Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Физико-химическая и биологическая характеристика нанокомплексов хитозан-микроРНК для доставки генов в клетки рака молочной железы MCF-7

Physicochemical and biological characterization of chitosan-microRNA nanocomplexes for gene delivery to MCF-7 breast cancer cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4555168/

Презентация: Маркус Ритцефельд: кафедра химии, Имперский колледж Лондона, Южный Кенсингтонский кампус, SW7 2AZ, Лондон, Великобритания.

Гендерная терапия рака требует разработки невирусных векторов, которые несут генетический материал и селективно доставляют его с минимальной токсичностью. Невирусные векторы на основе катионных природных полимеров могут образовывать электростатические комплексы с отрицательно заряженными полинуклеотидами, такими как микроРНК (miRNAs). Здесь мы исследовали физико-химические / биофизические свойства нанокомплексов хитозан-hsa-miRNA-145 (CS-miRNA) и биологические ответы клеток рака молочной железы MCF-7, культивируемых in vitro. Самоорганизованные нанокомплексы CS-miRNA были получены с диапазоном (+/-) зарядовых отношений (от 0,6 до 8) с использованием хитозанов с различной степенью ацетилирования и молекулярной массой. Z-средний диаметр частиц комплексов составлял <200 нм. Поверхностный заряд увеличивался с увеличением количества хитозана. Мы наблюдали, что хитозан индуцирует базовую укладку miRNA зависимым от концентрации образом. Поверхностная плазмонная резонансная спектроскопия показывает, что комплексы, образованные низкой степенью ацетилирования хитозанов, являются высокостабильными независимо от молекулярной массы. Мы не обнаружили доказательств того, что эти комплексы были цитотоксичными по отношению к клеткам MCF-7. Кроме того, нанокомплексы CS-miRNA со степенью ацетилирования 12% и 29% были биологически активными, что демонстрирует успешную подавление экспрессии мРНК-мишени в клетках MCF-7. Поэтому наши данные показывают, что комплексы CS-miRNA предлагают перспективную невирусную платформу для генной терапии рака молочной железы.

Рак является следствием неконтролируемой пролиферации клеток и дисрегуляции клеточных процессов, таких как дифференцировка и запрограммированная гибель клеток1. Большинство видов рака вызваны мутациями или перестройками хромосом, которые непосредственно влияют на экспрессию онкогенов или генов-супрессоров опухолей, но все больше доказательств того, что рак может быть вызван изменениями в регуляции генов, включая экспрессию небольших некодирующих молекул РНК, известных как микроРНК (miRNAs) 23.

МикроРНК представляют собой небольшие эндогенные РНК длиной приблизительно 22 нуклеотида, которые регулируют экспрессию экспрессии эукариот на посттранскрипционном уровне. Лишь небольшое число человеческих miRNAs функционально охарактеризовано, и многие из них регулируют связанные с раком процессы, такие как рост клеток и дифференциация, и, следовательно, потенциально функционируют как онкогены. Профилирование экспрессии с использованием miRNAs, а не белок-кодирующих генов, обеспечивает более точный метод классификации подтипов рака24. Таким образом, дифференциальная экспрессия некоторых miRNAs в опухолях является мощным инструментом для диагностики и лечения рака.

Введение miRNAs в клетки человека может обеспечить эффективный терапевтический подход для ингибирования прогрессирования опухоли5. Однако успешная генная терапия требует разработки подходящих средств для эффективной доставки нуклеиновых кислот в конкретные клетки-мишени с минимальной токсичностью. Оба вирусных и невирусных вектора были разработаны для генной терапии. Вирусные векторы были разработаны на основе широкого спектра вирусов и обычно включают сильные промоторы, которые достигают высокого уровня экспрессии гетерологичных генов. Однако использование вирусных векторов в клинических испытаниях человека вызывает серьезные проблемы с безопасностью, такие как потенциальная иммуногенность и ревность к патогенности67. Это стимулировало разработку невирусных векторов с лучшими профилями биобезопасности, включая нанокомплексы на основе дендримеров8, липидов, 9 или полисахаридов10.

Невирусные трансфекционные реагенты, состоящие из дендримеров (например, полиэтиленимина) и липидных составов (например, липофектамин), уже коммерчески доступны, но в последнее время исследования сфокусированы на биосовместимых векторах, подходящих для терапевтического использования in vivo, включая катионные полимеры, такие как полисахариды, которые образуют комплексы с отрицательно заряженные полинуклеотиды (ДНК и различные формы РНК). Эти поликатионы рассматриваются как строительные блоки, которые стабилизируют генетический материал, защищают его от деградации, способствуют его поглощению в клетки-мишени, а затем эффективно распаковывают и доставляют нуклеиновые кислоты6.

Хитозан (CS) представляет собой семейство линейных, катионных гетерополисахаридов, образующихся при частичном деацетилировании хитина, которое выделяется из ракообразных оболочек. Это биоразлагаемые полимеры, состоящие из случайно распределенных β (1 → 4) -связанных звеньев N-ацетил-d-глюкозамина и d-глюкозамина. Катионные свойства хитозана полезны в фармацевтических препаратах и ​​биоматериалах, потому что молекула может образовывать комплексы полиэлектролита (также известные как полиплексы) с плазмидной ДНК и, как недавно сообщалось, также с короткой интерферирующей РНК (siRNA), что делает ее привлекательной системой доставки101112. До сих пор в немногих исследованиях систематически изучалось, как структура хитозанов, в частности степень ацетилирования (DA), картина ацетилирования (PA) и степень полимеризации (DP), влияет на биофизические характеристики и биологическую функциональность полиплекса на основе хитозана , Действительно, были предприняты попытки установить связь между DP и DA хитозана, его формой соли и рН на эффективности трансфекции плазмидной ДНК in vitro1314151617 и определить пути внутриклеточной трафики, лежащие в основе их способа действия18. Идеальный баланс между силой взаимодействия между хитозаном и плазмидной ДНК и растворением комплекса в клетке (таким образом, обеспечивая оптимальную эффективность трансфекции) может быть достигнут с использованием молекул хитозана с конкретными DP и DAs19. Подробно исследованы биофизические свойства комплексов хитозан-siRNA и их способность к трансфекции20, а полезные свойства включают низкомолекулярный вес, высокий DA, небольшой размер частиц (100 нм) и умеренный положительный поверхностный дзета-потенциал вместе с высокий (+/-) коэффициент заряда21. Однако неясно, как эти факторы способствуют наблюдаемой эффективности трансфекции, и требуется дальнейшее исследование. Поставка микроРНК была протестирована с функционализованными наночастицами золота в сочетании с строкой шпильки или шпилечной структуры miRNA2223. Свойства комплексов хитозан-miRNA (CS-miRNA) не были задокументированы.

Здесь мы сообщаем о всестороннем исследовании зависимости структур-функция в системах CS-miRNA, чтобы определить, связаны ли физико-химические и биофизические свойства различных хитозанов и miRNAs (например, размер, дзета-потенциал, химическое сродство взаимодействия и конформации). Мы также изучали легкость, с которой miRNAs высвобождались из комплексов CS-miRNA и затем обрабатывались внутри клетки для достижения предполагаемой биологической активности.

Родительский хитозан деполимеризовали с использованием двух разных количеств азотистой кислоты (рассчитанной в соответствии со стехиометрией реакции) для получения хитозанов с высоким и низким молекулярным весом, обозначенных соответственно как HDP, так и LDP. Это селективная реакция, при которой нитрозирующие виды атакуют аминогруппы и расщепляют β-гликозидные, но не N-ацетильные связи2425. Хитозаны с четырьмя различными DA были получены путем ацетилирования непротонированных первичных аминогрупп с уксусным ангидридом. DA хитозанов оценивали с помощью 1H-ЯМР, как описано ранее262728. Среднюю молекулярную массу вязкости () определяли по значениям характеристической вязкости с использованием соответствующих констант Марк-Хоувинка29 (таблица 1).

Анализ реакции отжига с помощью гель-электрофореза (фиг.1) выявил уникальные полосы для однонитевых miRNAs, сравнимых с маркером размером от 20 до 25 мер. Образование двухцепочечного (дуплексного) было подтверждено уменьшенной подвижностью соответствующей полосы, отражающей ее более высокую молекулярную массу (14,2 кДа) по сравнению с одиночными цепями.

Различные описанные выше растворы хитозана (сделанные в воде, содержащей стехиометрические количества HCl, следовательно, имеющие чистый положительный заряд) смешивались с постоянным количеством (0,05 нмоль) miRNA (следовательно, с отрицательным зарядом) для получения комплексов CS-miRNA с (+/-) в диапазоне 0,6-8. Полученные комплексы характеризовались с точки зрения их среднего диаметра и дзета-потенциала (рис.2). Средний диаметр комплексов составлял ~ 80-190 нм, хотя комплексы, содержащие хитозаны низкого DP, были немного меньше, чем комплексы, содержащие хитозаны с высоким DP из-за более коротких цепей. Размер комплексов, содержащих хитозаны с высоким DP, увеличивался с увеличением DA при одинаковом соотношении зарядов, но это явление не наблюдалось для комплексов, содержащих хитозаны низкого DP. Оба типа комплексов увеличивались по мере приближения к точке нейтральности (+/- = 1,5), где происходит компенсация заряда, но при более высоких концентрациях хитозанов она становилась меньше (рис. 2А, В). Дзета-потенциал варьировался от -20 до +20 мВ для комплексов, содержащих хитозаны высокого DP и от -15 до +15 мВ для тех, которые содержат хитозаны низкого DP (рис. 2C, D). Как и ожидалось, дзета-потенциал всегда становился более позитивным, так как концентрация хитозанов возрастала.

Изображения нанокомплексов, содержащих HDP-29 или LDP-25 и miRNA, были зарегистрированы TEM и проанализированы в терминах морфологии частиц, размера и топологии поверхности. На рисунке 3 показаны типичные изображения этих нанокомплексов CS-miRNA, сформулированных с двумя разными отношениями.

Комплексы были сферическими по форме с гетерогенной структурой, как ранее сообщалось для 44 кДа хитозанов30. Средние диаметры комплексов CS-miRNA, определенные из среднего числа восьми изображений TEM с использованием ImageJ v1.49n, представлены в таблице, встроенной на фиг.3. Эти размеры хорошо коррелируют с теми, которые определяются динамическим рассеянием света.

Биотинилированный hsa-miR-145-5p был иммобилизован на чипсах датчика стрептавидина, а растворы хитозана с различными концентрациями пропускались по проточному каналу, что позволяет регистрировать сенсорные диаграммы во время взаимодействия между хитозанами и hsa-miR-145-5p (Supporting Information, S1) , Реакционные единицы значительно увеличились в течение первых секунд взаимодействия из-за образования комплексов CS-miRNA, но когда было добавлено определенное количество хитозана, было достигнуто установившееся состояние, в котором число ассоциирующих и диссоциативных комплексов CS-miRNA равны. Значения RU в равновесном состоянии были построены по логарифму соответствующих концентраций хитозана. Константы равновесной диссоциации (KD) были извлечены из этих кривых насыщения нелинейной регрессией (рис.4) с использованием модели сигмоидальной зависимости от дозы (переменный наклон). Значения KD приведены в таблице 2.

Быстрое увеличение RU во время фазы ассоциации наблюдалось как для хитозанов с высоким, так и с низким молекулярным весом, пока DA был низким. Однако комплексы, содержащие хитозаны с более высоким DA, характеризовались меньшим наклоном, представляющим кинетически более медленную ассоциацию. Аналогичная тенденция наблюдалась для значений КД: комплексы, содержащие хитозан высокого DA, показали более высокие значения КД и, следовательно, были значительно менее стабильными. Принимая во внимание доверительные интервалы 95%, значительная разница между значениями КД при разных DAs наблюдалась только для высоких хитозанов DP (HDP 12-49). В случае хитозанов низкого DP соответствующие комплексы LDP-11 и LDP-25 демонстрировали сопоставимые значения KD. Однако CS-miRNA-комплекс LDP-67 характеризуется значительно более высокой константой диссоциации по сравнению с двумя последними (табл. 2). Коэффициенты Хилла для всех комплексов были больше 1, что указывает на положительные кооперативные события связывания. Для хитозанов с высоким уровнем DP коэффициент Хилла значительно снижался по мере увеличения DA.

CD-спектроскопия чувствительна к конформационным изменениям в хиральных асимметричных структурах. Таким образом, изменения в спектрах КР полинуклеотидов в основном зависят от последовательности оснований и геометрии укладки3132. Этот метод идеально подходит для анализа структурных изменений дуплексов РНК, вызванных электростатическими взаимодействиями с полисахаридами. Мы приобрели CD-спектры для одноцепочечной РНК (hsa-miR-145-5p), дуплексной miRNA-145 и комплексов, образованных с хитозанами в диапазоне (+/-) зарядовых отношений (рис.5).

В спектре CD не было полосы поглощения для одноцепочечной РНК. Напротив, спектры CD для двухцепочечной miRNA выявили наличие положительной полосы (максимум при λ = 280 нм), отрицательную полосу (минимум при λ = 210 нм) и ноль CD при λ = 300 нм и выше. Эти особенности характерны для правой руки A-формы двухцепочечной РНК33. Спектры CD двухцепочечной miRNA сдвигались в положительной экситонной полосе длинноволнового компонента (λ = 270 нм) после добавления хитозанов даже для комплексов, дефицитных хитозанами (+/- = 0,6). Для комплексов, содержащих избыточные хитозаны, сдвиг влево был более выраженным во всех CD-спектрах, что отражает увеличение положительной экситонной зоны длинноволновой компоненты (λ = 270 нм). Добавление хитозанов не оказывало явного влияния на отрицательную экситонную зону (λ = 210 нм). Конформационные изменения, наблюдаемые с помощью CD-спектроскопии, по-видимому, не зависят от DA и DP хитозанов, только по соотношению (+/-).

Влияние наноматериалов на жизнеспособность клеток зависит от физических и химических параметров частиц (т. Е. Размера, заряда, морфологии и химического состава) и условий воздействия (типа и плотности клеток, концентрации частиц, состава среды, температуры и времени воздействия) , Хитозаны с различными характеристиками обычно демонстрируют отличную биосовместимость3435. Однако комплексы хитозан-siRNA с 50-70 избыточными положительными зарядами вызывали 20-40% цитотоксичность, когда они были представлены клеткам H129936 и 30-40% цитотоксичности, когда они были представлены клеткам NIH 3T337. Поэтому необходимо было контролировать потенциальную цитотоксичность комплексов хитозан-miRNA-145 в клетках рака молочной железы MCF-7.

Мы оценили влияние комплексов CS-miRNA путем инкубации клеток рака молочной железы MCF-7 с высокомолекулярными комплексами в течение 6 и 24 часов при различных концентрациях. Проводили три биологических независимых эксперимента, а затем анализы МТТ для определения активности митохондриальной дегидрогеназы в качестве маркера жизнеспособности клеток. Не было доказательств цитотоксичности независимо от соотношения хитозан / miRNA или DA, когда клетки подвергались воздействию в течение 6 или 24 ч комплексам в концентрациях, подходящих для трансфекции (фиг.6). Коммерческий трансфекционный реагент DharmaFECT показал наивысшую статистически значимую цитотоксичность как через 6, так и 24 часа (~ 65% жизнеспособности клеток, p ≤ 0,0001).

CLSM использовали для исследования поглощения комплексов CS HDP-12-miRNA с соотношением (+/-) заряда 1,5 в клетках рака молочной железы MCF-7. Клеточные мембраны окрашивали CellMask Deep Red, а комплексы CS-miRNA были образованы с флуоресцентно меченым miRNA-145 (фиг.7).

Образцы CLSM показали, что большинство комплексов находились в среде, окружающей клетки сразу после нанесения (нулевой момент — фиг.7А), и никакие комплексы не были обнаружены на большей глубине (Δz = 10 мкм) (время нуль — фиг.7В). Через 5 ч инкубации комплексы сохранялись на верхней поверхности мембраны, диагностируя взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью (рис.7C). Комплексы все еще не были видны на большей глубине (рис. 7D). Однако через 24 часа на верхней поверхности клеточной мембраны оставалось несколько комплексов (рис.7Е), и вместо этого они локализовались в основном при Δz = 10 мкм, что свидетельствует о наличии в цитоплазме; этот результат был более заметным после 48 ч инкубации, где наблюдалось большее количество интернализованных комплексов (фиг.7Н). Механизм поглощения оказался эндоцитозом, а внутриклеточные везикулы, содержащие комплексы CS-miRNA, можно видеть на увеличенном изображении на фиг. 7. Однако эти изображения дают только качественное свидетельство процесса интернализации с течением времени. Количественную эффективность трансфекции дополнительно оценивали с помощью количественного анализа RT-PCR. Необходимы дальнейшие механистические исследования по поглощению и торговле клетками.

Основная цель этого исследования заключалась в разработке невирусной векторной системы на основе наночастиц хитозана, которая была пригодна для доставки функциональных miRNAs в раковые клетки с использованием miRNA-145 в качестве примера. Поэтому мы определили эффективность трансфекции in vitro комплексами CS-miRNA-145 путем измерения биологической функции miRNA-145 после родов. Одна из биологических функций miRNA-145 заключается в том, чтобы подавить молекулу адгезии молекулы соединения A (JAM-A), которая может поэтому использоваться в качестве маркера для эффективности трансфекции miRNA-1453839. Мы измеряли уровень мРНК JAM-A относительно стандарта рРНК, используя количественный анализ RT-PCR на основе TaqMan, который также может обнаруживать эффекты, зависящие от дозы. Мы оценили несколько сценариев с использованием нанокомплексов при различных концентрациях (+/-) зарядовых отношениях и с различными трансфекционными реагентами. На фиг.8А показана понижающая регуляция мРНК JAM-A после трансфекции miRNA-145 в комплексе с хитозаном HDP (коэффициент заряда 1,5) при различных концентрациях, что свидетельствует о дозозависимом эффекте. Наблюдалось небольшое значительное снижение содержания мРНК JAM-A при стандартной концентрации (1x) 0,05 нмоль на лунку (p ≤ 0,01), но большее значительное влияние на дозы 5x и 10x 0,25 и 0,5 нмоль на лунку, соответственно (p ≤ 0,0001), по сравнению с контролем не трансфицированных клеток. Оба лечения вызывали уменьшение на 55% количества мРНК JAM-A. Чистый дуплекс miRNA-145 использовался как отрицательный контроль, и не было никакого воздействия на мРНК JAM-A, что указывало на то, что miRNA деградировали в среде и / или не могли пересечь плазматическую мембрану, возможно, отражая взаимные отрицательные заряды. Трансфекционный реагент DharmaFECT использовался как положительный контроль, а также достигал значительного уменьшения на 50% (p ≤ 0,0001) на уровне мРНК JAM-A. Хотя этот реагент показывает сходную эффективность трансфекции, как комплексы хитозанов in vitro, не рекомендуется для доставки гена in vivo из-за его цитотоксичности. В свою очередь, Novafect O 25, коммерчески доступный реагент на основе хитозана, также использовался в качестве положительного контроля. Мы протестировали два разных (+/-) соотношения зарядов (10 и 50), поддерживая постоянное количество miRNA. Существенного снижения уровней мРНК JAM-A при трансфекции клеток при (+/-) соотношении зарядов было 10. Трансфекция при соотношении (+/-) заряда 50 привела к значительному уменьшению менее 50% ( p ≤ 0,0001), что подтверждает, что избыток хитозана повышает эффективность трансфекции.

Мы также тестировали комплексы CS с более высоким (+/-) отношением зарядов, поскольку сообщалось о лучшей эффективности трансфекции, что отражает большее количество сайтов, доступных для взаимодействия с отрицательными зарядами на клеточной мембране. Кроме того, более высокое содержание CS может также помочь в механизме выделения гена из-за эффекта протонной губки10. Однако мы не обнаружили значительного улучшения по сравнению с комплексами с отношением зарядов 1,5 (рис.8). Кроме того, наблюдалось значительное влияние (p ≤ 0,001) DA на эффективность трансфекции, что показало лучшие результаты для CS с DA = 29% (фиг.8B).

Эффективная доставка генов является важной проблемой в генной терапии, потому что нуклеиновые кислоты отрицательно заряжены и гидрофильные. Эти характеристики препятствуют проникновению клеток в пассивную диффузию. Чтобы найти безопасный и эффективный невирусный вектор доставки miRNA, мы исследовали взаимодействие между хитозанами и miRNA и влияние полученных комплексов CS-miRNA на поглощение miRNA в клетки MCF-7 с использованием мРНК JAM-A в качестве маркера для контроля эффективности трансфекции3839. Поскольку подавление JAM-A miRNA-145 ингибирует рак молочной железы и инвазивность эндометриоидных клеток3839, успешное применение комплексов CS-miRNA-145 означает этот реагент как потенциальный кандидат на новые антиметастатические терапевтические применения.

Характеристики хитозана следует тщательно выбирать для достижения оптимального размера частиц комплексов CS-miRNA, поскольку эффективность трансфекции сильно зависит от свойств хитозана10. Мы обнаружили, что все подготовленные комплексы имели средний диаметр менее 190 нм, как сообщалось ранее для хитозановых комплексов с плазмидной ДНК и siRNA143040, что делает их пригодными для поглощения эндоцитозом. Было показано, что хитозаны с молекулярной массой 25-50 кДа полностью связывают и защищают siRNAs от деградации ферментов, предполагая, что CS-HDP, используемый в наших исследованиях, может вести себя аналогичным образом в комплексах с miRNA41.

Также было обнаружено, что более крупные комплексы были получены хитозанами с более высоким DAs, что отражает наличие дополнительных гидрофобных доменов, которые не могли образовывать электростатические связи с miRNA. Однако ожидается, что комплексы с CS более высоких DAs будут более гибкими4243 и могут поэтому использовать молекулярные конфигурации, которые являются комплементарными miRNA, тем самым защищая нуклеиновую кислоту от деградации. Эта комбинация свойств позволяет предположить, что miRNA остается стабильной в комплексах хитозана высокого DA из-за конформационной гибкости носителя, но выделяется после поглощения в клетке из-за слабых взаимодействий между двумя компонентами комплекса. Последнее необходимо для эффективной генной терапии, поэтому мы исследовали аффинность связывания между miRNA и различными хитозанами для определения механизма взаимодействия и выбора перспективного кандидата для дальнейших экспериментов.

Насколько нам известно, это первый случай, когда взаимодействие между miRNA и хитозанами было количественно оценено SPR-спектроскопией. Комплексы с более высоким ОУ показали повышенные значения КД (табл. 2). Этот вывод отражает влияние отношения зарядов в комплексах, то есть большее количество полимера требуется для обеспечения того же количества протонированных единиц глюкозамина, чтобы насытить систему. Такое поведение согласуется с предыдущими сообщениями, использующими изотермическую титровальную калориметрию для изучения взаимодействий хитозан-пДНК, где было показано, что DA и молекулярная масса влияют на структуру и стабильность комплексов CS-pDNA44. В этом случае сообщалось о хитозанах 80 кДа, что увеличение DA приводит к снижению аффинности связывания и большей стехиометрии связывания. Это было объяснено в результате электростатических взаимодействий между противоположно заряженными группами, которые определяют характеристики связывания. Следовательно, уменьшение DA хитозанов (т. Е. Увеличение плотности заряда) подразумевает, что требуется меньшее количество цепей хитозана для достижения насыщения сайтов связывания ДНК44. Тот факт, что значения коэффициента Хилла варьировались от 2,0 до 8,0 для всех систем CS-miRNA, согласуется с положительным совместным связыванием. Хорошо известно, что полиэлектролитные комплексы имеют общий характер. Это было подтверждено на полиэлектролитных комплексах на основе хитозана с каррагинанами, образующими спирали45. Взятые вместе, эти результаты SPR предполагают, что хитозаны с более высоким DA могут высвобождать miRNA в цитоплазму более эффективно, чем хитозаны низшего DA, из-за более низкой стабильности комплексов.

Первоначальная miRNA была показана с помощью CD-спектроскопии, чтобы принять конформацию A-формы33, которая подтвердила успех гибридизации и образование дуплекса между двумя олигонуклеотидными цепями. Изменение спектра CD при образовании комплексов CS-miRNA указывало на зависящее от концентрации увеличение базовой укладки. Электронное распределение оснований в dsRNA делает их гидрофобными, поэтому они стремятся укладываться в присутствии растворителей с водородной связью, чтобы минимизировать площадь поверхности π-электронов, подвергнутую воздействию растворителя. Однако гидрофильные группы, такие как NH, NH2 и СО, склонны ориентироваться к краям оснований и благоприятствовать взаимодействию с водородсодержащими растворителями. Спиральная структура образуется из-за базовых взаимодействий штабелирования, отражающих гидрофобные плоскости, гидрофильные края и взаимодействия зарядовых зарядов32. Взаимодействие с хитозанами, по-видимому, повышает базовую укладку во всех комплексах. Электронные переходы оснований хромофора находятся в непосредственной близости, что дает CD-спектры с более интенсивными полосами. Это говорит о том, что все хитозаны способны взаимодействовать с miRNA, что приводит к изменениям в конформации позвоночника и базовой укладке. Поскольку взаимодействие было обусловлено электростатическими силами, влияние на конформацию miRNA зависело от отношения (+/-) заряда, что подтверждено спектрами КР. Молекулярная масса и DA не оказали существенного влияния на конформацию, и наиболее важным свойством было количество аминогрупп на хитозановом полимере.

Хитозаны, как правило, биосовместимы, и несколько исследований подтвердили, что комплексы хитозан-олигонук-леоид показывают низкую цитотоксичность1546. Предыдущие отчеты продемонстрировали цитотоксичность высокомолекулярных хитозанов47. Однако наш анализ МТТ не показал признаков цитотоксичности после воздействия в течение 6 и 24 ч даже комплексами, содержащими самые высокие концентрации хитозана. Интернализация комплексов была исследована CLSM с использованием флуоресцентного маркера, предполагая, что комплексы взаимодействуют с мембраной и индуцируют образование эндосом, как мы ранее сообщали [6]. Предполагается, что дальнейшее высвобождение цитоплазмы обусловлено гипотезой протонной губки, которая дает убедительное объяснение диссоциации полиплекса на внутриклеточных везикулах41.

Мы обнаружили, что определенные концентрации хитозанов с определенным (+/-) отношением заряда были такими же эффективными, как коммерческие трансфекционные реагенты. Наши комбинированные данные показывают, что комплексы, содержащие низкомолекулярные хитозаны, непригодны для доставки генов, поскольку они нестабильны в трансфекционной среде и что комплексы, содержащие хитозаны промежуточного DA, эффективны. Это может указывать на достижение компромисса между образованием стабильных комплексов, способных взаимодействовать с клеточной мембраной, и достаточно неустойчивыми в пользу эндосомального высвобождения для надежной доставки miRNA в цитоплазму. Напротив, комплексы, содержащие хитозаны низшего DA, являются слишком стабильными и не освобождают груз miRNA, о чем свидетельствует высокая относительная экспрессия JAM-A и высокие константы сродства, определяемые титрованием флуоресценции в параллельном исследовании в нашей группе48. Отрицательно заряженные комплексы (т. Е. (+/-) отношения зарядов ниже 1,0) были признаны непригодными для трансфекции. Это может быть связано с тем, что плазменная мембрана несет аналогичный заряд и, следовательно, взаимодействие с комплексами не является благоприятным, а положительно заряженные комплексы эффективны только при превышении определенной концентрации. Это привело нас к выводу, что оптимальная трансфекция возникает, когда отношения молекулярной массы, DA и (+/-) зарядов идеально сбалансированы. Эта интерпретация согласуется с предыдущими выводами для комплексов хитозан-ДНК40.

В общем, катионные невирусные векторы успешно использовались для доставки siRNA и плазмидной ДНК, но не miRNA. Мы обнаружили, что хитозаны могут использоваться в качестве векторов для miRNA, если параметры композиции тщательно сбалансированы. CD-спектроскопия подтвердила, что miRNA оставалась в A-конформации при связывании с хитозаном, и мы также впервые использовали SPR-спектроскопию для количественной оценки аффинности связывания между miRNA и хитозанами с различными свойствами. Мы обнаружили, что идеальные комплексы были сформированы с использованием хитозанов с молекулярной массой ~ 40 кДа, DA 12% и отношения (+/-) заряда 1,5, что привело к эффективности трансфекции, аналогичной коммерческим реагентам, используемым в качестве положительных контролей (DharmaFECT и Novafect O 25). Мы показали, что ДА влияет на эффективность трансфекции для комплексов с эквивалентным соотношением (+/-) зарядов (8,0): более эффективная подавление гена-мишени в присутствии промежуточного ДА (~ 30%). CLSM предположил, что комплексы, возможно, были поглощены клетками. Тем не менее, точные механизмы путей внутриклеточного высвобождения остаются полностью выясненными.

Нетоксичные функциональные наноперенос, основанные на доставке miRNA, революционизируют развитие целенаправленной терапии рака. Прочная система доставки, функционализированная лигандами, которая распознает специфические рецепторы в мембранах опухолевых клеток, принесет значительные успехи в этой области, а хитозаны, как представляется, являются универсальными средствами доставки для достижения этих целей. Будущие исследования на животных моделях, направленные на получение доказательств принципа эффективности in vivo этих систем, также будут ключевыми в этом отношении.

Родительский хитозан, используемый для подготовки рабочих образцов, был предоставлен Sascha Mahtani Chitosan PVT Ltd (Veraval, India, Code 113 Batch No. 17/12/04, DA = 1,5%, Mw = 543 кДа). Было выпущено восемь высокочистых биомедицинских хитозанов с различными молекулярными массами и DA. Родительский хитозан стехиометрически растворяли в растворе уксусной кислоты в течение ночи при комнатной температуре и деполимеризовали с использованием нитрита натрия (образуя закись азота in situ, как сообщалось ранее 2425), для получения хитозанов с высокой степенью полимеризации (HDP) и низкой степенью полимеризации (LDP ), соответственно. РН повышали до> 8 путем добавления аммиака и осажденные хитозаны промывали для достижения нейтральности перед лиофилизацией. HDP и LDP хитозаны повторно ацетилировали, растворяя их стехиометрически в растворе уксусной кислоты до концентрации 12,5 мг / мл и последовательно пропуская их через фильтры 5, 1,2, 0,8 и 0,45 мкм для удаления агломератов и снижения полидисперсности. Затем добавляли уксусный ангидрид и 1,2-пропандиол, и реакционные смеси инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакции останавливали осаждением, как описано выше49. Лиофилизированные образцы использовали для получения наночастиц.

Относительную вязкость серии разбавленных растворов хитозана с различными концентрациями в 0,3 М уксусной кислоте и 0,2 М ацетата натрия измеряли при 25 ° С (угол наклона 50 °) с использованием микровискометметра автоматизированного качения шара AMVn (Anton Paar, Ostfildern, Germany ) с программируемым углом трубки, основанным на принципе времени шара качения (время, необходимое для того, чтобы стальной шарик катился в калиброванном капилляре диаметром 1,6 мм). Средние результаты, полученные из четырех пробегов, были выражены как характеристическая вязкость [η] и как средняя молекулярная масса вязкости () с использованием параметров Mark-Houwink282950. DA определяли 1 H-ЯМР при 300 МГц и комнатной температуре с использованием спектрометра Bruker AV300 NMR (Bruker, Bremen, Germany) 2627. ЯМР-образцы (~ 5 мг) растворяли в 0,5 мл смеси хлорида дейтерия (ДСl) и дейтерированной воды (D2O) с ~ 5% стехиометрическим избытком DCl над молярным содержанием глюкозамина соответствующего хитозана. Затем образец сушили вымораживанием и повторно растворяли в D2O три раза для удаления обменных протонов.

Одноцепочечные микроРНК hsa-miR-145-5p (5′-GUC CAG UUU UCC CAG GAA UCC CU-3 ‘) и hsa-miR-145-3p (5′-GGA UUC CUG GAA AUA CUG UUC-3’) были приобретены у Biomers (Ульм, Германия). Их растворяли в воде без РНКазы для получения растворов равной концентрации (50 мкМ), перемешивали и нагревали до 90 ° С в течение 4 мин для удаления вторичных структур. Затем растворы охлаждали до 40 ° С и инкубировали в течение 3 ч для содействия гибридизации. Образование двухцепочечной miRNA-145 анализировали 15% -ным полиакриламидным гель-электрофорезом с 1 × TAE-буфером. На каждую полосу загружали 5 мкл образца (5 мкМ), смешанного с 2 × РНК-загружающим красителем (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, США). Мы использовали в качестве маркера линейную ДНК-лестницу генератора ультранизкого диапазона (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, США), которая содержит 11 отдельных фрагментов ДНК, очищенных хроматографией. Электрофорез проводили при постоянном напряжении 120 В в течение 90 мин. Гель окрашивали SYBRGold (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Полосы РНК были визуализированы с использованием ультрафиолетового трансиллюминатора (AAB Advanced American Biotechnology, CA, USA), и изображение геля было захвачено видеокамерой (модель CCD-440, AAB Advanced American Biotechnology, CA, USA).

Полностью охарактеризованные хитозаны использовались для получения полиплексов CS-miRNA. Хитозаны растворяли в стехиометрических количествах HCl до концентрации запаса 1 мг / мл и затем разбавляли милли-водной водой для достижения желаемой концентрации амина (деацетилированные группы). Затем была подготовлена ​​серия комплексов с различными отношениями зарядов (+/-, определяемая как молярное отношение аминов к фосфатным группам) путем смешивания рабочих растворов хитозана с постоянным количеством miRNA (5 мкМ). Смеси инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С1140.

Для определения гидродинамического размера и дзета-потенциала вышеописанных комплексов CS-miRNA образцы анализировали при 37 ° C в Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания). Гидродинамический размер определяли путем динамического рассеяния света в аликвотах по 100 мкл. Образцы затем разбавляли до 1 мл и измеряли дзета-потенциал путем определения электрофоретической подвижности. Все измерения проводились в трех экземплярах и представлялись как среднее из трех измерений ± стандартное отклонение.

Полиплексы визуализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) с использованием 10 мкл образцов (5 мкМ в воде без РНКазы), разбавленной 1:10 без РНКазы, и смешивали с 10 мкл 1% (мас. / Об.) Уранилацетата для отрицательного окрашивания. Затем 10 мкл образцов осаждали на медную сетку, покрытую пленкой Formvar®. Излишнюю жидкость заливали фильтровальной бумагой. Изображения были сняты с использованием Philips CM100 TEM (Эйндховен, Нидерланды). Изображения обрабатывались с помощью ImageJ v1.49n для расчета среднего диаметра частиц (n = 8).

Биотинилированный hsa-miR-145-5p был приобретен у Biomers (Ulm, Germany). Все эксперименты по спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) проводили с использованием прибора Biacore 3000 (Biacore, Uppsala, Sweden) при 20 ° C. Буфер HBS-EP (GE Healthcare, Уппсала, Швеция) использовали в качестве бегущего буфера для иммобилизации (буфер иммобилизации) и ацетатного буфера (35 мМ ацетата натрия, рН 5,1, содержащего 10 мМ NaCl) использовали в качестве бегущего буфера во время измерения. Все буферы были приготовлены в воде, свободной от РНКазы, стерильно отфильтрованной и дегазированной перед использованием. Перед иммобилизацией поверхность чипа датчика стрептавидина (GE Healthcare, Уппсала, Швеция) трижды загрунтовали иммобилизационным буфером и получали три раза при введении 20 мкл 50 мМ NaOH / 1 М NaCl при скорости потока 20 мкл / мин , Поверхность промывали иммобилизационным буфером до тех пор, пока не была достигнута стабильная базовая линия, затем вводили 70% (мас. / Мас.) Глицерина (BIAnormalizing solution от GE Healthcare) для предотвращения неточностей, вызванных расходящимися отражательными свойствами. После тригровки системы трижды 400 единиц ответа (RU) одноцепочечной РНК (40 нМ) иммобилизировали со скоростью 5 мкл / мин. Однокаскадная ячейка оставалась пустой как ссылка. Перед первым измерением чип регенерировали с использованием двух инъекций 10 мкл регенерационного буфера (1 М NaCl / 6 мМ HCl). Затем иммобилизационный буфер затем обменивали с измерительным буфером на этапах грунтования. Сенсорныеграммы регистрировали со скоростью потока 20 мкл / мин. В начале каждого цикла поверхность кристалла уравновешивалась измерительным буфером в течение 3 мин. Затем в течение 4 мин вводили 20 мкл каждого хитозана в бегущем буфере. Фазу диссоциации контролировали в течение 5 мин с последующей стадией регенерации с двумя 10 мкл инъекциями буфера для регенерации и поверхность промывали бегущим буфером еще на 5 мин. Среднее значение двух измерений использовалось для анализа данных, а RU на равновесной фазе оценивали с помощью нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Software, Сан-Диего, США).

Конформационные изменения в дуплексных miRNAs, вызванные взаимодействием с хитозанами, анализировали с использованием спектрофотометра кругового дихроизма AVIV 400 (штат Мэриленд, США). Каждый 100 мкл образца микроРНК (10 мкМ) смешивали с 100 мкл раствора хитозана в 6 мМ HCl с образованием комплексов с (+/-) соотношениями заряда от 0,6 до 8. Образцы инкубировали в течение 30 мин и помещали в 1 мм кварцевые кюветы, а спектры регистрировались при 25 ° C и скорости сканирования 200 нм / мин от 320 до 200 нм с временем отклика 1 с и шагом полосы пропускания и данных 1 нм. Каждый спектр был накоплен из трех сканирований.

Клетки MCF-7 (10 000 клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО2. Среду удаляли и клетки дважды промывали средой, свободной от сыворотки RPMI. Комплексы готовили в бессывороточной среде RPMI и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С. Затем мы добавляли по 100 мкл каждого образца к клеткам и инкубировали их в течение 6 и 24 ч при 37 ° С и 5% СО2. Жизнеспособность клеток определяли путем измерения активности дегидрогеназы. Мы изменили среду и применили 100 мкл свободной от сыворотки среды RPMI с 25 мкл МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида) (5 мг / мл) в каждую лунку и инкубировали клетки в течение 4 ч при 37 ° С и 5% СО2, чтобы обеспечить образование фиолетовой формазановой соли. Среду заменяли на 100 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов формазана и планшеты инкубировали еще 15 мин при 37 ° С и 5% СО2 перед измерением поглощения при λ = 570 нм с использованием микропластинчатого считывателя (SAFIRE II , Tecan Group Ltd., Männedorf, Швейцария).

Мы исследовали внутриклеточный перенос нанокомплексов, содержащих 6-FAM-hsa-miR-5p (Biomers, Ulm, Germany). Клетки MCF-7 культивировали в 35-миллиметровых чашках со стеклянным покровным днищем. Клетки трансфицировали 5 мкмоль 6-FAM-hsa-miR-5p в виде комплекса с HDP-12 при соотношении заряда (+/-) 1,5 в течение 24 часов. Поглощение miRNA оценивали через 0,5, 4, 24 и 48 ч после трансфекции с использованием Leica TCS SP2, установленного на инвертированном микроскопе Leica DM IRES. В каждый момент времени трансфекционную среду удаляли и клеточные мембраны окрашивали CellMask Deep Red в течение 10 мин при 37 ° C по протоколу производителя (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, США). Клетки дважды промывали при 37 ° С забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим кальций и магний, как это было предусмотрено изготовителем. CellMask Deep Red визуализировалась на длинах волн возбуждения и излучения 649 и 666 нм соответственно, тогда как 6-FAM-hsa-miR-5p визуализировалась на длинах волн возбуждения и излучения 488 и 518 нм соответственно.

Трансфекционные анализы проводились в условиях, предусмотренных стандартным протоколом, рекомендованным для DharmaFECT. Вкратце, мы использовали постоянный объем 10 мкл miRNA-145 (5 мкМ) на трансфекцию, смешанный с различными хитозанами для достижения желаемого отношения молярного заряда. Комплексы разбавляли до 400 мкл минимальной средой RPMI и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С. Клетки MCF-7 высевали в 6-луночные планшеты (250 000 клеток на лунку) и инкубировали в течение 24 ч до трансфекции. Затем среду удаляли и заменяли 1600 мкл полной среды RPMI, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (FCS), и добавляли 400 мкл каждого комплексного раствора (в минимальной среде RPMI). Клетки инкубировали с трансфекционной средой в течение 24 ч при 37 ° С и 5% СО2, заменяли полной средой RPMI, содержащей 10% FCS, и инкубировали еще 24 часа. Контрольные клетки инкубировали только с средой (1600 мкл полной среды RPMI, содержащей 10% FCS и 400 мкл минимальной среды RPMI). Мы также подготовили контрольные образцы, содержащие чистую miRNA, DharmaFECT (Thermo Fischer Scientific Inc., Waltham, США), загруженную miRNA, и Novafect O 25 (Novamatrix, Sanvika, Norway), содержащую miRNA с двумя разными отношениями. В этих последних случаях мы следовали протоколам трансфекции производителей.

Общая РНК была выделена с использованием набора мини-наборов ДНК / РНК innuPREP (Analytik Jena AG, Йена, Германия) и количество очищенной полной РНК определяли путем измерения поглощения при λ = 260 нм с использованием спектрофотометра Эппендорфа (Гамбург, Германия). Синтез первой нити кДНК проводили с использованием 2 мкг изолированной РНК и комплекта обратной транскрипции с кДНК высокой емкости в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems, Калифорния, США).

Эффективность трансфекции оценивали, измеряя изоляцию мРНК молекулы адгезии J (JAM-A), являющейся прямой мишенью miRNA-145, которая кодируется геном F11R39. Мы использовали кДНК, соответствующую 0,05 мкг общей РНК, в качестве матрицы для ПЦР-амплификации с экспрессионными системами ABI Master Mix и TaqMan. Мы использовали зонд Hs00170991_m1 (F11R) для количественного определения уровней мРНК JAM-A и зонда Hs99999901_s1 (18S) для нормализации уровней мишеней мишеней к обилию 18S рРНК. Количественная ПЦР в реальном времени проводилась с использованием системы обнаружения последовательности ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) с условиями термического циклирования по умолчанию. Относительный уровень экспрессии JAM-A был рассчитан с использованием соответствующих значений Ct, нормированных на значения, записанные в контрольных клетках.

Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Software Prism v6 (Сан-Диего, США). Все эксперименты были статистически проанализированы с использованием непараметрических тестов с использованием теста Крускала-Уоллиса для сравнения непараметрических данных. Все биологические эксперименты проводились, по крайней мере, в трех экземплярах, и технические репликации варьировались от 3 до 8. Все обработки независимо друг от друга сравнивались с контролем клеток, инкубированных только со средой. Статистические значимые различия оценивались по значениям р.

Как процитировать эту статью: Santos-Carballal, B. et al. Физико-химическая и биологическая характеристика нанокомплексов хитозан-микроРНК для доставки генов в клетки рака молочной железы MCF-7. Sci. По донесению
5, 13567; doi: 10.1038 / srep13567 (2015).

Мы признаем финансовую поддержку и стипендию PhD для BSC от Немецкого исследовательского совета DFG (Project GRK 1549 International Research Training Group «Молекулярные и сотовые глико-науки»); от Датского агентства по науке, технике и инновациям, Дания (проект FENAMI 10-093456); исследования, ведущие к этим результатам, также получили финансирование от Седьмой рамочной программы Европейского Союза по исследованиям, технологическому развитию и демонстрации в соответствии с соглашением о грантах № 613931. Мы благодарны д-ру Клаусу Кворртупу из Копенгагенского университета за помощь в создании изображений ТЕА. Мы в долгу перед профессором Петром Брукнером и профессором Йоханнесом Эбле (Uniklinikum Münster) за щедрые возможности доступа к инструменту CD. Мы также обязаны проф. Эдвину Р. Моррису провести глубокие дискуссии. Мы благодарим доктора Ричарда Твимана за критическое чтение рукописи.

Авторские вклады B.S.C. и L.J.A. провели эксперименты. B.S.C., M.R., S.P., M.G. и F.M.G. задумал эксперименты. B.S.C., M.R. и F.M.G. написал рукопись. B.S.C., L.J.A. и М. Р. проанализировали данные. N.S., B.M.M., M.G. и F.M.G. способствовали интерпретации экспериментов. Все авторы рассмотрели рукопись.

Лэнд-коды: Лендер ДНК с низким уровнем молекулярного генератора M. Generuler; 1. hsa-miR-145-3p; 2. hsa-miR-145-5p; 3. miRNA-145.

Z-средний диаметр и индекс полидисперсности (PDI) комплексов, составленных с (A) высокой степенью полимеризации CS и (B) низкой степенью полимеризации CS; соответствующие значения дзета-потенциала для комплексов, образованных с (С) высокой степенью полимеризации CS, и (D) низкая степень полимеризации CS (n = 3, среднее значение ± SD).

Вложенная таблица показывает измеренный диаметр комплексов с использованием ImageJ v1.49n (n = 8, среднее значение ± SD).

Связывание анализировали в ацетатном буфере (35 мМ, рН 5,1, содержащем 10 мМ NaCl) на чипе датчика стрептавидина. Увеличение концентрации хитозана вводили в течение 20 с при 20 мкл / мин до тех пор, пока поверхность не была насыщена. Бары представляют собой максимальное и минимальное значения (n = 2).

Концентрация miRNA поддерживалась при постоянной 5 мкМ во всех экспериментах. Спектры были получены путем вычитания эффекта буфера и хитозана.

Жизнеспособность клеток была выражена относительно необработанных клеток. Положительным контролем были клетки, обработанные DharmaFECT (0,2 мкл / лунка), Novafect O 25 и Triton X-100. Концентрация miRNA была постоянной (1х = 0,002 нмоль / лунка). Данные представляют собой средние значения (± SD) трех независимых биологических экспериментов и восемь технических повторов. Статистические сопоставления были между каждой обработкой и контролем необработанных клеток с использованием непараметрического теста Крускал-Уоллиса (*** p ≤ 0,001; **** p ≤ 0,0001).

Горизонтальная ось: оптические секции при увеличении высоты (z-значения) Вертикальная ось: время инкубации: 0, 5, 24 и 48 ч. Красное флуоресцентное окрашивание = клеточная маска Глубокая красная окраска мембраны, зеленое флуоресцентное окрашивание = комплексы CS HDP-12-miRNA, меченные 6-FAM-hsa-miR-5p.

(A) Комплексы, содержащие CS HDP-12 при (+/-) соотношении зарядов = 1,5; (B) Комплексы, содержащие CS HDP-1.9, HDP-12, HDP-29 и HDP-49 при соотношении (+/-) заряда = 8. Дуплексная miRNA (доза 1x = 0,05 нмоль / лунка), DharmaFECT (5 мкл / лунка ) и Novafect O 25 использовали в качестве контролей. Данные представляют собой средние значения (± SD) трех независимых биологических экспериментов и трех технических повторов. Статистические сопоставления были между каждой обработкой и контролем необработанных клеток с использованием непараметрического теста Крускал-Уоллиса (*** p <0,001; **** p <0,0001).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *