Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

CRABP1 связан с плохим прогнозом при раке молочной железы: добавление к сложности реакции клеток рака молочной железы на ретиноевую кислоту

CRABP1 is associated with a poor prognosis in breast cancer: adding to the complexity of breast cancer cell response to retinoic acid
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4491424/

Клинические испытания, предназначенные для проверки эффективности ретиноевой кислоты (RA) в качестве адъюванта для лечения твердых раков, были разочаровывающими, в первую очередь из-за сопротивления RA. Эстрогеновые рецепторы (ER) -негативные клетки рака молочной железы более устойчивы к RA, чем ER-позитивные клетки. Было показано, что экспрессия и субклеточное распределение двух RA-связывающих белков, FABP5 и CRABP2 играют критическую роль в реакции клеток рака молочной железы на RA. CRABP1, третий член семейства RA-связывающих белков, ранее не исследовался как возможный медиатор действия РА при раке молочной железы.

Экспрессия CRABP1 и CRABP2 в первичных опухолевых тканях молочной железы анализировали с использованием экспрессии генов и микрочипов тканей. Уровни CRABP1 были обработаны с использованием siRNAs и переходной сверхэкспрессией. РА-индуцированная субклеточная транслокация CRABP была исследована с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и иммуноблоттинга. RA-индуцированная трансактивация RAR была проанализирована с использованием репортерной системы люциферазы с регрессивным сигналом (RARE). Эффекты экспрессии CRABP1 и RA-терапии на экспрессию генов ниже по потоку были исследованы с помощью полуколичественного RT-PCR-анализа.

По сравнению с нормальными тканями молочной железы экспрессия CRABP1 значительно снижается в ER + опухолях молочной железы, но сохраняется при тройном отрицательном раке молочной железы. Повышенные уровни CRABP1 связаны с плохим прогнозом пациентов, высокой иммунореактивностью Ki67 и высоким уровнем опухоли при раке молочной железы. Прогностическое значение CRABP1 объясняется его цитоплазматической локализацией. Мы демонстрируем, что экспрессия CRABP1 ослабляет рестрикционный рост клеток, индуцированный RA, и ингибирует передачу сигналов RA в клетках рака молочной железы путем секвестрации RA в цитоплазме. Мы также показываем, что CRABP1 влияет на экспрессию генов, участвующих в биосинтезе, торговле и метаболизме РА.

CRABP1 является неблагоприятным фактором клинического исхода при тройном отрицательном раке молочной железы и мощным ингибитором передачи сигналов RA в клетках рака молочной железы. Наши данные показывают, что CRABP1, в сочетании с ранее идентифицированными CRABP2 и FABP5, играет ключевую роль в реакции клеток рака молочной железы на RA. Мы предлагаем, чтобы эти три RA-связывающие белки могли служить биомаркерами для прогнозирования тройной отрицательной реакции рака молочной железы на RA с повышенными уровнями цитоплазматического CRABP1 или FABP5, связанного с резистентностью RA, и повышенными уровнями ядерного CRABP2, связанными с чувствительностью к RA.

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12943-015-0380-7) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Текущее клиническое лечение рака молочной железы зависит от клинико-патологических особенностей, а также от экспрессии биологических маркеров, таких как рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR) и рецептор 2 эпидермального фактора роста (HER2) [1, 2]. Было показано, что тамоксифен является высокоэффективным для лечения ER / PR-положительных случаев рака молочной железы [3], не существует конкретных молекулярных мишеней для опухолей, которые не экспрессируют ER, PR или HER2. Эти тройные отрицательные опухоли, которые составляют 15-20% рака молочной железы [4], более агрессивны и менее чувствительны к стандартным методам лечения, чем более распространенные ER / PR-положительные раковые заболевания молочной железы и имеют более низкий прогноз [5, 6] ,

RA и его производные, все вместе называемые ретиноидами, ингибируют рост и индуцируют апоптоз в различных эпителиальных раковых клетках и имеют большие перспективы в качестве химиотерапевтических агентов [7-9]. Ретиноиды ингибируют митогенную сигнализацию [10] и индуцируют пути передачи сигналов вниз по течению, связанные с остановкой роста, апоптозом и дифференциацией предраковых и раковых клеток [11-15]. Однако, за исключением острого промиелоцитарного лейкоза (APL) [14, 16, 17], клинические испытания, предназначенные для проверки эффективности RA и его производных при лечении рака, вызвали разочаровывающие результаты, прежде всего из-за побочных эффектов, вызванных RA и развитие сопротивления RA [18, 19].

РА оказывает физиологические эффекты путем связывания и активации рецепторов ядерной ретиноевой кислоты RARα, β и γ. RAR димеризуется ретиноид-X-рецептором (RXR) и связывается с элементами ответа ретиноевой кислоты (RARE) в промоторах генов-мишеней, регулируя их транскрипцию и функцию [7-9]. В качестве внутриклеточных переносчиков клеточные RA-связывающие белки определяют RA-субклеточное распределение, судьбы и функции [20-22]. Было показано, что два RA-связывающих белка, связывающий белок 2 ретиноевой кислоты (CRABP2) и связывающий жирные кислоты белок 5 (FABP5) играют противоположную роль в опосредовании клеточного ответа RA, нацеливая RA на различные ядерные рецепторы; то есть доставка RA в RAR с помощью CRABP2 приводит к ингибированию пролиферации клеток, тогда как доставка RA-рецептора бета-рецептора пролифератора пероксисом (PPARβ) с помощью FABP5 увеличивает пролиферацию клеток и вызывает RA-резистентность [23, 24].

Ранее сообщалось, что FABP5 преимущественно экспрессируется в ER- и тройной отрицательной опухоли молочной железы [25], подтипы, которые склонны к сопротивлению RA [26-28]. Кроме того, клетки рака молочной железы с повышенным коэффициентом FABP5 / CRABP2 демонстрируют повышенную устойчивость к RA [23, 25]. Тем не менее, отношение FABP5 / CRABP2 не всегда предсказывает реакцию клеток рака молочной железы на RA, а резистентность RA к клеточной линии клеточной карциномы COLO 16 не может быть преодолена либо восстановлением CRABP2-экспрессии, либо увеличенным отношением CRABP2 / FABP5 [29], указывая на то, что задействованы другие факторы.

Исследования, направленные на изучение важности CRABP1 в клинических исходах различных видов рака, дали противоречивые результаты [30-33]. До этого исследования выражение и прогностическое значение CRABP1 при раке молочной железы не исследовались. В свете предлагаемой роли CRABP1 в ослаблении активности РА путем улучшения метаболизма RA экспрессия CRABP1 при раке молочной железы может иметь важные последствия для ответа RA. Здесь мы сообщаем о выражении, клинико-патологической ассоциации и функции CRABP1 при раке молочной железы. Наши данные показывают, что CRABP1 является неблагоприятным прогностическим фактором и мощным ингибитором действия РА при раке молочной железы, который функционирует путем секвестрации RA в цитоплазме, а не путем улучшения метаболизма RA. Мы предлагаем, чтобы CRABP1 мог служить биомаркером для прогнозирования реакции RA и целью оптимизации эффективности RA при лечении рака молочной железы.

All-trans ретиноевую кислоту приобретали у Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada) и растворяли в ДМСО (Sigma-Aldrich) в концентрации 50 мМ. Скремблированные невидимые siRNAs и ген-специфические siRNAs, нацеленные на различные области мРНК CRABP1 (нуклеотиды 381-405 и 484-508 последовательности мРНК GenBank NM_004378) и мРНК CRABP2 (нуклеотиды 418-442 и 465-489 последовательности мРНК GenBank NM_001878) были приобретены из Life Technologies (Burlington, ON, Канада). Реагент Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) использовался для трансфекций siRNA. ДНК плазмиды pGL3-RARE-люциферазы была приобретена у Addgene (Cambridge, MA, USA) и системы анализа люциферазы из Promega (Madison, WI, USA). Полиэтиленимин (PEI) (Polysciences, Уоррингтон, Пенсильвания, США) использовали для трансфекции плазмидной ДНК. Для исследований с усилением функции вся открытая рамка считывания CRABP1 была амплифицирована ПЦР и клонирована в pcDNA3 (Life Technologies).

ZR-75-1, MDA-MB-468, MDA-MB-435, BT-20, T47D, BT-474, MDA-MB-231, BT-483, MCF-7, SK-Br-3, BT- 549 и Hs578T клетки рака молочной железы культивировали в модификации Дульбекко среды Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, пенициллином (100 единиц / мл) и стрептомицином (100 мкг / мл). Клетки выращивали при 37 ° С во влажном инкубаторе с 5% СО2. К нокдауну CRABP1 и CRABP2 клетки MCF-7 трансфицировали 10 нМ сиРНК. Среда была заменена свежей средой через 18 ч после трансфекции и клетки культивировали в течение дополнительных 48 часов. Для каждого эксперимента проводили два цикла трансфекций siRNA. Клетки Hs578T, BT-549 и SK-Br-3 трансфицировали 7 мкг пустой (контрольной) или экспрессирующей конструкции pcDNA3 (CRABP1 или CRABP2), как описано ранее [34]. Для анализов пролиферации клеток в каждую лунку 12-луночных планшета высевали 10000 клеток, подвергнутых siRNA-трансфецированию, и культивировали в течение ночи в DMEM, содержащей 10% FBS. Затем среду заменяли FBS-добавленной средой, содержащей указанные концентрации RA (или DMSO в качестве контроля на транспортном средстве). Через пять дней клетки подсчитывали с использованием анализатора частиц и размера Coulter (Coulter Corporation, Mississauga, Canada).

Клетки MCF-7 культивировали на покровных стеклах в течение 24 часов и обрабатывали 0,5 мкМ RA (растворенного в ДМСО) или носителе (ДМСО) в среде без содержания сыворотки DMEM в течение 6 часов. Затем клетки фиксировали в 1% параформальдегиде в PBS в течение 10 мин и проницали в 0,5% Triton X-100 в течение 5 мин. Клетки иммуноокрашивали антителами против CRABP1 или антител против CRABP2, за которыми следуют антитела Alexa 594-конъюгированные ослы против мышиных (для CRABP1) или Alexa 555-конъюгированных ослиных антикроличных (для CRABP2) вторичных антител (Life Technologies). Изображения были получены с использованием конфокального микроскопа Zeiss LSM510 (Oberkochen, Germany) с линзой для погружения 40 × 1,3.

В общей сложности было проведено 176 первичных образцов рака молочной железы без лечения и 10 образцов нормальной молочной железы из восстановительной маммопластики, полученных из канадского опухолевого банка рака молочной железы, и использовали для анализа микрочипов экспрессии генов, как описано ранее [35]. Материалы пациента и клиническая информация были собраны в соответствии с Протоколом по исследованиям в области этики ETH-02-86-17. Опухолевые ткани замораживали и гистологически анализировали, как описано ранее [35].

Пациенты получали стандартизованную химио-и гормональную терапию на основе оснований: пациенты с ER-положительными опухолями получали гормональную терапию, у пациентов с HER2-положительными опухолями, получавшими трастузумаб, у пациентов с высоким уровнем риска, связанным с высоким уровнем риска, лечение химиотерапией антрациклином, тогда как антрациклиновая и таксановая химиотерапия был использован для лечения узлоположительной болезни. 176 пациентов, отобранных для этого исследования, состояли из 88 пациентов, которые испытали ранний рецидив (через 5 лет после первоначального лечения) и 88 пациентов, у которых не было рецидивов. Статус ER, PR и HER2, этап и время наблюдения были сбалансированы между двумя группами. Медианное время наблюдения для выживших пациентов составляло 4,5 года. Данные профилирования генов, используемые в этой публикации, были депонированы в NCBI [GEO Datasets: GSE22820].

Общая РНК была выделена из замороженных биопсий молочной железы человека с использованием реагента TRIzol (Life Technologies) и дополнительно очищена колонками Qiagen RNeasy (Qiagen, Mississauga, ON, Canada). Средний процент площади опухолевых клеток составлял 72,6%, а средний процент клеток, которые были опухолевыми клетками, составлял 93,4%, для всех проанализированных тканей. Гибридизацию микроматриц проводили, как описано ранее [35]. Условия обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) были такими же, как описано ранее [25, 34]. Количество циклов для каждой пары праймеров было оптимизировано для количественной амплификации в фазе роста экспоненциальной ПЦР-продукции. ПЦР-праймеры перечислены в дополнительном файле 1: Таблица S1. ПЦР-амплификация бета-актиновой мРНК человека служила положительным контролем, как описано ранее [25]. Для количественного RT-PCR в реальном времени (qRT-PCR) мы использовали следующие праймеры анализа экспрессии гена экспрессии ThqMan FAM: человеческий CRABP1 (Hs00171635_m1), человеческий CRABP2 (Hs00275636_m1) и человеческий GAPDH (Hs03929097). образцы кДНК анализировали в трех повторностях, причем каждая кДНК подвергалась 40 циклам амплификации в 96-луночных реакционных планшетах (объем 10 мкл) с использованием TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems 7900HT в режиме реального времени ПЦР-системы).

Тканевые микрочипы (TMA) (TMArarayer, Pathology Devices) генерировались с использованием всех доступных формалин-фиксированных тканей, содержащих парафин, в опухолях молочной железы, представляющих 120 пациентов из когорты 176 пациентов, используемых для анализа экспрессии генов. Слайды TMA содержали трехкратные образцы ткани ткани (0,6 мм в диаметре) от каждой опухоли. TMA иммуноокрашивали моноклональным антителом против CRABP1 (Sigma-Aldrich, разведение 1: 200) и поликлональным антителом против CRABP2 (Protein Tech Group, разведение 1: 200). Сигнал был обнаружен с использованием вторичных систем EnVision + anti-mouse (CRABP1) или анти-кроликов (CRABP2) (DakoCytomation, Carpinteria, CA). Ткани контрастировали с гематоксилином. Цитоплазматическое и ядерное окрашивание оценивали отдельно в зависимости от средней интенсивности сигнала окрашивания по всей опухолевой ткани в масштабе 0 (отрицательный), 1 (слабый), 2 (умеренный) и 3 (сильный). Из 120 тестируемых образцов опухолей 105 и 106 имели достаточную ткань для анализа иммунореактивности CRABP1 и CRABP2, соответственно.

Цитоплазматические и ядерные экстракты получали согласно Dignam et al. [36], и целые клеточные лизаты были получены с использованием Dignam buffer A плюс 0,5% SDS. Цитоплазматический белок (20 мкг), ядерный белок (20 мкг) и белок цельной клетки (40 мкг) разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны путем электроблоттинга. Мембраны иммуноокрашивали первичными антителами в 5% бычьего сывороточного альбумина (в 1X трис-буферном солевом растворе) при 4 ° С в течение ночи. Сигнал детектировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, с использованием ECL Вестерн-блоттингового реагента (GE Healthcare Life Sciences, США). Для анализа вестерн-блоттинга использовали следующие первичные антитела: анти-CRABP1 (1: 1000), анти-CRABP2 (1: 1000), β -актин (Sigma-Aldrich, 1: 100 000), α-тубулин (DSHB, 1: 10 000) и Lamin A / C (ThermoFisher, 1: 1000).

После истощения siRNA CRABP1 или CRABP2 клетки MCF-7 высевали в 12-луночные культуральные планшеты при 20 000 клеток / лунку и трансфицировали репортерной конструкцией люциферазы (0,5 мкг / лунку) под контролем ретиноидного реагирующего элемента (RARE) (pGL3-RARE-luc, Addgene). Альтернативно, CRABP1-отрицательные клеточные линии (BT-549, SK-Br-3, Hs578T) высевали в 12-луночные планшеты, инкубировали при 37 ° С в течение 24 ч, а затем совместно трансфицировали с помощью экспрессирующей конструкции CRABP1 (0,8 мкг / лунку) и pGL3-RARE-Luc (0,5 мкг / лунку), разбавленную в 250 мкл бессывороточной среды, содержащей 5 мкл PEI. Пустой вектор pcDNA3 служил отрицательным контролем для этих экспериментов. Через 48 часов после трансфекции клетки обрабатывали RA (в ДМСО) при конечных концентрациях 0, 0,1 и 0,5 мкМ в течение 6 часов, сохраняя общий объем ДМСО постоянным в каждой лунке. Затем клетки собирали и лизаты целых клеток получали с использованием реагента для лизиса клеточной культуры люциферазы (CCLR, Promega). Активность люциферазы измеряли с помощью системы анализа люциферазы (Promega) и количественно определяли с помощью считывателя микропланшетов FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech) в соответствии с инструкциями производителя. Тройные лунки анализировали для каждого лечения.

Статистический анализ проводился с использованием MedCalc Statistical Software версии 12.7.2 (MedCalc Software, Ostend, Belgium), как описано ранее [25]. Вкратце, данные профилирования генома для CRABP1 и CRABP2 были классифицированы как «низкие» или «высокие» по анализу кривой рабочей характеристики приемника (ROC). Для тестирования значимости ассоциаций между уровнями мРНК CRABP или иммунореактивности и параметров клинических исходов использовали t-критерий ученика или хи-квадрат. Двухсторонний ANOVA использовался для проверки значимости эффектов нокдауна siRNA и лечения RA на клеточную пролиферацию. Прогностическое значение CRABP1 и CRABP2 анализировали с помощью теста logrank на кривых выживаемости Kaplan-Meier с использованием как профилирования генов, так и данных иммуноанализа TMA.

Основываясь на данных профилирования гена, CRABP1 заметно снижается в ER-положительных опухолях молочной железы в соответствии с сообщениями, свидетельствующими о том, что CRABP1 замолкают в раковых клетках [30, 31, 33, 37]. Однако экспрессия CRABP1 сохраняется в ER / PR-отрицательных опухолях молочной железы по сравнению с нормальными тканями молочной железы (рис.1a и таблица 1). Напротив, уровни мРНК CRABP2 значительно повышаются в ER-позитивных опухолях по сравнению с нормальными и тройными отрицательными опухолевыми тканями (рис.1a и таблица 1). Ни уровни CRABP1, ни уровень CRABP2 не показали статистически значимого различия между гиперэкспрессирующими опухолями HER2 и другими типами тканей. Эти данные показывают, что существует обратная связь между экспрессией CRABP1 и CRABP2 в тройном отрицательном по сравнению с ER / PR-положительными опухолями. 1Distinct образцы экспрессии мРНК и прогностические ассоциации CRABP1 и CRABP2 в опухолях молочной железы. Сравнение уровней мРНК CRABP1 и CRABP2 (на основе интенсивности сигнала нормализуемого гена микроматрицы) в нормальных тканях молочной железы (n = 10) и подтипах рака молочной железы человека (n = 176). До нашей эры
CRABP1 (b) и CRABP2 (c) мРНК в тканях опухолей, отобранных из когорты пациентов с раком молочной железы 176. Номера MT и GT относятся к отдельным пациентам. Уровни РНК измеряли количественной RT-PCR в реальном времени с GAPDH, служащим в качестве внутреннего контроля. Уровни экспрессии из трех повторных реакций показаны относительно MT633. d, e
CRABP1 (d) и CRABP2 (e) мРНК в группе из 11 линий клеток рака молочной железы. Уровни РНК анализировали с помощью количественной RT-PCR в реальном времени и показывали как изменение смены относительно ZR-75-1. f Общие кривые выживаемости пациентов Kaplan-Meier, полученные на основе низких и высоких уровней мРНК CRABP1, определяемых методом ROC. г общей кривой выживаемости пациентов Каплана-Майера, основанной на низких и высоких уровнях мРНК CRABP2. n, обозначает размер выборки; *, р <0,05; **, p <0,01

Клиникопатологические ассоциации CRABP1 и CRABP2 при раке молочной железы человека

Затем мы проанализировали экспрессию CRABP в выборке из десяти образцов кДНК из тканей опухоли грудной клетки пациента с использованием анализа qRT-PCR в реальном времени. CRRPP1 мРНК была обнаружена на повышенных уровнях (от 2 до 11 раз по сравнению с первым образцом опухоли, который был установлен в 1) в 4 из 6 тройных отрицательных опухолей; однако ни одна из четырех нетритровых отрицательных опухолей не показала относительных уровней, превышающих 1 (фиг.1b). Напротив, мРНК CRABP2 была обнаружена на более высоких уровнях в не-тройных отрицательных опухолях (от 3 до 9 раз по сравнению с MT633) по сравнению с тройными отрицательными опухолями (с 1 из 6 опухолей, показывающими относительные уровни выше 1) (рис. . 1в).

Мы также провели скрининг группы из 11 линий клеток рака молочной железы для экспрессии CRABP1 и CRABP2. CRABP1 был обнаружен на повышенных уровнях (в 4,5-6,8 раза по сравнению с ZR-75-1, который был установлен на уровне 1), в двух не-тройных отрицательных клеточных линиях рака молочной железы (MCF-7 и BT-483), при этом ни один из пять тройных отрицательных клеточных линий, имеющих уровни выше 1 (фиг.1d). Эти результаты свидетельствуют о том, что экспрессия CRABP1 не сохраняется в тройных отрицательных клетках рака молочной железы в условиях роста in vitro, возможно, в результате изменений микросреды [38]. Сообщается об аналогичном явлении для других белков и раковых образований, включая потерю глиального фибриллярного кислого белка и белка, связывающего жирные кислоты мозга, в клеточных линиях злокачественной глиомы по сравнению с опухолевой тканью [39-41]. CRABP2 экспрессировали на повышенных уровнях (в 2-28 раз по сравнению с ZR-75-1) во всех шести не-тройных отрицательных клеточных линиях рака молочной железы, тогда как только две из пяти тройных отрицательных клеточных линий имели относительные уровни CRABP2 выше, чем 1 (фиг.1е).

Затем мы исследовали ассоциацию уровней мРНК CRABP в первичных опухолях молочной железы с основными клинико-патологическими параметрами (таблица 1). Высокие уровни мРНК CRABP1 коррелировали с положительным узловым статусом (p = 0,021), высоким ядерным классом (p <0,0001), митотическим классом (p <0,0001) и общим уровнем гистологической опухоли (p <0,0001) (таблица 1). Такие корреляции не наблюдались с уровнями мРНК CRABP2. Анализ выживаемости Kaplan-Meier также показал, что высокие уровни мРНК CRABP1 были достоверно (p = 0,0083), что связано с более низкой вероятностью выживаемости пациентов (рис.1f), тогда как высокие уровни мРНК CRABP2 были значительно связаны с лучшим прогнозом (p = 0,0028; . 1 г). Опять же, эти результаты показывают противоположные роли CRABP1 и CRABP2 в клинических исходах рака молочной железы.

CRABP служат внутриклеточными шаперонами для RA и модулируют его ядерную доступность и биологическую активность [42, 43]. Поэтому субклеточная локализация CRABP является критическим детерминантом их функции. Чтобы выяснить, существует ли какая-либо связь между субклеточным распределением CRABP1 и 2 и клиническими исходами, мы провели иммуногистохимический анализ образцов первичной опухоли, содержащих ТМА, у 120 пациентов с раком молочной железы. Сначала мы подтвердили специфичность наших антител против CRABP1 и анти-CRABP2 путем вестерн-блот-анализа лизатов целых клеток, полученных из клеток MDA-MB-435 (отрицательных как для CRABP1, так и 2), трансфецированных CRABP1 или CRABP2. Для этих двух антител не наблюдалось кросс-иммунореактивности (фиг.2а). 2Immunoreactivity и субклеточного распределения CRABP1 и CRABP2 в первичной опухоли молочной железы человека TMA. вестерн-блоттинг CRABP1 и CRABP2 в клетках MDA-MB-435, трансфицированных соответственно экспрессией CRABP1 или CRABP2. b Частота опухолей молочной железы с различными оценками субклеточной иммунореактивности для CRABP1 и CRABP2: 0, отрицательная; 1, слабый; 2, промежуточный; 3, сильный. c Выделенные участки ткани от рака молочной железы человека TMA, иммунизированные антителами против CRABP1 и анти-CRABP2. Показаны ядерные (Nuc) и цитоплазматические (Cyt) баллы

Мы обнаружили, что 34,3% и 21,9% обнаруженных опухолей показали положительную цитоплазматическую и ядерную CRABP1 иммунореактивность соответственно (фиг.2b и таблица 1). ТМА ТМА с различными цитоплазматическими и ядерными иммуноокрашивающими свойствами CRABP1 и CRABP2 показаны на рис. 2в. Повышенные уровни CRABP1 в цитоплазме, но не в ядре, были связаны с отрицательным ER (p = 0,0058) и PR-статусом (p = 0,004). Как цитоплазматическая, так и ядерная иммунореактивность CRABP1 были положительно коррелированы с тройным отрицательным статусом и высоким уровнем гистологической опухоли (таблица 1).

В отличие от CRABP1, подавляющее большинство тканей опухоли молочной железы положительно оценили CRABP2, при этом 90,7% и 95,4% забитых образцов показали цитоплазматическую и ядерную CRABP2 иммунореактивность соответственно (фиг.2b и таблица 1). Около половины (43,5%) опухолей показали сильную ядерную CRABP2-иммунореактивность (оценка = 3) с сильным цитоплазматическим сигналом CRABP2, наблюдаемым у 16,7% опухолей (рис. 2b-c). Уровни белка ядерного CRABP2 были положительно коррелированы с положительным ER (p = 0,001), PR (p = 0,007) и общим невротическим отрицательным статусом (p = 0,0019). Наблюдалась также корреляция между высокими уровнями цитоплазматического CRABP2 и положительным статусом PR (p = 0,0371, таблица 1). Никаких корреляций с другими клинико-патологическими параметрами не наблюдалось как для цитоплазматической, так и для ядерной иммунореактивности CRABP2 (таблица 1).

Затем мы сопоставляли субклеточные уровни CRABP с вероятностью выживаемости пациентов. Мы обнаружили, что у пациентов с опухолями, которые были положительными для цитоплазматических, но не ядерных, CRABP1 имел значительно более низкую вероятность выживания пациентов (p = 0,0091) (рис.3a-b). Напротив, ядерная, но не цитоплазматическая иммунореактивность CRABP2 была положительно связана с вероятностью выживаемости пациентов (p = 0,0127) (рис. 3c-d). Таким образом, наш анализ TMA показывает, что: (i) клинико-патологические ассоциации CRABP1 и 2 на уровне белка находятся в хорошем согласии с данными профилирования гена; (ii) CRABP1 чаще встречается в цитоплазме, тогда как CRABP2 более обилен в ядре первичных опухолей молочной железы и (iii) клинический исход и прогностические последствия могут быть отнесены к цитоплазматическому CRABP1 и ядерному CRABP2, что предполагает различные субклеточные функции. 3Ассоциации субклеточного уровня CRABP1 и CRABP2 с выживанием пациентов с раком молочной железы и иммунореактивностью Ki67. Уровни белка CRABP1, CRABP2 и Ki67 определяли с помощью иммуногистохимического анализа ТМА, содержащего трехкратные сердечники для каждой опухоли из 120 первичной когорты опухоли молочной железы. a-b Ассоциация цитоплазматических и ядерных уровней CRABP1 с выживанием пациентов. c-d Ассоциация цитоплазматических и ядерных уровней CRABP2 с выживанием пациентов. e Положительная корреляция уровней цитоплазматического и ядерного CRABP1-белка с иммунореактивностью Ki67. f Положительная корреляция уровней CRABP1 и Ki67 мРНК на основе анализа микрочипов гена. g Значительная корреляция между субклеточными уровнями CRABP2 и иммунореактивностью Ki67 не наблюдалась. h Не было обнаружено корреляции между уровнями CRABP2 и Ki67 мРНК. HR, отношение рисков; p, уровень статистической значимости; r, коэффициент корреляции. Оценки: 0, отрицательные; 1, слабый; 2, промежуточный; 3, сильный. Поскольку размер образцов, выраженных CRABP1, невелик в наших TMA, образцы опухолей были классифицированы в «позитивные» и «отрицательные» группы для анализа выживаемости

Чтобы лучше понять противоположные роли CRABP1 и CRABP2 в прогрессировании рака молочной железы, мы иммунизировали наш рак молочной железы TMA с помощью Ki67, маркера пролиферации клеток (дополнительный файл 1: рисунок S1) и исследовали его корреляцию с уровнями белка CRABP. Мы обнаружили, что как цитоплазматический (p = 0,024), так и ядерный (p = 0,008) уровни CRABP1 были положительно коррелированы с иммунореактивностью Ki67 (фиг.3е). Напротив, ни цитоплазматические, ни ядерные уровни CRABP2 не коррелировали с уровнями белка Ki67 (рис. 3g). Как и ожидалось, уровни мРНК Ki67 также показали значительную положительную корреляцию с уровнями CRABP1, но не CRABP2 мРНК, на основе анализа профилей генов (рис.3f, h). Эти результаты показывают, что CRABP1 может влиять на прогрессию рака молочной железы, усиливая пролиферацию опухолевых клеток посредством модуляции передачи сигналов RA. Отсутствие корреляции между CRABP2 и Ki67 свидетельствует о том, что эффект CRABP2 на выживаемость пациентов может быть опосредовано путем дифференцировки и апоптоза, а не пролиферации, как ранее сообщалось для APL [17, 44].

CRABP1 и CRABP2 могут играть определенную роль в RA / RAR-опосредованной транскрипционной активности [42, 45]. Чтобы исследовать роль CRABP1 в действии RA, мы использовали siRNAs для истощения RA-чувствительных клеток MCF-7 либо CRABP1, либо CRABP2 (фиг.4a-b). Небольшое, но статистически значимое увеличение ингибирования роста наблюдалось, когда CRABP1-истощенные клетки обрабатывались RA, контрольные клетки показывали 81 и 74% относительный рост при 0,1 мкМ и 0,5 мкМ RA соответственно, а CRABP1-истощенные клетки с 65 и 66 % относительного роста при 0,1 мкМ и 0,5 мкМ РА, соответственно (фиг.4с). Более сильный эффект ингибирования роста наблюдался при лечении CRABP1-истощенных клеток с RA в отсутствие сыворотки (дополнительный файл 1: Рисунок S2). В отличие от CRABP1, нокдаун CRABP2 мало влиял на ингибирование роста клеток, опосредованное RA (91% при 0,1 мкМ и 88% при 0,5 мкМ) (фиг.4с). 4CRABP1 и CRABP2 дифференциально модулируют индуцированное РА индуцированное ингибирование роста и транскрипционную активность RAR. a, b Вестерн-блоттинг-анализ клеток MCF-7, трансфецированных CRAP1 или CRABP2 siRNAs с использованием антител против CRABP1 или CRABP2. c Относительная скорость роста клеток MCF-7, обработанных указанными концентрациями RA после трансфекции неспецифическими (контрольными) и специфическими siRNAs, нацеленными на CRABP1 или CRABP2. Значение различия было проверено с использованием двухсторонней ANOVA. d RAR трансактивация (измеренная люциферазной активностью) истощенных CRABP1a или CRABP2a-истощенных клеток MCF-7, трансфецированных репортерной конструкцией люциферазы под контролем RARE. Клетки обрабатывали ДМСО (контроль транспортного средства) или РА в течение 6 часов перед сбором урожая. Активность люциферазы (мера активации RAR) показана как изменение складки по сравнению с клетками, которые культивировались в отсутствие RA. e Анализ люциферазы повторяли со вторым набором siRNAs, нацеленным на CRABP1 и CRABP2 (CRABP1b, CRABP2b). f Вестерн-блоты, демонстрирующие эктопическую экспрессию CRABP1 в трех клеточных линиях рака молочной железы человека. g, h, i. Влияние эктопической экспрессии CRABP1 на трансактивацию RAR (измеренное по активности люциферазы) было исследовано в BT-549 (g), клетках SK-Br-3 (h) и Hs578T (i), ко-трансфицированных с помощью CRABP1 и репортер RARE-люциферазы. Клетки обрабатывали РА в течение 6 ч при указанных концентрациях. Активность люциферазы (мера активации RAR) была скорректирована на основе белковых концентраций отдельных лизатов и показана как изменение смены относительно контрольных клеток, трансфецированных пустым вектором, и культивируемых в отсутствие RA. KD обозначает нокдаун; *, р <0,05; **, p <0,01

Считается, что ингибирующий рост эффект RA опосредуется путем активации RAR [23, 24, 45]. Поэтому мы исследовали влияние CRABP1 и CRABP2 на активацию RAR, индуцированную RA, с использованием репортерной системы люциферазы. Мы использовали две разные siRNAs для истощения каждого из двух генов CRABP в клетках MCF-7. Выделенные CRABP клетки MCF-7 затем трансфицировали RA-реагирующим RARE-люциферазой и обрабатывали RA. Доза-зависимая индукция RA в активности люциферазы (указывающая на активацию RAR) наблюдалась как для контрольных, так и для трансформированных siRNA клеток (фиг.4d-e). Однако истощение CRABP1 приводило к 2-кратному увеличению активации RAR в присутствии RA по сравнению с контрольными клетками, тогда как истощение CRABP2 приводило к уменьшению транскрипционной активности RAR / RA-опосредованной (фиг.4d-e). Эти результаты показывают, что в отличие от CRABP2, который играет положительную роль в активации RAR, CRABP1 может служить ингибитором передачи сигналов RA в клетках рака молочной железы.

Затем мы совместно трансфецировали две тройные отрицательные линии рака молочной железы (Hs-578 T и BT-549) и одну сверхэкспрессирующую клеточную линию ER-негативный / HER2 (SK-Br-3) с экспрессирующей конструкцией CRABP1 и RARE-люциферазой репортер вектор. Выражение CRABP1 в трансфицированных клетках проверяли вестерн-блоттингом (фиг.4f). Эндогенный CRABP1 не был обнаружен ни в одной из этих трех клеточных линий. Люциферазная активность индуцировалась RA во всех трех клеточных линиях дозозависимым образом в клетках, трансфицированных пустым вектором (фиг.4g-i). Значительное снижение RA-индуцированной активации RAR наблюдалось во всех трех клеточных линиях при трансфекции экспрессией CRABP1. В частности, клетки SK-Br-3 и Hs578T демонстрировали снижение RAR-активации как в 0,1 мкМ, так и в 0,5 мкМ RA-обработанных клетках после экспрессии CRABP1 (фиг.4h-i). Сниженная активность люциферазы наблюдалась только при самой высокой концентрации RA, протестированной в клетках BT-549 (фиг.4g).

Затем мы проанализировали субклеточную локализацию CRABP1 и CRABP2 в ответ на RA в клетках MCF-7. Оба белка были в основном обнаружены в цитоплазме в отсутствие RA (фиг.5а). В отличие от CRABP2, который транслоцировался на ядро ​​при лечении RA, не было изменений в субклеточной локализации CRABP1 при лечении RA (рис.5a). Эти результаты согласуются с общей ролью CRABP1 в секвестрации RA в цитоплазме, что делает ее недоступной для активации RAR. 5
субклеточной локализации CRABP1 и CRABP2 в клетках MCF-7, обработанных RA. Клетки культивировали в среде с сывороткой в ​​течение 24 часов, а затем обрабатывали 0,5 мкМ RA в бессывороточной среде в течение 6 часов. К контрольным клеткам добавляли эквивалентное количество ДМСО. Клетки иммуноокрашивали анти-CRABP1 (красная, верхняя панель) или анти-CRABP2 (красная, нижняя панель) антитела, как описано в материалах и методах. Для визуализации ядра использовалось окрашивание DAP1 (синим). b Экспрессия RA-чувствительных генов в MCF-7. Клетки MCF-7 подвергались двум циклам трансфекции с помощью скремблированных или CRABP1 siRNAs. Клетки обрабатывали с увеличением концентрации RA [полос от 1 до 6 (0, 5 × 10-5, 5 × 10-4, 5 × 10-3, 5 × 10-2, 5 × 10-1 мкМ RA)]. РНК очищали от каждой культуры, и полуколичественную ОТ-ПЦР проводили с использованием генспецифических праймеров (дополнительный файл 1: таблица S1). c Резюме эффекта CRABP1 и RA на последующие гены и пути. d Вестерн-блоты, показывающие субклеточное распределение CRABP2 в клетках SK-Br-3 при избыточной экспрессии CRABP1 и лечении RA. Денситометрический анализ использовался для количественного определения интенсивности сигнала CRABP2 в цитоплазме и ядре относительно цитоплазматического маркера (β-тубулина) и ядерного маркера (ламин A / C) соответственно. Изменения интенсивностей полос показаны как изменение складки по отношению к полосе 1 (для цитоплазматического CRABP2) и полосы 5 (для ядерного CRABP2)

Для дальнейшего изучения механизма, участвующего в CRABP1 / RA-опосредованном эффекте в клетках рака молочной железы, мы исследовали экспрессию критических генов, вовлеченных в синтез, торговлю, метаболизм и действие RA при манипулировании CRABP1 и лечении RA. Клетки MCF-7 трансфицировали скремблированными или CRAMP1 siRNAs и обрабатывали с увеличением количества RA. Уровни CRABP2, фасилитатора передачи сигналов RA на ядро ​​[46], были усилены при истощении CRABP1 в отсутствие RA (фиг.5b). При лечении RA уровни CRABP2 индуцировали в контрольных клетках дозозависимым образом, но не в клетках с дефицитом CRABP1. Фактор транскрипции AP-2α (TFAP2A), RA-индуцируемый ген с подавляющей опухоль активностью [47, 48], был усилен истощением CRABP1 и обработкой RA в дозе до 5 нМ. Экспрессия RA метаболизирующего фермента CYP26A1 индуцировалась при высоких концентрациях RA (500 нМ RA) как в контрольных, так и в CRABP1-истощенных клетках с усиленной повышающей регуляцией, наблюдаемой в последнем. Наблюдение за тем, что уровни CYP26A1 повышены в более высокой степени в CRABP1-истощенном по сравнению с контрольными клетками, противоречит идее о том, что CRABP1 способствует метаболизму RA [49-51]. Экспрессия гена альдегидгидрогеназы ALDH1B1, которая участвует в биосинтезе РА и связана с раковой клеткой [52], была индуцирована RA в контрольных клетках, но не в клетках, истощенных CRABP1. Интересно отметить, что два клеточных ретинол-связывающих белковых гена (RBP1 и RBP7), кодирующие белки, которые облегчают поглощение, хранение и / или метаболизм ретинола [53-56], проявляют противоположные образцы экспрессии при нокдауне CRABP1 и лечении RA, при этом RBP1 индуцируется RA как в контрольных клетках, так и в клетках с избыточным CRABP1, и RBP7 снижается до минимума из-за истощения CRABP1 и подавляется RA дозозависимым образом. Эти результаты (суммированные на рис.5с) показывают, что CRABP1 оказывает ингибирующее действие на действие РА посредством модуляции спектра генов, участвующих в различных аспектах сети РА, включая биосинтез РА, метаболизм и внутриклеточную торговлю.

Затем мы рассмотрели влияние экспрессии CRABP1 на ядерную транслокацию CRABP2, что является важным показателем передачи сигналов RA ядру [57]. Клетки SK-Br-3 трансфицировали экспрессией CRABP1 и обрабатывали RA. Мы наблюдали более высокие уровни цитоплазматического и ядерного CRABP2 при лечении RA в контрольных клетках (рис.5d). Кроме того, отмечено заметное снижение уровней ядерного CRABP2 в клетках CRABP1-overexpressing при лечении RA. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что CRABP1 действует как ингибитор действия РА, ограничивая доступ RA к ядру посредством снижения уровня ядерных уровней CRABP2.

Наши результаты показывают, что CRABP1, в дополнение к ранее идентифицированным FABP5 и CRABP2, является ключевым фактором, регулирующим реакцию клеток рака молочной железы на RA. Чтобы исследовать возможность того, что уровни экспрессии этих трех связывающих белков RA могут быть полезными предикторами первичной чувствительности опухоли молочной железы к RA, мы проанализировали их относительные уровни мРНК в нашей 176 когорте пациентов с раком молочной железы на основе анализа микроматрицы генов. CRABP1 и FABP5, кодирующие RA-связывающие белки, связанные с резистентностью RA, были в 5,2 и 1 раз выше, соответственно, в ER-отрицательных опухолях молочной железы по сравнению с ER-положительными опухолями. С другой стороны, уровни CRABP2, положительного модулятора сигналов и активности RA, были в 1,2 раза выше в ER-положительном по сравнению с ER-негативными опухолями (рис.6a). Эти результаты показывают, что CRABP1, в частности, может играть важную роль в резистентности RA, наблюдаемой в ER-негативных опухолях. 6Симматическое представление эффектов различных RA-связывающих белков на модуляцию действия РА при раке молочной железы. Относительные уровни мРНК FABP5, CRABP1 и CRABP2 в ER-негативных (n = 64) и ER-позитивных (n = 112) первичных образцах ткани молочной железы. Уровни мРНК для каждого гена определяли на основании нормированной интенсивности сигнала данных микроматрицы гена и показывали относительно CRABP2 (устанавливали как 1) в случае ER-негативных опухолей и FABP5 (устанавливали как 1) в случае ER -положительные опухоли. Эти данные дают представление о возможной основной причине резистентности RA к ER-негативным опухолям. b Схематическая модель, иллюстрирующая четкие роли CRABP1, CRABP2 и FABP5 в модуляции клеточного ответа на RA в клетках рака молочной железы. Каналы FABP5 RA к PPARδ / β, ядерному рецептору, который способствует клеточной пролиферации. CRABP1-секвестры RA в цитоплазме. CRABP2 доставляет RA в RAR, что приводит к ингибированию роста клеток. Баланс между уровнями экспрессии FABP5 / CRABP1 и CRABP2 определяет клеточный ответ на RA (стимуляция или ингибирование роста клеток)

Считается, что клеточный ответ на RA зависит от двух разных классов ядерных рецепторов, RAR и PPAR [23, 24]. RAR-активация по RA приводит к ингибированию роста клеток, тогда как активация PPARδ / β стимулирует клеточную пролиферацию. Эти два сигнальных пути RA в свою очередь модулируются двумя внутриклеточными связывающими белками RA: CRABP2, который направляет RA в ядро ​​для нацеливания RAR и FABP5, который доставляет RA в ядро, тем самым активируя PPARδ / β [23, 24]. Ранее мы показали, что FABP5 предпочтительно экспрессируется в ER- и тройном отрицательном раке молочной железы, молекулярные подтипы считаются резистентными к RA-обработке [25]. Высокие уровни FABP5, а также низкое соотношение CRABP2 и FABP5 связаны с плохим прогнозом. В этом исследовании мы идентифицируем третий RA-связывающий белок CRABP1 как ингибитор действия RA и неблагоприятный фактор для клинических исходов при раке молочной железы. Как и FABP5, CRABP1 предпочтительно экспрессируется в ER- и тройном отрицательном раке молочной железы. Мы предлагаем модель, согласно которой CRABP1 может компенсировать или взаимодействовать с FABP5, чтобы конкурировать с CRABP2 для RA, путем секвестрации RA в цитоплазме, тем самым уменьшая доступ RA к RAR (рис.6b).

Роль CRABP1 в канцерогенезе и прогрессировании опухоли плохо изучена и противоречива. Например, CRABP1 снижается в некоторых раковых опухолях человека и клеточных линиях [31-33], причем предложенное метилирование ДНК способствовало замораживанию CRABP1 [33, 58-60]. Наблюдение за метилированием, опосредованное метилированием CRABP1, было обнаружено в подмножестве тканей карциномы молочной железы [60]. Предполагается, что CRABP1 является опухолевым супрессором при карциноме плоскоклеточного рака пищевода с уменьшенными уровнями CRABP1, связанными с увеличением клеточного роста и метастазированием отдаленных лимфатических узлов [33]. Сниженные уровни CRABP1 также связаны с более низким прогнозом в серозной (n = 40) и ячеистой аденокарциноме яичника (n = 59) [31]. С другой стороны, высокие уровни CRABP1 были связаны с метастазами в лимфатических узлах и плохой дифференциацией / высокой степенью поражения в панкреатических нейроэндокринных опухолях [30].

По соглашению с карциногенной ролью CRABP1 мы обнаружили связь между экспрессией CRABP1 и худшими клиническими исходами при раке молочной железы с использованием как профилирования генов, так и анализа ТМА. Как и в предыдущем докладе, показывающем, что CRABP1 дифференциально экспрессируется в разных подтипах аденомы гипофиза [37], мы обнаружили, что CRABP1 снижается в ER + опухолях молочной железы, но выражается в ER- и тройном отрицательных опухолях. Эти результаты показывают, что подавление экспрессии CRABP1 в раковых клетках может быть модулировано специфическими сигнальными путями в разных подтипах рака (например, сигнализация эстрогена) и что его роль в прогрессировании опухоли может различаться между типами рака. Следует отметить, что сигнализация эстрогена связана с регуляцией метилирования ДНК, возможно, в некоторой степени объясняя приведенную экспрессию CRABP1, наблюдаемую в ER +, по сравнению с раком ER-рака [61].

CRABP1 имеет самую высокую аффинность связывания RA всех белков связывания RA [42]. В целом считается, что CRABP1 подавляет клеточный ответ на RA путем секвестрации RA и / или промотирования катаболизма RA, снижая его доступность в ядре для активации RAR [51, 62-64]. В нескольких исследованиях показано, что CRABP1 способствует метаболизму РА [49-51]. Однако тот факт, что метаболиты RA могут активировать RAR in vitro [65], в сочетании с наблюдением, что существует положительная связь между метаболизмом РА и ингибированием роста клеток в нескольких линиях раковых клеток [66], свидетельствуют о том, что CRABP1-опосредованный метаболизм RA может не учитывайте сопротивление RA. В свете наших наблюдений, что: (i) цитоплазматический CRABP1 в опухолях молочной железы является неблагоприятным фактором клинических исходов, и (ii) CRABP1 накапливается в цитоплазме клеток, обработанных РА, мы предлагаем, чтобы основная роль CRABP1 в раке молочной железы была секвестра RA в цитоплазме, тем самым предотвращая активацию RAR в ядре (фиг.6b). Повышенная регуляция метаболизирующего RA гена CYP26A1, наблюдаемого при истощении CRABP1 при высокой концентрации RA, также указывает на отрицательную связь между метаболизмом CRABP1 и RA.

Известно, что более пятисот генов регулируются РА, включая CRABP2, который имеет функциональную RARE в своей области промотора [67, 68]. CRABP2 служит положительным регулятором передачи сигналов RA в клетках рака молочной железы [23, 24, 42], и его экспрессия может быть вызвана RA в различных типах клеток [67-69]. В этом исследовании мы обнаружили, что CRABP1 и CRABP2 имеют обратные образцы экспрессии в опухолях молочных желез и играют противоположную роль в медиации действия РА в клетках рака молочной железы. Далее сообщается, что CRABP1 отрицательно регулирует экспрессию CRABP2. Хотя экспрессия CRABP2 наблюдалась в эмбриональных стволовых клетках AB1 с гомозиготной делецией CRABP1 [70], это первый отчет, демонстрирующий, что CRABP1 оказывает ингибирующее действие на экспрессию CRABP2 в раковых клетках. Интригующе, CRABP1 не только обратно регулирует экспрессию CRABP2, но также влияет на ядерную транслокацию CRABP2 в клетках рака молочной железы. Мы постулируем, что CRABP1 играет ключевую роль в ослаблении активности РА в клетках рака молочной железы с высоким уровнем CRABP1, снижающим доступность RA в ядре. В свою очередь, связывание RA с цитоплазмой репрессирует RA-опосредованную ядерную транслокацию CRABP2 и индукцию экспрессии CRABP2.

В дополнение к CRABP2 наши данные показывают, что CRABP1 модулирует экспрессию различных генов, вовлеченных в биосинтез, метаболизм и действие РА. За исключением RBP7, все эти гены ранее были отредактированы RA [68]. Мы наблюдали, что гены, кодирующие CYP26A1 (катализирующий метаболизм RA) и ALDH1B1 (катализирующий биосинтез RA), регулируются и понижаются, соответственно, в присутствии RA при истощении CRABP1. Мы предполагаем, что это связано с процессом обратной связи, поскольку истощение CRABP1 может увеличивать уровни свободного RA (особенно когда клетки подвергаются воздействию высоких доз RA), что в свою очередь приводит к ускоренному метаболизму RA и уменьшению синтеза RA. Поэтому CRABP1 может играть определенную роль в регулировании клеточных уровней свободной RA. RBP1 и RBP7 являются ретинолсвязывающими белками, которые облегчают хранение ретинола и / или ретинол-RA-конверсию [53-56]. Различные картины экспрессии, наблюдаемые для этих двух генов в контроле и CRABP1-истощенных клетках MCF-7, указывают на противоположные роли. Мы предполагаем, что RBP1 (усиленный RA, но не затронутый CRABP1) может быть вовлечен в хранение ретинола, тогда как RBP7 (с понижением уровня RA и расщепление CRABP1) может быть вовлечен в метаболизм ретинола, продуцирующий RA.

TFAP2A представляет собой RA-индуцируемый ген, экспрессия которого возрастает при нокдауне CRABP1 в клетках MCF-7. TFAP2A кодирует AP-2α, недавно показанный, что он необходим для действия RA [71], ранее сообщалось о стимуляции экспрессии CRABP2 в эпителиальных клетках молочной железы и клетках рака молочной железы [72]. AP-2α значительно усиливает индуцированную RA-активацию RAR в клетках рака молочной железы (наши неопубликованные данные). Эти комбинированные данные свидетельствуют о наличии оси CRABP1-AP-2α-CRABP2, которая модулирует действие РА в клетках рака молочной железы.

Таким образом, мы показываем, что экспрессия CRABP1 сохраняется в ER- и тройной отрицательной опухоли молочной железы, и что повышенный уровень CRABP1 является значительным показателем высокой степени опухоли, иммунореактивности Ki67 и плохим прогнозом. Наши данные показывают, что цитоплазматический CRABP1, как и FABP5, является мощным ингибитором передачи сигналов RA. Повышенные уровни CRABP1 могут приводить к сопротивлению RA в клетках рака молочной железы путем секвестрации RA в цитоплазме, тем самым предотвращая опосредованную РА индукцию RAR. Мы также продемонстрируем, что CRABP1 ослабляет активность RA путем модуляции экспрессии важных RA-регулируемых генов, участвующих в доступности, трафике и действии сотовой RA. Таким образом, как CRABP1, так и FABP5 представляют собой потенциальные терапевтические цели для преодоления резистентности к RA при раке молочной железы. Открытие того, что в транспорте РА в клетках рака молочной железы участвует как минимум три белка (CRABP1, CRABP2 и FABP5 [23-25]), помогает решить молекулярный механизм, определяющий устойчивость RA в ER-негативном или тройном отрицательном раке молочной железы, и предоставляет молекулярные инструменты для прогнозирования и, в конечном счете, преодоления сопротивления RA при профилактике и терапии рака молочной железы.

Дополнительный файл 1: Таблица S1.
              
                Нуклеотидные последовательности ПЦР-праймеров. Рисунок S1. Образцы изображений иммуногистохимического окрашивания Ki67 рака молочной железы человека TMA. Показанные проценты представляют собой средние значения процентных положительных клеток Ki67 в трех ядрах TMA той же опухоли. Идентификационные номера опухолей указаны внизу. Рисунок S2. Влияние экспрессии CRABP1 на ингибирование роста клеток, индуцированного RA, в клетках MCF-7. Клетки трансфицировали с помощью siRNA, нацеленной на CRABP1 (CRABP1 kd) или скремблированной siRNA (контроль). Трансфицированные клетки затем высевали в 96-луночный планшет, культивировали в течение 24 ч и затем обрабатывали РА в бессывороточной среде в указанных концентрациях в течение двух дней. Пролиферацию клеток анализировали с использованием системы анализа пролиферации клеток МТС (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Значение разницы было проанализировано с помощью двухстороннего ANOVA. * обозначает p <0,05 и ** p <0,01.

Семейство альдегиддегидрогеназы 1, член B1

Острый промиелоцитарный лейкоз

Клеточный ретиноево-связывающий белок

Цитохром P450, семейство 26, подсемейство A, полипептид 1

Средство модифицированного Орел Дульбекко

Эстрогеновый рецептор

Эпидермальный рецептор фактора роста 2

полиэтиленимином

Рецептор, активированный пролифератором пероксисом

Рецептор прогестерона

Ретиноевая кислота

Ретиноевая кислота рецептор

Элемент ответа ретиноевой кислоты

Ретинол-связывающий белок

Ретиноид-Х-рецептор

Фактор транскрипции AP-2 alpha

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Вклад авторов

RZL задумал, провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. EG, DDG и HYP провели эксперименты. JRM участвовала в разработке проекта и сборе данных. RG участвовал в разработке исследования, интерпретации данных и редактировании рукописей. Все авторы рассмотрели и одобрили рукопись.

Мы благодарны Лилиан Кук и Шерил Сантос за отличную техническую помощь. Мы особенно благодарим доктора Кэтрин Грэм и Адриана Дриги за управление базой данных микрочипов гена. Эта работа была поддержана грантами Канадского фонда рака молочной железы (R.G. and J.R.M.).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *