Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

IN VIVO CARBON ТЕТРАХЛОРИДНО-ИНДУЦИРОВАННАЯ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНАЯ И В ВИТРО ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ГАРЦИНИИ ХОМБРОНИАНА (МОРСКОЙ МАНГОСТЕЙ)

IN VIVO CARBON TETRACHLORIDE-INDUCED HEPATOPROTECTIVE AND IN VITRO CYTOTOXIC ACTIVITIES OF GARCINIA HOMBRONIANA (SEASHORE MANGOSTEEN)
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5446463/

Garcinia hombroniana, известная как «manggis hutan» (jungle mangosteen) в Малайзии, распространяется в тропической Азии, Борнео, Таиланде, Андамане, Никобарских островах, Вьетнаме и Индии. В Малайзии его зрелая малиновая кислая фруктовая корка используется как приправа в карри и кулинарные блюда. Его корни и отвар листьев используются против кожных инфекций и после рождения ребенка. Это исследование предназначалось для оценки in vivo гепатопротекторной и in vitro цитотоксической активности экстракта коры 20% метанольного этилацетата (MEA) G. hombroniana.

При гепатопротекторной активности повреждение печени было вызвано обработкой крыс 1,0 мл четыреххлористого углерода (CCl4) / кг, а экстракт МЭА вводили в дозе 50, 250 и 500 мг / кг за 24 часа до интоксикации CCl4. Исследование цитотоксичности проводилось на MCF-7 (рак молочной железы человека), DBTRG (человеческая глиобластома), PC-3 (рак предстательной железы человека) и клеточные линии U2OS (человеческая остеосаркома). 1H, 13C-ЯМР (ядерный магнитный резонанс) и ИК (инфракрасный) спектральный анализ также проводили для экстракта MEA.

При оценке гепатопротекторной активности экстракт MEA при более высоком уровне дозы 500 мг / кг показал значительную (p <0,05) активность. В исследовании цитотоксичности экстракт MEA более токсичен по отношению к линиям клеток MCF-7 и DBTRG, что приводит к смерти клеток на 78,7 и 64,3% соответственно. Экстракт MEA в 1H, 13C-ЯМР и ИК-спектрах демонстрируют полосы, сигналы и значения J (константа связи), представляющие собой ароматические / фенольные составляющие.

Из полученных результатов можно сделать вывод о том, что экстракт MEA обладает способностью ингибировать гепатотоксичность и линии клеток рака MCF-7 и DBTRG, которые могут быть связаны с фенольными соединениями, представленными из ЯМР и ИК-спектров.

Живые клетки обладают естественной способностью извлекать избыточные свободные радикалы, которые образуются в результате естественного клеточного метаболизма и внешних факторов окружающей среды. Эти способности обусловлены наличием эндогенных ферментативных антиоксидантов, включая каталазу (CAT), супероксиддисмутазу (SOD), глутатионпероксидазу (GPX), глутатионредуктазу (GR) и неферментативные антиоксиданты, такие как восстановленный глутатион (GSH). Однако из-за подавляющего производства и внешних стрессов возникает дисбаланс между прооксидантом и антиоксидантным гомеостазом, и, следовательно, естественный процесс ингибирования свободных радикалов не является на 100% эффективным. Эти избыточные свободные радикалы приводят к перекислению липидов мембран, апоптозу клеток, некрозу, гепатотоксичности, нейродегенеративным расстройствам, сердечно-сосудистым заболеваниям, снижению иммунной системы, сахарному диабету и раку (Jothy et al., 2011).

Было доказано, что натуральные продукты являются перспективным источником биоактивных соединений при обнаружении и развитии лекарственных средств (Kingston, 2010). Например, некоторые растения, такие как Picrorhiza kurroa (Schuppan et al., 1999) и Phyllanthus niruri (Bhattacharjee & Sil, 2007), традиционно используются для лечения осложнений печени. Силимарин и силибин, наиболее эффективные гепатопротекторные и клинически используемые средства при печеночных заболеваниях были выделены из Silybum marianum (семейство Asteraceae) (Fernandes et al., 1995). Аналогично, использование натуральных продуктов в качестве цитотоксических агентов, таких как винбластин и винкристин, этопозид и тенипозид, таксаны, иринотекан и топотекан, используемые при химиотерапии рака, либо изолированы от видов растений, либо получены из природного прототипа (Cragg et al., 1994) ,

Гарциния, род семейства Guttiferae (Clusiaceae), обогащен потенциальными биоактивными соединениями, такими как пренилированные ксантоны (а- и β-мангостин), бензофеноны (гуттифероны, ксантохимол), флавоноиды и бифлавоноиды (колавирон, мореллофлавон) и тритерпены (гархмбронаны ) со значительной противовоспалительной, анти-ВИЧ, цитотоксической, гепатопротекторной, антимикробной и антихолинэстеразной активностью (Gustafson et al., 1992; Masullo et al., 2008; Mackeen et al., 2000; Rukachaisirikul et al., 2006; Zhang et al. al., 2010; Jamila et al., 2015a & b). Ранее несколько исследований, проведенных по фармакологическому воздействию химических компонентов, выделенных из видов Гарсинии, сообщили об их антигепатотоксической и цитотоксической активности. Например, сообщалось, что колавирон (смесь GB1, GB2 и колафлавонон), выделенных из семян G. kola (Kapadia et al., 1994), обладает гепатопротекторными свойствами (Nwokocha et al., 2011). Similaly, Panda et al. (2013) и Mahendran and Devi (2001) в своем исследовании на G. indica и G. Cambogia сообщили о своей антигепатотоксической активности против токсичности D-галактозамина, противотуберкулезного лекарственного средства и этанола. Однако из-за ограниченного числа гепатопротекторных агентов и легкой доступности растений растет потребность в растительных лекарственных средствах при лечении и лечении осложнений печени (Mukherjee et al., 2006).

Что касается цитотоксической активности видов Garcinia, то гуттифероны A и K, выделенные из G. Cambogia, продемонстрировали значительное цитотоксическое действие на клеточные линии рака толстой кишки HCT-11, HT-29 и SW-480 с IC50 в диапазоне от 5 до 25 мкМ (Yang et al., 2010). Кроме того, garciyunnanins A и B и тритерпеновая (3-β-гидрокси-5-глутинен-28-оновая кислота) были соответственно обнаружены активными против датчика HeLa-C3 и клеток MRC-5 в предыдущих исследованиях (Xu et al. , 2008; Elfita et al, 2009).

Garcinia hombroniana, которая распространяется в горных лесах Малайзии (Назре, 2010), дала различные классы биологически активных соединений, включая ксантоны, бензофеноны, флавоноиды, бифлавоноиды и тритерпены с антиоксидантной, антиагрегантной агрегацией, противомикробной, цитотоксической и антихолинэстеразной активностью (Klaiklay et al., 2014a, Jamila et al., 2014b, Jamila et al., 2014c; Jamila et al., 2015a; Jamila et al., 2015b; Jamila et al., 2016; Jamila et al., 2016; ). Что касается гепатопротекторного и цитотоксического эффектов сырых экстрактов G. hombroniana, то ранее не было опубликовано сообщение. Следовательно, принимая во внимание этот факт, а также гепатопротекторный и цитотоксический фон видов Гарсинии, целью настоящего исследования было оценить гепатопротекторную и цитотоксическую активность экстракта коры MEA G. hombroniana, полученную экстракцией Сокслета.

Анализируемый растительный материал (G. hombroniana) был собран из Ботанического сада Пенанг, Малайзия. Образец ваучера; PBGK12 депонирован на гербарии этого сада для дальнейшего использования.

Растворители; метанол и этилацетат аналитического класса реагентов, используемых для экстракции, были приобретены у QRёC, Малайзия. Тетрахлорметан; CCl4 (токсикант) и силимарин (эталонный гепатопротективный агент) и растворитель; ДМСО-d6 для эксперимента спектрального анализа 1H и 13C ЯМР были приобретены у Sigma-Aldrich Co., США. Силимарин (200 мг / кг) растворяли в дистиллированной воде. Сывороточные активности аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ) и щелочного фосфата (АЛП) измеряли с использованием Hitachi 902 Automatic Chemical Analyzer (Япония). Химические вещества цитотоксической активности; DBTRG (глиобластома), MCF-7 (рак молочной железы человека), линии U2OS (остеосаркома) и PC-3 (простата) были приобретены у Sigma-Aldrich (США). ИК-спектры регистрировали KBr с использованием спектрофотометра FT-IR Perkin Elmer (США) 2000. Эксперименты с 1H и 13С ЯМР проводили при комнатной температуре с использованием спектрометра Bruker Ascend 500 МГц (1 H) и 125 МГц (13 C) (Bruker Biospin, Switzerland).

Высушенную воздухом грунтовую обезжиренную кору G. hombroniana экстрагировали экстрактом Сокслета смесью полярных растворителей 20% метанола в этилацетате (1: 4). Отфильтрованный экстракт выпаривали и концентрировали, используя роторный испаритель при 40 ° С, и полученный концентрированный экстракт затем сушили путем пропускания свободного от кислорода газообразного азота. Получают блестящий коричневый высушенный 20% -ный метанольный экстракт этилацетата (MEA) и подвергают скринингу на гепатопротекторную и цитотоксическую активность.

Экспериментальные животные, включая самцов крыс Sprague-Dawley весом от 180 до 220 г во время лечения наркотиками, были получены из Ветеринарной группы животных, Universiti Putra Malaysia (UPM). Они были размещены в доме животных, факультете медицины и здравоохранения, UPM. Животные были акклиматизированы в полипропиленовых клетках, а стандартные пищевые гранулы и вода были предоставлены ad libitum. Их поддерживали в 12-часовом световом / темном цикле при 27 ± 2 ° С до начала лечения препаратами. Они заботились в соответствии с действующими принципами UPM и этическими принципами, установленными для ухода и использования лабораторных животных.

Использовался слегка модифицированный метод Zakaria et al. (2011) для анализа токсичности CCl4. Крыс случайным образом разделяли на шесть групп, каждая из которых состояла из шести крыс (n = 6). Группа I, которая служила нормальным контролем, получала только 10% ДМСО. Группа II служила отрицательным контролем, получала 10% ДМСО и была опьянен индукцией 1,0 мл CCl4 / кг массы тела, разбавленной в оливковом масле, с соотношением 1: 1 внутрибрюшинно (i.p). Группа III служила положительной контрольной группой, которую лечили 200 мг / кг силимарина с последующей индукцией токсичности с помощью CCl4. Другие три группы; IV, V и VI вводились перорально с экстрактом MEA 50, 250 и 500 мг / кг, соответственно, и токсичность в них индуцировалась CCl4. Все образцы и препараты для всех групп вводились перорально. До начала лечения всех животных подвергали голоданию в течение 48 ч при стандартных лабораторных условиях. Каждая группа получала соответствующую пероральную дозу тестового раствора в течение семи последовательных дней. После 3 часов введения раствора на седьмой день, CCl4 индуцировали, т.пл. В конце индукции в течение 48 ч крыс снова голодали и анестезировали с помощью диэтилового эфира. Для теста на гепатопротектор экстракта МЭА кровь собирали для биохимического анализа, а затем животных умерщвляли при диссекции шейки матки. Печень была удалена и предшествовала гистопатологическому исследованию.

Ущерб печени оценивали путем оценки активности сыворотки ALT, AST ALP и измеряли автоматическим химическим анализатором Hitachi 902 с использованием стандартных методов. 3 мл крови собирали путем сердечной пункции с помощью одноразового стерильного шприца и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин до сгустка. Для отделения сыворотки центрифугировали при 2500 об / мин при 30 ° С в течение 15 мин и использовали для оценки АЛП, АЛТ и АСП. Затем крыс приносили в жертву, их печень удаляли и отдельно отделяли от тела, измеряли ее вес на 100 г массы тела и фиксировали в 10% формалине для гистопатологических исследований.

Печень фиксировали в 10% формалине после вскрытия, обезвоживали в постепенном этаноле (50-100%), очищали в ксилоле и затем вставляли в парафиновый воск. Секции обрезали толщиной приблизительно 4-5 мкм и готовили для окрашивания гематоксилином и эозиновым красителем для микроскопической оценки. Патологические изменения (нормальный гепатоцит, стеатоз, коагулятивный некроз, кровоизлияние и воспаление) структуры печени оценивались по степени тяжести поражения печени с использованием модифицированного метода El-Beshbishy et al., (2010).

Анализ цитотоксичности проводили в соответствии с модифицированным методом Моссмана (1983). Вкратце, исходный раствор, содержащий 500 мкг / мл экстракта MEA, получали путем растворения 0,5 мг экстракта в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Рабочие растворы 10, 25, 50, 75 и 100 мкг / мл в трех повторностях получали из исходного раствора. Клеточные линии MCF-7 и DBTRG выращивали в среде 1650 среды Rosello Park Memorial Institute (RPMI), клетки U2OS в среде модифицированного орла Dulbecco (DMEM), тогда как PC-3 выращивали в среде Ham F12 K. Затем все клетки были добавлены 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 единиц / мл пенициллина. Их выдерживали при 37 ° С в увлажненном состоянии, 5% СО2 в воздухе и проходили 2-3 раза в неделю при легкой трипсинизации. Контрольные клетки получали только один автомобиль (<0,1%). Набор для определения цитотоксичности использовали для определения цитотоксического эффекта экстракта MEA на вышеупомянутых клеточных линиях. Количество лактатдегидрогеназы (LDH) измеряли с использованием набора для испытаний. Клетки высевали в 24-луночные планшеты при 50 000 клеток на мл, инкубировали в течение 24 ч и оставляли на ночь. Перед обнажением клеток в экстракте MEA (10, 25, 50, 75 и 100 мкг / мл) среду заменяли свежей, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки в течение 72 часов. Изменение цвета и его поглощение определяли спектрофотометрически на длинах волн 490 и 620 нм с использованием считывателя микропланшетов. Количество высвобождаемой ЛДГ рассчитывали по формуле, приведенной в протоколе изготовителя. В качестве контроля максимальной высвобождаемой активности LDH клетки обрабатывали реагентом лизиса (1% тритона X-100) в течение 10 минут, тогда как спонтанный LDH, высвобождаемый в надосадочной жидкости необработанных культур, измеряли. Были получены дополнительные бесклеточные лунки, содержащие только анализируемую среду, которые использовали в качестве заготовки. Результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Все численные данные, представленные как среднее ± SEM, анализировали с использованием одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с последующим пост-hoc-тестом Dunnett (p <0,05) с программным обеспечением SPSS, версия 19.0 (SPSS Inc., Чикаго, США).

Печень — жизненно важный орган живых организмов, выполняющий химические процессы метаболизма, секреции, детоксикации, синтеза белка, производства гормонов и производства биохимических веществ, необходимых для пищеварения (Adaramoye & Adeyemi, 2006). Четыреххлористый углерод (CCl4) при его взятии накапливается в клетках паренхимы печени, где он активируется цитохромом Р450 с образованием трихлорметильных радикалов. Эти радикалы окисляют жирные кислоты и клеточные белки для получения перекисей липидов, которые приводят к повреждению печени. Повреждение структурной целостности печени может быть оценено увеличением уровня специфичных к гепатону ферментов, таких как ALP, ALT и AST в сыворотке. Эти ферменты присутствуют в цитоплазме, которая выделяется в сыворотку после повреждения клеток (Suja et al., 2004). В настоящем исследовании антигепатотоксичность экстракта MEA оценивали по его способности уменьшать повышенные уровни ALP, ALT и AST в крови крыс, получавших дозы CCl4 (гепатотоксин). Экстракт MEA, вводимый крысам в дозе 50, 250 и 500 мг / кг. За 24 часа до интоксикации CCl4 уменьшалось повышение ферментов сыворотки, измеряемое как показатели функции печени и гепатотоксичности у крыс. Предварительное лечение (профилактическое) экстракта MEA предотвратило прогрессирование острой печеночной недостаточности CCl4. Введение CCl4 вызывало значительное увеличение уровня маркера ALP, ALT и AST в группе, предварительно обработанной 10% ДМСО по сравнению с обычной 10% DMSO-предварительно обработанной не-CCl4-индуцированной группой. Результаты влияния экстракта MEA на активность фермента печени печени у крыс-интоксицитов CCl4 приведены в таблице 1. Из результатов было установлено, что пероральное введение высокой дозы (500 мг / кг) экстракта MEA и силимарина 200 мг / кг были способны уменьшить гепатотоксические эффекты, уменьшив уровень ферментов ALP, ALT и AST в печени крыс, опьяненных CCl4.

Влияние CCl4 и защитной обработки MEA (20% метанольного этилацетата) экстракта G. hombroniana в ALT, AST и ALP (U / L)

Данные значительно различались (p <0,05) по сравнению с 10% DMSO + CCl4-обработанной группой в соответствующем столбце. Значения выражены как среднее значение ± SEM из шести повторов

Из рисунка 1а видно, что гистология печени нормальных контрольных животных демонстрирует нормальную архитектуру печеночных клеток, имеющих четко выраженную цитоплазму и синусоид, значительное ядро ​​и центральную вену. Однако секция ткани печени группы крыс, обработанных обработанной CCl4 группой 1,0 г / кг (i.p), приведенной на фиг. 1b, показала массивный коагуляционный некроз, кровоизлияние и инфильтрацию воспалительных клеток. Секция ткани печени другой группы, служащая в качестве положительного контроля, где печень была обработана 200 мг / кг силимарина с последующей индукцией CCl4, показала сохранение нормальных гепатоцитов (рис. 1в). Крысы, получавшие 50 мг / кг массы тела экстракта MEA вместе с интоксикацией CCl4, проявляли как некроз, так и воспаление (рис. 1d), тогда как у пациентов, получавших умеренную дозу 250 мг / кг массы тела экстракта MEA, наблюдалось менее выраженное повреждение и образование вакуолей, и коагуляционный некроз был меньше (рис. 1е). Кроме того, у крыс, которые получали дозу 500 мг / кг массы тела, печень оказалась нормальной, но с легким воспалением, сходной текстуры и расположения клеток, наблюдаемой для печени крыс, которые получали 200 мг / кг силимарина (Рис. 1f). Таким образом, экстракт MEA ингибировал индуцированную CCl4 гепатотоксичность у крыс при дозе, равной половине стандартного лекарственного средства; силимарин. Результаты гистопатологического скрининга тканей печени, предварительно обработанных соответствующими тестовыми растворами, приведены в таблице 2. Эти результаты свидетельствуют о поддержке биохимического анализа, который далее предположил, что экстракт MEA обладает способностью регенерировать клетки паренхимы, защищать мембрану хрупкость и снижение количества ферментов в кровоток. При гистопатологическом исследовании наличие выраженного некроза, воспаления и кровоизлияния у крыс, интоксицированных CCl4 (показанных отрицательной контрольной группой), заметно снижалось при предварительном лечении либо экстрактом MEA, либо силимарином. Эти изменения в гистологии печени соответствовали соответствующим изменениям уровня фермента, подтверждающим антигепатотоксические эффекты и ингибирование гепатоцеллюлярного некроза тестируемым экстрактом.

Гепатопротекторная активность экстракта коры MEA (20% метанола этилацетата) Garcinia hombroniana NH: нормальный гепатоцит, CN: коагулятивный некроз, I: воспаление

Гистопатологическая оценка влияния различных доз МЭА (20% метанольного этилацетата) экстракта G. hombroniana против CCl4-индуцированного поражения печени у крыс

Тяжесть различных признаков травмы печени оценивалась на основе следующей схемы подсчета: — нормальный, + умеренный эффект, ++ умеренный эффект, +++ тяжелый эффект.

Результаты теста на цитотоксичность экстракта MEA в диапазоне концентраций 10-100 мкг / мл, проведенного против клеток MCF-7, DBTRG, PC-3 и U2OS, показали, что испытуемый экстракт более токсичен по отношению к MCF-7 и DBTRG клеток, вызывающих максимальную гибель клеток с 78,7% и 64,3% через 24 ч, соответственно. Экстракт MEA показал значительную дозозависимую активность против раковых клеток MCF-7 и DBTRG, которая также изображена на рисунке 2.

Цитотоксическая активность экстракта коры MEA (20% метанола этилацетата) Garcinia hombroniana против линий клеток рака PC3 и DBTRG

Однако ингибирование больше не увеличивалось с большим количеством времени, и никакого дальнейшего увеличения до 72 часов не отмечалось. Концентрация клеток снижалась с увеличением концентрации экстракта. Ингибирование линий раковых клеток может быть связано с наличием фенольных соединений, таких как антоцианины, бензофеноны, флавоноиды и ксантоны, которые, как сообщалось ранее, являются основными составляющими видов Garcinia (Gustafson et al., 1992; Kapadia et al. , 1994, Masullo et al., 2008; Mackeen et al., 2000; Rukachaisirikul et al., 2006; Zhang et al., 2010; Jamila et al., 2015a; Jamila et al., 2015b).

Испытуемый экстракт также анализировали на 1H и 13C ЯМР и ИК-эксперименты. Спектры 1H и 13C ЯМР (фиг. 3 и 4) отображали сигналы областей, представляющих собой гликозилированные ароматические / фенольные соединения, скорее всего ксантоны, бензофеноны, флавоноиды, бифлавоноиды и их гликозиды. ИК-спектр (рис. 5) демонстрировал полосы поглощения при 3255 см-1 для O-H, 1646 см-1 для C = 0 и 1519 см-1 для растяжения C = C, что подтверждает наличие фенольных соединений с карбонильной группой. Растения, которые используются для защиты печени, содержат ряд биологически активных соединений, в частности, фенолов, таких как флавоноиды, бензофеноны, кумарины, органические кислоты и ксантоны (Kumar, 2012). Ксантоны, бензофеноны и бифлавоноиды являются важными классами соединений видов Гарсинии, которые, как сообщается, обладают антиоксидантной активностью из-за восстановительных способностей своих гидроксильных групп, пожертвование водорода свободными радикалами и, таким образом, предотвращение радикальных цепных реакций и, следовательно, осложнений возникали из этих радикалов (Riaz et al., 2011). Adaramoye и Adeyemi (2006) и Adaramoye et al. (2008) в своем исследовании G. kola обнаружили, что «колавирон», смесь трех бифлавоноидов (GB1, GB2 и колафлаванона) обладает мощными гепатопротеистическими эффектами. Из результатов ЯМР и ИК спектрального анализа экстракта МЭА G. hombroniana можно было сделать вывод, что его гепатопротекторная и цитотоксическая активность могут быть связаны с присутствующими в нем фенольными соединениями.

1 H ЯМР спектр (ДМСО-d6, 500 МГц) MEA (20% метанол-этилацетат) экстракт G. hombroniana

13C ЯМР-спектр (ДМСО-d6, 125 МГц) MEA (20% метанол-этилацетат) экстракт f G. hombroniana

ИК-спектр MEA (20% -ный метанольный этилацетат) экстракт G. hombroniana

Экстракт коры MEA G. hombroniana обеспечивает хорошую защиту от индуцированной CCl4 токсичности печени и цитотоксической активности против MCF-7 (рак молочной железы человека) и клеточных линий DBTRG (человеческая глиобластома). По результатам гепатопротекторной активности, полученной в этом исследовании, можно с уверенностью сказать, что экстракт MEA G. hombroniana с концентрацией 500 мг / кг значительно ослабляет повышенную активность ферментов крови. Кроме того, 1H и 13C ЯМР и ИК-спектры анализируемого экстракта показали характерные сигналы фенольных соединений, к которым могут быть связаны гепатопротекторная и цитотоксическая активности.

Авторы хотели бы отметить Фонд исследований, предоставленный Universiti Sains Malaysia (USM). Наргис Джамила благодарит TWAS (Академия наук третьего мира) за присуждение стипендий TWAS-USM PG.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *