Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Происхождение и природа плотно кластеризированных БТГ1-делетий в прекурсорной B-клеточной острой лимфобластной лейкемии поддерживают модель многоклановой эволюции

The Origin and Nature of Tightly Clustered BTG1 Deletions in Precursor B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Support a Model of Multiclonal Evolution
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3280973/

Задуманные и разработанные эксперименты: EW BS LTvdM PMH AGvK FNvL RPK. Выполнены эксперименты: EW BS SVvR LvE YK. Проанализированы данные: EW BS FNvL RPK. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: BS ES PMH. Написал документ: EW BS RPK.

Повторные субмикроскопические делеции в генах, влияющих на основные клеточные пути, являются признаком детской острой лимфобластной лейкемии (ВСЕ). Чтобы получить более полное представление о механизме, лежащем в основе этих делеций, мы изучили возникновение и характер аномалий в одном из этих генов, транслокационном генах В-клеток 1 (BTG1), в большой когорте педиатрических случаев ALL. Было обнаружено, что BTG1 подвергается исключительно воздействию геномных делеций, которые были обнаружены у 65 из 722 образцов B-клеток предшественника ALL (BCP-ALL) (9%), но не в 109 случаях T-ALL. Были идентифицированы восемь различных размеров удаления, которые были сгруппированы на теломере в области горячих точек в течение второго (и последнего) экзона гена BTG1, что привело к выражению усеченных транскриптов чтения BTG1. Наличие последовательностей сигналов рекомбинации V (D) J на ​​обоих сайтах практически всех делеций настоятельно указывает на нелегитимную RAG1 / RAG2-опосредованную рекомбинацию в качестве ответственного механизма. Более того, высокие уровни триметилирования гистона H3-лизина 4 (H3K4me3), который, как известно, связывают ферментный комплекс RAG с ДНК, были обнаружены внутри тела гена BTG1 в клетках BCP-ALL, но не в клетках T-ALL. Выделения BTG1 редко встречались в гиперпиплоидных BCP-ALLs, но преобладали в других цитогенетических подгруппах, включая ETV6-RUNX1 и BCR-ABL1 положительные подгруппы BCP-ALL. Через чувствительный скрининг на основе ПЦР мы идентифицировали множественные дополнительные делеции BTG1 на субклональном уровне в BCP-ALL с равным цитогенетическим распределением, которое в некоторых случаях выросло в основной клон при рецидиве. В совокупности наши результаты показывают, что делеции BTG1 могут выступать в качестве «драйверов» лейкогенеза в конкретных подгруппах BCP-ALL, в которых они могут возникать независимо в нескольких субклонах на сайтах, которые подвержены аберрантным событиям рекомбинации, опосредованным RAG1 / RAG2. Эти данные являются дополнительным доказательством сложной и многоклонной эволюции ALL.

Недавние исследования коснулись существования сложной клональной клеточной архитектуры при остром лимфобластном лейкозе (ALL), где множественные субклоны способствуют лейкогенезу. Здесь мы показываем, что в педиатрических В-клеточных предшественниках ALL (BCP-ALL) моноаллельные делеции в локусе опухолевого супрессора BTG1, которые, как обнаружено, встречаются у 9% исследованных пациентов, приводят к усечению гена, а не к полному аллели потери. Используя генетический и эпигенетический подходы, мы показываем, что эти делеции, скорее всего, происходят из нелегитимной регрессии RAG. Чувствительное обратное отслеживание с использованием ПЦР с удалением, показало, что эти удаления BTG1 встречаются в определенных подтипах BCP-ALL, частота которых выше, чем предполагалось ранее, часто в одном незначительном субклоне или в нескольких независимых субклонах у отдельных пациентов. Субклоны, несущие удаление BTG1 при диагностике, могут развиться в основной клон при рецидиве. Эти данные связывают механизм делеции гена-супрессора опухоли с многоклеточной эволюцией ALL.

Острая лимфобластная лейкемия (ALL) является наиболее распространенной формой рака у детей и может быть подразделена на лейкемию Т-линии (T-ALL) и лейкоз предшественника B-клеток (BCP-ALL). BCP-ALL составляет около 80% всех педиатрических случаев ALL и содержит генетически различные подтипы. Эти подтипы ALL характеризуются специфическими генетическими аномалиями, включая анеуплоидии (гипердиплоидия и гиподиплоидия) и хромосомные транслокации, приводящие к слияниям генов ETV6-RUNX1, E2A-PBX1, BCR-ABL1 и MLL [1]. Недавно был выявлен дополнительный уровень сложности идентификации повторяющихся изменений количества копий (CNA), включая делеции отдельных генов [2] — [4], некоторые из которых сильно связаны с прогрессированием заболевания и исходом [5] — [7] , Несмотря на большое количество CNA, которое было идентифицировано в BCP-ALL, общее количество структурных генетических повреждений в каждом отдельном образце лейкемии обычно ограничено менее чем 10 на случай. Подмножество этих генетических повреждений, преимущественно одиночных делеций генов, может выступать в качестве «драйверов» в развитии BCP-ALL. Гены, обычно затронутые этими исключениями драйверов, функционируют в ключевых путях, таких как регуляция клеточного цикла (CDKN2A, CDKN2B, RB1), лимфоидное развитие (PAX5, EBF1, IKZF1, RAG1 / 2) и передача сигналов ядерного гормонального рецептора (NR3C1, TBL1XR1).

Одним из вновь идентифицированных игроков в BCP-ALL является гена транслокации B-1 (BTG1) [4], [8]. BTG1 относится к семейству антипролиферативных генов BTG / TOB (BTG1-BTG4, TOB1 и TOB2), а экспрессия их продуктов генов изменяется во множестве различных видов рака [9]. Сообщается, что ген BTG1 поражен удалением примерно в 10% случаев BCP-ALL [2], [3] и нацелен на бессмысленные и миссенс-точечные мутации в диффузной большой В-клеточной лимфоме [10]. Было показано, что BTG1 непосредственно взаимодействует с множественными факторами транскрипции и модуляторами, участвующими в регуляции важнейших клеточных процессов, включая оборот мРНК и модификацию гистонов [11] — [14]. Кроме того, мы недавно продемонстрировали, что BTG1 регулирует глюкокортикоидный рецептор (GR) -зависимый транскрипционный ответ в лейкозных клетках [8], который превращает этот ген в интересную мишень для модуляции терапевтического ответа.

Несколько рецидивирующих хромосомных аномалий при лейкемии показывают кластеризацию их точек останова, предполагая, что признаки, присущие ДНК, могут лежать в основе их происхождения. Общим механизмом, лежащим в основе этих аномалий, является не гомологичное конечное соединение (NHEJ). NHEJ используется человеческими клетками для восстановления разрывов двойной цепи ДНК, вызванных внешним повреждением, или промежуточными стадиями рекомбинации V (D) J и рекомбинации кластерных коммутаторов (CSR) при развитии лимфоцитов [15] — [17]. Комплекс RAG опосредует рекомбинацию V (D) J посредством распознавания последовательностей сигналов рекомбинации (RSS), расположенных непосредственно рядом с сегментами V, D или J, тем самым генерируя вариабельность иммуноглобулинов (Ig), а также B- и T- клеточных рецепторов. Было предложено нелегитированную RAG-опосредованную рекомбинацию в процессе транслокации протоонкогенов LMO2 и TAL1 с TCRδ
[18], и, по-видимому, является причиной рецидивирующих внутригенных делеций гена IKZF1 в BCP-ALL и лимфоидного взрыва при хронической миелоидной лейкемии (ХМЛ) [19], [20].

Всесторонний геномный анализ рецидивированного BCP-ALL показал, что диагноз и образцы рецидивов связаны с клонами, но могут проявлять тонкие различия, часто включающие поражения, обнаруженные во время диагностики, которые отсутствуют во время рецидива [5], [21], [22]. Кроме того, диагнозы и образцы рецидивов могут нести альтернативные повреждения, влияющие на гены, такие как, например, CDKN2A и PAX5, что указывает на то, что эти поражения происходят неоднократно во время клоновой эволюции BCP-ALL [5]. Эти результаты согласуются с общепринятой концепцией о том, что каждый лейкозный отросток включает гетерогенную популяцию лейкемических клеток, из которых только подмножество может стимулировать прогрессирование заболевания, выживать в терапии и / или индуцировать развитие рецидивов [23]. Недавние исследования в BCP-ALL показали, что эта многоклеточная архитектура поддерживает сложную модель многоклонной эволюции [24], [25]. Во время прогрессирования заболевания и после рецидива после лечения сдвиги могут возникать при доминировании лейкозных субклонов, что, скорее всего, вызвано новыми избирательными узкими местами, тогда как субклональное разнообразие, по-видимому, сохраняется.

В настоящем исследовании мы охарактеризовали происхождение и характер делеций BTG1 в когорте из 831 детского ВСЕХ случаев. Мы демонстрируем, что делеции BTG1 исключительно обнаруживаются в BCP-ALL, как в преобладающем клоне, так и в (множественных) субклонах, и сильно связаны с ETV6-RUNX1 и BCR-ABL1 положительными ВСЮ, но редко встречаются в гипердиплоидных случаях. Кроме того, мы показываем, что эти делеции, скорее всего, возникают из-за нелегитимной RAG-опосредованной рекомбинации, плотно сгруппированы и практически все разделяют их теломерную точку останова во втором экзоне BTG1, что приводит к выражению сквозного транскрипта, что приводит к высокому нестабильный усеченный белок BTG1. Эти результаты дают важное представление о механизме, лежащем в основе возникновения делеций BTG1 в BCP-ALL, и поддерживают недавно наблюдаемую сложность многоклиновой эволюции ALL.

Мы провели скрининг 831 детского ВСЕХ образцов диагноза для аберраций числа копий в BTG1 (Entrez Gene: 694) с использованием мультиплексной лигингозависимой амплификации зонда (MLPA). В 722 образцах BCP-ALL мы обнаружили в общей сложности 65, преимущественно моноаллельных, делеций (9%), в то время как потеря количества копий BTG1 не была обнаружена ни в одном из образцов T-ALL (n = 109; P = 0,001; ). Кроме того, MLPA, выполненный на геномной ДНК, полученной из клеточных линий BCP-ALL (n = 10) и T-ALL (n = 5), выявил делеции BTG1 в клеточных линиях BCP-ALL REH, SUP-B15, MUTZ5 и 380, тогда как ни одно из них не может быть обнаружено в клеточных линиях T-ALL (см. Материалы и методы). Последовательность всего гена в 135 случаях BCP-ALL и эксона 2, которая содержит основную часть открытой рамки считывания, в 158 дополнительных случаях BCP-ALL и 44 случаях T-ALL не выявила мутаций. Кроме того, анализ бисульфитной последовательности показал отсутствие гиперметилирования промотора BTG1 в 20 случаях BCP-ALL и 5 T-ALL.

Статус удаления BTG1 определялся с использованием MLPA.

Из-за недостающих значений числа не всегда складываются до 722 случаев BCP-ALL. Имелись данные по 637 случаям гипердиплоидии; 513 дел для ETV6-RUNX1; 648 случаев для BCR-ABL1; 649 случаев для перегруппировки MLL.

«Другая» подгруппа охватывает случаи, отрицательные для транскрипций ETV6-RUNX1 или BCR-ABL1, MLL-перегруппировку и / или гипердиплоидию. Эта группа включает 10 случаев с транслокацией E2A-PBX1, из которых ни одна из них не содержит удаление BTG1.

Подгруппа неизвестна включает все случаи, когда данные не доступны в одной или нескольких цитогенетических классификациях.

Точный тест Фишера использовался, когда группы образцов были небольшими.

Было обнаружено, что удаления BTG1 неравномерно распределены между различными цитогенетическими подгруппами, обогащенными положительными случаями ETV6-RUNX1 (TEL-AML1) и BCR-ABL1, и менее частыми в случаях гипердиплоидов (P <0,001, P = 0,003 и P = 0,002 , соответственно, таблица 1). Кроме того, анализ целенаправленных количеств повторяющихся генов во ВСЕХ показало, что случаи с делециями BTG1 чаще укрывали делеции ETV6, RB1 и EBF1 (P = 0,007, P <0,001 и P <0,001 соответственно, таблица S1). Вместе наши данные показывают, что на BTG1 влияют делеции в определенных подгруппах детей BCP-ALL у детей.

Чтобы дополнительно определить размер и местоположение удалений BTG1, геномное профилирование на основе SNP было выполнено по 24 BTG1-позиционно-положительным образцам диагностики BCP-ALL и производным клеточным линиям BCP-ALL REH, SUP-B15 и 380. Почти у всех случаев, контрольная точка удаления теломера находилась в гене BTG1. Последующее точное картирование на основе ПЦР и прямое секвенирование показали, что интрагенические точки останова плотно сгруппированы в области из 33 пар оснований во втором (и последнем) экзоне БТГ1, причем большинство (75%) точек останова расположены в пределах растяжения из 10 пар оснований (рис. 1А, таблица S2). Центромерные точки останова, отображаемые в 8 разных положениях после гена BTG1, приводят к удалению в диапазоне от 101 до 557 т.п.н. (делеции I-VIII). Эта высокоспецифическая кластеризация точек останова удаления позволила нам провести скрининг на основе ПЦР всех 65 диагностических образцов BCP-ALL. Следовательно, мы смогли точно отобразить делеции в 52 из 65 случаев и обнаружили, что делеция III наиболее распространена, включая почти половину всех выявленных повреждений (49%). Удаления V и VIII были обнаружены в 15 и 17% случаев соответственно (рисунок 1B). Эти данные иллюстрируют высокую степень кластеризации точек останова BTG1 в BCP-ALL.

(A) Ген BTG1, расположенный на антисмысловой цепи хромосомы 12q22, исключительно разрушается посредством делеций (обозначенных черными полосками). Мы идентифицировали 8 различных делеций в диапазоне от 101 до 557 кб. Точки удаления останавливают кластер плотно в пределах экзона 2, большинство из которых расположены в пределах 10 пар оснований. Цветные треугольники указывают положение точек останова у разных пациентов. Голубой представляет собой точку прерывания удаления I, серое удаление II, синюю делецию III, розовую делецию IV, фиолетовое делецию V, выделение зеленого VI, красную делецию VII и оранжевую делецию VIII соответственно. Точные последовательности точек останова BTG1 перечислены в таблице S2. Хромосомное расположение относится к сборке генома человека GRCh37 / hg19. (B) В нашей когорте из 65 исключающих положительных случаев BCP-ALL, как определено MLPA, мы обнаружили восемь различных делеций с разными частотами. Наиболее распространенным было исключение III (49% случаев).

Примечательно, что при проверке делеций BTG1 с помощью ПЦР с точки зрения прерывания множественные удаления BTG1 были идентифицированы в 18 из 65 делеционных положительных случаев (27%), все из которых оказались моноаллельными потерями с использованием MLPA. Индивидуальные удаления оказались уникальными в их точках прерывания и фланкирующих интерстициальных последовательностях (таблица S2), что указывает на наличие нескольких субклонов, которые независимо получали удаления BTG1. У одного пациента было идентифицировано до 4 уникальных делеций (рис. 2А, таблица S3). В результате этого обнаружения мы выполнили аналогичный скрининг на BTR1 на основе ПЦР для трех наиболее распространенных делеций (III, V и VIII) в 89 случаях делеции отрицательных BCP-ALL случаев, полученных по протоколу MLPA или SNP, и смогли подтвердить наличие BTG1 в незначительных субклонах в 16 случаях (18%), что значительно чаще, чем появление этой аномалии в преобладающем лейковом клоне (рис. 2B). Подобно ранее наблюдавшимся клонированным ударам BTG1, эти субклональные события были обнаружены в нескольких ETV6-RUNX1-позитивных случаях, а не в подгруппе гипердиплоидов (рисунок 2B, таблица S4). Кроме того, никакие субклональные BTG1-делеции не были обнаружены в 77 случаях T-ALL или в 26 образцах костного мозга здоровых добровольцев. Вместе мы заключаем, что BTG1-делеции связаны с конкретными подтипами BCP-ALL, где они могут неоднократно возникать в независимых субклонах.

(A) Повторение многоклеточных делеций BTG1. Метод чувствительного ПЦР использовался для скрининга восьми различных точек прерывания удаления (удаление I-VIII) в BTG1 MLPA положительных (+) случаях (n = 65) и для скрининга трех наиболее часто встречающихся контрольных точек удаления (удаление III, V и VIII) в деле отрицательных (-) случаев BTG1 MLPA делеции (n = 89). (B) частота удаления BTG1 в двух основных цитогенетических подгруппах BCP-ALL (Hyperdiploid и ETV6-RUNX1). Наличие делеции BTG1 в преобладающем клоне определяли MLPA на всей когорте случаев BCP-ALL (n = 722) и сравнивали с делециями, обнаруженными как незначительный клон в случаях, отрицательных по MLPA (n = 89) путем делеции ПЦР. Распределения сходны, истощаются из гипердиплоидных случаев и обогащаются ETV6-RUNX1-положительными случаями по сравнению с общей группой.

Чтобы проверить, могут ли незначительные субклоны или их предшественники, которые содержат удаление BTG1, превратиться в клоны рецидива, мы проанализировали 62 сопоставленных образца рецидива с использованием MLPA для фокальных удалений BTG1. Все делеции-положительные случаи были подвергнуты ПЦР с точки зрения прерывания для каждого из восьми вариантов делеции (делеции I-VIII). Опять же, мы обнаружили уникальные делеции BTG1 как в преобладающем клоне, так и в (нескольких) субклонах (таблица 2). Дополнительное удаление было секвенировано, из которого точка останова теломера находилась на 2 кб ниже по потоку в 3’UTR BTG1. Откат и упорядочение контрольных точек удаления в сопоставленных образцах диагноза показали, что эти клонирующие клоны BTG1 происходили из (под) клона при диагнозе, по меньшей мере, в четырех случаях. Эти данные подтверждают, что удары BTG1 возникают неоднократно и независимо во время прогрессирования заболевания и что эти лейкозные (суб) клоны часто повторяются при рецидиве.

Определяется путем анализа последовательности точки останова, которая охватывает продукт ПЦР.

Точка прекращения удаления не может быть обнаружена (N.D.) с использованием восьми анализов ПЦР с точки зрения останова (I-VIII).

Точка останова не кластеризуется в экзоне 2 BTG1, но находится в 2 кб ниже по течению в 3’UTR.

Гомозиготное удаление.

Практически все делеции, влияющие на локус BTG1, нацелены на второй экзон BTG1, оставляя возможность экспрессии усеченного белкового продукта. Для определения того, была ли экспрессирована усеченная мРНК BTG1 из перегруппированного аллеля, RT-PCR с использованием праймеров с брейк-фланкированием выполняли на трех линиях клеток BCP-ALL с удалением BTG1 (380, REH и SUP-B15 с делециями II, III и IV , соответственно) и две клеточные линии, которые являются отрицательными по BTG1 (Nalm6 и RS4; 11) (рисунок 3). Обнаружено, что мРНК дикого типа BTG1 присутствует во всех клеточных линиях, тогда как усеченные сквозные транскрипты, специфичные для каждого типа делеции, могут быть обнаружены только в трех удаленных положительных клеточных линиях BCP-ALL (рисунок 3B). Аналогично, мы обнаружили транскрипты чтения BTG1 в первичных образцах BCP-ALL с делециями BTG1 III, V и VIII соответственно, некоторые из которых могут быть подтверждены на геномной ДНК этих пациентов (рисунок 3C). Примечательно, что наличие нескольких субклонов делеции BTG1, наблюдаемых на геномном уровне, также обнаруживалось на уровне транскрипта, и последующее секвенирование подтвердило уникальную идентичность каждого клона (таблица S5). Количественная ОТ-ПЦР показала, что в клетках REH, SUP-B15 и 380 ретранслированный аллель BTG1 экспрессируется на значительно более высоких уровнях по сравнению с аллелем BTG1 дикого типа, что может отражать различия в стабильности мРНК (рисунок 3D). Эти результаты показывают, что моноаллельные делеции BTG1 приводят к экспрессии усеченных транскриптов BTG1, кодирующих более половины белка BTG1.

(A) Схематическое представление человеческого BTG1 гена дикого типа, существующего из двух частично кодирующих экзонов, и пять различных транскриптов BTG1, связанных с удалением гена BTG1. Экзоны представлены черными (кодирующими) или белыми (некодирующими) барами. Показаны RT-ПЦР-праймеры, которые использовались для определения экспрессии транскрипта BTG1 дикого типа (праймеры A и B) или один из укороченных транскриптов BTG1 с прочтением для делеции II (праймеры A и C), делеция III ( пимеры A и D), делеция IV (праймеры A и E), делеция V (праймеры A и F) или делеция VIII (праймеры A и G). (B) RT-PCR-анализы на общую РНК, выделенную из клеточных линий BCP-ALL Nalm6 и RS4; 11 (BTG1 дикого типа) и REH, SUP-B15 и 380, каждая с отдельными моноаллельными удалениями BTG1. (C) RT-PCR-анализы на первичных образцах BCP-ALL, в которых единственная делеция BTG1 (Pt1, Pt2, Pt3 и Pt5), множественные делеции BTG1 (Pt4 и Pt6) или отсутствие BTG1-делеций были обнаружены с помощью геномной ПЦР (Pt7). Указывается тип исключений (III, V или VIII) и результат MLPA (p: удаление-положительный; n: отрицательный результат). Транскрипты чтения BTG1 были проверены путем секвенирования (таблица S5), за исключением Pt3-делеции V, которая была несвязанной последовательностью ДНК. (D) Количественные данные RT-PCR реального времени, представляющие относительные уровни экспрессии BTG1, измеренные 5 ‘(праймеры exon 1/2) и 3’ точки доступа точки BTG1 (праймеры exon 2). Уровни экспрессии были нормированы на уровни HPRT и сравнивались с уровнем экспрессии в Nalm6, который был установлен в 1. Показанные данные представляют собой среднее значение двух независимых реакций кДНК и трех повторов qRT-PCR.

Для оценки функции усеченного белка BTG1 вариант C-концевой делеции BTG1, который заканчивается в общей точке останова после аминокислотного остатка 100, клонировали в вектор pcDNA3.1 и тестировали на экспрессию белка. Для сравнения, в анализы был включен BTG1 дикого типа (рисунок S1A). Полноразмерный HA-меченный белок BTG1 подвержен протеосомной деградации [8], но в присутствии ингибитора протеосом MG132 экспрессия может быть легко обнаружена (фиг. S1B). Напротив, усеченные уровни белка BTG1 (HA-BTG1-Trunc) оказались очень неустойчивыми и едва различимы даже в присутствии MG132 (фиг. S1B), тогда как уровни экспрессии мРНК были равны уровням полноразмерного HA-BTG1 (рисунок S1C). Основываясь на этих выводах, мы заключаем, что транскрипты считывания, которые выражаются при фокальной потере BTG1, вряд ли приведут к функционально активному протеину, что благоприятствует сценарию гаплоинтенсивности BTG1.

Поскольку нелегитимная RAG-опосредованная рекомбинация была вовлечена в происхождение нескольких транслокаций и делеций при лейкемии [18] — [20], мы исследовали последовательности, фланкирующие каждую из точек останова BTG1 для присутствия последовательностей сигналов рекомбинации (RSS). RSS-мотивы представляют собой умеренно консервативные последовательности гептамера (CACAGTG) и nonamer (ACAAAAACC), разделенные либо спейсером 12 ± 1 bp (12-RSS), либо спейсером 23 ± 1 bp (23-RSS). Комплекс RAG объединяет только сегменты генов, содержащие RSS с разной длиной спейсера, соответствующие правилу 12/23 для эффективной рекомбинации V (D) J (рис. S2). Примечательно, что мы обнаружили, что 23-RSS присутствовал в горячей точке рекомбинации во втором экзоне BTG1, в то время как все, кроме одной из центромерных точек останова, содержали 12-RSS (таблица 3, таблица S2). Кроме того, все точки оставления делеции содержали случайное добавление одиночных нуклеотидов между соединяющими концами, что, скорее всего, связано с действием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Вместе эти данные сильно подтверждают роль незаконной RAG-опосредованной рекомбинации при возникновении делеций BTG1.

Подчеркиваются несоответствия консенсуса;

RSSs фланкирующие сегменты V (D) J гена;

Показанная последовательность показана в обратной ориентации;

Функциональные криптографические RSSs в контрольных точках протоонкогена [18].

Недавние исследования показали, что RAG-опосредованная V (D) J-рекомбинация контролируется модификациями гистонов, включая ацетилирование гистона H3 и H4 и триметилирование H3, которые обычно присутствуют в промоторных областях активно транскрибируемых генов [26], [27]. Более конкретно, было продемонстрировано, что палочка гомеодомен (RG2) растений (PHD) непосредственно связывается с H3K4me3, тем самым стимулируя каталитическую активность ферментного комплекса RAG [28]. Чтобы показать, могут ли различия в уровнях триметилирования H3K4 и / или H3K9 / 14 ацетилирования объяснить специфическое происхождение специфических случаев делеции BTG1, проводились эксперименты с иммунопреципитацией хроматина (ChIP), нацеленные на различные положения в гене BTG1 в нескольких B-линиях и T- линии линий линии, демонстрирующие обильную экспрессию BTG1 (фиг. 4A). Как и ожидалось, заметные уровни H3K4me3 присутствовали в проксимальной области промотора вблизи места начала транскрипции как в линиях линий B-линии, так и линии T-lineage (рисунок 4B). Напротив, только клеточные линии BCP-ALL отображали значительно более высокие уровни H3K4me3 вблизи точки точки останова во втором экзоне BTG1. Было обнаружено, что уровни ацетилирования H3K9 / 14 значительно различаются в проксимальной области промотора между клетками B- и T-линии, но не у тела гена BTG1 (рисунок 4C). В заключение наши данные свидетельствуют о том, что нелегитимную RAG-опосредованную рекомбинацию в точке разрыва точки прерывания во втором экзоне BTG1 в клетках B-линии могут быть облегчены за счет увеличения уровней H3K4me3.

(A) Количественные данные RT-PCR реального времени, представляющие относительные уровни экспрессии BTG1 в клеточных линиях T-ALL HSB2, Jurkat и KARPAS45, и клеточные линии BCP-ALL RS4; 11, Nalm6 и CCRF-SB (HPRT, нормированные и связанные с Уровни экспрессии HSB2). Показанные данные представляют собой среднее значение двух независимых реакций кДНК и трехкратных реакций qRT-PCR. (B и C). Процентное восстановление после ChIP, проведенное с антителом H3K4me3 (B) или антителом H3K9 / 14Ac (C) к T-ALL (HSB2, Jurkat, KARPAS45) и BCP-ALL (RS4; 11, Nalm6 и CCRF-SB) Сотовые линии. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с праймерами, специфичными для области 1 kb, выше по течению от сайта начала транскрипции (-1 kb prom), непосредственно фланкируя сайт начала транскрипции (prox prom), второй экзон вблизи точки доступа точки останова (экзон 2) и к концу 3′-транслируемой области (3’UTR) на втором (и последнем) экзоне человеческого BTG1-гена. Значения представляют собой два независимых эксперимента ChIP. Т-критерий Стьюдента проводился для оценки различий между средним восстановлением образцов T-ALL по сравнению с BCP-ALL. Asterisk (*) указывает значение p <0,05.

В этом исследовании мы демонстрируем, что BTG1, рекуррентная мишень в педиатрии ALL, зависит от делец усечения генов, которые встречаются преимущественно в двух цитогенетических подгруппах педиатрического BCP-ALL, то есть ETV6-RUNX1 (19%) и BCR- ABL1 положительные (26%) подгруппы. В этих подгруппах делеции BTG1 часто возникают независимо в разных субклонах, что полностью соответствует недавно опубликованной комплексной мультиклиновой эволюционной модели ALL [24], [25]. Кроме того, наши результаты указывают на роль делеций BTG1 в клонировании и разрастании в этих подгруппах BCP-ALL.

Через геномное профилирование с высоким разрешением BTG1 был недавно идентифицирован как рецидивирующая цель в детском ALL [2] — [4]. Здесь мы демонстрируем, используя когорту из 831 детского ВСЕХ случаев, что BTG1 нацелен на ограниченное количество хорошо демаркированных геномных делеций. Эти микроделеции были обнаружены преимущественно как моноаллельные события на клональном уровне примерно в 9% случаев BCP-ALL и, как было установлено, полностью отсутствовали в изученных случаях T-ALL. Промежуточные события гиперметилирования или мутации последовательности не были обнаружены. Напротив, мутации BTG1 часто встречаются в диффузной большой В-клеточной лимфоме, утверждая, что другие механизмы мутаций могут нацеливаться на BTG1 при более выраженных злокачественных новообразованиях B-линии [10]. Восемь различных делеций в 52 случаях были молекулярно клонированы и секвенированы. Вместе три наиболее распространенных делеции (III, V и VIII) были обнаружены в 81% от общего числа. Следует отметить, что подавляющее большинство теломерных точек остаточного теломера BTG1 было обнаружено, что они плотно сгруппированы в пределах 10 п.о. в последнем экзоне BTG1.

Этот замечательный вывод имеет как структурные, так и функциональные последствия. Структурно эта кластерная точка останова подразумевает наличие функций последовательности, лежащих в основе возникновения удалений BTG1. Практически все точки останова, которые были отображены, в том числе в рамках exon 2, были окружены неканоническими последовательностями RSS, что настоятельно свидетельствует о том, что они возникли из нелегитимной RAG-опосредованной рекомбинации. В соответствии с этими наблюдениями линии клеток BCP-ALL показали локальное накопление H3K4me3 в кодирующей области гена BTG1, включая второй экзон, который содержит точку доступа точки останова. Эта эпигенетическая метка обычно ассоциируется с проксимальным промотором активно транскрибируемых генов и, кроме того, было показано, что она выступает в качестве стыковочного узла для связывания RAG2, тем самым облегчая рекомбинацию V (D) J [28]. Напротив, в клеточных линиях, полученных из T-ALL, эти метки H3K4me3 не были обогащены сайтом тела гена BTG1, что указывает на то, что в этих клетках локус менее доступен для ферментного комплекса RAG. Незаконные события рекомбинации в критических RSS-мотивах были связаны с несколькими рецидивирующими хромосомными аномалиями в лимфоидных злокачественных новообразованиях, такими как транслокации и делеции. Например, было высказано предположение, что транскрипции ETV6-RUNX1 и BCR-ABL1 возникают из-за ошибочного применения белков RAG, которые облегчают RAG-опосредованную транспозицию или, по крайней мере, создают одно из инициирующих поражений в виде ников [29] — [31]. Это ошибочное исследование белков RAG может происходить как редкое спонтанное событие при дифференцировке лимфоцитов, но может также быть результатом повышенной или продолжительной активности RAG при лейкозных лимфоидных взрывах. Это последнее явление может объяснить специфичность подтипа делеций BTG1 и / или совпадение этих делеций с транслокатами ETV6-RUNX1 и BCR-ABL1.

Повторение усеченных BTG1 делеций в BCP-ALL может также указывать на функциональную роль в лейкогенезе. BTG1 относится к семейству антипролиферативных генов BTG / TOB (BTG1-BTG4, TOB1 и TOB2), участвующим в нескольких типах рака [9]. Недавно мы сообщали, что в BCP-ALL BTG1 регулирует реакцию глюкокортикоидного рецептора (GR) -зависимого транскрипционного ответа в лейкозных клетках, в то время как потеря экспрессии BTG1 приводит к резистентности к глюкокортикоиду в моделях клеточных линий [8]. Кроме того, мы показали, что клоны лейкозов, несущие делеции BTG1, могут выдержать терапию и развиваться как преобладающий клон при рецидиве или, как показывают другие, могут возникать как новые поражения при рецидиве [21], [32]. Многие удаления BTG1 приводят к почти одинаковым усечениям открытой рамки считывания и последующей потере двух сохраняющихся доменов взаимодействия C-концевых белков. Тем не менее эффекты доминантно-негативного или усиления функции усеченного белка BTG1 менее вероятны, поскольку усеченный белок BTG1, по-видимому, очень нестабилен. Кроме того, мы также сталкивались с исключениями, охватывающими всю открытую рамку считывания или только часть 3′-UTR, что указывает на то, что усечение открытой рамки считывания BTG1 является очень частым, но не существенным.

Тот факт, что контрольные точки удаления BTG1 плотно сгруппированы, дает возможность выполнять быстрый и конфиденциальный скрининг с удалением через ПЦР с точки зрения останова. Применяя этот скрининг-подход к нашей детской ВСЕ-когорте, мы выявили, кроме наиболее известных удалений BTG1, дополнительные делеции в значительной доле (18%) случаев BCP-ALL на уровне субклона. Эти удаления остались необнаруженными, используя стандартные процедуры, такие как MLPA или SNP-массивы. В нескольких случаях множественные делеции происходили одновременно у одного пациента, каждый из которых обладал уникальными последовательностями, ограничивающими точки останова, которые были обнаружены как на геномном, так и на уровне транскрипта. Аналогично наиболее заметным делециям эти субклональные поражения демонстрировали очень сходное распределение по различным цитогенетическим подгруппам в BCP-ALL и не присутствовали в T-ALL или нормальных образцах костного мозга. Более того, у одного пациента этот субклональный BTG1-делеционно-положительный клон при диагностике снова появился как основной клон при рецидиве, тогда как в образцах повторного рецидива пяти других пациентов появились новые (суб) клоновые удаления BTG1. Эти результаты полностью согласуются с недавними исследованиями, описывающими эволюцию клонов EUL6-RUNX1 и BCR-ABL1 положительных ВС с эволюцией клона во время развития лейкемии, показывающей, что после лечения повторяющиеся поражения происходят неоднократно и независимо от одного пациента, что приводит к сложное множество немного разных субклонов [24], [25]. Наши текущие данные являются дополнительными доказательствами для этой модели на молекулярном уровне, показывая, что делеции BTG1 возникают независимо в нескольких субклонах ALL зависимым от контекста образом.

Кроме того, наши результаты дают представление о генетических поражениях, которые действуют совместно с удалением BTG1 в развитии BCP-ALL. Мы обнаружили, например, что делеции в ETV6, EBF1 и RB1 совместно с BTG1 делециями, что указывает на то, что потеря нормальной функции BTG1 может добавить к дефектам в pRb / E2F-опосредованном клеточном цикле и EBF1-опосредованном пути дифференцировки B-клеток. В качестве ответственного механизма для IKZF1 была предложена нелегитированная RAG-опосредованная рекомбинация
[19], [20], CDKN2A / B
[33], [34] и LMO2
[35], а также транслокации ETV6-RUNX1 [30]. Остается установить, связана ли RAG-опосредованная рекомбинация или другие механизмы, такие как CSR, при возникновении делеций RB1 и EBF1. Однако, подобно BTG1, эти рекуррентные делеции генов могут неоднократно возникать в разных субклонах из-за локальной специфичности доступа этих локусов к конкретным рекомбинационным механизмам, а затем клонального отбора и разрастания.

В заключение наш всесторонний анализ аберраций BTG1 показал, что этот ген периодически и исключительно зависит от делеций в конкретных подтипах BCP-ALL. Удаление BTG1 может возникать независимо в разных субклонах ALL, которые либо развиваются в преобладающий клон при постановке диагноза, остаются в виде второстепенных субклонов во время болезни, либо развиваются в основной клон при рецидиве. Таким образом, это явление может служить молекулярным объяснением модели многолетней эволюции во время лейкогенеза.

В исследование было включено 831 пациент с диагнозом BCP-ALL (n = 722) и T-ALL (n = 109). Образцы диагноза (n = 831) и соответствующие образцы рецидивов (n = 62) были собраны Нидерландской детской онкологической группой (DCOG) и Медицинским центром Университета Радбуда Неймеген, Нидерланды. Мононуклеарные клетки собирали путем разделения градиента Ficoll и ДНК выделяли с использованием набора для очистки QiaAmp (Qiagen, Venlo, The Netherlands). ДНК из образцов, отличных от лейкемического костного мозга, была предоставлена ​​доктором Йоопом Янсеном (отдел гематологии, медицинский центр Университета Радбуд Неймеген, Нидерланды). Письменное информированное согласие было получено для всех пациентов и контрольных образцов.

Человеческие линии BCP-ALL (CCRF-SB, RS4; 11, Nalm6, REH, SUP-B15, 380, 697, SEM, TOM1, MUTZ5) и T-ALL (MOLT4, Jurkat) были приобретены либо из ATCC, либо из DSMZ , Линии клеток T-ALL CML-T1, HSB2 и KARPAS45 были получены от доктора Адольфо Феррандо (Колумбийский университет, Нью-Йорк, США), а клеточная линия T-ALL TK6 была получена от доктора Альберта Форнеса (NCI, Bethesda, США). Клеточные линии лейкемии поддерживали в среде RPMI-1640 (Invitrogen), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 100 ед. / Мл пенициллинового натрия и 100 мкг / мл сульфата стрептомицина при 37 ° С в увлажненной атмосфере воздуха, содержащей 5% диоксида углерода ,

Были проанализированы образцы пациентов с лейкемией и клеточные линии (380, 697, CCRF-SB, RS4, 11, SEM, TOM1, REH, MUTZ5, SUP-B15, Nalm6, Jurkat, KARPAS45, MOLT4 и TK6) для изменения количества копий в BTG1 с использованием (MLPA). ДНК выделяли с использованием набора для очистки QiaAmp (Qiagen). Всего было разработано 9 зондов с использованием программного обеспечения MeltIngeny и рекомендаций, предоставленных MRC-Holland (Амстердам, Нидерланды, таблица S6). Анализ MLPA проводили с использованием реакционной смеси SALSA MLPA и эталонной зондовой смеси P200-A1 (MRC Holland), как описано ранее [5]. Кроме того, мы определили статус количества копий нескольких генов, связанных с лейкемией (PAX5, IKZF1, EBF1, CDKN2A, CDKN2B, RB1, ETV6, BTG1) с комплектом SALSA MLPA P335-A2 ALL-IKZF1 (MRC Holland) в соответствии с инструкции.

В 25 образцах диагностики пациентов BCP-ALL мы определили статус метилирования промотора BTG1 с использованием секреции бисульфита. В общей сложности 500 нг ДНК на образец превращали в бисульфит с использованием набора EZ DNA Methylation ™ Kit (исследовательские корпорации Zymo, Лейден, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя. Затем остров CpG амплифицировали ПЦР (для праймеров см. Таблицу S7), клонировали в векторе pGEM-T (Promega Benelux BV, Leiden, Нидерланды), трансформировали в компетентные клетки E. coli DH5α и высевали на пластину агара LB, содержащую 7 мкг / мл ампициллина, 200 нМ изопропил -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) и 200 мкг / мл X-Gal. После инкубации в течение ночи отдельные белые клоны отбирали для ПЦР колонии и секвенировали с использованием анализатора последовательности 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Последовательности анализировали с использованием программного обеспечения Vector NTI (Advance TM 11.0, выпуск 15 декабря 2008 г., Invitrogen, Breda, Нидерланды). В качестве положительного контроля использовали метилированную ДНК in vitro. Вкратце, 1 мкг ДНК инкубировали с 4 U M.SssI CpG Methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, United Kingdom), 160 мкМ S-аденозилметионином, 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ Дитиотреитол ( рН 7,9) в течение 4 часов при 37 ° С. В качестве отрицательного контроля ДНК HEK293 амплифицировали с использованием набора для амплификации генома CompletePlex Complete Whole (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Нидерланды) в соответствии с протоколом производителя.

Секвенирование первого (n = 135) и второго (n = 337) экзона гена BTG1 проводили на PCR-амплифицированных экзонах с использованием фланкирующих праймеров на основе интрона (см. Таблицу S7). ПЦР-амплификации проводили с 10 нг ДНК, 200 нМ каждого праймера, 2 (ex1) или 2,5 (ex2) mM MgCl2, 200 мкМ dNTP, 1 M GC-расплав (Clontech, Saint-Germain-en-Lay, France), 10 × ПЦР-буфер II, 2,5 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), используя предварительный нагрев 5 минут при 96 ° C, а затем 35 циклов 30 секунд при 96 ° C, 30 секунд при 55,3 ° C и 1 минуту при 72 ° C и прекращение в течение 3 мин при 72 ° С. Образцы секвенировали с использованием анализатора последовательностей 3730 (Applied Biosystems), и результаты анализировали с использованием программного обеспечения Vector NTI (Invitrogen).

Чтобы более подробно охарактеризовать удаления BTG1, мы выполнили анализ количества копий и генотипирования с высоким разрешением с использованием массивов Affymetrix SNP6.0 в соответствии со стандартными протоколами, предоставленными изготовителем. Генотипы были созданы с использованием Affymetrix Genotyping Console v2.1 и программного обеспечения Nexus 5.0 (BioDiscovery, Inc 2010, версия для сборки 4621). Нормальное изменение числа копий было отфильтровано с использованием данных нашей собственной базы данных (содержащей более 600 здоровых контрольных образцов), Hapmap и базы данных геномных вариантов (http://projects.tcag.ca/variation/).

Начиная с данных массива SNP, мы использовали пошаговый подход для увеличения восьми отдельных точек останова различных удалений BTG1. Мы определили точные геномные точки останова и интерстициальные последовательности с использованием Q-PCR, ПЦР на большие расстояния и, наконец, стандартную ПЦР и секвенирование. Q-ПЦР выполняли на 7900HT FAST Real-Time PCR system (Applied Biosystems) с SYBR Green для обнаружения продукта ПЦР. ПЦР с длинным диапазоном проводили с использованием TaKaRa La Taq (Takara Bio Inc, Otsu, Shiga, Japan). ПЦР-ампликоны секвенировали с использованием анализатора последовательностей 3730 (Applied Biosystems) и анализировали с помощью программного обеспечения VectorNTI (Invitrogen). Партии праймеров, используемые для обнаружения и последовательности восьми различных точек останова, перечислены в таблице S7. Для проверки на основе ПЦР использовали 20 нг ДНК, 200 нМ каждого праймера, 2 или 2,5 мМ MgCl2, 200 мкМ dNTP, 10 × ПЦР-буфер II, 2,5 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) с использованием 5 минут предварительного нагрева при 95 ° C, затем 10 циклов 30 секунд при 95 ° С, 2 мин при 60 ° С или 57,8 ° С и 2 мин при 72 ° С и еще 30 циклов 30 секунд при 95 ° С, 30 секунд при 60 ° С или 57,8 ° С и 2 мин при 72 ° С и завершение в течение 10 мин при 72 ° С.

Общая РНК из клеточных линий BCP-ALL и T-ALL была экстрагирована Trizol (Invitrogen), тогда как общая РНК из диагностических образцов пациентов была выделена с использованием набора RNeasy (Qiagen), как в соответствии с инструкциями производителя. Общая РНК превращалась в кДНК через ОТ-ПЦР с использованием случайных 6-мер и обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen). После этого кДНК разрешали в 50 мкл ддН2О и амплификации ПЦР проводили в 30 мкл реакциях при стандартных концентрациях (1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTP, 1 × PCR-буфер (Invitrogen), 2 U Platinum Taq (Invitrogen), 0,3 мкМ каждый праймер и 2 мкл кДНК-шаблона) (см. таблицу S7 для последовательностей праймеров). Реакции ПЦР проводили в течение 35 циклов при температуре отжига 58 ° С с использованием Эппендорфского мастера. Полученные фрагменты ПЦР разрешали 1% -ным электрофорезом в агарозном геле, изолировали с использованием набора для экстракции гена Qiagen и клонировали в pGEM-T для секвенирования с помощью праймеров M13. Количественная ПЦР в реальном времени была выполнена для определения экспрессии последовательностей 5РРНК мРНК 5 ‘до точки точки останова (экзоновые праймеры, фланкирующие интрон 1), экзона 2 BTG1 (праймеры, фланкирующие точки точки останова) и HPRT с силовым SYBR Green (Applied Biosystems) (таблица S7). Реакции проводили в трех повторностях на двух независимых шаблонах кДНК с использованием термоциклера PCR реального времени Applied Biosystems 7500 (ABI). Данные представляли как разность краев относительно экспрессии мРНК BTG1 в клетках Nalm6, нормированных на экспрессию HPRT, на основе расчета 2-ΔΔCt.

HA-BTG1-Trunc генерировали с помощью ПЦР на основе полноразмерного HA-BTG1 [8] с использованием праймеров, указанных в таблице S7. Продукты ПЦР очищали, клонировали в сайты EcoRI и XhoI pcDNA3.1 (Invitrogen) и проверяли секвенированием Sanger. Для анализа экспрессии белка различных конструкций BTG1 клетки HEK293 трансфицировали 10 мкг плазмидной ДНК с использованием линейного полиэтиленимина (PEI, Polysciences, Warrington, PA). На следующий день клетки разделяли на две чашки и через 24 часа после трансфекции обрабатывали 5 мкМ MG132 (Peptides International, Louisville, KY) в ДМСО или носителе в течение 16 часов. Для обнаружения экспрессии белка HA-BTG1 5 × 106 клеток лизировали в образце образца Laemmli, содержащем 2% SDS и 100 мМ DTT, кипятили в течение 5 минут, загружали на 15% SDS-PAGE, промокали на PVDF-мембране и окрашивали с помощью HA антитело, клон 3F10 (диагностика Roche). Экспрессия белка была визуализирована с использованием системы обнаружения ECL Plus Western Blot Detection System (GE Healthcare) и цифрового фоточувствительного устройства FluorchemE (Cell Biosciences).

После сшивания в течение 15 мин с 1% формальдегидом клетки лейкемии повторно суспендировали в ледяном буфере для лизиса (50 мМ HEPES [рН 7,6], 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100, 0,1% Дезоксихолат натрия), дополненный полными ингибиторами протеазы (Roche) с плотностью 35 × 106 клеток / мл и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин, 30 секунд и 30 секунд (Bioruptor Diagenode). Хроматин инкубировали в течение ночи в присутствии 0,1% BSA, 20 мМ HEPES (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,15% SDS, 1% Triton X-100, белковых A / G-гранул (Santa Cruz ), Полные ингибиторы протеазы и 2 мкг антитела H3K4me3 или H3K9 / 14Ac (оба из диагодеда). Бусины промывали два раза в буфере 1 (0,1% SDS, 0,1% дезоксихолата натрия, 1% Triton X-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 20 мМ HEPES [рН 7,6]), один раз в буфер 2 (0,1% SDS, 0,1% дезоксихолат натрия, 1% Triton X-100, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 20 мМ HEPES [рН 7,6]), один раз в буфере 3 (0,5% натрий Дезоксихолат, 0,5% NP40, 250 мМ LiCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ЭГТА, 20 мМ HEPES [рН 7,6]) и два раза в буфере 4 (1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ЭГТА, 20 мМ HEPES [рН 7,6] ). Хроматин элюировали из гранул 1% SDS / 100 мМ NaHCO3 и де-сшивали вместе с исходным материалом в течение 4 часов при 65 ° С с 200 мМ NaCl. После экстракции фенолом: хлороформ: изоамиловым спиртом ДНК осаждали в присутствии 10 мкг гликогена. Затем разбавленную ДНК подвергали количественной ПЦР с использованием Power SYBR Green (Applied Biosystems) и термоциклера PCR реального времени Applied Biosystems 7500 (праймеры перечислены в таблице S7). Процент восстановления был равен коэффициенту разбавления входной ДНК × 2 (Ct Input-Ct ChIP) × 100.

Совместное появление изменений количества копий и цитогенетических подгрупп сравнивали с использованием кросс-таблиц и стандартного теста хи-квадрат или точного теста Фишера, когда группы образцов были небольшими. Различия между уровнями H3K4me3 и H3K9 / 14Ac в образцах T-ALL по сравнению с BCP-ALL оценивали с использованием t-теста Стьюдента. Статистический анализ проводился с использованием статистического пакета SPSS (IBM, Чикаго, Иллинойс, США, выпуск 16.0.2, апрель 2008 г.), а двухсторонние значения P ниже 0,05 считались статистически значимыми.

Уровни белка BTG1-Trunc очень нестабильны и выражены на чрезвычайно низких уровнях. (A) Схематическое представление белка BTG1 полной длины BTG1 и делеционного мутанта BTG1-Trunc, который имитирует общий вариант делеции, наблюдаемый в BCP-ALL, унаследовающем моноаллельные BTG1 делеции. Показаны сохраненные домены BoxA, BoxB и BoxC, а также остатки взаимодействия рецептора ядерного гормона LxxLL. (B) Иммуноблот показывает уровни белка BTG1 из векторов pcDNA3.1, экспрессирующих HA-BTG1 (WT) и HA-BTG1-Trunc (Tr) при трансфекции в клетках HEK293 в отсутствие или присутствие 5 мкМ MG132 в течение 16 часов. Экспрессия белка обнаруживается с помощью HA-антитела 3F10. (C) BTG1 РНК в одном пуле трансфицированных клеток HEK293: ПЦР в реальном времени проводили на кДНК, генерируемой в отсутствие (черные полосы) или присутствие (серые полосы) обратной транскриптазы (RT). Экспрессия BTG1 была нормирована на уровни экспрессии базального транскрипционного фактора TBP.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Моноаллельные удаления BTG1 являются результатом аберрантной RAG-опосредованной рекомбинации. Последовательность рекомбинационного сигнала (RSS) состоит из консервативной последовательности 7-bp (гептамер, консенсус CACAGTG), 9-bp-последовательность (неамериканский консенсус ACAAAAACC) и промежуточная неконсервированная спейсерная последовательность 12 ± 1 или 23 ± 1 п.о. , Рекомбинация, происходящая между RSS, найденная в противоположной хромосомной ориентации, приведет к удалению промежуточных последовательностей ДНК. Объединение RAG-опосредованных двунитевых разрывов осуществляется не гомологичными белками ДНК-конца (NHEJ) посредством согласованного действия белков Ku70 / 80, ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK), Artemis, XRCC4, ДНК-лигаза 4 (Lig4) и терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT). RAG-опосредованная рекомбинация приводит к образованию точного сигнального сустава и модифицированного кодирующего сустава. (A) Схематическое представление локуса IgH рецептора В-клеток человека с числом сегментов гена, указанных выше локусов гена V, D и J. Рекомбинация V (D) J происходит только между двумя сегментами гена, фланкированными соответственно, 12-б.п. RSS и 23-п.п. RSS, которые относятся к правилу 12/23. Таким образом, правило 12/23 запрещает прямое соединение VH-to-JH. (B) Схематическое представление человеческого гена BTG1 на хромосоме 12, которое содержит 23-б.п. RSS в точке доступа для удаления во втором экзоне и одну из семи идентифицированных контрольных точек дистальной делеции, содержащих 12-б.п. RSS. RAG-индуцированная рекомбинация приводит к удалению промежуточной ДНК и модифицированного кодирующего сустава у гена BTG1, где TdT добавляет случайные, неизмеримые нуклеотиды.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Микроделеции BTG1 сосуществуют с делециями у рецидивирующих генов в BCP-ALL. a Из-за недостающих значений числа не всегда складываются до 722 случаев BCP-ALL.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

BTG1 последовательности точек прерывания удаления в BTG1 MLPA делеционно-положительные случаи BCP-ALL и клеточные линии. Секвенирование интрагенических делеций BTG1 демонстрирует наличие (близких) консенсусных мотивов ДНК ДНК для рекомбинации V (D) J, фланкирующих точку доступа точки останова в экзоне 2 BTG1 и кластерах дистальной точки останова. Консенсусный гептамер RSS [CAC (A / T) (A / G) (C / T) (A / G) на (+) цепи и (C / T) (A / G) (C / T) (A / T) GTG на (-) нити] отображается красным цветом и полужирным. Подчеркиваются несоответствия консенсуса. Одиночные нуклеотидные мутации обозначены серым цветом. Указаны нуклеотиды, вставленные между проксимальным BTG1 и дистальными точками останова.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Число уникальных последовательностей удаления BTG1 в BTG1 MLPA делеционно-положительных случаях BCP-ALL и клеточных линиях.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Субклональное проявление микроделеции BTG1 в цитогенетических подгруппах. Все пациенты, прошедшие скрининг, были отрицательными по BTG1, как определено MLPA. Статус удаления субклонального BTG1 определяли с использованием обнаружения на концах ПЦР делеций III, V и VIII. a Из-за отсутствующих значений числа не всегда складываются до 89 случаев BCP-ALL. Данные были доступны для 77 случаев гипердиплоидии; 41 случай для ETV6-RUNX1; 60 случаев для BCR-ABL1; 74 случая перегруппировки MLL. Другая подгруппа охватывает случаи, отрицательные для транскрипций ETV6-RUNX1, MLL, BCR-ABL1 и / или гипердиплоидии. Эта группа не содержит случаев транслокации E2A-PBX1. cSubgroup unknown включает все случаи, когда данные отсутствуют в одной или нескольких цитогенетических подгруппах. Точный тест dFisher использовался, когда группы образцов были небольшими.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Последовательности транскрипции BTG1, обнаруженные в независимых субклонах. Последовательность перекрытия удаления была подтверждена секвенированием геномной ДНК того же случая.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

MLPA для анализа количества копий области гена BTG1. Универсальные ПЦР-праймеры M13 выделены жирным шрифтом.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Праймеры, используемые для секвенирования бисульфита BTG1, скрининг мутаций, отображение точки останова, анализ экспрессии и анализ CHIP.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Eugène Verwiel за советы и поддержку, д-р Joop Jansen за предоставление образцов костного мозга, доктора Эвелена де Бонта для образцов лейкемии, и д-ра Адольфо Феррандо и доктора Альберта Форнеса за предоставление клеточных линий.

Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Это исследование было поддержано Нидерландским онкологическим обществом (KUN 2009-4298) и KiKa Foundation. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе данных и анализе, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *