Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Гипоксия запускает основные метаболические изменения в клетках AML без изменения индуцированного индометацином отмены регуляции цикла TCA

Hypoxia Triggers Major Metabolic Changes in AML Cells without Altering Indomethacin-Induced TCA Cycle Deregulation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3042854/

Наши предыдущие исследования показали, что нестероидный противовоспалительный препарат индометацин проявляет антилейкемическую активность in vitro и может ингибировать альдокеторедуктазу AKR1C3, которую мы идентифицировали как новую мишень при остром миелоидном лейкозе. Однако антилейкемические действия индометацина, вероятно, будут сложными и выходят за пределы ингибирования либо AKR1C3, либо циклооксигеназ. Для дальнейшего понимания антилейкемической активности индометацина мы использовали нецелесообразный метаболический анализ на основе ядерного магнитного резонанса для характеристики ответов клеточных линий KG1a и K562 как в нормальных условиях культуры, так и в гипоксии, что лучше отражает среду опухоли in vivo. Гипоксия вызывала резкие метаболические изменения в необработанных KG1a и K562, включая адаптацию как фосфолипидного, так и гликолитического метаболизма. Несмотря на эти изменения, обе клеточные линии поддерживали относительно неизмененное дыхание митохондрий. Администрация индометацина вызывала подобные метаболические реакции независимо от уровня кислорода в окружающей среде. Известные исключения включали метаболиты, связанные с синтезом жирных кислот de novo и метаболизмом холинфосфолипидов. В совокупности эти результаты показывают, что клетки лейкемии обладают присущей способностью переносить изменения в напряжении кислорода при сохранении неизмененного дыхания митохондрий. Однако введение индометацина значительно увеличивало окислительный стресс как в KG1a, так и в K562, вызывая митохондриальную дисфункцию, независимо от условий оксигенации. Эти данные подчеркивают особое отношение цикла трикарбоновой кислоты к выживанию раковых клеток и могут объяснить, почему некоторые антилейкемические препараты были обнаружены и успешно развиты, несмотря на использование условий культуры, которые не отражают гипоксическую среду раковых клеток in vivo.

Важно отметить, что в наших предыдущих исследованиях действия индометацина на клетки миелоидного лейкоза использовали обычные условия культивирования, которые не отражают гипоксические состояния, присутствующие в злокачественном костном мозге. Имеются данные о том, что пониженное напряжение кислорода влияет на клеточный метаболизм и микроокружение, включая уровень рН.16-20. Например, гликолиз усиливается при гипоксии за счет повышенной активности переносчиков глюкозы и гликолитических ферментов, что в конечном итоге вызывает увеличение производства лактата и снижение уровня рН. 16,21 Эти и другие модуляции в концентрациях метаболитов, вызванных гипоксией, могут влиять на ответ на фармакологическое лечение. (17) Поэтому здесь мы используем метаболическое профилирование на основе ЯМР для изучения влияния лечения индометацином на метаболизм клеток миелоидной лейкемии K562 и KG1a с целью получения дальнейшего механистического понимания антилейкемической активности этого препарата, а также влияния местной среды на результат лечения. Для достижения последнего мы исследовали эффекты лечения как в стандартных условиях культуры, так и в гипоксических условиях, которые лучше имитируют микроокружение опухоли in vivo. Кроме того, мы использовали две клеточные линии, которые апоптозируют в ответ на лекарство, чтобы исследовать общность любых обнаруженных метаболических реакций. Наши результаты показывают, что, несмотря на резкие изменения в метаболизме миелоидных клеток, выращенных в обычных или гипоксических условиях культивирования, цикл трикарбоновой кислоты (TCA) относительно сохраняется. Однако в присутствии индометацина цикл TCA становится обычно дерегулированным независимо от преобладающего кислородного напряжения.

1H-ЯМР-спектры J-разрешенных (J-RES) экстрактов линий клеток AML KG1a и K562, выращенных в условиях гипоксии или нормальной культуры. Ранее мы показали, что метаболические профили этих двух линий клеток AML, выращенных в нормальных условиях культуры, значительно различаются. (14) Здесь мы демонстрируем (как показано для клеток KG1a в спектрах ЯМР в 1, панель a), что гипоксия индуцированные заметные изменения в метаболических профилях клеточных линий K562 и KG1a. Более того, независимо от конститутивных метаболических различий между этими двумя клеточными линиями индуцированные гипоксией изменения в метаболических профилях были поразительно похожи между KG1a и K562. Анализ основных компонентов (PCA) выполнялся на проектируемых наборах данных ЯМР Я-RES двух необработанных клеточных линий, выращенных как в гипоксических, так и в нормальных условиях; полученный в результате график оценки PCA (дополнительный рисунок 1) подчеркивает значительные различия между метаболями клеток K562 и KG1a (почти 70% изменчивости захватывается первым основным компонентом). Метаболические различия между гипоксическими и нормальными средами культуры, учитываемыми на PC2, составляют около трети вариации, описанной на PC1. Изменчивость метаболизма в каждой из 4 групп была незначительной по сравнению с изменениями, вызванными типом клеток и кислородными условиями в культуре.

Метаболические различия, вызванные лечением индометацином в линиях линии острого миелоидного лейкоза, выращенных в негипоксических или гипоксических условиях. а) 1H-проецируемые спектры ЯМР-спектроскопии, полученные на полярной фракции клеточных экстрактов KG1a, выращенных либо в негипоксических (зеленые линии, показывающие все 12 повторяющихся спектров), либо в гипоксическом (~ 1% кислорода, красная линия, показывающая все 6 повторяющихся спектров) условия. б) график загрузки по PC2, полученный из анализа основных компонентов спектров 1H ЯМР, полученных на внутриклеточных экстрактах клеточных линий острого миелоидного лейкоза KG1a и K562, обработанных индометацином, и выращенных в негипоксических или в гипоксических условиях. c) График оценки, полученный из анализа основных компонентов наборов данных ЯМР ЯМР необработанных (зеленых символов) и обработанных индометацином (красных символов) клеток KG1a и K562, выращенных в гипоксических и негипоксических условиях. d) Средние концентрации выбранных промежуточных продуктов цикла TCA и восстановленного глутатиона в необработанных или обработанных индометацином клетках KG1a и K562 в негипоксических (в среднем 12 образцов) или в условиях гипоксии (в среднем 6 образцов). e) Средние концентрации метаболитов холинового пути в необработанных или обработанных индометацином клетках KG1a и K562 при негипоксическом (в среднем 12 образцов) или в условиях гипоксии (в среднем 6 образцов). f) Лечение индометацином вызывает образование активных форм кислорода в клетках AML. Процент ROS-положительных клеток в необработанных и обработанных индометацином клетках AM1 K1 и K562, выращенных и обработанных либо в негипоксическом, либо в гипоксическом состоянии, измеренных с использованием проточной цитометрии. (Phe, фенилаланин, тир, тирозин, His, гистидин, фум, фумарат, UDP, уридиндифосфат, лак, лактат, Ala, аланин, Cre, креатин, PCre, фосфокреатин, Gly, глицин, тау, таурин, m-Ino, myo-inositol, Cho, choline, PCho, фосфохолин, GPCho, глицерофосфохолин, Asp, аспартат, Asn, аспарагин, сук, сукцинат, глю, глутамат, Gln, глутамин, GSH, глутатион, цитрат, Pro, пролин, ацетат, Val, валин, Ile, изолейцин, Leu, лейцин, *: p <0,01; **: p <0,0001).

Множественные одномерные анализы (t-тесты), за которыми следовала коррекция для множественного тестирования гипотез (ложная скорость обнаружения, FDR (22)) на уровне 1% была выполнена на наборах данных ЯМР J-RES после исключения шума (в результате чего около 18 000 точек данных на набор данных); в частности, были сопоставлены наборы данных о состоянии гипоксии и нормальной культуры для каждой клеточной линии. Это подтвердило, что подавляющее большинство обнаруженных пиков метаболитов существенно различалось между условиями роста. Влияние гипоксической среды на метаболические профили клеток AML K562 и KG1a вызывает значительное увеличение концентраций разветвленных аминокислот (валина, лейцина и изолейцина), лактата, аланина, креатина, фосфокреатина, глицерина-3-фосфата, глицерофосфохолин, мио-инозитол, уридин-5′-дифосфо-N-ацетилглюкозамин (UDP-GlcNAc), уридин-5′-дифосфо-N-ацетил-галактозамин (UDP-GalNAc) и фенилаланин. Напротив, пролин, фосфохолин, цитрат, глутамат, глутатион и аспартат значительно снижаются в клетках, выращенных в гипоксических условиях (дополнительный рисунок 2). Более того, в обеих клеточных линиях фумарат, малат и сукцинат существенно не различаются между клетками, выращенными в гипоксических и негипоксических условиях. Среди всех обнаруженных метаболитов, общих для обеих клеточных линий, только изменения саркозина и глицина изменяются в противоположных направлениях, т. Е. В клетках, выращенных в гипоксических условиях. Оба метаболита имеют повышенную концентрацию в клетках K562 и снижают уровни в клетках KG1a. Более того, глутамин присутствует в обнаруживаемых количествах только в клетках K562. Чтобы оценить степень этих изменений более количественно, спектры 1H 1D ЯМР были собраны с большим временем повторения, чтобы обеспечить полную продольную релаксацию протонов. Концентрации GSH и нескольких других метаболитов, участвующих в цикле TCA или связанных с ним, а также метаболизм холина для клеток, выращенных в гипоксических или негипоксических условиях, представлены в дополнительном рисунке 3.

Независимо от конститутивных различий между двумя линиями клеток AML метаболические изменения, вызванные гипоксической средой, поразительно похожи в клетках KG1a и K562. Эти результаты свидетельствуют о том, что обе линии клеток AML используют общий адаптивный механизм при воздействии среды с низким напряжением кислорода. В соответствии с предыдущими исследованиями, проведенными на системных моделях клеток, мы наблюдаем усиление гликолитической активности (что подтверждается внутриклеточным накоплением аланина и лактата), индуцируемым гипоксической средой (18). Это, вероятно, является результатом избыточной экспрессии глюкозы транспортеров (в частности, GLUT1 и GLUT3) и повышенной активности гликолитических ферментов в гипоксии.23,24 Было показано, что повышенная экспрессия индуцируемого гипоксией фактора (HIF) в гипоксических опухолях вызывает экспрессию нескольких гликолитических ферментов, способствующих накоплению лактата и углекислоты, что приводит к повышенной кислотности во внутриклеточной среде.17,19,25

Интересно, что хотя гликолиз, по-видимому, усиливается в клетках, выращенных при гипоксии, концентрации метаболитов в цикле ТСА, за исключением цитрата, существенно не изменяются. Эти наблюдения показывают, что адаптивные механизмы, сохраняющиеся между типами клеток, служат для защиты дыхания митохондрий и, таким образом, способствуют выживанию клеток. Стабильность цикла TCA при пониженных условиях натяжения кислорода сделана еще более примечательной наблюдаемыми изменениями гипоксии в других путях. Гипоксия изменила несколько метаболитов, связанных с биосинтезом и катаболизмом фосфолипидов и других липидов (например, цитрата в качестве предшественника синтеза жирных кислот de novo) в обеих клеточных линиях. Накопление фосфокреатина, метаболита, признанного функцией фосфагена и, следовательно, энергетического резервуара для клеток, указывает на адаптивный ответ на усиленный энергетический метаболизм в гипоксических клетках. (18) Снижение фосфохолина в гипоксии и увеличение концентраций глицерофосфохолина были связаны с уменьшением оборота фосфатидилхолина, 18,26, напротив того, что сообщалось о клеточных линиях рака предстательной железы при гипоксии. (20) Точно так же накопление мио-инозита в клетках AML в гипоксических условиях может быть связано с фосфатидилхолином оборот. Фактически, измененные требования мио-инозита, изомера глюкозы, имеющей несколько важных функций в клетках млекопитающих (например, в качестве осмолита), были связаны с модуляцией уровней фосфолипидов. 27,28. Повышенные концентрации метаболитов гексозаминового пути может быть объяснено повышением регуляции метаболизма глюкозы, влияющим на синтез гликолитических промежуточных соединений.29-31 Метаболиты в пути гексозаминов, такие как UDP-GlcNAc и UDP-GalNAc, являются важными предшественниками образования N-гликанов, и их возвышение было связано с ответом нескольких форм клеточного стресса, включая гипоксию. (31)

Относительная стабильность цикла TCA между различными состояниями оксигенации в контексте других довольно больших изменений в метаболизме интересна для рассмотрения, поскольку в других системах гипоксия имеет тенденцию к снижению регуляции цикла TCA. (32) Гемопоэтические стволовые клетки ( HSC) и клетки-предшественники способны покидать свои гипоксические ниши в костном мозге, вступать в нормоксическое периферическое кровообращение и возвращаться в костный мозг. Это происходит на очень низкой частоте, но используется в трансплантационной медицине путем мобилизации большого количества HSCs на периферию доноров с использованием стимулов цитокинов. Эти мобилизованные стволовые клетки затем, когда они вводятся реципиенту, снова возвращаются из нормального периферия в гипоксические ниши в костном мозге пациентов. Таким образом, способность переносить обмен кислородной напряженностью является неотъемлемой способностью HSC и клеток-предшественников. Эта способность разделяется взрывами AML, которые снова размножаются в костном мозге, но также накапливаются на периферии. Наши данные показывают, что, несмотря на длительную культуру в искусственных условиях, клетки KG1a и K562 сохранили эту пластичность и дают новое представление о молекулярных механизмах, которые допускают такое поведение.

Исследования культуры тканей с использованием клеточных линий широко использовались для изучения потенциальных методов лечения рака in vitro. Несмотря на многочисленные успехи, этот подход часто критикуется как недостаток, поскольку обычные условия культуры не отражают гипоксическую среду опухолевых клеток. Здесь мы рассмотрели метаболические последствия лечения индометацином на двух линиях клеток AML как при нормальных, так и, возможно, более реалистичных гипоксических условиях. PCA выполняли на наборах данных ЯМР клеточных линий AML с обработкой индометацином и без него, выращенных как в гипоксических, так и в негипоксических условиях (нагрузки и оценки, включенные в 1, панели b и c). Полученная оценка PCA (PC1 против PC2; 1, панель c) указывает на то, что разделение между обработанными индометацином и необработанными образцами (внутри каждой клеточной линии и уровнем кислорода) намного меньше, чем разделение, вызванное генетической изменчивостью между типами клеток или напряжением кислорода. Степень различий, вызванных лечением лекарств, может быть лучше подчеркнута путем выполнения СПС на каждом подмножестве данных ЯМР, ограниченном одной клеточной линией и одним условием оксигенации. Четыре контрольных графика, сравнивающие данные для набора контроля и индометацина для клеток KG1a и K562, выращенных в гипоксических и негипоксических условиях, показаны на фиг. 4. Четкое разделение наблюдается между контролем растворителя и обработанными индометацином клетками KG1a и K562, выращенными в как гипоксические, так и негипоксические состояния.

Анализ связанных графиков нагрузки PCA (данные не показаны явно), а также результаты одномерных анализов (t-тесты с коррекцией FDR со значением 5%) в сочетании с визуальной интерпретацией спектров ЯМР суммированы в биохимических путях изображенные на фиг. 5 (обработанные клетки в негипоксических условиях) и 2 (обработанные клетки при гипоксии). Можно выделить как общие, так и разрозненные изменения, вызванные лечением, между двумя линиями клеток и условиями роста. Например, глутатион, креатин и α-кетоглутарат все значительно снижаются после лечения лекарственными средствами в обеих клеточных линиях и в обоих условиях роста. Одновременно сукцинат, фумарат, холин, глицерин-3-фосфат, аланин, UDP-GlcNAc и UDP-GalNAc все значительно накапливаются в обеих клеточных линиях независимо от уровня кислорода. Однако изменения концентрации цитрата следуют противоположным тенденциям для клеток, выращенных в гипоксии или в негипоксических условиях (в гипоксических клетках цитрат значительно накапливается в препарате, обработанном против необработанных образцов, а в негипоксическом контрасте наблюдалось значительное истощение цитрата в обработанных образцах ). Аналогичным образом, изменения концентрации некоторых метаболитов, участвующих в метаболизме холина, являются общими для обеих линий клеток, но отличаются при сравнении наборов данных гипоксии и негипоксии. Фактически, клетки, обработанные индометацином в негипоксической среде, показывают накопление глицерофосфохолина и уменьшение фосфохолина, тогда как введение препарата в гипоксических условиях вызывает противоположный эффект. Некоторые из этих наблюдений, в частности для метаболитов, участвующих в цикле TCA или метаболизме холина, были количественно определены из спектров ЯМР в 1, панелях d и e.

Метаболические различия, вызванные лечением индометацином в линиях линии острого миелоидного лейкоза, выращенных в гипоксических условиях. Схематическое представление метаболических путей, показывающих наиболее важные метаболические изменения, вызванные обработкой индометацином и общие для клеточных линий KG1a и K562, выращенных в гипоксических условиях. Метаболиты в зелёном / красном имеют значительно увеличенные / уменьшенные концентрации в клеточных линиях KG1a и K562, обработанных индометацином и выращенных в гипоксической среде; метаболиты в черном обнаруживаются / идентифицируются в спектрах ЯМР, но изменяются по-разному или незначительно в двух клеточных линиях; метаболиты в сером не были обнаружены в спектрах ЯМР.

Наблюдаемое индометациновое истощение α-кетоглутарата и связанное с ним увеличение сукцинатных зеркальных наблюдений, проведенное в нашем предыдущем исследовании, где мы продемонстрировали, что объединение медроксипрогестерона ацетата (MPA) с безафибратом (Bez) в нормальных условиях культивирования приводит к образованию активных форм кислорода (ROS) . (33) Следуя более ранним наблюдениям, показывающим, что ROS непосредственно превратил α-кетоглутарат в сукцинат (34) и обработку клеток KG1a реконструированным истоком α-кетоглутарата H2O2 и накоплением сукцината, мы пришли к выводу, что ROS, генерируемый комбинированными MPA и Bez, является механизмом что вызывает нарушение цикла TCA. (14) В текущем исследовании мы поэтому измерили индукцию ROS при лечении индометацином (1, панель f). Лекарственная терапия вызывала значительное увеличение ROS в обеих клеточных линиях. Поразительно, что, несмотря на то, что клетки способны защищать цикл TCA в условиях низкой доступности кислорода, индометацин дерегулировал баланс метаболитов ТЦА как в клеточных линиях, так и в нормальных и гипоксических условиях культивирования. Более того, все наблюдаемые ответы промежуточных продуктов ТЦА (за исключением цитрата) на индометацин были совместимы в обоих условиях культивирования. Значительное истощение α-кетоглутарата и одновременное накопление сукцината и фумарата свидетельствуют о частичном усечении цикла TCA, вызванного генерацией ROS, вызванной обработкой индометацином. Индометацин-индуцированная генерация ROS также связана с наблюдением, что восстановленный глутатион истощается в клетках AML после лечения на разных уровнях кислорода. Подобные наблюдения ранее сообщали де Гроот и его коллеги. (35) Поразительное кислородзависимое поведение цитрата, по-видимому, указывает на то, что введение индометацина в сочетании с гипоксией вызывает влияние только гипоксии и указывает на накопление цитрата в цитозоля из-за затрудненного синтеза жирных кислот de novo, холестерина и изопреноидов путем превращения цитрата в ацетил-CoA. (36) Накопление пула цитрата вне цикла TCA поэтому окрашивает интерпретацию индуцированного индометацином эффекты этого промежуточного соединения с митохондриями.

Не все изменения, индуцированные индометацином, были такими же устойчивыми, как наблюдаемые в цикле ТСА. Обработка клеток в нормальных условиях культуры приводила к изменениям метаболизма холинфосфолипидов, которые в целом согласуются с предыдущими сообщениями.37,38 Однако введение индометацина в клетки под гипоксией приводило к разрозненным изменениям этих метаболитов. Подобно изменениям концентрации цитрата, эти противоположные тенденции свидетельствуют о том, что противовоспалительное действие индометацина на воспалительные пути зависит от уровня кислорода в культурной среде. В колоректальных опухолевых клетках и в клеточных линиях рака предстательной железы было показано, что HIF-1 повышает регуляцию СОХ2. (39) Таким образом, можно утверждать, что лечение лейкемией клеточными линиями с индометацином оказывает влияние на гипоксию на ферменты, регулирующие метаболизм холин-фосфолипидов.

С терапевтической точки зрения основное замечание, сделанное здесь, заключается в том, что введение индометацина значительно увеличивало окислительный стресс посредством генерации ROS в клетках лейкемии KG1a и K562, вызывая митохондриальную дисфункцию, независимо от условий оксигенации. Эти данные могут подчеркнуть особую актуальность цикла ТЦА для выживаемости раковых клеток и могут объяснить, почему некоторые антилейкемические препараты были обнаружены и успешно развиты, несмотря на использование условий культуры, которые не отражают гипоксическую среду раковых клеток in vivo. Также следует отметить, что только индометацин индуцировал ROS, наблюдение, не замеченное в нашем более раннем исследовании, с использованием менее AKR1C3-селективного ингибитора MPA. (14) Это открытие подтверждает поддержку подхода, используемого другими для разработки новых ингибиторов AKR1C3 на основе структуры of indomethacin.8-10 Наконец, поскольку различные NSAIDs ингибируют AKR1C3,11,40-43 в будущих исследованиях, следует рассмотреть вопрос о том, сообщают ли химиопревентивные действия НПВП в ряде раковых образований44-47 дерегулирование цикла TCA в предраковых клетках.

Клеточные линии KG1a и K562 AML поддерживали в экспоненциальной пролиферации в среде RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Gibco-Invitrogen) и 100 единиц мл-1 пенициллина и 100 мкг мл-1 стрептомицина ( Гибко-Invitrogen). Клетки культивировали в увлажненной камере при 37 ° С и 5% СО2 (негипоксическое состояние). Для экспериментов, выполненных в гипоксических условиях, клетки переносили в гипоксическую камеру (увлажняли при 37 ° С, 1% O2 и 5% СО2) и привыкли к этой среде в течение 24 часов до начала лечения.

Клетки (5 × 107) обрабатывали либо контрольным раствором (этанолом), либо 20 мкМ индометацином. Для каждой обработки были получены 12 повторных образцов для негипоксического роста и 6 повторных образцов для гипоксического. Через 24 ч клетки промывали PBS (Lonza Group Ltd.) и собирали центрифугированием. Осадки клеток немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С.

Извлечение полярных внутриклеточных метаболитов из клеточных гранул проводили с использованием модифицированной процедуры Блай-Дайера (48). Образцы сушили в течение ночи в центробежном вакуумном концентраторе. Высушенные полярные экстракты повторно растворяли в 90% H2O / 10% D2O (GOSS Scientific Instruments Ltd.), полученном в виде 100 мМ фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,5 мМ натрий-3- (триметилсилил) пропионат-2,2,3,3 -d4 (TMSP, Cambridge Isotope Laboratories) как внутренняя ссылка.

Для измерения 2D 1H J-RES (49) и 1D 1H NMR использовался спектрометр Bruker с частотой 500 МГц, снабженный криогенно охлаждаемым зондом. В обоих случаях водный резонанс подавлялся с помощью возбуждения. (50)

1D были получены с длительной задержкой релаксации 15 с и углом поворота 30 ° для обеспечения почти полной продольной релаксации. 1D спектры были получены со спектральной шириной 5 кГц и 256 переходных процессов.

Спектры 2D J-RES собирали с использованием последовательности двойного спинового эха с 16 переходными процессами на шаг и 32 приращения. Сильные соединительные артефакты были подавлены фазовым циклом. (51) До преобразования Фурье 2D-спектры J-RES умножались на объединенную функцию синусоидального / экспоненциального окна в прямом измерении и функцию синусоидального сигнала в приращенной размерности ( 52) Расчеты горизонтальных линий (из нефильтрованных и несимметричных 2D-спектров) рассчитывали, а затем выровняли с TMSP при 0,0 ppm. Выбранные сигналы, возникающие из остаточных растворителей и ТМСП, были исключены. Спектры были нормализованы в соответствии с вероятностным факторным методом (53) и закорочены при 0,0015 ppm. Перед проведением многомерного статистического анализа было применено преобразование обобщенного лога. (54) Многомерный статистический анализ (PCA) прогнозируемых данных ЯМР-спектроскопии J-RES проводился с использованием инструментария PLS (версия 4.1; исследование собственных векторов).

Множественные одномерные анализы (t-тесты) выполнялись во всех точках данных спектров 1H 1D ЯМР после исключения шума (в 3 раза выше уровня шума, рассчитанного по формуле (55)). Затем были получены результаты ложной скорости обнаружения (FDR), скорректированной на уровни значимости 1% или 5%.

Все наборы данных ЯМР обрабатывались с использованием NMRLab (56) в среде программирования MATLAB (The MathWorks, Inc.). ЯМР-резонансы метаболитов назначались и определяли количественно с использованием NMR Suite Chenomx (версия 5.0; Chenomx Inc.). Концентрации метаболитов сообщаются как средние значения ± стандартное отклонение. Представленная статистическая значимость основана на t-тесте.

Carboxy-H2DCFDA (Молекулярные зонды, Invitrogen) добавляли к клеткам в течение последних 30 минут 24-часового периода лечения. После инкубации клетки промывали PBS и анализировали с помощью проточной цитометрии.

#Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Эти авторы в равной степени способствовали старшим авторам.

Эта работа была поддержана грантами от Leukemia Research (LRF, U.K.) и премией Марии Кюри передачи знаний (ToK) (MOTET). Мы также благодарим Wellcome Trust за поддержку механизма HWB · NMR в Бирмингеме и Chenomx Inc. за использование своего программного обеспечения для метаболизма ЯМР. Мы признаем персонал HWB · NMR, в частности C. Ludwig, за помощь в использовании импульсных последовательностей NMR и наборов данных.

Этот материал доступен бесплатно через Интернет по адресу http://pubs.acs.org.

cb900300j_si_001.pdf

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *