Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генерация моноклональных антител против MGA и сравнение их применения при выявлении рака молочной железы с помощью иммуногистохимии

Generation of monoclonal antibodies against MGA and comparison of their application in breast cancer detection by immunohistochemistry
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4536492/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Маммаглобин A (MGA) является молекулярным биомаркером, специфичным для органа, для диагностики метастатического рака молочной железы. Тем не менее, по-прежнему необходимо разработать оптимальные моноклональные антитела (mAb) для определения экспрессии MGA в карциноме молочной железы с помощью иммуногистохимии. В этом исследовании мы впервые создали mAb против MGA. Затем мы использовали предсказание эпитопов и компьютерный структурный анализ для экранирования пяти доминирующих эпитопов и идентифицировали mAb против пяти эпитопов. Дальнейший иммуногистохимический анализ 42 образцов карциномы молочной железы показал, что MHG1152 и MGD785 интенсивно окрашиваются преимущественно в мембрану, тогда как CHH11617, CHH995 и MJF656 имеют более интенсивное окрашивание в цитоплазме. Результаты оценки MGA показали, что MJF656 имел самый высокий показатель (92,8%) положительного окрашивания среди пяти mAb, включая более высокую интенсивность окрашивания по сравнению с MHG1152 (p <0,01) и CHH995 (p <0,05) и самый высокий средний процент клеток, окрашенных среди mAb. Кроме того, мы проанализировали соотношение положительной скорости окрашивания с помощью mAb с клиническими характеристиками пациента. Полученные результаты свидетельствуют о том, что MJF656 удалось обнаружить экспрессию MGA, особенно на ранней клинической стадии, низкосортный и лимфатический узел - метастазирование отрицательной карциномы молочной железы. В заключение, наше исследование породило пять mAb против MGA и определило лучшего кандидата для обнаружения экспрессии MGA в тканях рака молочной железы.

Рак молочной железы является наиболее распространенным раком у женщин и второй ведущей причиной смертности от рака у женщин во всем мире1. Частота и смертность от рака молочной железы продолжают расти не только в западном мире2, но и в азиатских странах3. Дистальные метастазы рака молочной железы являются основной причиной смерти, поэтому улучшение раннего выявления и диагностики метастазов рака молочной железы будет способствовать снижению смертности от рака молочной железы.

Маммаглобин A (MGA) представляет собой связанный с мембраной 93-аминокислотный белок, который относится к суперсемейству секреторнобинов45. Было показано, что экспрессия MGA ограничена грудным органом, и она выражается на более низком уровне в нормальном грудном эпителии, но на более высоком уровне в ткани рака молочной железы6. Важно отметить, что экспрессия MGA или экспрессия высокого уровня путем иммуногистохимического окрашивания была обнаружена примерно в 80 ~ 90% от интрадуктивной карциномы и инвазивной протоковой карциномы7. MGA используется в качестве биомаркера для диагностики рака молочной железы и прогноза68910111213. Используя вложенный анализ полимеразной цепной реакции обратной транскриптазы (RT-PCR), MGA можно было легче обнаружить в метастатической группе рака молочной железы, чем здоровые контрольные группы и рак молочной железы без группы метастазов в образцах периферической крови14. Обычно используемые биомаркеры рака молочной железы, включая карциноэмбриональный антиген (СЕА) и СА15-3, редко повышаются на ранней стадии метастаза и не повышаются у многих пациентов с метастазами1516. Из-за его специфического и дифференциального экспрессии в ткани молочной железы MGA может служить биомаркером для рака молочной железы для оценки вторичных опухолей из неизвестных первичных сайтов171819202122. Что еще более важно, MGA можно использовать в качестве метастатического биомаркера рака молочной железы для выявления наличия микрометастаза в костном мозге23 и лимфатического узла24. Чувствительность и специфичность обнаружения метастазов в лимфатических узлах рака молочной железы можно достичь при 90% и 94% соответственно, когда MGA объединяют с цитокератином-19 (CK19) и используют в качестве диагностического теста24. Таким образом, MGA используется как специфический биомаркер для диагностики метастазов рака молочной железы с иммуногистохимическим методом18192526.

Однако имеющиеся коммерчески доступные mAb MGA для иммуногистохимического окрашивания показали ограниченную чувствительность и специфичность. В свете важности МГА при диагностике и прогнозе рака молочной железы, о чем сообщалось выше, необходимо срочно создать эффективные антитела для специфического выявления МГА с хорошей иммуногистохимической реактивностью в тканях карциномы молочной железы. В этом исследовании мы создали несколько mAb MGA после выполнения прогноза эпитопа в сочетании с компьютерным моделированием и анализом стыковки. Характеристики генерируемых mAb оценивали и сравнивали для обнаружения экспрессии MGA иммуногистохимией. В дополнение к разработке mAb MGA с хорошей иммуногистохимической реактивностью, наше исследование показало, что предсказание эпитопа, за которым следуют компьютерное моделирование и док-анализ, является хорошей стратегией для генерации mAb.

Генерирование mAb проводили, как показано в материалах и методах. Для выбора и идентификации mAb мы сначала использовали программное обеспечение Biosun для прогнозирования доминантных эпитопов белка MGA. Как показано на фиг.1А, были предсказаны пять доминирующих эпитопов (А-Е), относительные последовательности которых показаны ниже графика. Используя метод гидротерапии Kyte & Doolittle, были изучены гидрофобные и гидрофильные свойства MGA. Как показано на фиг.1B, четыре эпитопа (эпитоп A-D) все обладали сильной гидрофобной областью, в то время как последний эпитоп, эпитоп E, имел гидрофильную область с 71-82 аминокислотными остатками.

Чтобы идентифицировать, участвуют ли в упомянутых пяти эпитопных областях MGA в взаимодействиях антиген-антитело, стабильную трехмерную структуру MGA строили с использованием компьютерного метода моделирования гомологии, как показано на фиг.2. Кроме того, упомянутые выше эпитопы были отображается в трехмерной структуре. Как показано на рисунке 2, все эпитопы были расположены в области поворота трехмерной структуры МГА. Кислотные аминокислотные остатки подвергали действию растворителя и могли легко взаимодействовать с экранированным антителом. Поэтому вышеупомянутые пять эпитопов являются хорошими кандидатами на выбор и идентификацию mAb. Между тем, изотип антитела был идентифицирован на каждом генерируемом антителе (дополнительная таблица 1).

Для исследования реакционной способности генерируемых mAb при обнаружении MGA на последовательных парафиновых срезах ткани карциномы молочной железы была проведена иммуногистохимия на 42 образцах карциномы молочной железы. Клинические и патологические характеристики пациентов с раком молочной железы были показаны в таблице 1. Как показано на фиг.3А, иммуноокрашивание MHG1152 и MGD785 с анти-MGA было неоднородным и происходило как в цитоплазме, так и в клеточной мембране, главным образом в клеточной мембране, тогда как анти-MGA иммуноокрашивание CHH11617, CHH995 и MJF656 было более обширным в цитоплазме (фиг.3А).

Как показано на фиг.3В, MGD785 показал четкое окрашивание в выделениях молочной железы, которые не были обнаружены другими mAb. Важно отметить, что окрашивание MJF656 наблюдалось в опухолевых клетках, которые просачивались как в полость молочной железы, так и в кровеносные сосуды (фиг.3C). Вышеприведенные данные показали, что mAb MGA против разных эпитопов имеют различные образцы иммуноокрашивания в тканях молочной железы.

Чтобы дополнительно характеризовать реактивность mAb при иммуноокрашивании, положительную скорость окрашивания оценивали в соответствии с интенсивностью окрашивания и процентом окрашенных клеток. Как показано в дополнительной таблице 2, однозначное положительное окрашивание наблюдалось у 39 из 42 случаев (92,8%) с MJF656 Ab, тогда как положительное окрашивание наблюдалось только в 22 из 42 случаев (52,4%) с MHG1152 Ab. 16 из 42 случаев были отмечены как +3 при окраске MGD785 Ab, а положительная — 57,1%. Для лучшей оценки mAb наносили и сравнивали интенсивность окрашивания и процент клеток, окрашенных каждым mAb, и сравнивали, как показано на рисунке 4. Разница в интенсивности между MJF656 и MHG1152 была статистически значимой (p <0,01), а разница между MJF656 и CHH995 также значительна (p <0,05) (фиг.4A). Однако не было обнаружено существенной разницы при сравнении интенсивности окрашивания MJF656 с показателем MGD785 или CHH11617 (фиг.4A). Как показано на фиг.4B, средний процент окрашенных клеток с MJF656 был самым высоким среди всех пяти mAb. Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что MJF 656 является лучшим из пяти mAb для иммуноокрашивания MGA в тканях карциномы молочной железы.

Чувствительность и специфичность mAb MGA были суммированы в таблице 2. Чувствительность mAb оценивалась положительной экспрессией MGA в 42 случаях рака молочной железы. Было ясно, что MJF656 имеет более высокую диагностическую чувствительность по сравнению с другими mAb MGA, значение p <0,001 во всех случаях, за исключением сравнения с CHH11617. Специфичность mAb MGA оценивали экспрессию в карциноме плоскоклеточного рака легких, аденокарциноме легкого, раке толстой кишки, раке прямой кишки, цервикальном полипе и раке пищевода, которые, как предполагается, не имеют экспрессии белка MGA. Но окрашивание MHG1152, MGD785, CHH11617, CHH995 и коммерчески доступного mAb MGA наблюдалось при карциноме легкого плоскоклеточного рака и полипах шейки матки (рис.5). Никакое окрашивание каким-либо из тестируемых mAb MGA не наблюдалось при аденокарциноме легких, раке толстой кишки, раке прямой кишки и раке пищевода (фиг.5). MJF656 показал специфическое окрашивание нормальной грудной клеткой (рис.5).

Соотношение реактивности Ab при иммуноокрашивании с клиническими характеристиками 42 случаев анализировалось на основании клинических данных пациентов, включая патологический тип рака молочной железы, гистологический ранг, клиническую стадию и метастазы в лимфатические узлы (рис.6). Результаты статистического анализа были показаны в дополнительной таблице 3. На рисунке 6А показаны положительные MGA-выражения в различных патологических типах рака молочной железы. MJF656 имел значительно более высокую положительную скорость окрашивания (88%) в инфильтрационной протоковой карциноме (IDC) по сравнению с другими антителами (p <0,05 во всех случаях, за исключением CHH11617). Инфильтрационная дольковая карцинома (ILS) и карцинома in situ (ISC), окрашенная MJF656, была положительной в 100% случаев. Кроме того, CHH995 показал положительное окрашивание во всех 9 ILS, но с очень низкой реактивностью с другими двумя патологическими типами рака молочной железы. Как показано на фиг.6В, все 14 случаев карциномы молочной железы первой стадии показали окрашивание MJF656; p меньше 0,01 во всех случаях по сравнению с MGD785, CHH995 и MHG1152. Что касается рака молочной железы стадии 2, положительная скорость окрашивания MJF656 выше, чем MHG1152 (p <0,05) (дополнительная таблица 3). При сравнении положительной экспрессии MGA в соответствии с гистологическим классом MGD785, CHH11617 и MJF656 показали хорошее окрашивание во всех образцах ткани 5 G1 (фиг.6C). Реакционная способность MJF656 в карциноме молочной железы G1 лучше, чем MHG1152 (p = 0,05) (дополнительная таблица 3). Важно отметить, что все образцы рака молочной железы, поражающие метастазы в лимфатические узлы, были окрашены MJF656 (фиг.6D). Положительная скорость окрашивания MJF656 в образцах рака молочной железы с метастазами в лимфатические узлы значительно выше, чем у MGD785, CHH995 или MHG1152 (p <0,01 во всех случаях) (дополнительная таблица 3). В целом, MJF656 может быть лучшим кандидатом для обнаружения MGA на ранних стадиях, пациентов с низким уровнем метастазирования и рака молочной железы с низким клиническим и лимфатическим узлами. В то время как CHH11617 может быть более подходящим для поздних стадий, пациентов с раком молочной железы с высоким уровнем и лимфатическим узлом по сравнению с MGD785 или CHH995 (фиг.6) (дополнительная таблица 3).

В качестве специфического биомаркера опухоли молочной железы MGA является важным инструментом для выявления первичного и метастатического рака молочной железы и мониторинга метастазов лимфатических узлов рака молочной железы с иммуногистохимическим методом. Поэтому мы решили разработать специфические mAb для определения экспрессии MGA в ткани опухоли молочной железы с помощью иммуногистохимического анализа. Не существует надежного метода предсказания того, какой mAb будет работать в иммуногистохимии, поэтому мы провели иммуногистохимическое окрашивание на серийных парафиновых отделах карциномы молочной железы с использованием пяти генерируемых mAb. Мы обнаружили, что все пять моноклональных антител хорошо работают при иммуногистохимическом окрашивании, хотя интенсивность окрашивания и процент клеток, окрашенных mAb, различны. Среди них MJF656 имел самую высокую положительную скорость окрашивания 92,8%. Кроме того, мы изучили отношения окрашивания mAb с клиническими характеристиками пациентов с раком молочной железы. Эти исследования показали, что MJF656 является наиболее подходящим mAb для обнаружения белка MGA иммуногистохимией на ранней стадии карциномы молочной железы низкого ранга. Это может быть связано, по крайней мере, частично, с более высоким сродством MJF656 к эпитопу, используемому для генерации Ab по сравнению с другими mAb.

В этом исследовании мы также обнаружили мембранное окрашивание MGA с использованием MHG1152 и MGD785, но не с другими тремя mAb. Гидрофобный анализ показал, что области пептида A-D, против которых были получены MHG1152, MGD785, CHH11617 и CHH995, являются гидрофобными, тогда как область пептида E, против которой был получен MJF656, является гидрофильной, что может дать хорошие объяснения для лучшего окрашивания цитоплазмой MJF656. Кроме того, различие в иммуноокрашивании с помощью различных mAb также может быть связано с воздействием антигенного эпитопа в разных средах (таких как кровь, выделения молочных желез). Более того, мембранный MGA-белок может быть использован для доставки лекарственного средства для рака молочной железы, поэтому MHG1152 и MGD785 могут использоваться в качестве целевого антитела для будущей целевой терапии MGA. Поскольку специфическое окрашивание для отшелушенных клеток, MJF656 может быть использовано для обнаружения эрозии рака молочной железы в кровеносных сосудах во льду во время операции. В частности, MJF656 может быть хорошим кандидатным антителом для идентификации клеток рака молочной железы, которые были захвачены системой обнаружения CTC (CELLSEARCH® Circulation Tumor Cell (CTC) Test) в качестве специфического окрашивания в расслаированных клетках. Кроме того, наше исследование по применению пяти mAb при обнаружении MGA в сыворотке уже ведется.

mAb, генерируемые против разных эпитопов, показали различную иммуногистохимическую реактивность и окрашивание, что выявило, что выбор антитела является ключевым фактором, который может повлиять на воспроизводимость и количественную ценность иммуногистохимического окрашивания. Кроме того, неправильный выбор антител приведет к неправильным результатам клинического прогноза. Важно отметить, что настоящее исследование доказало, что компьютерный белковый структурный анализ является полезным инструментом для разработки диагностических реагентов для обнаружения антигенов в лабораторных и клинических образцах.

Все экспериментальные протоколы, связанные с работой на животных, были одобрены Комитетом по уходу за животными Института фундаментальных медицинских наук. Все методы проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по уходу за животными. pBV220 / hMGA (8-93aa) использовали в качестве иммуногена шестимесячным самкам BALB / c мышей. Животных иммунизировали три раза подкожно, примерно через 4 недели, с 50 мкг белка в полном адъюванте Фрейнда (Sigma). Через три дня после последней инъекции клетки селезенки от иммунизированных мышей сливали с клетками миеломы Sp2 / 0 (АТСС) в соотношении 10: 1. Гибридомы отбирали и идентифицировали положительные лунки с использованием непрямого ELISA с пептидами MGA A-E (см. Фиг.1А) в качестве антигенов. mAb очищали с помощью набора для очистки моноклональных IgG Melon ™ (Thermo scientific) и изотипировали с помощью Rapid Isotyping Kit (Thermo scientific).

Все пациенты были должным образом проинформированы, и каждому человеку было получено письменное информированное согласие. Все методы проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами Комитета по этике Института основных медицинских наук и Аффилированной больницы 307. В исследование были включены 42 пациента с диагнозом рака молочной железы в возрасте от 29 до 86 лет. Их первичные опухоли удаляли хирургическим путем и подвергали иммуногистохимическому анализу. Характеристика пациентов была основана на их опухолевой стадии и метастазировании лимфатических узлов, которая показана в таблице 1. Среди 42 исследованных больных раком молочной железы наиболее часто встречающимся раком была инвазивная протоковая карцинома (59,5%), а затем инфильтрирующая дольковая карцинома ( 21,4%). 61,9% пациентов были отрицательными для метастазов в лимфатические узлы. Наиболее часто встречающимся клиническим этапом был этап II (42,9%) и 59,5% пациентов были в гистологическом классе II.

Вкратце, 3 мкм срезы были получены из готовых формалином, содержащих парафин в клетках препаратов. Выделение индуцированного тепловым излучением применяли с 0,02 М концентрацией цитратного буфера (рН 6,0) в нагревателе в течение 10 мин. Иммуноокрашивание проводили с mAb против MGA при 4 ° C в течение ночи в темной влажной камере. После промывки слайдов в PBS применяли систему стрептавидин-биотин. DAB (3, 3′-диаминобензидин) использовали для развития цвета. Секции контрастировали гематоксилином, обезвоживали и монтировали с нейтральной смолой. Подготовлены соответствующие положительные и отрицательные контрольные слайды.

Для двойного окрашивания MGA и CD34 секции инкубировали с 1: 1 объемной смесью мышиного mAb (MJF656) и Rabbit CD34 mAb (ZA0550, ZSGB-BIO, Beijing) в буфере (1% бычьего сывороточного альбумина в PBS) при 4 ° C в течение ночи в темной влажной камере. Секции сначала инкубировали с конъюгированным с HRP антителом против кролика козы (ZB2301, ZSGB-BIO, Пекин) в течение 0,5 ч при комнатной температуре, а DAB использовали для развития цвета. Затем секции инкубировали с AP-конъюгированным козьим антимышиным вторичным антителом (SAP-9102, ZSGB-BIO, Beijing), а затем с развитием цвета с AP-red (ZLI-9042, ZSGB-BIO, Beijing). Наконец, срезы контрастировали с гематоксилином, обезвоживали и монтировали с Clearmount (ZLI9553, ZSGB-BIO, Пекин).

Основываясь на последовательности MGA, хранящейся в базе данных Swissport (код ID, Q13296), вторичная структура MGA была проанализирована с использованием метода GOR IV2728. Используя методы моделирования гомологии с компьютерным управлением27, трехмерная структура MGA была построена на основе предсказанной вторичной структуры MGA. При моделированной трехмерной структуре MGA в качестве исходной конформации оптимизированная трехмерная структура MGA была получена на основе метода молекулярной минимизации под действием поля CVFF и Charmm force27. Все расчеты выполнялись с использованием программного обеспечения InsightII2000 (MSI, Сан-Диего, Калифорния) на рабочей станции SGI (www.sgi.com).

Оценка MGA в образцах тканей была основана на интенсивности окрашивания и процентной окраски окрашенных клеток следующим образом: отрицательный (0), слабый положительный с менее 10% окрашенных клеток (+1), умеренный положительный с 11-50% окрашенными клетками (+2) и сильным положительным с более чем 51% окрашенными клетками (+3). Скоринг MGA показан в дополнительной таблице 2. Оценка> +1 считалась положительным окрашиванием.

Интенсивность окрашивания и процент клеток, окрашенных каждым антителом, сравнивали с использованием непарного t-теста с коррекцией Уэлша. Пирсонский хи-квадрат и точный критерий Фишера были использованы для сравнений в сравнении чувствительности и специфичности и скорости положительного окрашивания mAb с сопоставлениями клинических характеристик пациентов с mAb MGA. Во всех случаях р <0,05 считалось статистически значимым.

Как процитировать эту статью: Duan, C. et al. Генерация моноклональных антител против MGA и сравнение их применения при выявлении рака молочной железы с помощью иммуногистохимии. Sci. По донесению
5, 13073; doi: 10.1038 / srep13073 (2015).

Мы благодарны пациентам за то, что они разрешили использовать их ткани для этого исследовательского проекта. Эта работа была поддержана Национальной научно-исследовательской программой в области высоких технологий (2011AA02A120, 2011-2015 годы).

Вклад автора Представленная здесь работа была проведена в сотрудничестве между всеми авторами. C.M.D., X.Q.Y. и X.H.Z. выполнил большую часть экспериментов. J.N.F. было построено трехмерное структурное моделирование и теоретическое предсказание М.Г.А., X.H.Z и H.J., на котором был написан основной текст рукописи. Y.L.L. рассмотрели все изображения патологии. H.Q.Z. обеспечил общее научное руководство. Z.Q.L. и H.P.Q. внесенные реагенты / материалы / инструменты анализа. Y.F.Z. и Y.W.F. выполнил часть статистического анализа. Y.H., B.S.X. и X.Y.F. задумал и разработал эксперименты. Все авторы рассмотрели рукопись.

(A) Были предсказаны пять антигенных доминантных эпитопов MGA, как показано. Ниже графика показаны последовательности синтетических пептидов, используемых для идентификации. (B) Анализ гидрофобных и гидрофильных свойств различных областей МГА.

Представление ленты обозначало трехмерную теоретическую структуру MGA, полученную на основе компьютерного моделирования. Пять областей эпитопа с боковыми цепями, выделенными красками, были показаны в A-E. (А) эпитоп А был выделен фиолетовым. (B) эпитоп B был выделен красным цветом. (C) эпитоп C был выделен фиолетовым. (D) эпитоп D был выделен красным цветом. (E) эпитоп E был выделен фиолетовым.

(A) Репрезентативные изображения, демонстрирующие иммунитет MHG1152, MGD785, CHH11617, CHH995 и MJF656A в молочной железе молочной железы и строме. (B) Репрезентативные изображения, показывающие окрашивание MGD785 в выделениях молочной железы. (C) Репрезентативные изображения, показывающие окрашивание MJF656 в опухолевых клетках, которые пролистывают полость молочной железы (a) и кровеносный сосуд (b). a: окрашивание MGA, b: двойное окрашивание MGA и CD34 (MGA: розовый, CD34: коричневый). Фиксированные фиксированные парафином участки карциномы молочной железы были окрашены указанными MGA-mAb. Шкала шкалы: 20 мкм, увеличение: × 100. «M» указывает на окрашивание MGA на клеточной мембране.

(A) Интенсивность иммуногистохимического окрашивания mAb. (B) Процент клеток, окрашенных mAb. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Непарный t-тест с коррекцией Уэлша использовался для сравнения результатов интенсивности окрашивания или процента клеток, окрашенных MJF656, с другими mAb. Мы проанализировали три участка каждой ткани рака молочной железы для каждого mAb MGA.

Нормальные ткани груди были сделаны как положительный контроль. Шкала шкалы: 50 мкм, увеличение, × 200.

(A-D) Взаимосвязи скорости положительного маточного окрашивания с патологическим типом пациентов, стадией опухоли, гистологическим классом и метастазами в лимфатические узлы. IDC: инфильтрирующая протоковая карцинома, ILC: инфильтрирующая дольковая карцинома, карцинома ISC in situ, LN-: метастазы в узел лимфатического узла, LN +: положительный метастаз узла лимфатического узла.

NA: данные недоступны.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *