовых клеток не выявил какого-либо существенного влияния на самообновление стволовых клеток или дифференциацию линии вниз по течению. По сути, эти данные показывают, что у этих мышей нормальная устойчивая гемопоэтическая система. Сообщаемое выражение других членов семейства Eph на кроветворных клетках предполагает, что другие члены этого семейства RTK могут компенсировать функцию в отсутствие одного члена. Например, Ting et al. сообщили об экспрессии EphA3 и EphA5, оба из которых функционально подобны как EphA2, так и EphA7, на гемопоэтических клетках-предшественниках, однако функциональных исследований этих генов не было [6].

Как описано выше, члены семейства EF RTK выражены во многих злокачественных новообразованиях. Eph гены, включая EphA2 [24, 25], в некоторых случаях показали, что они чрезмерно выражены в раке и имеют положительный онкогенный эффект [11, 26]. Однако в некоторых случаях гены Eph подавляются во многих случаях эпигенетическим молчанием во время прогрессирования опухоли [27-29]. Основываясь на сообщениях о чрезмерной экспрессии EphA2 в человеческом лейкозе и нашем собственном анализе клинических образцов, мы исследовали экспрессию гена EphA2 в двух моделях лейкемии, модели острой миелоидной лейкемии MLL-AF9 и модели хронического миелоидного BCR-ABL лейкемия [29]. Экспериментальная экспрессия EphA2 была только достоверно представлена ​​в модели MLL-AF9, как ранее сообщалось Nakanishi et al. [16]. Таким образом, мы исследовали возможные функциональные эффекты экспрессии EphA2 на лейкемию MLL-AF9, а также емкость mAb EphA2 в качестве целевой терапии антител или радиоиммунотерапии. Наши исследования показывают, что экспрессия EphA2 не оказывает существенного влияния на лейкоэмогенный процесс в модели мыши MLL-AF9, и отсутствие EphA2 не оказывает существенного влияния на латентность, тяжесть или лейкемическую стволовые клетки (LSC) самообновления. Хотя это говорит о том, что, как показывают другие [16], ген EphA2 является прямой транскрипционной мишенью онкогена слияния MLL и может не иметь роли в лейкогенезе. Что еще более важно, когда была проанализирована полная экспрессия Eph-рецепторов, уровни экспрессии в лейкозных клетках EphA2 были сопоставимы с лейкемическими клетками дикого типа. Это означает, что наблюдается компенсаторное увеличение экспрессии других Eph-рецепторов, что указывает на то, что действительно может быть требование для функции Eph при лейкемии MLL, необходимы дальнейшие исследования, возможно, с несколькими мышами-нокаутами Eph, чтобы определить роль этого семейства RTK в этих лейкозах.

Кроме того, потенциал EphA2 в качестве терапевтической мишени при лейкемии MLL-AF9 исследовали с использованием моноклонального антитела IF7, которое специфически связывается с белком EphA2 человека и мыши. Однако не было никакого прямого противоопухолевого эффекта, получаемого при лечении мышей MLL-AF9 моноклональным антителом EphA2 (mAb IF7). Это открытие может отражать отсутствие функциональных последствий выбивания EphA2 в лейкозных клетках MLL-AF9. Учитывая, что это антитело является изотипом мышиного IgG1, оно не обеспечило бы требуемую функцию Fc для клеточной или гуморальной антителозависимой цитотоксичности, ограничивая ее потенциальную применимость в виде голого антитела. Таким образом, мы спросили, можем ли мы использовать это высокое сродство и высокоспецифическое антитело для нацеливания на цитотоксическую радиоактивную полезную нагрузку на лейкозные клетки в аналогичном подходе, который применяется в неходжкинской лимфоме, используя моноклональные антитела, специфичные для CD20 (131I-tositumomab и 90Y- ibritumomab tiuxetan) [30]. Действительно, лечение меченым 177 лейтетием анти-EphA2 mAb (IF7) значительно задержало курс лейкемии MLL-AF9, особенно когда вводили две дозы препарата. Учитывая высокую агрессивность и рефрактерность терапии этой модели лейкемии, это было поразительное открытие. Что более важно, лечение антителом 177Lutetium-IF7 EphA2 не приводило к обнаруживаемой токсичности у этих мышей, несмотря на проблемы, вызванные испытанием антитела EphA2, конъюгированного с лекарственным средством, которое было остановлено из-за осложнений кровотечения [31]. Эти исследования показывают, что радиоиммунотерапия, направленная на EphA2, потенциально может быть новым подходом к нацеливанию на лейкоз MLL-AF9, положительно влияющий на EphA2, особенно в сочетании с другими анти-лейкозными препаратами.

Таким образом, мы обнаружили, что присутствие экспрессии EphA2 не является существенным для нормального или лейкозного гемопоэза, возможно, из-за функциональной избыточности между членами семейства Eph рецепторных тирозинкиназ. Однако нацеливание лейкозов MLL-AF9 на радиоактивно меченые моноклональные антитела EphA2 значительно задержало течение лейкемии в этой модели мыши. Это повышает вероятность того, что нацеленность на EphA2 может иметь терапевтическую ценность в EphA2-положительных лейкозах.

Экспрессия EphA2 в AML с перегруппировкой t (11q23) / MLL, HSC, HPC, CMP, GMP и MEP, полученными на веб-сайте HemaExplorer. (P <0,0001, 38 AML с t (11q23) / MLL, 8 HSC, 4 HPC, 3 CMP, 3 образца GMP и 3 MEP) (http://servers.binf.ku.dk/hemaexplorer/).

(TIFF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы с благодарностью признаем техническую помощь г-жи Грейс Хойновски и г-жи Паула Холл от проточной цитометрии QIMR-Berghofer и членов Дома животных QIMR-Berghofer. Мы хотели бы поблагодарить персонал и пациентов, которые внесли свой вклад в детский клуб Квинсленда. Мы также признаем финансирование от Фонда Лейкемии и Рио Тинто Райд, чтобы покорить рак.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *