Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Отрицательный выбор клеток хронической лимфоцитарной лейкемии с использованием бифункционального коктейля на основе розетки на основе розетки

Negative selection of chronic lymphocytic leukaemia cells using a bifunctional rosette-based antibody cocktail
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2254389/

Это статья открытого доступа, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (), которая допускает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа была правильно указана.

Высокая чистота образцов опухолей является необходимостью для точного генетического анализа и анализа экспрессии и обычно достигается путем положительного отбора при хронической лимфоцитарной лейкемии (ХЛЛ).

Мы адаптировали бифункциональный коктейль на основе розетки для отрицательного отбора B-клеток для выделения клеток CLL из периферической крови (PB). Образцы ПБ у пациентов с ХЛЛ были разделены на аликвоты. Одна аликвота каждого образца обогащалась центрифугированием с градиентом плотности (DGC), в то время как другая аликвота каждого образца инкубировалась с коктейлем антитела для обогащения B-клеток до DGC (RS + DGC). Чистота клеток CLL после DGC составляла в среднем 74,1% (диапазон: 15,9 — 97,4%). Используя RS + DGC, чистота составляла в среднем 93,8% (диапазон: 80,4 — 99,4%) с 23 из 29 (79%) образцов, показывающих чистоту ХЛЛ выше 90%. РНК, экстрагированная из обогащенных клеток CLL, имела надлежащее высокое качество для анализа микрочипов.

Это исследование подтверждает использование бифункционального коктейля на основе антител на основе розетки в качестве эффективного метода очистки клеток CLL от периферической крови.

Обогащение опухолевых клеток до чистоты более 90% крайне желательно для точных результатов во многих применениях, особенно для анализа экспрессии RT-PCR и микрочипов [1,2]. В В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии (ХЛЛ) такую ​​чистоту обычно достигали центрифугированием с градиентом плотности (DGC) и последующей флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS) или с помощью сортировки по магнитным ячейкам (MCS) для CD19-положительных клеток [1].

Исследования, посвященные анализу экспрессии в CLL с использованием микрочипов, сообщают медианную чистоту 88 и 90% CD19-положительных клеток с использованием DGC [3,4], хотя, вероятно, выбор был сделан для образцов с высокой степенью чистоты. В одном исследовании, использующем DGC и FACS мононуклеарных клеток, сообщалось о чистоте между 90 и 95% коэккрезирующих клеток CD5-CD19 [5]. В трех исследованиях [6-8] сообщалось о чистоте выше 97% CD19-положительных клеток после DGC и MCS. Хотя высокая степень чистоты достигается с помощью FACS и MCS, как временные, так и дорогостоящие процедуры, которые часто ограничены в отношении выхода опухолевых клеток и применимости, поскольку они требуют дорогостоящего оборудования, а время обработки зависит от объема образца. Другим потенциальным недостатком является то, что они представляют собой положительные селекционные подходы, которые могут влиять на экспрессию генов посредством активации рецепторов клеточной поверхности [1].

В нашем исследовании основное внимание уделялось адаптации метода отрицательного отбора, который мог бы обеспечить требуемую чистоту после этапа DGC, тем самым значительно сокращая время и стоимость обработки образцов и уменьшая риск изменения картины экспрессии генов.

Мы использовали бифункциональный коктейль антител для обогащения B-клеток (RosetteSep ™ (RS)), который связывает эритроциты (через гликофорин) с одной стороны и популяции белых клеток, отличные от B-клеток (через CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 и / или CD66b-антигены) с другой стороны, образуя, таким образом, плотные розетки эритроцитов, окружающих нежелательные лейкоциты, при добавлении к цельной крови. Повышенная плотность розеточных клеток приводит к их гранулированию с последующим DGC. Эта комбинация инкубации RS и последующего центрифугирования градиента плотности (RS + DGC) приводит, таким образом, к истощению нежелательных клеток и оставляет очищенные B-клетки позади, которые могут быть собраны из интерфейса [9]. Здесь мы исследуем, может ли RS + DGC также эффективно изолировать клетки CLL при высокой чистоте от периферической крови (PB).

Предварительный эксперимент был использован для оценки оптимальной концентрации RS, которая привела к лучшей чистоте. Аликвоты из трех образцов ХЛЛ обрабатывали 50, 60, 70 и 80 мкл RS / мл ПБ для контроля влияния на полученную чистоту. Эксперименты показали, что концентрация 70 мкл RS / мл PB приводит к лучшей чистоте (см. Дополнительный файл 1). Это была концентрация, используемая для последующего обогащения всех образцов ХЛЛ.

Обогащение RS + DGC проводилось менее чем за 90 минут и показало более высокую степень чистоты CD-1 / CD19-ко-экспрессирующих клеток для каждого образца по сравнению с обогащением только DGC. Анализируемые образцы ПБ пациентов с ХЛЛ показали среднюю чистоту CLL-клеток 74,1% (от 15,9 до 97,4%) после ДГК (см. Рис. 1А и дополнительные файлы 2 и 3). После обогащения RS + DGC те же образцы демонстрировали среднюю чистоту CLL-клеток 93,8% (от 80,4 до 99,4%). Средняя степень чистоты CD-1 / CD19-ко-экспрессирующих клеток повышалась с 74,1% после DGC до 93,8% после RS + DGC. Средний процент CD5-CD19 + (нормальные В-клетки), CD5-CD19- (естественные киллерные клетки и моноциты) и CD5 + CD19-клетки (Т-клетки) был снижен с 1,4, 10,1 и 14,4 до 1,0, 3,5 и 1,6% соответственно после RS + DGC (см. Дополнительный файл 3).

чистота CD5 + CD19 + клеток в том же образце после обогащения DGC или RS + DGC (A) и абсолютного выхода WBC после обогащения RS + DGC (B), нанесенного против соответствующего количества лейкоцитов.

Чистота обогащенных клеток CLL (на основе совместного экспрессии CD5 / CD19) увеличивалась с учетом количества WBC образцов (см. Рисунок 1A). Обогащение RS + DGC приводило к чистоте CLL более 90% для всех 23 из 29 образцов, которые показали количество WBC выше 20 × 106 клеток / мл PB, в то время как 6 образцов с количеством WBC от 7 до 20 × 106 клеток / мл PB показал чистоту CLL от 80 до 90% после обогащения RS + DGC. Постоянно более высокая чистота, достигаемая с RS + DGC во всех 29 образцах по сравнению с только DGC, показывает эффективность метода обогащения на основе розетки и сравнима с чистотой, достигаемой MCS и FACS, и превосходит по времени и стоимости (см. Таблицу 1) ,

Сравнение обсуждаемых четырех различных подходов к обогащению

DGC: центрифугирование градиента плотности, RS + DGC: инкубация RosetteSep до DGC, DGC + MCS: DGC и последующая сортировка магнитных ячеек, DGC + FACS: DGC и последующая флуоресцентная активированная сортировка клеток.

средняя чистота, наблюдаемая в нашем исследовании

b, о котором сообщается Haslinger et al., 2004

c чистотой, сообщенной Falt et al., 2005

d, о чем сообщал Розенвальд и др., 2004 и Wiestner et al., 2003

e Huttman et al., 2006

f чистота, сообщенная Stankovic et al., 2004

Неудивительно, что выход клеток также зависел от количества WBC (см. Рис. 1B и дополнительный файл 4). Количество собранных клеток можно регулировать путем увеличения (или уменьшения) объема крови, подлежащей обработке, и путем корректировки объема добавленного коктейля RS-антитела соответственно без какого-либо влияния на время обработки 90 минут. Это еще одно потенциальное преимущество перед FACS и MCS, где увеличение количества клеток требует увеличения времени обработки.

РНК, экстрагированная из обогащенных клеток с использованием RS + DGC, показала средний RIN 8,9 (в диапазоне от 7,7 до 9,5), что указывает на качественную РНК (см. Дополнительный файл 3), которая впоследствии дала отличные результаты при анализе микрочипов (данные не показаны).

Это исследование показывает, что отрицательный отбор с использованием бифункционального коктейля с антителом на основе розетки является эффективным методом для выделения CLL-клеток высокой чистоты, особенно в образцах со значением WBC выше 20 × 106 клеток / мл. Короткое время очистки, независимость от дорогостоящих и трудоемких процедур, таких как FACS и MCS (см. Таблицу 1), и гибкая регулировка выходов ячеек делают RS + DGC привлекательным методом очистки для широкого спектра приложений, расположенных ниже по потоку, анализ с использованием микрочипов, в которых желательна CLL чистота> 90%.

Образцы периферической крови (ПБ) пациентов с ХЛЛ были получены в рамках исследования, одобренного Комитетом по этике человеческих исследований Питера МакКаллума. Количество лейкоцитов (WBC) составляло от 7,81 до 437,08 × 106 / мл и составляло в среднем 76,1 × 106 / мл. Диагноз CLL был основан на более раннем исследовании пленки крови пациентов и иммунофенотипировании для легкой цепи иммуноглобулинов CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD22, CD19, CD20, CD22, CD23, CD38, CD45, CD56, FMC7 выражение.

Кровь от пациентов с ХЛЛ инкубировали с RosetteSep ™ (StemCell Technologies Inc., Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) (RS) в концентрации 70 мкл / мл PB в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут с осторожным ручным закручиванием каждые 5 минут , В качестве контроля аликвоту того же образца обрабатывали таким же образом, за исключением без добавления RS. После инкубации обе аликвоты крови разбавляли 4 объемами (а не 2 объемами, рекомендованными изготовителем) забуференного фосфатом солевого раствора Dulbecco (PBS), содержащего 2% фетальной бычьей сыворотки, поскольку в противном случае мы обнаружили, что образцы крови с высоким количеством лейкоцитов были недостаточно разбавленный для эффективного разделения. Затем образцы подкладывали 3 мл среды для отделения лимфоцитов (MP Biomedicals, Aurora, OH) и центрифугировали в течение 20 минут при 1200 г. Обогащенные клетки затем собирали из интерфейса и промывали один раз в 2 объемах PBS Dulbecco с 2% фетальной бычьей сывороткой центрифугированием в течение 10 минут при 200 г.

Чистоту популяции обогащенных клеток анализировали окрашиванием панелью флуоресцентно меченных антител (BD Biosciences, San Jose, CA) в трех разных пробирках. (Трубка 1: CD5-FITC, CD10-PE, CD19-PerCP и CD45-APC. Трубка 2: FMC7-FITC, CD23-PE, CD19-PerCP и CD45-APC. Трубка 3: CD22-FITC, CD38-PE, CD20-PerCP и CD45-APC). Сбор данных осуществлялся с использованием FACScalibur-цитометра (BD Biosciences) и программного обеспечения Cell Quest (BD Biosciences). Анализ необработанных данных проводился с использованием программного обеспечения Cytomics RXP (Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Диагноз CLL был подтвержден путем оценки положительности для CD5, CD19, CD23 и CD45, слабой положительности для CD20; слабая положительность или отрицательность для CD22 и FMC7 и отрицательность для CD10. После подтверждения диагноза CLL чистоту CLL оценивали путем совместной экспрессии CD5 и CD19.

РНК экстрагировали из клеток CLL, обогащенных RS + DGC, путем применения комбинации Trizol-протокола (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и набора RNeasy Micro Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Номер целостности РНК (RIN) экстрагированной РНК определяли с использованием биоанализатора 2100 (Agilent, Santa Clara, CA) в соответствии с протоколом производителя.

ХЛЛ Хроническая лимфоцитарная лейкемия

Центрифугирование градиента плотности DGC

FACS флуоресцентно-активированная сортировка клеток

Сортировка магнитной ячейки MCS

PB периферическая кровь

Фосфатно-буферный солевой раствор PBS Dulbecco

ПЦР-полимеразная цепная реакция

Номер целостности RIN RNA

RS RosetteSep ™

RS + DGC добавление коктейля для обогащения B-клеток RosetteSep до центрифугирования с градиентом плотности

RT-ПЦР обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция

WBC лейкоциты

SE адаптировала методологию, провела лабораторную работу, участвовала в экспериментальном проектировании и подготовила рукопись. DC участвовал в экспериментальной разработке и поставлял клинические образцы. DW участвовал в экспериментальной разработке и поставлял клинические образцы. PG помогал иммунофенотипированию. JFS предоставил клинические образцы. А. Д. участвовал в экспериментальном проектировании, руководил лабораторной работой и довел рукопись до ее окончательной формы. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

CD5 / CD19 иммунофенотипирование образца CLL22 (1), CLL35 (2) и CLL36 (3) после обогащения RS + DGC с использованием либо 50 мкл (A), 60 мкл (B), 70 мкл (C), либо 80 мкл (D) RosetteSep / мл цельной крови. Данные показывают, что концентрация 70 мкл цельной крови RosetteSep / ml дает максимальную чистоту CD5 + CD19 + клеток.

Нажмите здесь для файла

CD5 / CD19 иммунофенотипирование образца CLL2 после DGC (слева) и после обогащения RS + DGC (справа). На рисунке показана экспрессия поверхности CD5 / CD19 одного образца (CLL2) после DGC и пост-RS + DGC-обогащение, определяемое иммунофенотипированием. Обогащение RS + DGC приводит к значительному увеличению доли CD5 + CD19 + клеток.

Нажмите здесь для файла

White Blood Cell (WBC) подсчитывает свежие образцы периферической крови CLL и их исследование на чистоту CLL после центрифугирования градиента плотности DGC и инкубации RosetteSep до обогащения DGC (RS + DGC). Данные сортируются по возрастанию количества WBC. Показаны числа целостности РНК (RIN) для РНК, выделенной из клеток CLL после обогащения RS + DGC. На рисунке показано количество WBC всех образцов периферической крови CLL и соответствующая чистота CD5-CD19 +, CD5 + CD19 +, CD5-CD19- и CD5 + CD19-фракций после DGC и после RS + DGC. В этой таблице также показаны номера целостности РНК для РНК, экстрагированные из очищенных клеток CLL с использованием RS + DGC.

Нажмите здесь для файла

Лейкоциты (WBC) подсчитывают свежие образцы периферической крови (CL) периферической крови (CLL) CLL и урожайности и чистоты после инкубации RosetteSep до центрифугирования с градиентом плотности (RS + DGC). Данные сортируются по возрастанию количества WBC. На рисунке показано количество WBC всех образцов периферической крови CLL и соответствующий выход клеток и чистота CD5 + CD19 + фракций после DGC и после RS + DGC.

Нажмите здесь для файла

Мы благодарим Нэнси Мессино за помощь в иммунофенотипировании и Софи Галлей, Ида Кандилоро, Анжела Тан, Лассе Кристенсен, Майкл Крипуй и Челси Хьюитт за критическое чтение рукописи. Финансирование этого исследования было получено от грантов Глобального исследовательского фонда CLL до AD и JFS и Reece Australia до DW и AD. SE также признает своих академических руководителей в Университете им. Генриха Гейне, профессора Хайнца Мехлхорна и профессора доктора Кристофера Порембы.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *