Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Пероральное или парентеральное введение куркумина не предотвращает рост клеток с высоким риском t (4; 11) острой лимфобластной лейкемии, привитых в модель мыши NOD / SCID

Oral or parenteral administration of curcumin does not prevent the growth of high-risk t(4;11) acute lymphoblastic leukemia cells engrafted into a NOD/SCID mouse model
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3583839/

В этом исследовании эффективность перорального и парентерального введения куркумина оценивали у мышей с непереносимым диабетом / тяжелой комбинированной иммунодефицитной (NOD / SCID) (мышей NOD.CB17-Prkdcscid / J), привитых человеческим t (4; 11) ) острая линия лимфобластной лейкемии, SEM. SEM-клетки вводили в хвостовую вену, а приживление контролировали проточной цитометрией. После приживления наблюдали химиотерапевтический потенциал путем инъекции мышей внутрибрюшинно куркумином (5 мг / кг массы тела), растворенным в диметилсульфоксиде (ДМСО) или ДМСО отдельно (контроль) через день или винкристин (0,5 мг / кг массы тела) 3 раза в неделю в течение 4 недель (n = 16 на группу). Внутрибрюшинное введение куркумина не препятствовало росту лейкозных клеток. Для определения эффективности перорального куркумина мышей вводили контрольную диету или диету, содержащую 0,5% мас. / Мас. Куркумина за 3 недели до инъекции лейкемических клеток и на протяжении всего экспериментального периода (n = 16 на группу). Чтобы определить, может ли дикий куркумин повысить эффективность обычного химиотерапевтического агента, винкристин вводили внутрибрюшинно лейкемическим мышам, получавшим разные диеты. Диетический куркумин не задерживал приживление или рост клеток лейкемии, или сенсибилизировать клетки до винкристина. Анализ жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии сывороток мыши показал, что куркумин быстро метаболизируется до глюкуронидированных и сульфатированных форм в течение 1 ч после инъекции, и это были основные метаболиты куркумина, обнаруженные в сыворотках мышей, кормящих дичью куркумина. В отличие от результатов предыдущих моделей in vitro, текущие данные указывают, что пероральный или парентерально вводимый куркумин не является мощным превентивным средством против острого лимфобластного лейкоза с высоким риском t (4; 11).

Куркумин [1,7-бис (4-гидрокси-3-метоксифенил) -1E, 6E-гептадиен-3,5-дион] представляет собой биоактивный полифенол, обнаруженный в куркуме (Curcuma longa). Сообщается, что куркумин ингибирует активность множества сигнальных ферментов в клетках, таких как NF-κB, митоген-активированные протеинкиназы, циклооксигеназа-1, Bcl-2, Bcl-xL и cyclin D1, которые способствуют выживанию клеток и (см. пп. 1-3). Учитывая вышеупомянутые эффекты куркумина, он широко рекламируется как потенциальный антиканцерогенный агент, и его эффективность была исследована в многочисленных клинических испытаниях (см. Ссылку 3). Хотя интерес к куркумину как потенциальному антиканцерогенному агенту является понятным, важно отметить, что многие предполагаемые противораковые активности этого фитохимического вещества основаны на данных, полученных в исследованиях in vitro с использованием сверхфизиологических концентраций исходного соединения , Однако in vivo куркумин претерпевает быстрые и обширные метаболические превращения, которые в значительной степени приводят к циркулированию глюкуронидированных и сульфатированных метаболитов куркумина или тетрагидро- и гексагидроциркуцинов, которые имеют плохо документированные функции (4,5). Поэтому физиологическое значение исследований in vitro, в которых использовалось исходное соединение, может подвергаться сомнению. С учетом вышеизложенного несколько исследований на животных предложили потенциальную роль куркумина в предотвращении выбора рака. Сообщалось, что куркумин эффективно подавляет инициирование опухоли бензо [а] пиреном и 7,12-диметилбензо [а] антрацена и ингибирует промотирование опухоли, индуцируемую эфиром форбола у мышей (6,7). Считается, что дикий куркумин обладает мощной химиопревентивной активностью, подавляя развитие рака желудка и толстой кишки (8), радиационно-индуцированных опухолей молочной железы (9,10) и гепатокарциногенеза (11) на животных моделях. Сообщалось, что диетический куркумин ингибирует метастазы рака молочной железы человека в легкие у иммунодефицитных мышей (12,13). Сообщалось, что куркумин, вводимый перорально при 100 и 20 мг / кг массы тела, увеличивает выживаемость мышей Balb / c с эритролейкемией, вызванной заражением вирусом лейкоза мыши Friend и снижением инфильтрации клеток лейкемии селезенки (14). Показано, что ежедневные внутрибрюшинные инъекции куркумина в концентрации 40 мг / кг массы тела приводят к увеличению выживаемости мышей Balb / c, приживленных с B-острой лимфобластной лейкемией, хотя выживаемость была увеличена только на 11 дней по сравнению с контрольными мышами (15).

В настоящем исследовании мы исследовали эффективность in vivo перорального и парентерально вводимого куркумина в отношении линии клеточной линии острого лимфобластного лейкоза с высоким риском (ALL) с хромосомной транслокацией t (4; 11). Транслокация t (4; 11) встречается у 60-80% младенцев со ВСЕМИ, и этот высокий риск лейкемии имеет плохой прогноз (16,17). Линия SEM была установлена ​​у рецидивирующего пациента с t (4; 11) ALL (18) и использовалась в наших экспериментах для пришивания неживых диабетических / тяжелых комбинированных иммунодефицитных (NOD / SCID) мышей. Способность диетического или i.p. вводили куркумин для снижения или предотвращения роста клеток лейкемии, сенсибилизировали лейкозные клетки к химиотерапевтическому агенту, винкристин или задержку приживления у этих мышей. Концентрации сыворотки куркумина, глюкуронида куркумина и сульфата куркумина анализировали в подмножестве мышей перорально или в / в. вводили куркумин для определения наличия достаточных уровней куркумина для предотвращения роста клеток лейкемии в этой модели мыши.

Линия клеток SEM, содержащая транслокацию t (4; 11) (18), выращивали в RPMI-1640 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 1 ммоль / л пирувата натрия, 2 ммоль / л L-глутамина, 50 мкл / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина В (Invitrogen Life Technologies) и инкубировали при 37 ° С с 5% СО2. SEM-клетки дважды промывали в забуференном фосфатом солевом растворе Дульбекко (PBS) без Ca2 + или Mg + (Sigma-Aldrich) и ресуспендировали в PBS при конечной концентрации 50 × 106 клеток / мл перед инъекцией.

Сульфат винкристина был приобретен у Sigma-Aldrich и растворен в PBS. Для инъекционных исследований куркумин (> 98% чистый) был приобретен у Axxora LLC (San Diego, CA) и растворен в диметилсульфоксиде (DMSO, Sigma-Aldrich). Растворы фильтровали, аликвотировали и замораживали при -20 ° C до использования. Для эксперимента по кормлению кукумин (> 90% чистоты) был приобретен навалом у Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI). Конъюгированные с Phycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7) -коммутированные анти-человеческие CD19 и аллоцикоцианин-Cy7 (APC-Cy7) -конъюгированные антитела против мышиного CD45 были приобретены у Becton-Dickinson (San Jose, CA). Для масс-спектрометрических (МС) анализов были приобретены следующие реагенты: диметоксициклюмин и 1-циклогексилилуридо-3-додекановая кислота (CUDA) (Cayman Chemical Co.), сульфатаза из аэрогебков Aerobacter, β-глюкуронидаза (тип IX-A) из Escherichia coli, муравьиной кислоты, глицерина, 4-нитрофенилсульфата калия и 4-нитрофенил-D-глюкуронида (Sigma-Aldrich), гидроксида аммония, марок ЛК-МС метанола, ацетонитрила и воды (Fisher Scientific Co. LLC, Fair Lawn, Нью-Джерси). Обычную сыворотку мыши получали из биологического вещества США (Swampscott, MA).

Все экспериментальные процедуры с использованием мышей были одобрены Институтом Калифорнийского института по уходу и использованию животных в Калифорнии. Женские мыши NOD.CB17-Prkdcscid / J (5-6 недель) были приобретены в Лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME, общее название, мыши NOD / SCID) и размещены в стойках вентилятора в условиях отсутствия патогенов в Калифорнийском университете , Davis Vivarium. Мышей выдерживали в среде с контролируемой температурой с 12-часовым темно-темным циклом и снабжали стерилизованной пищей и водой ad libitum. Добавление стерильных пищевых продуктов, а также изменений в воде и клетке было выполнено в шкафу для замены ламинарного потока. Мышей взвешивали один раз в неделю. Весы мышей и инъекции лейкемических клеток или химиотерапевтических агентов проводились в шкафу биобезопасности для снижения риска заражения животных патогенами. Мышей эвтаназировали удушью двуокиси углерода, когда они заболели или в конце экспериментального периода.

В качестве базовой диеты для всех экспериментов использовалась диета для грызунов 7013 (Harlan Teklad, Madison, WI), коммерческая модифицированная диета NIH-31, так как она похожа по составу на диету, используемую Лабораторией Джексона для поддержания NOD. CB17-Prkdcscid / J. Для эксперимента по кормлению Харлан Текклад подготовили 2 диеты для вмешательства. Диета 1 была базовой диетой (контроль), а диета 2 была базовой диетой, содержащей 0,5% мас. / Мас. Куркумина. Диетическая концентрация 0,5% мас. / Мас. Куркумина эквивалентна приблизительно 750 мг / кг массы тела в день, предполагая 20-граммовую мышь и потребление 3 г пищи в день. Пища подвергалась γ-облучению для целей стерилизации. Осажденную пищу упаковывали в 2-килограммовые вакуумные герметичные пакеты для снижения воздействия воздуха. Диеты хранят при -20 ° C до использования, а мышам ежедневно дают свежие продукты.

В возрасте 8 недель каждой мыши вводили 5 × 10 6 SEM-клеток через хвостовую вену с использованием шприца 1 см3 с иглой 30 калибра (Becton-Dickinson). Объем инъекции составлял 100 мкл. Приживление лейкемических клеток контролировалось путем обнаружения лейкозных клеток человека в крови с использованием FACSCanto ™ флуоресцентно активированного клеточного сортировщика (FACS) и программного обеспечения FACSDiva ™ (Becton-Dickinson), как описано ранее (19). Для каждого образца было собрано 30 000 событий. Положительное приживление было установлено, когда доля человеческих CD19 + клеток достигла 1% в популяции лейкоцитов периферической крови мыши (PBL) (20,21).

Для i.p. инъекции, начальная доза 100 мг куркумина / кг массы тела была использована, поскольку эта доза была хорошо переносимой у крыс (22). Однако этот i.p. доза увеличивала смертность у лейкозных мышей по сравнению с лейкемической контрольной группой. Поэтому анализ реакции дозы проводили с использованием 5, 10, 25 и 50 мг куркумина / кг массы тела для определения соответствующей концентрации для использования в наших последующих экспериментах (n = 4 мыши на группу). Было определено, что доза 5 мг куркумина / кг массы тела является безопасной дозой у этих мышей. Мышам (8 недель) вводили клетки лейкемии SEM, как описано выше, и случайным образом разделяли на группы контроля, куркумина или винкристина (n = 16 на группу). После того, как было установлено приживление лейкемических клеток, мышам вводили, т.пл. каждый день с ДМСО или куркумином (5 мг / кг массы тела) или 3 раза в неделю с винкристином (0,5 мг / кг массы тела) в общей сложности 4 недели. Объемы ДМСО и куркумина составляли 40-60 мкл на мышь и 80-130 мкл винкристина на мышь. Вес тела измеряли еженедельно, а объемы ДМСО и терапевтических агентов соответственно корректировались. Кровь от каждой мыши контролировалась на процент клеток CD19 + лейкемии человека с помощью проточной цитометрии. Мышей ежедневно контролировали признаки явной болезни.

Чтобы определить, задерживает ли куркумин диетическое приживление и рост клеток лейкемии, 32 5-недельных мышей случайным образом разделяли на группы и кормили контрольную диету или диету, содержащую 0,5% мас. / Мас. Куркумина (n = 16 на группу). Через 3 недели на контрольной или куркуминовой диете каждой мыши (8 недель) вводили 5х106 SEM-клеток и контролировали их приживление, как описано выше. Чтобы определить, может ли дикий куркумин повышать активность обычного химиотерапевтического лекарственного средства, все мыши вводили, т.е. с винкристином (0,5 мг / кг массы тела) 3 раза в неделю. Инъекция винкристина началась примерно через 4,5 недели после инъекции клеток лейкемии, и положительное приживление было хорошо установлено. Общий объем для каждой инъекции винкристина составлял приблизительно 100 мкл и регулировался еженедельно в зависимости от массы тела каждой мыши. Все животные содержались на контрольных или куркуминовых диетах во время химиотерапевтического лечения, а процент клеток лейкоза человека контролировали в крови мыши с помощью проточной цитометрии, как описано выше.

Кровь от мышей NOD / SCID собирали в конце экспериментального периода у выживших и получали сыворотку и замораживали до использования. Образцы сыворотки оттаивали на льду и разделяли на 25 мкл аликвот для смешения, глюкуронидазы и сульфатазы. В каждую аликвоту добавляли в общей сложности 5 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,2 г / мл и бутилированного гидрокситолуола до добавления диметоксикуркумина при 2 мкмоль / л (суррогат восстановления) и 500 нмоль / л каждого из нитрофенилглюкуронида и нитрофенилсульфата (расщепление суррогаты). В качестве дополнительного контроля восстановления и пищеварения 3 аликвоты нормальной мышиной сыворотки были пронизаны куркумином при 200 нмоль / л и вышеуказанными суррогатами. Пищеварение проводили либо с 5 мкл 0,1 ммоль / л формиата аммония с рН 6,9 (ложный дайджест), 5 мкл (0,5 кU) -глюкуронидазы, восстановленной в формиатном буфере, или 10 мкл сульфатазы (0,11 U), и инкубировали при 37 ° С в темноту в течение 1 часа в качающейся водяной бане. Сывороточные переваривания разбавляли 75 мкл воды и дважды экстрагировали 400 мкл аликвотами холодного этилацетата и один раз 400 мкл холодного ацетонитрила. На каждой стадии экстракции включали 5-минутный вихрь 4 ° C и центрифугирование в течение 10 минут 4 ° C при 14000 x g. Органические фазы объединяли в прокладку из полипропилена с винтовой крышкой, содержащую 5 мкл 50% метанольного глицерина и высушивали с использованием Savant SV110A SpeedVac (Savant Instruments Inc., Холбрук, Нью-Йорк). Высушенные экстракты восстанавливали в 100 мкл 100 нмоль / л CUDA (внутренний стандарт, полученный в метаноле) путем встряхивания, а затем фильтровали через 0,1 мкм фильтры Amid Ultrafree-MC durapore PVDF (Millipore, Billerica, MA) в течение 4 мин при 4000 xg для переноса на стеклянную вставку в ампулах объемом 2 мл для жидкостной хроматографии (LC) -MS / MSanalysis. Для оценки эффектов, зависящих от матрицы, на ионизацию аналита, растворы нормализации были приготовлены в трех экземплярах для каждой партии образцов путем обогащения экстрактов сывороточной сыворотки нормальной мыши мыши целевыми аналитами непосредственно перед фильтрованием. Матричные эффекты на ионизацию оценивали по отношению к трехкратным нормализационным растворам, приготовленным в метаноле, содержащем 100 нмоль / л CUDA.

Для разделения аналитов использовали жидкий хроматограф с высокой эффективностью (UPLC) (Waters Corp., Milford, MA) с колонкой Acquity BEH C18 (размером 2 × 150 мм, размером 1,7 мкм), удерживаемой при 50 ° C. Многоступенчатый градиент пропускали со скоростью 0,25 мл / мин из 90% подкисленной воды (0,1% муравьиной кислоты) до аккуратного ацетонитрила в течение 13,5 мин. Образцы поддерживали при 10 ° C внутри автосамплера во время каждой партии образцов и 10 мкл инъекций делали в частичной петле с режимом переполнения иглы. Масс-спектральный анализ эффлюента UPLC проводили с использованием тандемного масс-спектрометра API 4000 QTrap (AB Sciex, Foster City, CA), работающего в режиме многорежимного мониторинга (MRM). Остатки ионизовали с использованием отрицательной электрораспылительной ионизации (ESI-) в течение первых 7,75 мин и положительной электрораспылительной ионизации (ESI +) для остальной части пробега. Параметры ионизации и источника для QTrap были: температура нагревателя и источника, 500 ° C; поток занавеса, 40 мл / мин; Газ 1 / Газ 2, 40 мл / мин; столкновение газа, высокое; Икспрерывное напряжение, 4,5 кВ; и потенциал потенциала входа (EP) / выхода на столкновение (CXP), 10 В. Предел обнаружения куркумина определяли из визуально определенных пиков с отношением сигнал / шум> 2 (23). Оптимизированные параметры аналита, используемые в этом исследовании, приведены в таблице I.

Количественное определение куркумина осуществляли с использованием 7-точечной стандартной кривой от 1 до 3000 нмоль / л куркумина, нитрофенилсульфата и нитрофенилглюкуронида в метаноле, содержащем 100 нмоль / л CUDA и 2 мкмоль / л диметоксикуркумина. Аналитик 1.4.2 (AB Sciex) использовался для интеграции площадей пиков. Сигналы анализа измерялись как отношение площадей пиков к внутреннему стандарту, CUDA, для корректировки вариабельности испарения и объема впрыска. 1 / x взвешенная линейная регрессия стандартной кривой была использована для расчета наблюдаемого уровня куркумина в сыворотке, который был скорректирован на потери во время пищеварения и экстракции и влияние матрицы на ионизацию путем деления на долю сигнала диметоксикуркумина, извлеченного из каждого образца , Матричные и нормализационные растворы метанола сравнивали, чтобы отличить матричные эффекты от потерь экстракции аналитов.

Программное обеспечение GraphPad (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния) использовалось для статистического анализа. Для парентерального введения куркумина была рассчитана выживаемость без событий (EFS), начиная с инициирования i.p. лечение. Для эксперимента по диетическим добавкам EFS рассчитывали, начиная со дня инъекции лейкемических клеток. Событие было определено как открытое клиническое заболевание, которое требовало эвтаназии и включало доказательства> 20% потери веса, тяжелой слабости или летаргии или невозможности достичь пищи или воды. EFS отображалась как графики Каплана-Мейера с разницей, рассчитанной с использованием теста логарифмического ранжирования. Двусторонний анализ дисперсии (ANOVA) использовался для сравнения процента клеток CD19 + между группами с течением времени. Данные отображаются как арифметические средства ± стандартное отклонение. Различия считались значимыми при α (значение Р) <0,05.

100% приживление клеток лейкемии наблюдали у мышей, получавших i.p. обработкой транспортного средства (ДМСО), куркумина или винкристина. 100 мг / кг внутрибрюшинно. доза куркумина, первоначально использованная в этом исследовании, была токсична для мышей и уменьшала выживаемость по сравнению с контрольной группой (фиг.1А). Поэтому для определения подходящей дозы для этих мышей проводили анализ доза-ответ. Были испытаны дозы 5, 10, 25 и 50 мг / кг массы тела (n = 4 мыши на группу). 25- и 50 мг / кг внутрибрюшинно. доза показала токсичность и наличие в брюшной полости кукумината. I.p. для химиотерапевтического эксперимента была выбрана доза 5 мг / кг массы тела, поскольку она не обнаруживала признаков токсичности и хорошо впитывалась без признаков абдоминального осаждения. При 5 мг / кг массы тела куркумин не ингибировал рост привитых лейкозных клеток по сравнению с контрольной группой, тогда как лечение винкристином увеличивало выживаемость мышей (фиг.1В). Вес тела мышей не отличался между двумя группами (данные не показаны). Данные о выживаемости для контрольных и винкристинных групп на фиг.1 использовались ранее в параллельном анализе лечения ресвератролом (19).

Диетический куркумин оценивали на предмет его способности замедлять приживление и сенсибилизировать лейкозные клетки к химиотерапевтическому агенту, винкристину. Все 16 мышей в контрольной группе были привиты клетками лейкемии. В общей сложности 3 из 16 мышей в группе, получавшей куркумин, не были привиты клетками лейкемии из-за неэффективной инъекции клеток хвостовой вены, и эти 3 мыши были исключены из анализа. Мышам вводили интервенционные диеты, начиная с 5-недельного возраста, и мышам вводили клетки лейкемии в возрасте 8 недель. Не было задержек при приживлении клеток лейкемии у мышей, получавших куркумин, по сравнению с мышами, которые получали контрольную диету (рис.2). Обе группы показали одинаковое процентное содержание человеческих клеток CD19 + лейкемии в каждый недельный момент времени. Мышам, которым вводили контроль и диеты куркумина, вводили, т.пл. с винкристином после приживления, чтобы определить, повышает ли диетический куркумин эффективность этого химиотерапевтического агента. Стрелка на фиг.2 указывает начало лечения винкристином. Несмотря на снижение доли клеток CD19 + лейкемии человека в обеих группах мышей в ответ на винкристин, на фиг.2 показано, что дикий куркумин не усиливает опосредованное винкристином снижение лейкемического бремени. Как контрольная группа, так и группы, содержащие куркумин, показали сходную концентрацию клеток CD19 + лейкемии человека в популяции PBL мыши. Кривая выживаемости для мышей, получавших куркумин и контрольную чау, показана на рисунке 3. Частота выживания была одинаковой в 2 диетических группах. Вес тела не отличался между двумя группами (данные не показаны). Данные для контрольной группы на фиг. 2 и 3 были использованы ранее в параллельном анализе диетических ресвератрол (24).

Биодоступность куркумина после i.p. инъекции и диетическое вмешательство были определены в подгруппе выживших мышей с использованием тандемной МС. Предел обнаружения куркумина оценивался в 0,8 нмоль / л в сыворотке. На фиг.4 показаны репрезентативные профили пиков куркумина после издевательства над глюкоронидазой и сульфатазой мышиной сыворотки из i.p. и диетические вмешательства, соответственно. Эффективность деконъюгирования глюкуронидазы и сульфатазы составила> 99% для всех образцов, как определено суррогатами пищеварения, 4-нитрофенил-D-глюкуронидом и 4-нитрофенилсульфатом. Обработка глюкуронидазы и сульфатазы приводила к увеличению пиковых интенсивностей для куркумина в обоих профилях. Наибольшее изменение пиковой интенсивности куркумина наблюдалось после расщепления глюкуронидазы, что указывает на то, что большинство циркулирующего куркумина находилось в виде метаболитов глюкуронида. Оценки количеств куркумина агликона и его метаболитов проводились путем измерения площадей под пиковыми кривыми. На фиг.5 показаны приблизительные концентрации циркулирующего агликона, глюкуронидированных и сульфатированных метаболитов в сыворотке после того, как яд. (фиг.5А) и диетических добавок (фиг.5В). Для i.p. инъекции, сыворотка была получена от мышей 1 и через 48 ч после инъекции (фиг.5А) и показали, что куркумин и его глюкуронидированные метаболиты, хотя они все еще присутствуют при низких концентрациях нмоль / л, были существенно уменьшены через 48 часов. Образцы сыворотки были приготовлены у эвтаназированных мышей примерно в то же время утром (примерно 10:00) для обоих вариантов. и эксперименты по кормлению. Средняя концентрация глюкуронида куркумина в сыворотке достигала приблизительно 1,2 мкмоль / л через 1 ч после i.p. инъекции и 1,7 мкмоль / л для диетического вмешательства.

И перорально, и i.p. вводили куркумин в качестве эффективных способов предотвращения роста t (4; 11) ВСЕХ клеток в модели лейкоза мыши NOD / SCID. Исследования по кормлению человека показали, что дикий куркумин до 10 г хорошо переносится с минимальными побочными эффектами, такими как легкая диарея и головные боли (25-27). В текущем исследовании оценочная суточная доза куркумина в мышечной диете составляла 750 мг / кг массы тела, что эквивалентно примерно 52 г куркумина для человека массой 70 кг в день в расчете на массу тела. Никаких побочных эффектов у лейкемических мышей не кормили этим количеством куркумина в рационе. Однако этот уровень дикого куркумина не уменьшал приживление и рост лейкемических клеток у этих животных. Следует отметить, что 3 мыши в группе дикого куркумина не были привиты клетками лейкемии и не были включены в анализ диетического вмешательства. Хотя 100% приживление было достигнуто в других экспериментальных группах, описанных в этом исследовании, отсутствие приживления этих 3 мышей, вероятно, было связано с ошибкой в ​​инъекциях хвостовой вены, а не с диким куркумином. Это подтверждают данные других 13 мышей в группе куркумина, которые показали типичный быстрый рост клеток лейкемии SEM без каких-либо различий в выживаемости или проценте клеток CD19 + по сравнению с контрольной группой.

Хотя i.p. дозу куркумина при 100 мг / кг массы тела вводили крысам в предыдущих исследованиях (22), мы наблюдали, что это количество куркумина было токсичным для мышей NOD / SCID, привитых линией клеток t (4; 11) ALL, SEM , Это наблюдение привело к существенному уменьшению числа частиц, дозу куркумина, которую мы впоследствии вводили мышам в нашем исследовании. Аналогично, мыши NOD / SCID, привитые клетками лейкемии в нашем предыдущем исследовании, не могли переносить высокие дозы, вводили ресвератрол (19). Для i.p. куркумина, мы наблюдали присутствие оранжевого осадка в брюшной полости в дозах 25 и 50 мг куркумина / кг массы тела, что указывает на то, что куркумин эффективно не поглощается при высоких концентрациях у этих мышей. Другие исследователи использовали дозу 40 мг куркумина / кг массы тела у мышей Balb / c для лечения ALL с объемом инъекции 200 мкл (15). Эти исследователи не сообщили о токсичности или абдоминальных осадках у их мышей. Однако мыши NOD / SCID чувствительны к ДМСО при объемах инъекции 100 мкл или более, что указывает на временный паралич задней конечности (19). Чтобы облегчить неврологическую чувствительность, мы уменьшили объем инъекции ДМСО до 40-60 мкл. Другое транспортное средство, которое было более переносимым для мышей NOD / SCID, могло позволить больший объем инжекции и введение более высоких концентраций куркумина, чем сообщалось в этом исследовании. На фиг. дозу 5 мг куркумина / кг массы тела, куркумин не показал никаких признаков ингибирования роста t (4; 11) ВСЕХ клеток.

Фармакокинетические исследования проводились с использованием животных и людей для оценки биодоступности куркумина и его метаболитов после абсорбции. Распределение тканей и экскреция 3-меченого куркумина оценивали у крыс (28). В то время как большинство диетического куркумина устраняются в фекалиях, через 12 дней после однократной пероральной дозы 400 мг куркумина / кг массы тела, в крови остается около 13% радиоактивности, 5% в печени и 0,45% в почках , У мышей один i.p. доза 100 мг куркумина / кг массы тела приводила к приблизительно 177, 26, 27 и 8 мкг куркумина / г ткани в кишечнике, селезенке, печени и почках, соответственно, через 1 ч после инъекции (4). Общее количество куркумина на орган было рассчитано как 319,52 мкг в кишечнике, 2,61 мкг в селезенке, 33,09 мкг в печени и 3 мкг в почках. Оценка метаболитов куркумина из плазмы выявила наличие глюкуронидных конъюгатов в этом исследовании. Сообщалось, что у людей уровни в крови достигали примерно 1,8 мкмоль / л в сыворотке людей через 2 часа после потребления 8 г куркумина (29). Другие исследования выявили как глюкуронидированные, так и сульфатированные формы куркумина в плазме человека после перорального введения (25). Vareed и др. (30) обнаружили максимум около 2 мг / л глюкуронида куркумина и 1 мг / л куркумина сульфата в плазме человека после потребления разовой дозы 10 г куркумина. Эти авторы обнаружили, что глюкуронидированные и сульфатированные метаболиты почти исключительно присутствуют в плазме с небольшим или отсутствующим детектируемым куркуминовым агликоном. В настоящем исследовании глюкуронид куркумина и сульфат были основными метаболитами куркумина, обнаруженными у мышей после i.p. и диетические методы лечения, что согласуется с данными вышеупомянутых исследований.

Сообщалось, что куркумин оказывает профилактическую и профилактическую деятельность, особенно в исследованиях на животных, вызванных раком эпителия, таких как рак толстой кишки, кожи и желудка (6-8), где неметаболизированный агликон этой молекулы будет более доступен для раковых эпителиальных клеток и присутствуют на самом высоком уровне. Важно отметить, что большинство недавних клинических исследований с использованием куркумина были сосредоточены на оральных и желудочно-кишечных раках (3). Клиническое исследование фазы IIa для профилактики колоректальной неоплазии пероральным куркумином проводили с использованием доз 2 и 4 г куркумина у 41 пациента с аберрантными очагами склепа (31). Авторы сообщили, что куркумин при пероральной дозе 4 г / день в течение 30 дней вызывал 40% -ное уменьшение аберрантных очагов склепа. В другом человеческом исследовании диетический куркумин значительно уменьшал рецидив язвенного колита, предполагаемого предшественника рака толстой кишки, во время 6-месячного совместного лечения сульфасалазином или месаламина (32). Куркумин был оценен как потенциальное лечение рака поджелудочной железы у людей с ограниченными результатами (33). В общей сложности у 2 из 21 пациента, получившего оценку, был биологический ответ на 8 г / день перорально введенного куркумина. Эти 2 пациента показали стабилизацию заболевания или отмеченную, но кратковременную регрессию опухоли. Авторы объяснили отсутствие реакции на низкую биодоступность куркумина.

Был значительный интерес к разработке новых систем доставки для увеличения биодоступности поглощенного куркумина. Системы доставки включают наночастицы, наногели, липосомы и нанокристаллы (см. Ссылку 34). Поли (лактико-гликолевая кислота) наночастицы куркумина показали в 5,6 раза большую биодоступность и более длительный период полураспада, чем нативный куркумин у крыс (35). Наноэмульсии куркумина с полиэтиленгликолем и производным касторового масла Cremaphor EL® увеличивали максимальную концентрацию куркумина в 40 раз у мышей (36). Сообщалось, что куркумин хемосензитизирует ряд различных видов рака для деятельности стандартных химиотерапевтических препаратов (37). Липосомально инкапсулированный куркумин с концентрацией 25 мг / кг массы тела, синергированный с паклитакселом, для снижения частоты и объема шейки матки у мышей (38). Было показано, что наноэмульсии из масла в воде куркумина в сочетании с паклитакселом значительно уменьшают объем опухоли у мышей, несущих подкожную аденокарциному яичника, задерживая пролиферацию и рост опухолевых клеток (39).

При концентрациях, описанных в этом исследовании, куркумин, независимо от того, вводили ли он или кормили, не удалось снизить рост клеток лейкемии SEM в модели мыши NOD / SCID. Линия лейкемии SEM была получена от пациента с рецидивом t (4; 11) ALL, что указывает на то, что эти клетки прошли химиотерапевтические процессы отбора, что привело к резистентности к химиотерапии. Мы показали, что эти клетки лейкемии SEM подвергались быстрому возврату к химиотерапевтическому фенотипу у мышей NOD / SCID при обследовании винкристином, который является стандартным химиотерапевтическим средством, используемым для лечения этого заболевания (40, 41). По-прежнему существует вероятность того, что куркумин может быть эффективным против t (4; 11) ALL на момент постановки диагноза, пока не будут усилены механизмы сопротивления, и анализ эффективности куркумина против t (4; 11) ALL необходимо дополнительно изучить. Куркумин также может оказаться эффективным против менее агрессивных форм ВС. Однако дальнейшая оценка этого агента должна учитывать быстрое метаболическое превращение куркумина, которое происходит in vivo, и для эффективного лечения этого заболевания, вероятно, потребуется генерация уникальной системы доставки плюс использование комбинаторного химиотерапевтического подхода.

Это исследование было поддержано грантом Национального института здоровья, Национального института рака, США, грант № 1R21CA122117-01. Контент принадлежит исключительно авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здоровья. USDA является поставщиком равных возможностей и работодателем.

Внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) (курение) куркумин не продлевал выживаемость у мышей NOD / SCID, привитых клетками лейкоза. (A) Мышей трансплантировали линией клеток SEM и обрабатывали, с ДМСО (n = 13) или 100 мг куркумина / кг массы тела (n = 14) через день или 0,5 мг винкристина / кг массы тела (n = 13) один раз в неделю. Значительное снижение выживаемости наблюдалось у куркумин-обработанных мышей по сравнению с контрольными ДМСО и обработанными винкристином группами (* Р <0,0001). (B) Мышей трансплантировали с помощью SEM-клеток и обрабатывали i.p. с ДМСО или куркумином (5 мг / кг массы тела) через день, или винкристин (0,5 мг / кг массы тела) 3 раза в неделю в течение 4 недель (n = 16 на группу лечения). Мышей подвергали эвтаназии, когда они показали> 20% потерю веса, летаргию, слабость или неспособность достичь пищи или воды. Группа, обработанная винкристином, показала повышенную выживаемость по сравнению с группами DMSO- и куркуминов (* P <0,0001). Никаких различий в выживаемости между мышами, обработанными ДМСО и куркуминами (Р = 0,41). Тест лог-ранга использовался для определения различий в выживаемости между различными группами мышей. Данные о выживаемости для контрольных и винкристинных групп ранее использовались при параллельном анализе лечения ресвератролом (19).

Процент человеческих CD19 + клеток в популяции лейкоцитов периферической крови мыши (PBL) был одинаковым с течением времени между контрольными мышами или диетами куркумина. Мышам (n = 16 на группу) вводили контрольную диету или диету, содержащую 0,5% мас. / Мас. Куркумина, начиная с возраста 5 недель. Мышам вводили SEM-клетки через хвостовую вену в возрасте 8 недель. Через две недели после инъекции лейкемических клеток ПБЛ выделяли из каждой мыши в неделю и окрашивали конъюгированными с PE-Cy7 анти-человеческими CD19 и APC-Cy7-конъюгированными антимышиными антителами CD45 для мониторинга приживления и роста с помощью проточной цитометрии. Еженемобиль контролировался еженедельно. Три из мышей в группе дикого куркумина не были привиты и были исключены из анализа. Стрелка указывает начало лечения винкристином. Между двумя диетическими группами не наблюдалось разницы в процентах клеток CD19 +. Данные представляют собой средства ± SD. Данные для контрольной группы ранее использовались при параллельном анализе диетических ресвератрол (24).

Диетический куркумин не увеличивал выживаемость мышей NOD / SCID с t (4; 11) лейкемией. Мышам вводили контрольную диету или диету, дополненную 0,5% куркумина с весной за 3 недели до инъекции клеток лейкемии SEM (n = 16 на диетическую группу). Винкристин лечение началось примерно через 28-30 дней после инъекции лейкозных клеток. Мышей подвергали эвтаназии, когда они показали> 20% потерю веса, летаргию, слабость или неспособность достичь пищи или воды. Три из мышей в группе дикого куркумина не были привиты и были исключены из анализа. Тест лог-ранга использовался для определения различий в выживаемости между диетическими группами. Никаких различий в выживаемости не наблюдалось между контрольной и куркумин-питающей мышей (Р = 0,53). Данные для контрольной группы ранее использовались при параллельном анализе диетических ресвератрол (24).

Жидкостная хроматография (LC) — тандемная масс-спектрометрия (MS) профилей куркумина из мышиной сыворотки после деконъюгации метаболитов. (A) Образцы сыворотки собирали у 5 выживших мышей через 1 ч после i.p. впрыскивание куркумина и переваривание буфером (mock), β-глюкуронидазой или сульфатазой. Профиль показывает репрезентативные результаты от 1 мыши. Хроматограммы с высокой эффективностью LC (UPLC) -MS / MS показывают увеличенные площади пиков для куркумина после деконъюгирования с -глюкуронидазой или сульфатазой по сравнению с ложным расщеплением, в первую очередь с перевариванием глюкуронидазы. (B) Образцы сыворотки собирали у 5 выживших мышей, которые получали диету с добавлением 0,5% мас. / Мас. Куркумина и расщепляли буфером (макет), -глюкуронидазой или сульфатазой. Профиль показывает репрезентативные результаты от 1 мыши. UPLC-MS / MSchromatograms показывают увеличенные площади пиков для куркумина после деконъюгирования с β-глюкуронидазой или сульфатазой по сравнению с ложным расщеплением.

Глюкуронид куркумина является основной формой куркумина у лейкозных мышей. (A) Мыши внутрибрюшинно (внутрибрюшинно) вводили куркумином, и сыворотки собирали через 1 и 48 ч после инъекции (n = 5 для каждой временной точки). Образцы сыворотки анализировали методом ультраэффективной жидкостной хроматографии (UPLC)-масс-спектрометрии (MS) / MS после переваривания буфером (mock), глюкуронидазой и сульфатазой. Концентрации куркумина и его метаболитов оценивали по участкам под кривыми результирующих куркуминовых пиков после пищеварения. (B) Образцы сыворотки собирали у мышей, которые кормили чау, добавляли 0,5% куркумина (n = 5) и расщепляли буфером (макет), глюкуронидазой и сульфатазой. Образцы анализировали, как указано выше, и концентрации куркумина и его метаболитов оценивали по участкам под кривыми пиков куркумина после переваривания. Данные представляют собой средства ± SD.

Параметры для тандемного масс-спектрометрического анализа куркумина в сыворотке мыши.

API 4000 QTrap Параметры MS / MS: Икспрерывное напряжение, 4,5 кВ; поток занавеса, 40 мл / мин; столкновение газа, высокое; температура нагревателя и источника, 500 ° C; EP / CXP, 10 В; Газ 1 / Газ 2, 40 мл / мин. DCP, плазма постоянного тока; CE, капиллярный электрофорез.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *