Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Ключевой вклад Т-лимфоцитов (эффектор, регуляторный и контрольный контрольный точки) и цитокины (TH1, TH2 и TH17) в патологический полный ответ, индуцированный неоадъювантной химиотерапией у женщин с раком молочной железы

Crucial Contributions by T Lymphocytes (Effector, Regulatory, and Checkpoint Inhibitor) and Cytokines (TH1, TH2, and TH17) to a Pathological Complete Response Induced by Neoadjuvant Chemotherapy in Women with Breast Cancer
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5061970/

академический редактор: Y i Zhang

Микроокружение опухоли состоит из злокачественных клеток, стромы и иммунных клеток. Выдающиеся опухолевые инфильтрационные лимфоциты (TIL) при раке молочной железы связаны с хорошим прогнозом и являются предикторами патологического полного ответа (pCR) с неоадъювантной химиотерапией (NAC). Вклад различных T эффекторных / регуляторных клеток и цитокинов в гибель опухолевых клеток с помощью NAC требует дальнейшей характеристики и был исследован в этом исследовании. Опухоли молочной железы у 33 женщин с крупными и локально прогрессирующими раковыми опухолями молочной железы, подвергающимися NAC, были иммуногистохимически (внутрипузырными, стромальными), оцененными для подмножеств Т-клеток и экспрессии цитокинов с использованием меченых антител с использованием установленных полуколичественных методов. Значительные уровни TIL и CD4 +, CD8 + и CTLA-4 + (стромальные) Т-клетки и CD8 +: FOXP3 + были связаны со значительным pCR; связи с FOXP3 +, CTLA-4 + (внутримышечно) и PD-1 + Т-клеток не наблюдалось. NAC значительно уменьшал CD4 +, FOXP3 +, CTLA-4 + (стромальный) (одновременно кровь FOXP3 +, CTLA-4 + Tregs) и PD-1 + Т-клетки; не наблюдалось снижение с CD8 + и CTLA-4 + (внутрипузырными) Т-клетками. Высокие уровни опухоли FOXP3 + IL-10 и IL-17 с высоким уровнем постнатального NAC были связаны с неудачным pCR. Наше исследование еще более показало вклад T эффекторных / регуляторных клеток и цитокинов в гибель опухолевых клеток с помощью NAC.

Индукция, развитие и распространение злокачественных заболеваний у человека представляют собой сложные процессы, включающие ключевое взаимодействие между злокачественными клетками, окружающей стромой и инфильтрационными опухолями воспалительными и иммунными клетками [1-3]. В ряде человеческих твердых опухолей было зарегистрировано различное количество врожденных и адаптивных иммунных клеток в микроокружении опухоли (гнезда опухолевых клеток, перитумуральная строма). Распределение и плотность иммунных клеток варьируют между различными типами гистопатологических раков и среди видов рака того же типа. В целом, однако, они присутствуют на повышенных уровнях по сравнению с незлокачественными тканями [2, 4, 5].

Ряд исследований показал, что наличие заметного лимфоцитарного инфильтрата в опухолях связано с улучшенным прогнозом и хорошим долгосрочным клиническим исходом у пациентов с различными типами рака [2, 4-7]. Присутствие инфильтрационных опухолей лимфоцитов (TIL) было признано биомаркером противоопухолевого ответа в широком диапазоне твердых раковых образований (молочной железы, кишечника, почечной и меланомы) [2, 8]. При раке молочной железы было показано, что значительное присутствие TIL связано с увеличением частоты патологического полного ответа (pCR) в опухоли после неоадъювантной химиотерапии (NAC) [9-11]. Однако подмножества T-клеток (CD4 +, CD8 +, FOXP3 + (белок-бэк-воронка 3) и PD-1 + (запрограммированная молекула смерти 1)), проникающие в рак молочной железы, могут иметь различную патобиологическую значимость и прогностические характеристики и являются вопросом продолжения дебаты [2, 5, 12-16]. Взаимосвязь между НАС и различными подмножествами является предметом большого научного и клинического интереса. Однако он недостаточно хорошо охарактеризован и нуждается в дальнейшем исследовании для более точного определения его вклада в возможную гибель опухолевых клеток, опосредованных иммунной системой, с помощью NAC [17-20].

Ранее мы сообщали, что женщины с крупными и локально развитыми раками молочной железы (LLABC) имеют значительно повышенный уровень циркуляции T-регуляторных клеток (Tregs). % FOXP3 + Tregs коррелировали с патологическим ответом LLABC на последующий NAC. После NAC кровь Tregs (%) была значительно снижена у женщин, у которых опухоли показали хороший патологический ответ. Мы также документировали поляризованные профили Т-хелперных клеток (Th1, Th2 и Th17) в лимфоцитах крови, но они не были изменены NAC [21]. Имеются данные о том, что иммунный ответ хозяина на молекулярном и клеточном уровнях изменяется в разных анатомических отделениях и что обнаруженные в крови молекулярные и клеточные изменения могут не всегда отражать ситуацию в микроокружении опухоли [22].

Поэтому мы хотели исследовать микроокружение опухоли в LLABC и установить, был ли сопутствующий противораковый иммунный ответ, и если иммунные изменения крови, связанные с NAC, были отражены в сопоставимых изменениях в микроокружении опухоли. Мы провели иммуногистохимический анализ различных лимфоцитарных иммунных клеток и гуморальных факторов, проникающих в LLABC. Мы зафиксировали патологическое воздействие NAC на микроокружение опухоли и возможный вклад различных иммунных клеток хозяина и гуморальных факторов в иммунную опосредованную гибель опухолевых клеток и pCR для NAC, признанного суррогатного маркера полезного долгосрочного клинического ответа в груди рак [23, 24].

Изучены парафиновые участки опухолей молочной железы у 33 женщин с L (≥3 см), LABCs (T3, 4; N1, 2; M0), зарегистрированных в исследовании NAC (между 2008 и 2011 годами) [24].

Гистологическая диагностика была установлена ​​с помощью биопсий, основанных на ультразвуковых исследованиях. Чтобы свести к минимуму гетерогенность опухоли и расхождения в выборке, из каждой опухоли было получено несколько биопсий. Все опухоли до НАК имели вставку с радиопакой. После NAC проводилось проводящее удаление остаточной «опухоли» (в случае сохранения груди), если не было никаких клинических или радиологических доказательств рака. Оперативные образцы (широкое локальное удаление, мастэктомия) имели радиологическое подтверждение наличия катушки для обеспечения точной локализации и гистопатологической оценки. Репрезентативные участки ткани использовали для иммуногистохимической оценки. Все образцы до и после НАК обсуждались на междисциплинарном совещании, и был достигнут консенсус относительно вариантов патологического ответа и лечения.

Исследование NAC оценило эффект добавления капецитабина (Х) к доцетакселу (Т), которому предшествовали адриамицин и циклофосфамид (АС). Все пациенты получали либо 4 курса AC, затем 4 курса T ± X или 2 курса AC, затем 6 курсов T ± X, согласно протоколу испытания. Патологические реакции оценивали в иссеченных хирургических образцах после NAC. Установленные и ранее опубликованные критерии классификации были использованы для определения гистопатологических ответов в груди [25, 26]. Хорошие патологические ответы оценивались 5 (pCR, без остаточной инвазивной болезни) и 4 (90% -ная потеря инвазивного заболевания). Бедные патологические реакции оценивались как 3 (30-90% -ная потеря инвазивного заболевания), 2 (<30% -ная потеря инвазивного заболевания) и 1 (без потери опухолевых клеток). Уровни крови FOXP3 + и CTLA-4 + Tregs у 16 ​​из этих 33 пациентов были зарегистрированы в предыдущем исследовании нашего отделения [21]. Важной целью представленной работы было установить, было ли ранее зарегистрированное торможение крови Tregs NAC происходило одновременно в опухолях молочной железы у одних и тех же людей. Случай пациентов выбирался случайным образом на основании наличия образцов тканей и равноценности распределения между сравниваемыми группами (pCR по сравнению с non-pCR).

Иммуногистохимические (IHC) оценки подмножеств иммунных клеток и экспрессии цитокинов проводились в 4 мкм срезах ткани. Вкратце, секреты, вложенные в парафин, депарафинизировали и регидратировали с использованием ксилола и градуированного алкоголя. Цитратный буфер, pH 6,0, при 98 ° С добавляли в течение 20 минут (мин) для извлечения антигена. После последовательной блокировки секции инкубировали с первичным моноклональным антителом (MAb) против CD4 (Dako, M7310, clone 4B12), разбавлением 1: 80 в течение 30 минут при комнатной температуре (RT); MAb против CD8 (Dako, M7103, клон C8 / 144B), разведение 1: 100 в течение 30 минут при комнатной температуре; MAb против FOXP3 (Abcam, ab20034, клон 236A / E7), 20 мкг / мл в течение 30 минут при RT; MAb против CTLA-4 (Santa Cruz Bio, sc-376016, клон F-8), разведение 1: 300 в течение 30 минут при комнатной температуре; MAb против PD-1 (Abcam, ab52587, клон NAT105), разведение 1: 100 в течение 30 минут при RT; MAb против интерлейкина-1 (IL-1) (Abcam, ab8320, clone 11E5), разведение 1: 150 в течение ночи при 4 ° C; MAb против IL-2 (Abcam, ab92381, клон EPR2780), разведение 1: 500 в течение 30 минут при комнатной температуре; поликлональное Ab против IL-4 (Abcam, ab9622), 4 мкг / мл в течение 30 минут при RT; поликлональное Ab против IL-10 (Abcam, ab34843), разведение 1: 400 в течение 30 минут при комнатной температуре; поликлональный Ab против IL-17 (Abcam, ab9565), разведение 1: 100 в течение 30 минут при комнатной температуре; поликлональный Ab против интерферона-гамма (IFN-γ) (Abcam, ab9657), 4 мкг / мл в течение 30 минут при RT; MAb против трансформации фактора роста-бета 1 (TGF-β1) (Abcam, ab64715, clone 2Ar2), 12 мкг / мл в течение ночи при 4 ° C; поликлональный Ab против PD-L1 (Abcam, ab58810), 2,5 мкг / мл в течение 15 минут при RT. Полимеризационная система Novolink ™ Leica RE7280-K с полимерными конъюгатами конъюгатов конъюгатов пероксидазы хрена (HRP-) и хромоген диаминобензидина (DAB) была использована для мечения фермент-субстрат. Наконец, секции были контрастированы с гематоксилином, обезвожены и смонтированы в монтажной среде DPX. Положительные и отрицательные контрольные окраски проводили с участками миндалин, за исключением CTLA-4 (секции карциномы толстой кишки), IL-1, IL-4 и TGF-β (участки карциномы почки) и IL-10 (нормальные участки толстой кишки). Контроль отрицательного окрашивания был продемонстрирован путем пропускания первичного антитела. Положительные и отрицательные контрольные показатели выполнялись одновременно с каждым пробегом окраски IHC.

Были изучены участки цельной ткани, а не микрочипы (чтобы минимизировать смещение выборки). Для упрощения и ясности представления показаны показательные высокомощные поля (HPF) × 400. Чтобы оценить наличие и степень специфических подмножеств Т-клеток в опухолях молочной железы, среднее количество клеток, окрашенных коричневой мембраной / ядром, независимо от интенсивности, было подсчитано в 5 HPF. Положительно окрашенные клетки, контактирующие с опухолевыми клетками или внутри гнезд опухолевых клеток, были определены как «внутримышечные», тогда как положительно окрашенные клетки в интерстициальной строме, окружающие опухолевые гнезда, были определены как «стромальные». Оценка инфильтрации подмножеств в образцах после НАК проводилась на остаточные опухолевые гнезда и в случае pCR (полное исчезновение инвазивных опухолевых клеток в образце) в опухолевом ложе. Последнее характеризовалось гистологически как гиалинизированная аморфная область с отложениями гемосидерина [27, 28].

Для оценки присутствия IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TGF-β и PD-L1 использовали полуколичественную систему подсчета H, используя целые участки ткани. Показатель H рассчитывали путем умножения% положительных клеток (опухоли и иммунных) на фактор, представляющий интенсивность иммунной реактивности (1 для слабых, 2 для умеренных и 3 для сильных), давая максимальный балл 300. A оценка <50 считалась отрицательной, а оценка 50-100 считалась слабо положительной (1+). Оценка 101-200 была оценена как умеренно позитивная (2+) и оценка 201-300 как сильно положительная (3+). Отрицательные и 1+ считались низкими, тогда как 2+ и 3+ считались высокой экспрессией.

Для оценки TIL в окрашенных гематоксилином и эозине (H & E), интратумуральные лимфоциты (Itu-Ly) были зарегистрированы как% опухолевых эпителиальных гнезд, содержащих инфильтрационные лимфоциты. Стромальные лимфоциты (Str-Ly) были определены как% стромальных участков опухоли, которые содержали лимфоцитарные инфильтраты без непосредственного контакта с опухолевыми клетками. Оценки> 60% считались высокими уровнями инфильтрации, тогда как ≤60% считались низкими уровнями инфильтрации как для Иту-Ли, так и для Str-Ly. Случаи были определены как высокие TIL, когда Itu-Ly и / или Str-Ly были> 60% и как низкие TIL, если Иту-Ly и Str-Ly были ≤60%. 60-процентная точка отсечения для уровня ТИЛ соответствовала ранее опубликованным исследованиям и методологическим рекомендациям международной рабочей группы ТИЛ 2014 [9, 29, 30]. Все разделы были оценены без знания клинических и патологических параметров пациентов.

Образцы крови собирали до и после завершения NAC. Моноядерные клетки крови (BMC) собирали на Ficoll-Hypaque, промывали и составляли в RPMI с 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS) (Sigma, UK) и антибиотиками и хранили при -80 ° C для дальнейшего анализа. Анализы цельной крови были использованы для документирования абсолютных чисел (AbNs). Анализ проточной цитометрии (Beckman Coulter, FC500) проводили с помощью панели MAbs. FOXP3 + Tregs окрашивали для маркеров клеточной поверхности в течение 30 минут с 2,5 мкл фикоэритринового техасского красного конъюгата (ECD-) анти-человеческого CD4, 5 мкл фикоэритрин-анти-человеческого CD25, 5 мкл аллоцикоцианина-анти-человеческого CD127; CTLA-4 + Tregs окрашивали для внутриклеточного CD152. Маркеры клеточной поверхности для CD4 и CD25 определяли окрашиванием в течение 30 минут 2,5 мкл CDCD с анти-человеческим CD4 и 5 мкл флуоресцеина изотиоцианата (FITC) против человеческого CD25. Затем клетки промывали RPMI и 2% FCS; 2% формальдегида использовали для фиксации BMC в течение 10 минут при комнатной температуре. BMC затем промывали один раз в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), содержащем 2% FCS, и дважды в PBS / 0,5% Твин с 0,05% азидом и 3% FCS. В соответствующие пробирки добавляли 2,5 мкл FITC анти-человеческого FOXP3 (внутриклеточный) и 5 ​​мкл PE-анти-человеческого CTLA-4 (внутриклеточный CD152) и инкубировали в течение 2 часов при 4 ° C. Осадок BMC затем дважды промывали в PBS / 0,5% Tween, 0,05% азида и 3% FCS. BMC ресуспендировали в 400 мкл 0,5% фиксирующего раствора параформальдегида для анализа ФК. Целую кровь использовали для определения абсолютного числа клеток. CD4 + CD25 + Tregs были охарактеризованы с использованием 2,5 мкл ECD-анти-человеческого CD4 и 5 мкл PE-анти-человеческого CD25. CTLA-4 + Tregs были охарактеризованы с использованием 2,5 мкл ECD-анти-человеческого CD4, 5 мкл FITC-анти-человеческого CD25 и 5 мкл PE-анти-человеческого CD152 (внутриклеточный CTLA-4). При добавлении MAbs к цельной крови в течение 5 секунд применяли нежный вихрь, а трубки FACs оставляли в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавляли 500 мкл раствора optilyse C (Beckman Coulter) для индуцирования полного лизиса красных кровяных телец, встряхивали и оставляли в течение еще 15 минут при комнатной температуре в темноте. 500 мкл PBS добавляли в пробирки FACS для прекращения реакции лизиса между optilyse C и цельной кровью. Смесь всей крови встряхивали при комнатной температуре. Перед анализом на проточном цитометре добавляли 100 мкл гранулы счетчика-флюоросферы (Beckman Coulter).

Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения IBM SPSS, версия 21 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Если данные не соответствовали нормальному распределению, непараметрические тесты (тест Манна-Уитни U (между двумя переменными / группами) и критерий Крускала-Уоллиса (среди трех или более переменных / групп)) были использованы для сравнения групп на основе патологических ответов и клинико-патологические параметры. Тест Pearson Chi-Square проводился для сравнения биномиальных данных (отрицательный / низкий по сравнению с высоким) по экспрессии цитокинов между группами. Для оценки и сопоставления данных, относящихся к выборке, между группами до NAC и пост-НАК, были проведены сравнительные тесты с образцами раннего теста Wilcoxon и соответствующие образцы McNemar для сравнения количества клеток и экспрессии цитокинов / PD- L1, соответственно. Корреляции между TIL и подмножествами T-клеток (непрерывные данные) и оценка (1-5) патологических ответов (порядковые данные) проводились с использованием коэффициента корреляции Спирмена (rho). Был проведен одномерный и многомерный (логистический регрессионный) анализ для определения прогнозирующих факторов для pCR с NAC. Значение вероятности (значение p) равное или меньшее 0,05 (2-хвостовое) считалось статистически значимым. Основываясь на нашем предыдущем исследовании с результатами Treg и использовании программного обеспечения для анализа N Query Advisor 6.0, мы установили, что минимальное число пациентов (n = 7) в группе образцов, относящихся к группам патологического ответа, было подходящим [21].

Высокие уровни TIL были связаны со значительным pCR (ответ 5-го класса: без остаточного инвазивного заболевания при раке молочной железы) после 8 циклов NAC. Это было замечено как внутриутробными (p = 0,001), так и стромальными (p <0,001) TIL и в преобладающих лимфоцитах молочных железах (LPBC) (p <0,001), независимо от микроокружения опухоли (таблица 1) (рисунок 1).

Существовала значительная положительная корреляция между интратумуральными и стромальными TIL до-NAC (rho = 0,592, p = 0,016). Существовала также значительная положительная корреляция между внутриутробными и стромальными TIL после НАК (rho = 0,693, p = 0,004). Однако не было обнаружено существенной разницы между уровнями pre-NAC и TIL после NAC (см. Дополнительный файл 1 в дополнительном материале, доступный в Интернете по адресу: http://dx.doi.org/10.1155/2016/4757405).

Таблица 2 показывает, что высокий уровень интратумуральных (опухолевых клеток) инфильтрации CD4 + и CD8 + T-клетками ассоциировался со значительным pCR в раке молочной железы (p = 0,023 и p = 0,008, соответственно). Инфильтрация FOXP3 +, CTLA-4 + и PD-1 + T-клетками (гораздо более низкий уровень инфильтрации) не ассоциировалась с pCR впоследствии в LLABC после NAC.

Заметный уровень стромальной инфильтрации CD4 + и CD8 + T-клетками также был связан с pCR после NAC (p = 0,001 и p = 0,002, соответственно). Стромальная инфильтрация CTLA-4 + T-клетками также была связана с pCR (p = 0,041), но инфильтрация FOXP3 + и PD-1 + T-клеток не была (табл. 2) (рис. 2, 3 и 4).

В таблице 3 показана значительная связь между прорастающим опухолью CD8 +: FOXP3 + Т-клеточным соотношением и патологическим ответом. Хорошая патологическая реакция (5 и 4 классы) наблюдалась с интрамумуральными (p = 0,027) и стромальными (p = 0,027) коэффициентами инфильтрации. Аналогичные и более выраженные отношения наблюдались с внутрипузырными (7,40 против 1,48, p = 0,002) и стромальными (5,37 против 1,67, p = 0,001) pCRs (таблица 3). Таким образом, одновременный высокий уровень CD8 + и низкий уровень FOXP3 + Т-клеток являются важным фактором, предрасполагающим к pCR с NAC в LLABC.

В таблице 4 показаны значительные корреляции между инфильтрационными опухолями (внутриутробными, стромальными) лимфоцитами (TILs: rho = 0,601, p <0,001 и rho = 0,641, p <0,001; CD4 + Т-клетки (строма): rho = 0,468, p = 0,006, CD8 + Т-клетки: rho = 0,446, p = 0,009 и rho = 0,471, p = 0,006) и степень патологического ответа (степень 1 (отсутствие патологического ответа) до 5 класса (pCR)) при раке молочной железы после 8 циклов NAC. Инфильтрация внутригрудных CD4 + T-клеток не достигла статистической значимости (p = 0,073) (таблица 4). Также была значительная корреляция между отношениями CD8 +: FOXP3 + T-клеток внутримышечно (rho = 0,511, p = 0,002) и стромально (rho = 0,484, p = 0,004) и степень ответа, вызванная LLABC с NAC (таблица 4).

Различные подмножества лимфоцитов (CD4 +, CD8 +, FOXP3 +, CTLA-4 + и PD-1 + Т-клетки) были документированы инфильтрированием LLABC (таблица 5). Наиболее заметная инфильтрация была CD4 + и CD8 + Т-клетками, причем для CD4 + Т-клеток наблюдалось трехкратное увеличение, а двукратное увеличение для CD8 + Т-клеток в перитумуральной строме по сравнению с гнездом внутрипузырных (гнезд опухолевых клеток) (45,6 [6,8-242,0] против 15,4 [2,6-171,0] и 43,6 [1,8-201,6] против 20,2 [3,4-202,4]) соответственно (таблица 5) (рисунок 2). Наблюдалась меньшая, но все же заметная инфильтрация FOXP3 + Т-клетками, сравнимая в обоих отделениях (15,9 [2,2-110,6] против 14,8 [12,4-96,8]). CTLA-4 + Т-клетки, с другой стороны, присутствовали в низких количествах как в стромальном, так и в внутриутробном отделениях (таблица 5) (рисунок 3). Точно так же инфильтрация PD-1 + Т-клетками была низкой, хотя был широкий диапазон значений как внутри, так и в перитумуральных компартментах (таблица 5) (рисунок 4).

Восемь циклов NAC вызывали существенное и значительное снижение количества подмножеств T лимфоцитов. Существовало значительное снижение как внутрипузырной (p = 0,010), так и стромальной (p = 0,006) CD4 + Т-клеток. Однако не наблюдалось существенного снижения интратумуральной (p = 0,278) или стромальной (p = 0,326) инфильтрации CD8 + Т-клеток после NAC, хотя было некоторое снижение уровня инфильтрации в обоих отделениях (таблица 5). После 8 циклов NAC наблюдалось значительное снижение как внутрипузырной (p = 0,001), так и стромальной (p = 0,001) FOXP3 + Т-клеток. Существовало также значительное снижение стромальных (р = 0,029) CTLA-4 + Т-клеток. Хотя внутриутробные CTLA-4 + T-клетки также были снижены, это просто не достигло статистической значимости (p = 0,060) (таблица 5). NAC значительно уменьшал внутрипузырные и стромальные PD-1 + Т-клетки (p = 0,005 и p = 0,016, соответственно) (таблица 5). Таким образом, 8 циклов NAC значительно уменьшали все вышеуказанные подмножества T-лимфоцитов, кроме CD8 + T-клеток, проникающих в LLABC.

Существовало значительное снижение уровня FOXP3 + Т-клеток в крови (% [p = 0,001], абсолютные числа (AbNs) [p = 0,001]) и рак молочной железы (внутриутробный [p = 0,001], стромальный [p = 0,001]), следующий 8 циклов NAC в той же когорте из 16 пациентов (таблица 6). Существовало также значительное снижение CTLA-4 + Т-клеток в крови (% [p = 0,017], AbNs [p = 0,001]) и рака молочной железы (стромальный [p = 0,029]) после 8 циклов NAC в том же когорта из 16 пациентов. Интратумуральная инфильтрация просто не достигла статистической значимости (р = 0,060) (таблица 6). Уменьшение опухоли было по меньшей мере в 10 раз для FOXP3 + и 4-кратного для CTLA-4 +. Это было более выражено, чем сокращение, наблюдаемое в крови (в 2 раза для FOXP3 + и CTLA-4 +%).

Результаты исследования крови FOXP3 + и CTLA-4 + T-клеток были получены из гораздо более обширной когорты пациентов и были опубликованы нами ранее [21].

Наблюдалась положительная корреляция между пост-НАК% крови FOXP3 + Т-клеток и внутриклеточных FOXP3 + Т-клеток после NAC (rho = 0,687, p = 0,003). Существовала также незначительная тенденция к корреляции между предраковыми абсорбентами крови и внутриклеточными FOXP3 + T-клетками после NAC (rho = 0,470, p = 0,066). Не было обнаружено корреляций для CTLA-4 + T-клеток (см. Дополнительные файлы 2 и 3).

При диагнозе и до НАК не наблюдалось существенных различий в уровнях циркулирующих (%, AbNs) и инфильтрационных опухолей Т-клеток (FOXP3 +, CTLA-4 +) и последующих различных группах ответа NAC (хороший патологический ответ по сравнению с плохим патологическим ответ и pCR по сравнению с не-pCR) (см. Дополнительный файл 4).

Однако после NAC было обнаружено значительно более высокое содержание в крови FOXP3 + Т-клеток и значительно более высокие уровни внутриутробных (гнезд опухолевых клеток) FOXP3 + Т-клеток у женщин, у которых опухоли имели плохой патологический ответ на 8 циклов NAC (p = 0,001 и p = 0,016 или, соответственно, не продемонстрировали pCR (p = 0,007 и p <0,001, соответственно) (таблица 7). В случае CTLA-4 + Т-клеток более высокие уровни AbN в крови были значительно связаны с плохим патологическим ответом на 8 циклов NAC (p = 0,008) (таблица 7).

В таблице 8 представлена ​​экспрессия различных цитокинов в микроокружении опухоли у женщин с LLABC, до и после 8 циклов NAC. Не было достоверной связи с pCR после NAC и экспрессии in situ цитокинов Th1 (IL-2, IFN-γ) (фиг. 5). Однако была отмечена значительная связь с неудавшимся pCR после NAC и экспрессией in situ иммуносупрессивного Th2-цитокина IL-10 (p = 0,039) (рис. 6). Экспрессия in situ IL-17 цитокина Th17 также была значительно связана с плохим патологическим ответом и отсутствием достижения pCR (p = 0,013) (таблица 8) (рисунок 7). Существовала незначительная связь между экспрессией in situ иммуносупрессивного цитокина TGF-β и pCR при раке молочной железы после NAC (p = 0,062) (рис. 7).

NAC не оказывал существенного влияния на экспрессию in situ тиокинов Th1 (IL-2, IFN-γ), Th2 (IL-10) и Th17 (IL-17) в микроокружении опухоли. Однако экспрессия Th2 цитокина IL-4 была значительно изменена после NAC (p = 0,016) (см. Дополнительный файл 5). Был высокий уровень экспрессии IL-4 (87,5% (14 из 16)) в образцах до NAC. После NAC 43,8% (7 из 16) образцов опухолей показали изменение уровня экспрессии IL-4. 50% (7 из 14) образцов опухоли, демонстрирующих высокий уровень экспрессии до НАК, были изменены до низкого / отрицательного уровня экспрессии IL-4 после NAC. Ни один из изученных случаев (0%) не изменился до высокого уровня экспрессии. Незначительное снижение экспрессии IL-2 in situ наблюдалось также после NAC, которое снижалось с 11 из 16 (68,8%) в образцах до NAC до 5 из 16 (31,3%) в образцах после НАК (p = 0,070 ).

В таблице 9 приведены клинические признаки, схемы NAC и характеристики опухоли у пациентов, которых изучали. Существовала значительная ассоциация подмножеств T лимфоцитов (CD4 +, CD8 + и FOXP3 +) с уровнем опухоли: инфильтрация CD4 + и CD8 + Т-клетками, внутриутробная (p = 0,026 и p = 0,038, соответственно) и стромальная (p = 0,004 и p = 0,032, соответственно) и стромальной инфильтрации с помощью FOXP3 + T-клеток (p = 0,018). Высокие уровни инфильтрации опухоли этими тремя подмножествами Т-клеток были в значительной степени связаны с опухолями высокой степени (3). Не было очевидной связи с другими патологическими и клиническими параметрами у небольшого пациента (n = 33) образца.

Однофакторный анализ показал следующие предиктивные факторы для pCR: TIL (p = 0,001), уровень опухоли (p = 0,005) и статус рецептора эстрогена (ER) (p = 0,049) (таблица 10). Многомерный анализ показал, однако, что TIL были единственным независимым предиктором pCR у 33 пациентов, изученных с LLABC, которые подвергаются NAC (таблица 10).

Было показано, что наличие высокого уровня TIL в различных раковых опухолях человека, включая рак молочной железы, является надежным прогностическим показателем и связано с улучшением клинического исхода [4, 6-8, 31, 32]. Однако исследования специфических подмножеств Т-клеток дали различные результаты в разных типах опухолей [2].

Связь TIL и различных подмножеств лимфоцитов у пациентов с раком молочной железы, перенесших НАК и способствующих смерти опухолевых клеток, вызвала клинический и научный интерес. Demaria et al. (2001) впервые показали, что после NAC с паклитакселом наличие TIL после лечения коррелировало с патологическим ответом, вызванным раком молочной железы, до NAC [33]. Несколько исследований впоследствии показали, что TIL являются важными предикторами патологического ответа, в частности pCR [9, 11, 34]. Фактически, Denkert et al. (2010) показали, что TIL являются независимым предиктором для pCR у женщин, проходящих NAC [9]. Наше исследование с гораздо меньшей группой пациентов также показало, что высокий уровень TIL является независимым прогностическим фактором (многомерный анализ) для pCR, признанного суррогатного маркера хорошего результата при раке молочной железы после NAC [23, 24]. West et al. (2011) сообщили, что наличие TIL при раке молочной железы является хорошим предиктором pCR у пациентов с опухолями ER -ve, которые получили схему NAC, основанную на антрациклине [35]. Ono et al. (2012) продемонстрировали, что ТИЛ коррелируют с ответом на НАК (антрациклин-таксановый) при тройном раке молочной железы [34]. Dieci et al. (2014) также продемонстрировали, что высокий уровень TIL (стромальный и внутриутробный) в остаточной опухоли молочной железы после NAC при трехкратном раке значительно ассоциировался с лучшей безрецидивной выживаемостью (DFS) и общей выживаемостью (OS) [29]. Lee et al. (2013) показали, что TILs ассоциируются с лучшим прогнозом в подмышечных лимфатических узлах (ALN) + ve, ER -ve и HER2 -ve подтипах после NAC (антрациклин-таксан) [36]. В нашем исследовании режим НАК состоял из циклофосфамида, антрациклинового доксорубицина и таксанового доцетаксела — капецитабина. Однако шестьдесят семь процентов исследуемых опухолей были ER + ve, а только 9% были трипл-ан [24]. Мы показали значительную корреляцию между высокими уровнями TIL (внутриутробным, стромальным) и последующим патологическим уровнем ответа (5-1) в LLABC после 8 циклов NAC, о чем ранее не сообщалось.

Хотя влияние TIL на рак молочной железы, с или без NAC, было зарегистрировано в большой когорте пациентов, вклад различных подмножеств TIL недостаточно изучен, а данные для нескольких подмножеств плохо документированы. Существует малочисленность опубликованных данных о CD4 + Т-клетках, проникающих в опухоли молочной железы. Droesser et al. (2012) обнаружили, что они не являются прогностическим показателем [37]. Heys et al. (2012) сообщили о низком уровне CD4 + Т-клеток, чтобы быть значительно связанными с лучшим ответом на NAC [38].

В ряде человеческих твердых раков (колоректальная, яичниковая, пищеводная, легкая, молочная и поджелудочная железа) наличие высоких уровней инфильтрационных опухолей CD8 + T-клеток (и CD45RO + памяти Т-клеток) было связано с благоприятным прогнозом [1,4] ]. Mahmoud et al. (2011) документировали CD8 + Т-клетки в гнездах опухолевых клеток и строме. Высокие количества лимфоцитов CD8 + были независимо связаны с более длительной выживаемостью, связанной с раком молочной железы [15]. Matkowski et al. (2009), однако, показали, что высокий уровень CD8 + Т-клеток в опухолях молочной железы был связан с высоким уровнем опухоли, отрицательной реакцией ER, экспрессией HER2, метастатическим распространением в ALN и плохим прогнозом [39]. В небольшом числе исследований было зафиксировано релевантность опухолепроникающих CD8 + Т-клеток с NAC. В двух исследованиях было обнаружено, что высокий уровень CD8 + Т-клеток при раке молочной железы связан с pCR после NAC [27]. В HER2, сверхэкспрессирующем рак молочной железы, высокое отношение CD8 +: FOXP3 + T-клеток было связано с pCR и улучшенной DFS и OS [40].

Наше исследование продемонстрировало инфильтрацию как с CD4 +, так и с CD8 + Т-клетками с преобладанием в перитумуральной строме по сравнению с гнездами опухолевых клеток. Этот профиль и компартментализация эффекторных Т-клеток при раке молочной железы плохо описаны в литературе. Degnim et al. (2014) задокументировал картину инфильтрации CD4 + и CD8 + Т-клетками в нормальных грудных дольках человека [41]. CD4 + Т-клетки были сопоставимы (медианный, межквартильный диапазон) с внутриутробными уровнями, зарегистрированными у наших пациентов. CD8 + Т-клетки, однако, были более выраженными и в 2,5 раза выше, чем внутриутробные уровни, зафиксированные у наших пациентов. Таким образом, при раке молочной железы происходит снижение нормального соотношения CD8 +: CD4 + Т-клеток из-за более низких уровней инфильтрации CD8 + Т-клеток. После NAC наблюдалось значительное снижение как внутрипузырной, так и стромальной CD4 + Т-клеток, но не CD8 + Т-клеток, хотя было некоторое снижение уровня CD8 + Т-клеток.

В нашем исследовании высокие уровни CD4 + и CD8 + Т-клеток, внутрижелудочно и стромально, в LLABC были связаны с последующим pCR после NAC. Эти данные согласуются с недавно опубликованными данными [27, 42-44]. Мы также установили, что высокое отношение CD8 +: FOXP3 + Т-клеток в LLABC до NAC было связано с последующим pCR. Ladoire et al. (2011) задокументировали подобные результаты в сверхэкспрессирующем раке молочной железы HER2. Большинство опухолей в нашем исследовании, однако (как и в случае рака молочной железы вообще), были HER2 -ve. Наше исследование также продемонстрировало значительную корреляцию между инфильтрационными опухолями CD4 + и CD8 + Т-клетками, CD8 +: FOXP3 + Т-клеточным соотношением и патологическим признаком ответа (5-1), вызванным NAC. Насколько нам известно, такие результаты ранее не публиковались. Кроме того, недавно мы зафиксировали значительную корреляцию между высокими уровнями стромальной инфильтрации клетками естественного киллера (NK) и патологическим уровнем ответа в LLABC [20]. Таким образом, наши результаты показывают, что различные адаптивные и врожденные подмножества лимфоцитов, по-видимому, играют важную роль в содействии эффективному противораковым реакциям, связанным с НАК, у женщин с LLABC. Функциональные анализы должны выполняться на изолированных подмножествах Т-клеток, чтобы более точно определить эти роли.

CD4 + Т-клетки включают различные Th-клеточные подмножества (Th1, Th2 и Th17), секретирующие широкий спектр про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИФН-И, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10 и IL-17), а также природные и индуцируемые CD4 + CD25 + FOXP3 + Tregs. Эти подмножества показывают степень пластичности (клетки Th17, секретирующие Th1 цитокин IFN-Υ, трансформацию Tregs в подтипы Th1 и Th17) [45]. Этот сложный профиль затрудняет точное определение вклада каждого подмножества или комбинации подмножеств CD4 + Th клеток в pCR с NAC. Отсутствие связи с pCR из FOXP3 + T-клеток (предполагаемые Tregs) указывает на важную роль подмножеств Th. CD8 + Т-клетки также состоят из разных подмножеств, а именно наивных, памяти и активированных CD8 + цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). CD8 + T-супрессорные клетки, лишенные экспрессии CD28, но экспрессирующие CD122 и FOXP3, также описаны. Это сильно ограниченное и слабое подмножество клеток-супрессоров [46].

Интерес был сфокусирован на возможном вкладе FOXP3 + TIL в прогноз и патологические реакции при раке молочной железы, вызванном NAC, и является предметом продолжающихся дебатов [13, 28, 40, 47]. Bates et al. (2006) изучали нормальную ткань молочной железы (уменьшение маммопластики) и обнаружили очень низкие уровни инфильтрации с помощью FOXP3 + Т-клеток [48]. Высокие уровни FOXP3 + Т-клеток в опухолях молочной железы были зарегистрированы как в карциноме протоков in situ (DCIS), так и на гораздо более высоких уровнях в инвазивном раке молочной железы [14, 48, 49]. Наше исследование показало 45-кратный более высокий уровень FOXP3 + Т-клеток в образцах LLABC (средний, межквартильный диапазон) по сравнению с нормальной грудной клеткой [48]. Было обнаружено, что высокий уровень Т-клеток FOXP3 + значительно увеличивается при раке молочной железы HER2 + ve [13, 50]. В нашем исследовании FOXP3 + T-клетки также были видны при раке HER2 -ve (основной фенотип при раке молочной железы).

Tregs (FOXP3 +) играют важную роль в борьбе с аутоиммунностью, поддержании толерантности к трансплантации и подавлении противораковых иммунных реакций. FOXP3 является транскрипционным фактором, необходимым для генерации CD4 + CD25 + Tregs и является ключевым маркером для идентификации таких клеток. Треги в периферических тканях представляют собой смесь естественных и индуцированных FOXP3 + Tregs. Индуцированные FOXP3 + Tregs имеют более гетерогенный фенотип (некоторые клетки не имеют CD25) и индуцируются TGF-β и IL-10 [51]. В изученных срезах ткани рака молочной железы была обнаружена in situ экспрессия IL-10 и TGF-β и, следовательно, вероятное присутствие индуцированных FOXP3 + Treg. Однако было невозможно провести различие между двумя типами Treg. С другой стороны, они способствуют ингибированию иммунных реакций. Вклад CD8 + FOXP3 + Tregs, вероятно, будет минимальным, поскольку они представляют собой небольшое подмножество со слабой иммунной подавляющей активностью [46].

Треги генерируются на ранней стадии адаптивного иммунного ответа, а ИЛ-2 играет центральную роль в их развитии и выживании. Они подавляют функцию широкого спектра иммунных клеток (CD4 + и CD8 + Т-клеток, NK-клеток и NK-клеток и дендритных клеток (DCs)) [52, 53]. Поскольку значительное количество человеческих CD4 + Т-клеток временно экспрессирует FOXP3 + во время активации, но не обязательно приобретает регулятивную функцию, была высказана осторожность в отношении ее уникальности как маркера для Tregs [51].

Повышенные уровни FOXP3 + Tregs были зарегистрированы в крови, лимфатических узлах и проникают в различные опухоли человека [2, 14, 21, 54-56]. Было показано, что во многих случаях высокий уровень инфильтрации FOXP3 + T-клеток связан с неблагоприятным клиническим исходом [2, 14, 48]. При некоторых раках (колоректальный, яичниковый, мочевой пузырь, голова и шея) было обнаружено, что высокий уровень инфильтрационных опухолей FOXP3 + T-клеток связан с улучшенным прогнозом [2, 57]. Bates et al. (2006) сообщили, что присутствие FOXP3 + Т-клеток выявило пациентов с раком молочной железы с высоким риском рецидива [48]. Gobert et al. (2009) обнаружили, что регуляторные Т-клетки избирательно активируются в лимфоидных инфильтратах при раке молочной железы, что приводит к плохим прогнозам [58]. Demir et al. (2013) заявили, что intratumoural FOXP3 + Т-клетки являются прогностическими факторами в LLABC [28]. Mahmoud et al. (2011), однако, не продемонстрировали никакой связи с клиническим исходом с опухолепроникающими FOXP3 + Tregs при раке молочной железы [16]. Как это ни парадоксально, высокий уровень FOXP3 + Tregs в ER -ve рака груди (менее распространенный тип рака молочной железы) был связан с хорошим клиническим исходом [59].

Oda et al. (2012) подтвердили, что высокие уровни опухолевых FOX3 + Т-клеток до NAC были связаны с высокими показателями pCR [27]. В когорте пациентов с раком HER2 + ve была лучшая ОС и DFS, если сами раковые клетки рака экспрессировали FOXP3 +, возможно, действуя как ген супрессора опухоли [60]. В нашем исследовании большинство образцов молочной железы были HER2 -ve, и только в одном образце был FOXP3 +, экспрессированный в клетках рака молочной железы. Lui et al. (2012) сообщили, что снижение стромальных FOXP3 + Tregs после NAC было связано с pCR, тогда как внутриутробное снижение после NAC было независимым прогностическим предиктором ОС [47]. Высокие уровни инфильтрации FOXP3 + Treg после NAC, однако, коррелировали с повышенными скоростями pCR в другом исследовании [28]. Наши результаты согласуются с опубликованными результатами, касающимися профилей CD8 +: FOXP3 + Т-клеток и пост-NAC-снижением FOXP3 + T-клеток и pCR (суррогатный маркер улучшенной выживаемости). Наши результаты, однако, не согласуются с данными, сообщающими о положительном ответе на НАС с высоким уровнем проникновения клеток FOXP3 + до и после NAC. Причины этого несоответствия не ясны.

CTLA-4 (CD152) представляет собой молекулу коингибиторного рецептора, экспрессируемую на активированных Т-клетках и Tregs, которая отрицательно регулирует взаимодействие Т-клеток с сайтами связывания B7-1 (CD80) / B7-2 (CD86), конкурирующие с CD28, который активирует активацию Т-клеток [ 61, 62]. Существует мало выражений в неактивных или наивных Tregs [63, 64]. CTLA-4 ингибирует взаимодействие рецепторов CD28 на CD4 + и CD8 + Т-клетках с CD80 / 86 лигандами на DC и уменьшает продукцию IL-2, экспрессию рецептора IL-2 и прогрессирование клеточного цикла активированных Т-лимфоцитов, что приводит к ингибированию активированных DC и генерации CD4 + Th подмножеств и CD8 + CTL [65, 66]. Таким образом, CTLA-4 является важным ингибитором иммунной контрольной точки как эффекторных клеток CD4 +, так и CD8 + T, предотвращающих неадекватную и длительную активацию Т-клеток и повреждение ткани. При раке молочной железы наблюдается повышенная экспрессия CTLA-4 по сравнению с нормальной грудной клеткой [66]. Показано, что увеличение уровня мРНК CTLA-4 связано с метастазами ALN и более поздней стадией опухоли [66, 67]. Ранее мы продемонстрировали высокий уровень клеток CTLA-4 + в крови женщин с LLABC [21]. В нашем текущем исследовании был широкий диапазон уровней CTLA-4 + клеток, проникающих в LLABC, но в целом уровни были низкими.

Мы продемонстрировали значительное снижение содержания FOXP3 + (внутрипузырной, стромальной) и CTLA-4 + T-клеток (стромальных) в опухолях после 8 циклов NAC. Результаты FOXP3 согласуются с опубликованными данными [28, 44, 47]. Выводы CTLA-4 + T-клеток ранее не сообщались. Мы также показали одновременное значительное снижение Tregs (FOXP3 +, CTLA-4 +) в крови той же когорты пациентов [21]. Более того, была положительная корреляция между пост-НАК% крови FOXP3 + Tregs и внутриутробной инфильтрацией после NAC с помощью FOXP3 + T-клеток. Таким образом, значительное снижение уровней циркуляции Treg у женщин с LLABCs, подвергающихся NAC, было связано с существенным и значительным сопутствующим снижением Т-клеток FOXP3 + и CTLA-4 +, проникающих в опухоли молочной железы. После NAC было обнаружено значительно более высокое% крови FOXP3 + Tregs и значительно более высокий уровень внутриутробных (гнезд опухолевых клеток) FOXP3 + Т-клеток у пациентов, у которых опухоли имели плохой патологический ответ и не смогли продемонстрировать pCR. Насколько нам известно, эти данные не были опубликованы ранее. Наши результаты подчеркивают важность регуляторных механизмов супрессора в окружающей среде кровообращения и опухоли при индуцировании иммунной опосредованной смерти опухолевых клеток с помощью NAC.

PD-1 (CD279) представляет собой трансмембранный рецептор и член семейства CD28 и экспрессируется на активированных Т-клетках и других лимфоцитах (Tregs, NK-клетках и В-клетках) [68-70]. При взаимодействии с PD-L1 и PD-L2 в коингибирующем пути в периферических тканях он ослабляет активированные Т-клетки (цитотоксическая активность, пролиферация и продуцирование цитокинов), поддерживая устойчивость периферических Т-клеток и предотвращая аутоиммунитет [71]. Путь PD-1 является одним из иммунных контрольных точек, используемых раковыми клетками, чтобы избежать противораковых иммунных защит [72]. PD-L1 экспрессируется на разных лимфоидных клетках, активируется в различных нормальных клетках при воспалении и выражается во многих раковых опухолях человека. Было показано, что он коррелирует с размером опухоли, степенью, метастатическим распространением и снижением уровня инфильтрационных опухолей CD8 + Т-клеток [73-75]. Было показано, что высокий уровень клеток PD-1 + имеет значительную корреляцию со снижением выживаемости пациентов [76]. В нашем исследовании, хотя был широкий диапазон как внутри, так и в перитумуральных стромальных компартментах, инфильтрация в целом была низкой. Значительное снижение как внутрипузырной, так и стромальной инфильтрации с помощью лимфоцитов PD-1 + T наблюдалось после 8 циклов NAC. Однако уровень инфильтрации в LLABC не был связан с последующим pCR после NAC. В литературе отсутствует информация о влиянии NAC на подмножества PD-1 + T-клеток, проникающих в LLABC. Мы считаем, что это новоиспеченный вывод.

В различных раках человека злокачественные клетки и инфильтрирующие клетки-хозяева экспрессируют и секретируют ряд цитокинов Th1, Th2 и Th17 (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17 и IFN -γ) и TGF-β. Эти цитокины модулируют и подавляют in situ противораковые иммунные реакции, усиливают рост и прогрессирование опухолевых клеток и склонность к метастазированию [77-83]. В нашем исследовании применяемый полуколичественный метод не различал инфильтрационные опухоли иммунные и воспалительные клетки и злокачественные клетки, а также не количественно определял вклад различных иммунных и воспалительных клеток хозяина в уровни цитокинов в микроокружении опухоли.

В микроокружении опухоли Th1, Th2 и Th17 цитокины, а также TGF-β играют важную роль в модулировании in situ и адаптивных иммунных механизмов [84]. Цитокины Th1 IL-2 и IFN-Υ улучшают ЦНС-и NK-опосредованную регрессию раковых клеток. IFN-Υ может либо стимулировать, либо подавлять активность Treg в зависимости от среды цитокинов. IL-2 также играет ключевую роль в контроле функции Treg на периферии [51]. Цитокины Th2 IL-4 и IL-10 подавляют генерацию CTL и Th1-клеток и вводят опухолевый вход Tregs [1, 53]. Кроме того, показано, что IL-4 увеличивает и ингибирует функцию Treg. Он может усилить экспрессию FOXP3 и супрессорную активность Tregs и, наоборот, может ингибировать TGF-β-индуцированное развитие Treg [85, 86]. Экспрессия цитокинов Th1 и Th2 в опухолях оказывает изменчивое влияние на результаты лечения пациентов в различных раковых опухолях человека, включая рак молочной железы [2]. Роль ИЛ-17 не определена. Некоторые исследования на животных предполагают, что он способствует росту опухоли и ангиогенезу [87, 88]. Yamazaki et al. (2008) показали, что IL-17 способствует рекрутированию Tregs на сайты опосредованного IL-17 воспаления [89]. Другие предложили повышенную генерацию ЦТЛ и усиленное отторжение опухоли [90, 91]. Противоречивые результаты были продемонстрированы в ряде опухолей человека, включая рак молочной железы [2]. Было показано, что в одном исследовании рака молочной железы уровень клеток Th17 был увеличен и был связан с улучшенным прогнозом [81]. Экспрессия TGF-β обычно повышается при раковых заболеваниях человека. Он индуцирует продукцию FOXP3 + Tregs и обладает сильным иммуносупрессивным эффектом, препятствуя генерации и активности врожденных (DC, NK-клеток) и адаптивных (CD4 + и CD8 + Т-клеток) иммунитета [53, 84]. TGF-β может способствовать эпителиальному мезенхимному переходу, что приводит к усилению подвижности опухолевых клеток, локальному вторжению и образованию метастазов [92]. Восприимчивая среда, не редко встречающаяся в опухолях, может индуцировать трансформацию FOXP3 + Tregs в клетки FOXP3-эффектора, продуцирующие IFN-Υ [93]. IL-6 также может индуцировать потерю FOXP3 + Treg и превращение в фенотип Th17 и функцию [94]. Это еще раз свидетельствует о пластичности различных подэлементов регулятора эффектора CD4 + Т-клеток. Взаимодействие между различными профилями Т-клеток в раках человека является сложным, переменные результатов и нуждаются в дальнейшем тщательном изучении.

Влияние NAC на продукцию цитокинов Th1, Th2 и TH17 в опухолях плохо документировано. В нашем исследовании уровни экспрессии до уровня NAC не были связаны с pCR после NAC. IL-4 был значительно снижен в микроокружении опухоли после NAC. Аналогичный, но незначительный тренд наблюдался при экспрессии IL-2 in situ (p = 0,070). Однако экспрессия IL-10 и IL-17 после НАК показала значительную связь с неспособностью достичь pCR. Аналогичная тенденция наблюдалась при наличии TGF-β in situ in situ (p = 0,062). Эти различные данные с НАС ранее не сообщались.

Известно, что высокий уровень опухоли связан с NCR-индуцированным pCR при раке молочной железы. Было показано, что высокий уровень опухоли достоверно связан с инфильтрацией опухоли (внутриутробной, стромальной) с помощью CD4 + и CD8 + Т-клеток и стромальных FOXP3 + Т-клеток, что, возможно, способствовало вызванному NAC pCR. Существенной связи с какими-либо клиническими или другими патологическими параметрами не наблюдалось. Это может быть связано с относительно небольшим количеством изученных образцов. В многомерном анализе высокий уровень TIL был значительным независимым предсказателем pCR с NAC и согласуется с опубликованными данными.

Большинство химиотерапевтических средств ингибируют аспекты врожденного и адаптивного иммунитета. Некоторые, однако, могут усилить противораковый иммунитет и активировать иммунную опосредованную гибель опухолевых клеток [19, 95-97]. Химиотерапия может индуцировать стресс / повреждение раковых клеток, приводящий к высвобождению «опасных» сигналов (например, белков теплового шока) и иммуногенных опухоле-ассоциированных антигенов (TAA). Первые активируют врожденные иммунные клетки, в то время как последние поглощаются DC, приводящими к высвобождению провоспалительных цитокинов и генерированию противоопухолевых CTL-ответов. Антрациклины, в частности, индуцируют повреждение опухолевых клеток и воздействие калькретинулина и других эндоплазматических ретикулярных белков, секрецию АТФ и высвобождение молекул группы с высокой подвижностью 1 (HMGB1). Они взаимодействуют с рецепторами на ДК, стимулируя поглощение и представление ТАА наивным Т-клеткам [18, 98-100].

Известно, что комбинация НАК (антрациклин, циклофосфамид и таксан-капецитабин), используемый в нашем исследовании, обладает иммуномодулирующим действием. Было показано, что доксорубицин повышает генерацию антигенспецифических CD8 + Т-клеток и способствует инфильтрации опухоли активированными IFN-γ, продуцирующими CD8 + Т-клетки [69, 101]. In vitro доксорубицин увеличивал антигенспецифические ответы CD4 + Th1, индуцируя экспрессию CD40L и 4-1BB на CD4 + Т-клетках [69]. Циклофосфамид ингибирует генерацию и функцию FOXP3 + Tregs у людей с различными раковыми заболеваниями [97, 102]. Показано, что таксаны обладают иммуномодулирующим действием против опухолей [95, 103]. У пациентов с прогрессирующим раком молочной железы терапия доцетакселом была связана с увеличением уровней IFN-γ, IL-2 и IL-6 в сыворотке и усилением циркулирующей активности NK-клеток [95]. Капецитабин ферментативно превращается в 5-фторурацил (5-FU) при проглатывании. Известно, что 5-ФУ увеличивает экспрессию ТАА на опухолевые клетки и повышает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность [104]. У мышей 5-ФУ индуцировали истощение иммуносупрессивных миелоидных супрессорных клеток и усиленное продуцирование IFN-γ инфильтрационными опухолями CD8 + Т-клетками [105].

Комбинация NAC, используемая в нашем исследовании, по-разному сохраняла популяцию опухолей-инфильтрирующих CD8 + T-клеток, но значительно уменьшала как циркулирующие, так и опухолевые инфильтрационные FOXP3 +, CTLA-4 + (стромальные) и иммунные контрольные точки PD-1 + T-клетки, тем самым предотвращая секрецию ингибирующих цитокинов (IL-4, IL-10 и TGF-β) и нарушение пути PD-1 / PD-L1. Восстановление иммунных противораковых эффекторных механизмов, вероятно, приведет к усилению иммунной опосредованной смерти опухолевых клеток. Более того, значительная корреляция высоких CD8 + T-клеток и отношения CD8 +: FOXP3 + Т-клеток с pCR (и, следовательно, DFS и OS) предполагает тесную связь между высокими уровнями CD8 + T-клеток / CTL и сопутствующим истощением Tregs. Дисфункциональные реакции CD8 + Т-клеток в результате чрезмерной и продолжительной стимуляции и непрерывной неадекватной активации сигнала приводят к истощению Т-клеток и потере эффектора и функции памяти. Это сохраняется даже после удаления Tregs [106]. Тесная взаимосвязь между pCR в LLABC и сопутствующими иммунными изменениями, вызванными NAC, предполагает, что иммунная опосредованная клеточная смерть может быть решающим компонентом разрушения и удаления опухолевых клеток, связанных с NAC. Лучшее понимание этой сложной взаимосвязи в раке человека, в частности, факторов, препятствующих оптимальной доставке иммунной опосредованной смерти опухолевых клеток, необходимо для разработки более эффективных химиотерапевтических стратегий в лечении рака.

Наше исследование подтвердило ранее опубликованные результаты и задокументировало новые результаты, далее установив, что иммунная микроокрузия является ключевым фактором, способствующим лучшему патологическому ответу с НАС. Уровень TIL и CD4 + и CD8 + T-клеток в LLABC, которые хорошо продемонстрированы с использованием методов IHC, могут быть клинически полезными для дальнейшего определения женщин с LLABC, которые могут извлечь выгоду из NAC. Эти биологические маркеры могут быть легко определены из гистопатологического исследования биопсий опухоли молочной железы (с использованием H и E и IHC) до начала терапии. Они могут дополнять другие клинические параметры при установлении оптимального лечения, а также прогностического прогноза для отдельных женщин с LLABC, подходящих для NAC.

Дополнительный файл 1: документирует влияние NAC на уровни TIL между образцами до и после NAC. Уровни как внутрипопухолевого, так и стромального TIL не были существенно изменены, когда образцы до НАК сравнивались с образцами после НАК. Пять из 16 пациентов с высоким уровнем TIL впоследствии имели низкий уровень после NAC, в то время как 1 из 16 с низким уровнем TIL имели более высокий уровень пост-НАК (p = 0,229). Дополнительный файл 2: до NAC не было достоверной корреляции между уровнями циркулирующих Tregs и уровнями в микроокружении опухоли. Однако после НАК была значительная положительная корреляция между% циркулирующих и внутрипузырных FOXP3⁺ Tregs. [Коэффициент корреляции (rho) 0,687, p = 0,003]. Дополнительный файл 3: не обнаруживает существенной корреляции между циркулирующими и прорастающими опухолями CTLA-4⁺ Tregs. Дополнительный файл 4: аналогичные дореципирующим Tregs (FOXP3⁺ и CTLA-4 to) до уровня NAC, уровни циркулирующих Tregs (AbNs и%), предшествующие NAC, не были существенно различны в любой группе ответов NAC (GPR против PPR и pCR по сравнению с non pCR, p> 0,05). Дополнительный файл 5 иллюстрирует влияние NAC на экспрессию цитокинов и PD-L1 при раке молочной железы. Не было существенной разницы между экспрессией до и после НАК (p> 0,05), за исключением ИЛ-4. Экспрессия IL-4 после NAC была значительно снижена (p = 0,016); в 43,8% (7 из 16) от высокого к низкому, и ни в коем случае это не изменилось.

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Кристофера Нолана (Академическое отделение клинической онкологии, городской больницы, Университет Ноттингема) за его совет и помощь в анализах IHC. Клинические испытания, из которых были собраны образцы тканей и образцы крови для исследования, были поддержаны образовательными грантами от Sanofi-Aventis, UK, Roche, UK и Chughai, UK. Авторы выражают признательность за финансовую поддержку, предоставленную для этого исследования грантом Ноттингемширского, Дербиширского и Линкольнширского исследовательского альянса и Благотворительной благотворительной организации «Свечи».

5-фторурацил

адриамицин

Абсолютное число

Подмышечный лимфатический узел

циклофосфамид

Кластер дифференциации

Цитотоксический Т-лимфоцит

Цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4

диаминобензидин

Безрецидивная выживаемость

Дендритная клетка

Прозрачная карцинома in situ

Эстрогеновый рецептор

Противопоказания

Рецептор фактора эпидермального роста человека 2

Группа с высокой мобильностью 1

Мощное поле

Пероксидаза хрена

Гематоксилин и эозин

иммуногистохимия

Интерлейкин

Интерферон-гамма

Интрамумуральный лимфоцит

Большой местный рак молочной железы

Моноклональное антитело

Большой комплекс гистосовместимости

Неоадъювантная химиотерапия

Естественный убийца

Общая выживаемость

Патологический полный ответ

Запрограммированная смерть 1

Запрограммированный лиганд смерти 1

Комнатная температура

Стромальный лимфоцит

Docetaxel

Опухоль-ассоциированный антиген

Т х хелпер

Т-регуляторная клетка

Т-клеточный рецептор

Трансформирование фактора роста-бета

Инфильтрационный лимфоцит опухоли

Капецитабина.

Исследование получило одобрение Лестерширского, Нортгемптонширского и Ратлендского комитета по этике исследований 1: Ссылка №. 07 / H0406 / 260, благоприятное мнение 24/01/2008. Регистрация исследования — ISRCTN00407556.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Авторы внесли свой вклад в развитие: концепцию и дизайн: Вирия Каюкансадан, Чандан Верма, Дженнифер М. Еремин, Джерард Коули и Олег Еремин; сбор данных: Вирия Каюкансадан, Чандан Верма, Дженнифер М. Еремин, Джерард Коули и Олег Еремин; анализ и интерпретация данных: Вирия Каюкансадан, Чандан Верма, Дженнифер М. Еремин, Жерар Коули, Мохаммед Ильяс и Олег Еремин; лабораторные анализы: Вирия Каюкансадан, Чандан Верма и Жерар Коули; письменность рукописи: Вирия Каукансадан, Чандан Верма, Дженнифер М. Еремин и Олег Еремин; обзор и окончательное утверждение рукописи: Вирия Каукансандан, Чандан Верма, Дженнифер М. Еремин, Жерар Коули, Мохаммед Ильяс и Олег Еремин.

TIL в разделах LLABC с использованием окрашивания H & E при 400-кратном увеличении; (а) низкий уровень лимфоцитарной инфильтрации; (б) высокий уровень лимфоцитарной инфильтрации. Низкий уровень TIL, определяемый как ≤60% опухолевых гнезд (Itu: intratumoural) и стромальных областей (Str: стромальный), инфильтрированных лимфоцитами. Высокий уровень TIL, определяемый как> 60% опухолевых гнезд и / или стромальных областей, инфильтрированных лимфоцитами.

CD4 + (a, b) и CD8 + (c, d) Т-лимфоциты в срезах LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с MAbs до CD4 (Dako, M7310) при разведении 1: 80 в течение 30 минут при RT и MAbs до CD8 (Dako, M7103) при разведении 1: 100 в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a, c) низкий уровень инфильтрации Т-клеток CD4 + и CD8 +; (b, d) высокий уровень инфильтрации Т-клеток CD4 + и CD8 +. Было подсчитано среднее количество окрашенных коричневой оболочкой клеток, независимо от интенсивности, в контакте с опухолевыми клетками или внутри гнезд опухолевых клеток (Itu: intratumoural) и в интерстициальной строме (Str: стромал) на HPF.

FOXP3 + (a, b) и CTLA-4 + (c, d) в срезах LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с MAbs до FOXP3 (Abcam, ab20034) в концентрации 20 мкг / мл в течение 30 минут при RT и MAbs до CTLA-4 (Santa Cruz Bio, sc-376016) при разведении 1: 300 для 30 мин при комнатной температуре. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a, c) Низкий уровень инфильтрации FOXP3 +, CTLA-4 + Treg; (b, d) высокий уровень проникновения FOXP3 + и CTLA-4 + Treg. Среднее количество окрашенных в коричневый цвет (FOXP3), окрашенных в мембрану (CTLA-4) клеток, независимо от интенсивности, в контакте с опухолевыми клетками или в гнездах опухолевых клеток (Itu: intratumoural) и в интерстициальной строме (Str: стромальная ) на HPF.

PD-1 + Т-клетки в участках LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с MAbs до PD-1 (Abcam, ab52587) при разведении 1: 100 в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a) низкий уровень инфильтрации PD-1 + T-клеток; (б) высокий уровень проникновения PD-1 + Т-клеток. Было подсчитано среднее количество окрашенных коричневой оболочкой клеток, независимо от интенсивности, в контакте с опухолевыми клетками или внутри гнезд опухолевых клеток (Itu: intratumoural) и в интерстициальной строме (Str: стромал) на HPF.

IL-1 (a, b), IL-2 (c, d) и IFN-γ (e, f) в разделах LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с MAbs до IL-1 (Abcam, ab8320) при разведении 1: 150 в течение ночи при 4 ° C и MAbs до IL-2 (Abcam, ab92381) при разведении 1: 500 в течение 30 минут при комнатной температуре и поликлональные абс-IFN-γ (Abcam, ab9657) в концентрации 4 мкг / мл в течение 30 минут при RT, соответственно. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a, c, e) Низкий уровень выражения; (b, d, f) высокий уровень выражения. Для оценки уровня экспрессии использовали показатель H (% положительных клеток (опухоль с коричневой мембраной / цитоплазматической окраской и иммунные клетки) × интенсивность окрашивания (от 1 до 3)); низкий — ≤100 и высокий -> 100. Оценка производится на участке цельной ткани (> 10 HPF); Ту: опухоль и ли: лимфоцит.

IL-4 (a, b) и IL-10 (c, d) в секциях LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с поликлональным абссом до IL-4 (Abcam, ab9622) в концентрации 4 мкг / мл в течение 30 минут при RT и поликлональном абс-IL-10 (Abcam, ab34843) при разведении 1: 400 для 30 мин при комнатной температуре. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a, c) низкий уровень выражения; (b, d) высокий уровень выражения. Для оценки уровня экспрессии использовали показатель H (% положительных клеток (опухоль с коричневой мембраной / цитоплазматической окраской и иммунные клетки) × интенсивность окрашивания (от 1 до 3)); низкий — ≤100 и высокий -> 100. Оценка производится на участке цельной ткани (> 10 HPF); Ту: опухоль и ли: лимфоцит.

IL-17 (a, b), TGF-β (c, d) и PD-L1 (e, f) в разделах LLABC с использованием окрашивания IHC при 400-кратном увеличении. Вкратце, поиск опосредованного теплом антигена осуществляли с использованием цитратного буфера, рН 6 (20 минут). Затем секторы инкубировали с поликлональным абссом до IL-17 (Abcam, ab9565) при разведении 1: 100 в течение 30 минут при RT, MAbs до TGF-β (Abcam, ab64715) с концентрацией 12 мкг / мл в течение ночи при 4 ° C и поликлональных абс в PDL1 (Abcam, ab58810) при концентрации 2,5 мкг / мл в течение 15 минут при RT, соответственно. В качестве вторичного антитела использовали полимерный конъюгат антитела HRP-линкерного антитела. DAB-хромоген использовался для визуализации окрашивания. Секции контрастировали с гематоксилином. (a, c, e) Низкий уровень выражения; (b, d, f) высокий уровень выражения. Для оценки уровня экспрессии использовали показатель H (% положительных клеток (опухоль с коричневой мембраной / цитоплазматической окраской и иммунные клетки) × интенсивность окрашивания (от 1 до 3)); низкий — ≤100 и высокий -> 100. Оценка производится на участке цельной ткани (> 10 HPF); Ту: опухоль и ли: лимфоцит.

Уровни инфильтрационных опухолей лимфоцитов (TIL) у женщин с LLABC (1) и последующий патологический полный ответ после NAC (2).

(1) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (2) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (3) ПЦР (класс 5): нет остаточной инвазивной болезни; (4) ЛПВС: лимфоцит-преобладающий рак молочной железы; * Статистически значимый.

Уровни опухолеинфильтрации T-клеток у женщин с LLABC (1) и последующий патологический полный ответ после NAC (2).

(1) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (2) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (3) средний подсчет клеток на 400-кратное высокомощное поле (основные биопсии рака молочной железы); (4) Тест Манна-Уитни U; (5) ПЦР (степень 5): нет остаточной инвазивной болезни; * Статистически значимый.

Опухоль-инфильтрация CD8 +: FOXP3 + Т-клетка в LLABCs (1) и последующий патологический ответ на NAC (2).

(1) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (2) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (3) отношение CD8 + Т-клеток / FOXP3 + Treg; (4) Тест Манна-Уитни U; (5) GPR (хорошая патологическая реакция, оценки 5 и 4): нет остаточной инвазивной болезни,> 90% потери инвазивного заболевания, соответственно; (6) PPR (плохой патологический ответ, 3, 2 и 1): 30-90% -ная потеря инвазивного заболевания, <30% -ная потеря инвазивного заболевания и отсутствие потери опухолевых клеток соответственно; (7) ПЦР (патологический полный ответ, 5 класс); * Статистически значимый.

Корреляции между инфильтрационными опухолями лимфоцитами (TIL) и специфическими подмножествами Т-клеток и степенью патологического ответа на NAC (1) (коэффициент корреляции Спирмена (rho)) у женщин с LLABCs (2).

(1) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (2) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (3) патологические ответы оценивались от 1 до 5 классов (1 класс (без потери опухолевых клеток), степень 2 (<30% потеря инвазивного заболевания), 3-й класс (30-90% -ная потеря инвазивного заболевания), 4-й класс (> 90% -ная потеря инвазивного заболевания) и 5-й степени (полный патологический ответ, отсутствие остаточной инвазивной болезни)); * Статистически значимый.

Т-клеточные подмножества, инфильтрирующие опухоли (внутриутробные, стромальные) у женщин с LLABC (1): значительное снижение с помощью NAC (2).

(1) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (2) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (3) средний подсчет клеток на 400x высокомощное поле; (4) Уилкоксон, подписанный ранг-тест; * Статистически значимый.

Кровь (1) и инфильтрационные опухоли FOXP3 + и CTLA-4 + Т-клетки у женщин с LLABC (2): значительное снижение с помощью NAC (3).

(1) Кровь: данные, ранее опубликованные (Verma et al., 2013 [21]); (2) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (3) НАК: неоадъювантная химиотерапия; (4) средний подсчет клеток на 400x высокомощное поле; (5) Уилкоксон, подписанный ранг-тест; (6) АбН: абсолютное число (ячейки / мм3); * Статистически значимый.

Кровь (1) и инфильтрационные опухоли FOXP3 + и CTLA-4 + Т-клетки (пост-НАК) у женщин с LLABC (2) и патологический ответ, вызванный опухолями после NAC (3).

(1) Кровь: данные, ранее опубликованные (Verma et al., 2013 [21]); (2) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (3) НАК: неоадъювантная химиотерапия; (4) средний подсчет клеток на 400x высокомощное поле; (5) АбН: абсолютное число (ячейки / мм3); (6) Тест Манна-Уитни U; (7) GPR (хорошая патологическая реакция, оценки 5 и 4): нет остаточной инвазивной болезни,> 90% потери инвазивного заболевания, соответственно; (8) PPR (плохой патологический ответ, 3, 2 и 1): 30-90% потери инвазивного заболевания, <30% потери инвазивного заболевания и отсутствие потери опухолевых клеток соответственно; (9) ПЦР (патологический полный ответ, 5 класс): нет остаточного инвазивного заболевания; * Статистически значимый.

Экспрессия цитокинов и PD-L1 (1) в LLABCs (2) (pre-NAC и post-NAC (3)) и патологический полный ответ, вызванный опухолями после NAC.

(1) PD-L1: запрограммированный лиганд смерти 1; (2) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (3) НАК: неоадъювантная химиотерапия; (4) ПЦР (патологический полный ответ, степень 5: отсутствие остаточной инвазивной болезни); (5) TGF-β: считается отрицательным или положительным; * Статистически значимый.

Клинические и патологические параметры пациентов (n = 33) изучались и наличие до-NAC (1) опухолепроникающих CD4 + и CD8 + и FOXP3 + Т-клеток.

(1) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (2) средний подсчет клеток на 400x высокомощное поле; (3) Тест Манна-Уитни U; (4) ИМТ: индекс массы тела (≤30: nonobese,> 30: ожирение); (5) испытание Крускала-Уоллиса; (6) ER: рецептор эстрогена; (7) AC-TX: доксорубицин, циклофосфамид, таксотер и Xeloda® (капецитабин), соответственно; * Статистически значимый.

Одномерный и многомерный (логистический регрессионный) анализ клинико-патологических параметров как прогностических факторов для патологического полного ответа на NAC (1) в LLABCs (2) (n = 33).

(1) NAC: неоадъювантная химиотерапия; (2) LLABC: большие и локально распространенные раковые заболевания молочной железы; (3) ИЛИ: отношение шансов; (4) CI: доверительный интервал; (5) TIL: инфильтрационные опухоли лимфоциты; (6) LPBC: лимфоцит-преобладающий рак молочной железы; (7) ER: рецептор эстрогена; (8) AC-TX: доксорубицин, циклофосфамид, таксотер и кселода (капецитабин) соответственно; * Статистически значимый; NA: неприменимо.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *