Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Асимметричное формирование покрытых ям на дорсальной и вентральной поверхностях на передних кромках подвижных клеток и на выступах неподвижных клеток

Asymmetric formation of coated pits on dorsal and ventral surfaces at the leading edges of motile cells and on protrusions of immobile cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4472015/

Трехмерная флуоресцентная микроскопия с высоким разрешением в реальном времени показывает отсутствие покрытых клатрином ям и пузырьков на вентральных поверхностях ламеллиподий и ламелей в передней части мигрирующих клеток. Кроме того, данные поддерживают модель, вызывающую сетевое мембранное осаждение на клеточном фронте мигрирующих клеток из-за дисбаланса между потоком эндоцитов и экзоцитарных мембран.

Везикулы, покрытые Clathrin / AP2, являются основными эндоцитарными носителями, происходящими на плазматической мембране. В экспериментах, представленных здесь, мы использовали конфокальную и решетчатую световую микроскопию спиннинг-диска для изучения динамики сборки покрытых ям на дорсальной и вентральной мембранах мигрирующих клеток глиобластомы U373, стабильно экспрессирующих AP2, меченные усиленной зеленой флуоресценцией (AP2-EGFP) и на боковых выпячиваниях из неподвижных клеток карциномы молочной железы SUM159, отредактированных генами для экспрессии AP2-EGFP. На клетках U373 покрытые ямки, нанесенные на дорсальную мембрану в передней части ламеллиподия и на приблизительной границе между ламеллиподием и ламеллой, продолжали расти по мере их возврата к телу клетки; покрытые ямки отсутствовали на соответствующей вентральной мембране. Мы наблюдали аналогичную дорсальную / вентральную асимметрию на мембранных выпячиваниях из клеток SUM159. Стационарные покрытые ямы, сформированные и распущенные на остальной части дорсальной и вентральной поверхностей обоих типов клеток. Эти наблюдения поддерживают ранее предложенную модель, которая вызывает удаление чистой мембраны на переднем крае из-за дисбаланса между потоком эндоцитов и экзоцитарных мембран в передней части мигрирующей клетки.

Ячейки, покрытые Clathrin и покрытые везикулы, составляют самую большую долю эндоцитарного трафика, происходящего от клеточной поверхности клеток млекопитающих (см. Обзоры в Watts and Marsh, 1992; Kirchhausen, 2009; Bitsikas et al., 2014). Clathrin и его адаптерный адаптер AP2 являются основными компонентами покрытия на цитозольной стороне мембранного бислоя ячеек и везикул с эндоцитовым покрытием. Сборка клатрина в клеткоподобные структуры обеспечивает молекулярный каркас для деформации мембраны, где AP2 является основной молекулой распознавания груза, связывающей слой клатрина с мембраной (рассмотрен в Kirchhausen et al., 2014). Кинетика образования покрытых ям и покрытых пузырьков изучалась путем включения в сборку покрытий флюоресцентно меченых клатрина, AP2, груза и других компонентов пальто с использованием изображения флуоресценции живой клетки с высоким пространственным и временным разрешением (см., Например, Keen et al., 1999; Merrifield et al., 2002; Ehrlich et al., 2004; Kirchhausen, 2009; Kirchhausen et al., 2014; Taylor et al., 2011; Cocucci et al., 2012; Aguet et al. 2013). Канонические покрытые ямки и везикулы со временем жизни от 35 до 90 с соответствуют плотно изогнутым ямкам с покрытием и образуются на вентральной и дорзальной поверхностях клеток (Ehrlich et al., 2004; Perrais and Merrifield, 2005; Saffarian and Kirchhausen, 2008; Saffarian et al., 2009; Cocucci et al., 2012; Aguet et al., 2013). Более крупные и долгоживущие структуры соответствуют бляшкам с нижней кривизной покрытием (Saffarian et al., 2009; Grove et al., 2014) и встречаются в основном на вентральной поверхности адгезивных клеток (обзоры см. Kirchhausen, 2009; Kirchhausen et al., 2014).

Изображения флуоресценции, полученные из немигрирующих клеток, показывают равномерное распределение покрытых клатрином и AP2 покрытых ям на всех поверхностях вентральной мембраны (Ehrlich et al., 2004; Perrais and Merrifield, 2005; Boucrot and Kirchhausen, 2007; Aguet et al., 2013 ). Это резко контрастирует с неравномерным распределением покрытых ям и везикул, сообщенных для быстро мигрирующих клеток с использованием электронной микроскопии (Davis et al., 1982) или флуоресцентной микроскопии (Nishimura et al., 2003; Rappoport and Simon, 2003; Samaniego et al. ., 2007; Tojima et al., 2010; Fletcher et al., 2012; Mutch et al., 2014). Быстро мигрирующий Т-лимфоцит имеет широкий и относительно тонкий ламеллиподиум спереди и uropod сзади. Электронная микроскопия показала, что в сплющенных ламеллиподиях этих клеток нет покрытых ям и пузырьков (Davis et al., 1982). Это асимметричное распределение эндоцитарных структур клатрина было подтверждено с помощью флуоресцентной микроскопии и было установлено, что оно согласуется с относительно низкой эндоцитарной активностью при ламеллиподине и активном эндоцитозе на уроподе (Samaniego et al., 2007). Другие исследования эндоцитоза на основе клатрина во время направленной миграции включали визуализацию флуоресцентной микроскопии клатрина или AP2 на вентральных поверхностях мигрирующих клеток MDCK, Vero или MDA-MB-231 (Nishimura et al., 2003; Rappoport and Simon, 2003; Fletcher et al., 2012; Mutch et al., 2014) и конусов роста в нейронах (Tojima et al., 2010). Хотя в этих исследованиях не сообщается, отмечается заметное отсутствие флуоресцентных пятен клатрина или AP2 на передней кромке мигрирующих клеток (Nishimura et al., 2003; Fletcher et al., 2012; Mutch et al., 2014) или рост конусов (Tojima et al., 2010) в опубликованных цифрах. Из копланарности пятен в остальной части клеток, прикрепленных к поверхности стекла, мы предполагаем, что покрытые ямки и везикулы формировались на оптических участках, соответствующих вентральным поверхностям клеток. Однако, несмотря на все эти данные, одно исследование, полученное с использованием полной внутренней рефлекторной микроскопии, показало, что структуры клатрина присутствуют на ведущих нижних поверхностях мигрирующих клеток MDCK, но полностью отсутствуют на задних частях тех же клеток (Rappoport and Simon, 2003). Но те же авторы позже опубликовали изображения, в которых клатриновые ямы отсутствовали на вентральных передних краях того же типа клеток (рисунок S4 в Fletcher et al., 2012).

Чтобы разрешить эти противоречивые наблюдения и более полно охарактеризовать пространственную асимметрию формирования пласта с покрытием на поверхности подвижных ячеек, мы опишем здесь исследования с использованием высокоразрешающей трехмерной (3D) флуоресцентной визуализации. Мы выбрали клетки глиобластомы человека U373 в качестве модели подвижности клеток из-за их активной миграции (Ulrich et al., 2009). Быстро мигрирующие клетки поляризуются в направлении миграции с восходящими, вздутыми ламеллиподиями на передних краях, за которыми следуют плоские и относительно тонкие ламели, прилегающие к телам задней части тела (Salmon et al., 2002; Planchon et al., 2011). ). Ламеллиподий имеет более быстрый ретроградный поток актина, чем ламелла (Ponti et al., 2004).

Наш подход к 3D-визуализации и отслеживанию частиц (Kural et al., 2012) позволил нам в первый раз отделить события на вентральной и дорзальной поверхностях той же клетки. Мы обнаружили, что образование очень большого количества покрытых ям, инициированных на передних краях мигрирующих клеток U373. Затем эти ямы были отброшены с ретроградным течением вдоль дорзальных поверхностей ламеллиподий. Они продолжали собираться по мере их перемещения, заканчивая размножением мембраны, образованием пузырьков с пузырьками и разрывом оболочки клатрина / AP2, часто на приблизительной границе между lamellipodium и lamella. Вторая популяция покрытых ям, инициированных на этой границе. Эти ямы были также отброшены назад по спинной пластинке, когда они созревали, чтобы стать покрытыми везикулами. Покрытые ямы и везикулы практически отсутствовали на вентральной поверхности соответствующего ламеллиподия и ламеллы, но вновь появились, как только подвижная ячейка стала неподвижной. По остальной части поверхности клетки, покрытые ямы, инициированные и созревшие в покрытые везикулы без большого поперечного движения, независимо от общего перемещения клеток.

Мы также отслеживали образование покрытых ям и пузырьков на небольших выпячиваниях на краю немигрирующих клеток карциномы молочной железы человека SUM159. Используя решетчатую световую микроскопию (Chen et al., 2014), чтобы помочь разрешить события в малом объеме выступов, мы наблюдали инициирование покрытых ям на передней кромке выступов и их созревание в сочетании с движением вдоль спинного поверхность к телу клетки. При отсутствии на вентральной поверхности выступа неподвижные покрытые ямки обычно образуются вдоль остальных дорсальных и вентральных мембран тех же клеток.

Мы установили клеточную линию, полученную из клеток глиобластомы человека U373, стабильно экспрессирующую AP2, флуоресцентно меченную слиянием ее субъединицы σ2 с усиленным зеленым флуоресцентным белком (AP2-EGFP), следуя той же стратегии, которая использовалась ранее с клетками BSC1 (Ehrlich et al., 2004; Cocucci et al., 2012). Используя конфокальную микроскопию спиннинга, мы визуализировали флуоресцентные пятна AP2, соответствующие ямкам и пузырькам с эндоцитовым покрытием на поверхностях клеток мигрирующих клеток глиобластомы. Мы обнаружили разные типы поведения в зависимости от местоположения (рис. 1 и 2 и дополнительный фильм 1). Мы наблюдали почти полное отсутствие пятен AP2 на вентральных поверхностях ламеллиподий и ламелей мигрирующих клеток (рис. 1A, фронт AP2 и рисунок 2A, вентральный), в то время как пятна AP2 были очевидны как на остальных вентральных поверхностях, так и на всех спинных поверхности этих же клеток (фиг. 1A, AP2 назад и фиг. 2A, дорсально-вентральный). Аналогичное отсутствие флуоресцентных пятен clathrin / AP2 наблюдалось для вентральной и дорзальной поверхностей подвижных клеток U373, стабильно экспрессирующих флуоресцентно меченный AP2 вместе с кратковременной экспрессией легкой цепи Clathrin A, слитой на ее N-конце до помидора (Tomato-LCa; Massol et al., 2006; Saffarian et al., 2009; Рисунок 1B). Количественная оценка плотности мембран пятен AP2 для пяти мигрирующих клеток, представленных на рисунке 2А, ​​показала почти полное отсутствие на вентральном ламеллиподие и ламелле (0,02 ± 0,01 пятна / мкм2). Напротив, пятна AP2 были одинаково распределены на дорсальных поверхностях ламеллиподия и ламеллы (0,26 ± 0,08 пятна / мкм2), а остальные вентральные (0,27 ± 0,07 пятна / мкм2) и дорсальные (0,19 ± 0,05 пятна / мкм2) поверхности к назад из тех же клеток.

Асимметричное образование ямок и везикул, покрытых клатрином / AP2, на передней части мигрирующих клеток глиобластомы U373. (A) Отсутствие клатрина / AP2-содержащих покрытых структур на вентральных поверхностях ламеллиподий и ламелей. Одиночная оптическая секция, полученная конфокальной микроскопией прядильного диска с вентральных (прикрепленных) поверхностей трех разных мигрирующих клеток U373. AP2 флуоресцентно помечен устойчивой экспрессией σ2-EGFP. Изображения подчеркивают вездесущее отсутствие AP2-содержащих структур на вентральных поверхностях ламеллиподий и ламелей и их присутствие в спине к задней части тех же клеток. См. Соответствующий дополнительный фильм 1. Желтые наконечники стрелок выделяют пятна AP2 на границе между ламелей и остальной частью тела клетки; белые стрелки указывают направление миграции; штрихованные желтые линии демаркируют передние кромки ячеек. Шкала шкалы: 10 мкм. (B) Наличие покрытых оболочкой клатрина / AP2 с покрытием на дорсальной поверхности ламеллиподия и ламеллы. Конформный образ спиннингового диска с вентральной поверхности и дорзальная проекция, полученные путем комбинирования изображений с дорзальной поверхности мигрирующей клетки U373. Вентральное изображение было выполнено из одного оптического сечения, а дорзальное изображение соответствует максимальной z-проекции из шести последовательных оптических секций, расположенных на расстоянии 280 нм друг от друга. Clathrin был помечен кратковременной экспрессией Tomato-LCa, а AP2 флуоресцентно помечен устойчивой экспрессией σ2-EGFP. Изображения подчеркивают отсутствие пятен клатрина и AP2 на вентральной поверхности lamellipodium и ламеллы и их присутствие на соответствующей дорзальной поверхности. Белые стрелки указывают направление миграции; штрихованные желтые линии демаркируют передний край ячейки. Шкала шкалы: 10 мкм.

Плотность поверхности AP2-содержащих покрытых ям и пузырьков у передней и задней части мигрирующих клеток U373. (A) Репрезентативные изображения, полученные с вентральной поверхности и максимальной z-проекции из 30 оптических секций, расположенных на расстоянии 700 нм от соответствующей дорзальной поверхности той же мигрирующей клетки U373, стабильно экспрессирующей AP2, флуоресцентно помеченной σ2-EGFP. Представленная область подчеркивает отсутствие структур AP2 на вентральной поверхности lamellipodium и связанных ламелей и их присутствие на соответствующей дорзальной поверхности; Структуры AP2 также присутствовали на смежных вентральных и дорзальных поверхностях. Белая стрелка указывает направление миграции; штрихованные желтые линии демаркируют передний край ячейки. Шкала шкалы: 10 мкм. (B) Схематическое изображение мигрирующей ячейки U373 и демаркация областей, используемых для анализа поверхностной плотности структур AP2; фронт включает ламеллиподий и ламелей. Графики штрихов сравнивают поверхностную плотность пятен AP2 на переднем и заднем концах тех же пяти мигрирующих клеток U373. Данные выражены как среднее ± SD от 1124 вентральных пятен и 1380 дорзальных пятен.

Отсутствие ячеек и везикул, покрытых клатрином / AP2 на вентральной поверхности ламеллиподий и ламелей мигрирующих клеток глиобластомы, было полностью обратимым (фиг. 3A и дополнительный фильм 2). Пункты AP2 быстро появлялись, как только клеточная миграция прекращалась (рис. 3B), и их продолжительность жизни составляла тот же диапазон, что и покрытые ямки и везикулы на других участках той же клетки (рис. 3C). Сходство распределения времени жизни предполагало сходную эндоцитарную активность, поскольку сроки жизни, определяемые с относительно низкой чувствительностью конфокального микроскопа спиннинга, в основном представляют собой успешные (долгоживущие и более крупные) покрытые ямы, которые созревают и превращаются в покрытые везикулы (Ehrlich et al. , 2004; Cocucci et al., 2012; Aguet et al., 2013). Эти времена жизни были аналогичны тем, которые были определены ранее для канонических, дифракционно-ограниченных, клатриновых / AP2-покрытых ям и пузырьков на вентральных поверхностях немигрирующих клеток BSC1 (Ehrlich et al., 2004; Cocucci et al., 2012; Kural et al. , 2012; Aguet et al., 2013). Проверка распределения времени жизни показала, что небольшая часть пятен AP2 была долгоживущей (> 200 с), как и ожидалось для бляшек с покрытием (Saffarian et al., 2009).

AP2-содержащие покрытые ямы и пузырьки снова появляются на вентральной поверхности lamellipodium и lamella, как только миграция прекращается. (A) Изображения, полученные в указанные моменты времени из временного ряда, полученного с вентральной поверхности lamellipodium и ламеллы клетки глиобластомы U373. Изображения показывают появление AP2 пятен вскоре после прекращения миграции клеток. См. Соответствующий дополнительный фильм 2. Белые стрелки указывают направление миграции; штрихованные желтые линии демаркируют передний край ячейки. Шкала шкалы: 10 мкм. (B) Временной курс, показывающий увеличение поверхностной плотности пятен AP2 на вентральных поверхностях ламеллиподий и ламелей из пяти клеток при их остановке миграции. (C) Сравнение времени жизни канонических структур AP2 на вентральной поверхности ламеллиподия и ламеллы пяти клеток, которые прекратили миграцию (проанализировано в B) и вентральной поверхности немигрирующих клеток. Пункты AP2 со временем жизни> 200 с представляют собой долгоживущие бляшки.

Мы использовали наш трехмерный одночастичный протокол отслеживания (Kural et al., 2012; Kural and Kirchhausen, 2012), который позволяет определять положение покрытых дифракцией покрытых ям и пузырьков с субдифракционной предельной осевой и боковой точностью для отслеживания AP2 структуры, сформированные на дорсальных поверхностях у мигрирующих астроцитов (рис. 4). Воспользовавшись осевой точностью 100-нм протокола слежения, мы могли бы однозначно установить, что пятна AP2 продолжают расти на дорсальной поверхности lamellipodium и lamella (рис. 4, A и B). Большинство ям AP2, инициированных на передней кромке ячейки (рис. 4C). Когда они продолжали сборку, они двигались к задней части мигрирующих клеток после ретроградного направления вдоль дорзальных поверхностей ламеллиподий (рис. 4B и 5, A и B, Kural and Kirchhausen, 2012). Потеря сигнала AP2, указывающая на разборку слоя вокруг абортивных ям и / или полностью сформированных покрытых везикул, произошла вблизи границы между lamellipodium и lamella (рис. 5, A и B). Вторая группа покрытых ямок инициировала образование примерно на этой границе и также подметалась к телам клеток по мере их созревания (рис. 5, А и В). Скорость миграции клеток достигала до 30 нм / с и обратно пропорциональна скорости ретроградной точки AP2 (рис. 5C). Агенты Actin формируются на пластинке, достигают дорзальной мембраны и подвергаются ретроградному течению (Cramer, 1997), опосредованному сочетанием с сокращением актомиозина (Ponti et al., 2004; Burnette et al., 2014). Сходство между ретроградной скоростью пятен AP2 на передних кромках подвижных клеток U373 (рис. 5C) и ретроградной скоростью актиновых дуг, визуализируемых кратковременной экспрессией LifeAct-Cherry (рис. 5, D и E и дополнительный фильм 3) согласуется с сильным взаимодействием между эндоцитарными ямами, покрытыми клатрином, и актиновой сеткой.

Трехмерное отслеживание содержащих AP2 покрытых ям и пузырьков, появляющихся на дорзальных поверхностях на передних краях мигрирующих клеток U373. (A) Максимальная проекция интенсивности вентральной и дорзальной поверхностей ламеллиподий и ламелей, полученных из временных рядов, полученных из восьми различных мигрирующих клеток глиобластомы (1-8). Число последовательных z-плоскостей, отображаемых с экспозицией 40 мс для каждой ячейки, включая расстояние между плоскостями, интервал между стеками и длительность временного ряда, указано в таблице внизу рисунка. Белые стрелки указывают направление миграции. Шкалы шкалы: 10 мкм. (B) Трехмерные следы цвета, закодированные для z-положения пятен AP2, когда они образовались на дорсальной поверхности ламеллиподия и ламелей мигрирующих клеток глиобластомы. Штифтовые белые линии указывают приблизительные границы между ламеллиподиями и ламелями. Шкалы шкалы: 10 мкм. (C) Каждая точка указывает местоположение, в котором каждое пятно AP2 от данных в B начинало формироваться, с цветовой кодировкой в ​​соответствии с их локальной поверхностной плотностью, определяемой числом соседних событий инициирования в сферическом объеме с радиусом 2,5 мкм. Шкалы шкалы: 10 мкм.

Ретроградный поток AP2-содержащих покрытых ям и пузырьков вдоль дорзальной поверхности lamellipodium и ламеллы мигрирующей клетки U373. (A) Трехмерное отслеживание пятен AP2 при их формировании на дорсальной поверхности ламеллиподия и ламеллы мигрирующей клетки U373. Пункты AP2, цветные для положения вдоль оси z, показывают ретроградный поток (оранжевая стрелка) к телу ячейки в противоположном направлении миграции клеток (белая стрелка). Строчная белая линия указывает приблизительную границу между lamellipodium и lamella. Графики на вставках подчеркивают зависимость времени от местоположения вдоль оси z репрезентативных точек AP2 между инициированием и интернализацией. Данные взяты из четырех последовательных z-плоскостей, расположенных на расстоянии 350 нм друг от друга, с изображениями 50 мс, полученными каждые 1,6 с в течение 320 с. Шкала шкалы: 10 мкм. (B) Схематическое изображение области, отображаемой в направлении А, указывающего направление движения ячейки, расположение структур AP2, закодированных по их z-положению при их формировании на дорзальной поверхности ламеллиподия и ламеллы, и направление их ретроградного потока. (C) Зависимость между средними ретроградными скоростями пятен AP2 на дорзальной поверхности мигрирующей клетки и скоростью миграции передней кромки той же клетки. Каждая точка данных представляет среднее ± SD точек AP2 из каждой из семи ячеек; было проанализировано 808 пятен. (D и E) Ретроградное движение актиновых дуг в ламеллиподиях мигрирующих клеток U373. Кимографы взяты из временных рядов, полученных вдоль синих и красных пунктирных линий двух мигрирующих клеток U373, временно экспрессирующих LifeAct-Cherry. Черные стрелки отслеживают ретроградные движения каждой из двух выбранных дуг актина. Средняя ретроградная скорость актиновых дуг в D и E составляла 13,5 ± 3,5 и 10,2 ± 2 нм / с для мигрирующих клеток при 20,6 и 22,8 нм / с соответственно.

Отслеживание структур AP2, образовавшихся на оставшихся дорзальных поверхностях мигрирующих клеток U373 (рис. 4B), показало сборку ям в относительно стационарных местах, подобно стационарной сборке, ранее описанной для немигрирующих клеток (Ehrlich et al., 2004; Cocucci et al. , 2012; Kural et al., 2012; Aguet et al., 2013).

Мы также исследовали поведение покрытых ям и пузырьков в относительно небольших выпячиваниях, которые образовались на периферии в основном стационарных клеток молочной железы карциномы молочной железы SUM159. В этом случае мы визуализировали флуоресцентно меченные комплексы AP2 в клетках SUM159, отредактированные генами, для экспрессии σ2-EGFP вместо σ2 (SUM-AP2.1). Мы отобрали покрытые ямки и везикулы, используя решетчатую световую микроскопию (Chen et al., 2014), чтобы разрешить дорзальную часть с вентральных поверхностей выступов (рис. 6, A-C и дополнительный фильм 4). Как и на передних краях мигрирующих клеток U373, мы наблюдали ретроградный поток флуоресцентных точек AP2, который начинался на ведущих спинных поверхностях выступов (рис. 6, A и C). Вентральные области выступов не имели AP2, а их плотность была нормальной на остальных вентральных поверхностях тех же клеток (рис. 6, A и C). В отличие от выступов не было существенной гетерогенности в пространственном распределении точек AP2 на вентральной или дорзальной поверхности этих клеток (неопубликованные данные).

Формирование AP2-содержащих покрытых ям и пузырьков в небольших выступах на периферии немигрирующих клеток SUM159. (A) AP2-содержащие эндоцитарные покрытые ямы и везикулы, полученные с использованием решетчатой ​​световой микроскопии на вентральной и дорзальной поверхностях немигрирующего гена SUM-AP2.1 номер 6, отредактированного для экспрессии AP2, помеченного σ2-EGFP. Одиночные плоскости x, z из временного ряда томов, состоящих из 80 плоскостей, расположенных на расстоянии друг от друга на расстоянии 205 нм, с интервалом 2,18 с между стеками. Изображения были получены с экспозицией 25 мс, а продолжительность временного ряда — 216 с. Небольшой выступ проявляется в левой части ячейки. Большинство точек AP2 относительно неподвижны во всех вентральных и дорзальных поверхностях, за исключением тех, что находятся в ретроградном потоке на дорзальной поверхности мелких выступов (см., Например, точку AP2, выделенную красной стрелкой). Этот пример также показывает ограниченность пятен AP2 на вентральной поверхности выступа. Шкала шкалы: 5 мкм. (B) Одноплоскостные верхние виды, соответствующие вентральной поверхности, из отредактированных по генам SUM-AP2.1 клеток 1, 2 и 3 соответственно. Изображения показывают отсутствие пятен AP2 на ведущих фронтах выступов, которые в целом были более узкими, чем ламеллиподии и ламели мигрирующих клеток глиобластомы. Оранжевые стрелки указывают направление ретроградного движения AP2 на дорсальных поверхностях выступов (не показано). Шкала шкалы: 5 мкм. (C) Трехмерное отслеживание пятен AP2, образующихся на дорзальных поверхностях выступов, иллюстрирует их ретроградное движение к телам клетки (оранжевые стрелки). Трассировки AP2 кодируются цветом в соответствии с их z-положением относительно вентральной мембраны и в соответствии с их ретроградной скоростью в отредактированных гена клетках 4 и 5 SUM-AP2.1. Шкала шкалы: 5 мкм.

Мы впервые показали, с помощью трехмерной флуоресцентной микроскопии живой клетки клеток глиобластомы U373, мигрирующих на двумерной поверхности, причем на передней кромке формируются клатрин / AP2-содержащие эндоцитарные покрытые ямки и завершают их сборку, тело клетки вдоль дорзальной поверхности lamellipodium. Покрытые ямки в виде пузырьков в виде покрытых везикул, а затем развязываются к тому времени, когда они достигают границы между ламеллиподием и ламеллами; абразивные ямы также растворялись на границе. Мы обнаружили второй пул покрытых ям, которые начались на этой границе. Они также были сформированы, будучи охвачены ретроградным течением к телу клетки. Напротив, покрытые ямки и везикулы заметно отсутствовали на вентральных мембранах ламеллиподия и ламеллы. Ретроградный поток ям на дорзальных поверхностях ламеллиподий и ламелей подвижных клеток U373 заканчивался, как только клетки перестали мигрировать, а новые ямы с нормальной динамикой сборки появились на соответствующих вентральных поверхностях. Мы обнаружили аналогичное асимметричное распределение покрытых ям и пузырьков на дорсальной и вентральной поверхностях мелких выступов, образующихся вокруг края немигрирующих клеток рака молочной железы SUM159, а также на ламеллиподиях и ламелях клеток MEF, стабильно экспрессирующих AP2-σ2-EGFP (неопубликованные данные) ,

Данные визуализации живой клетки согласуются с ранними результатами электронной микроскопии, показывающими отсутствие покрытых ям и пузырьков в расширенных дорсальных и вентральных поверхностях ламеллиподий и нормальных количеств в телах клеток и хвостовых uropods быстро мигрирующих Т-клеток (Davis et al., 1982). Они также согласуются с более свежими данными, четко демонстрирующими отсутствие эндоцитоза в lamellipodium и нормальное поглощение в теле клетки и уроподе (Samaniego et al., 2007). Опубликованные изображения и фильмы из исследований расширения нейронного роста конуса (Tojima et al., 2010) также показывают почти полное отсутствие ящиков с эндоцитовым покрытием, помеченных флуоресцентным клатрином или динамином на вентральной поверхности. Один из фильмов Тоджимы и др. (2010; их дополнительный фильм 1) также показывают ясные примеры покрытой ямы, подвергающейся ретроградному течению; вполне вероятно, что это зависящий от актина ретроградный поток на дорзальной поверхности, так как его скорость была аналогична скорости F-актина и уменьшалась в присутствии blebbistatin, ингибитора миозина II, который замедляет течение F-актина (Tojima et al. ., 2010). Накопление долгоживущих покрытых бляшек (Kirchhausen, 2009; Saffarian et al., 2009; Grove et al., 2014) на адгезионных вентральных поверхностях тел клеток и задних краях мигрирующих клеток путало интерпретацию наблюдений в некоторых работах ( Nishimura and Kaibuchi, 2007; Fletcher et al., 2012; Mutch et al., 2014). В этих работах рассматривалась колокализация груза с большими пятнами клатрина как прямое указание на эффективный эндоцитоз, хотя эффективность эндоцитов этих более крупных структур низкая по сравнению с эндоцитарной способностью более активных и обильных канонических покрытых ям и пузырьков (Saffarian et al. , 2009). Однако тщательная интерпретация опубликованных изображений показывает явное отсутствие флуоресцентных пятен клатрина или AP2 на ведущих вентральных краях того, что, по-видимому, переносит Hela, MDCK и MDA-MB-231cells (Nishimura and Kaibuchi, 2007; Fletcher et al., 2012; Mutch et al., 2014). Все эти исследования согласуются с асимметричным образованием покрытых ям на дорсальной и вентральной поверхностях на переднем крае подвижных клеток. Открытый вопрос заключается в том, присутствует ли подобный мембранный поток на передних краях мигрирующих клеток в более сложной трехмерной геометрии, с которой они сталкиваются в живых тканях.

Какими могут быть молекулярные сигналы, которые определяют преимущественное инициирование питтинговой оболочки на переднем крае? Фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат [PI (4,5) P2] имеет важное значение для инициирования порошковой оболочки (для недавнего обзора см. Kirchhausen et al., 2014), а простым механизмом может быть поляризованное распределение PI (4, 5) Р2. Динамика разветвленного актина, опосредованная Arp2 / 3, также требует мембранного PI (4,5) P2 (для обзоров см. Wang et al., 2003; Zhang et al., 2012). В клетках COS-7 Arp2 / 3 сильно обогащается ламеллиподиями, но значительно истощается от вентральных поверхностей соседних ламелей (см. Рисунок 5F в Zoncu et al., 2007). Мигрирующие нейтрофилы, иммунизированные антителом, специфичным к PI (4,5) P2, также показали обильное накопление при ламеллиподии и минимальный сигнал на вентральной поверхности ламелей (Sharma et al., 2008). В настоящее время неясно, почему плотность покрытых ямок, начинающихся на переднем крае, выше, чем в других местах ячейки. Поскольку передний край представляет собой сайт поляризованного экзоцитоза (Hopkins et al., 1994; Gauthier et al., 2009; Osmani et al., 2010), возможно, что активация образования клатриновой ямы, наблюдаемая в этом регионе, является ответом на повышенное осаждение мембран. Такой ответ ранее был показан в клетках HeLa, подвергнутых воздействию перфорина, порообразующего белка, который вызвал реакцию восстановления мембраны, в которой лизосомы и эндосомы обеспечивали их мембраны для повторного запечатывания поврежденной мембраны (Thiery et al., 2010).

Поляризованная сборка актина на переднем крае мигрирующих клеток ведет вперед движение (Ponti et al., 2004). Раннее предложение о том, что мембранное осаждение экзоцитозом было бы предпочтительным в передней части мигрирующих клеток (Abercrombie et al., 1970a, b; Bretscher and Thomson, 1983), потеряли поддержку от нескольких более поздних наблюдений, что обратная миграция бусин, адсорбированных во внеклеточное спинные поверхности на фронте мигрирующих клеток объяснялись присоединением шариков к мембранным белкам, взаимодействующим с актиновыми полимерами, движущимися центростремительно (Sheetz et al., 1989). Аналогично, поглощенные бусины могут быть отброшены назад цитозольным потоком (Caspi et al., 2001). Однако осаждение мембран на передней кромке подтверждается наблюдениями о том, что на поверхности внеклеточных поверхностей аксонов от конусов роста к клеточным телам растущих нейронов перемещались липид-присоединенные шарики (Dai and Sheetz, 1995).

Клетки уравновешивают эндоцитарное и экзоцитарное везикулярное движение для обеспечения строгого контроля поверхности во время интерфазы (Boucrot and Kirchhausen, 2007; Tacheva-Grigorova et al., 2013). Поляризованное отсутствие покрытых ям в передней части мигрирующих клеток или в специализированных выступающих областях, таких как конусы роста в нейронах и ламеллиподии в мигрирующих Т-клеточных лимфоцитах, в сочетании с местным экзоцитозом (например, предпочтительное осаждение рецептора трансферрина на переднем крае мигрирующих клеток A431, Хопкинс и др., 1994), преимущественная доставка везикул, содержащих Cdc42, на передние края мигрирующих астроцитов (Osmani et al., 2010) или до 50% плазматической мембраны с помощью GPI-привязанного (Gauthier et al., 2009) обеспечили бы простой способ получения чистой мембраны, необходимой для обеспечения движения вперед. Асимметрия мембранного осаждения во время миграции, по-видимому, обусловлена ​​главным образом регулируемым увеличением экзоцитоза, поскольку простого локального блока всех форм эндоцитоза было бы недостаточно. Расширение lamellipodium в течение 10 с со скоростью 10 нм / с с шириной 10 мкм потребовало бы чистого осаждения 106 нм2. Это количество эквивалентно ~30 покрытым везикулам диаметром 100 нм. В течение того же периода патч мембраны того же размера создавал бы только 0,07 покрытые везикулы, предполагая скорость образования ~ 0,4 покрытых везикулы / 106 нм2-мин. Эта оценка сохраняется, даже если предположить, что эндоцитарный путь клатрина обеспечивает основной путь входа и игнорирует вклад других форм эндоцитоза, включая эндофилин-зависимые и не содержащие клатрин носители, связанные с локальной деформацией мембраны и образованием канальцев (Kirkham et al. , 2005, Howes et al., 2010; Boucrot et al., 2014; Renard et al., 2014) и другие менее точно определенные процессы, связанные с образованием более крупных мембранных инвагинаций, связанных с макропиноцитозом (Liberali et al., 2008) ).

Более сбалансированный поток эндоцитов и экзоцитарных мембран в оставшихся частях этих клеток (включая тело клетки и дорзальную поверхность выступов) может установить общую полярность, как это предлагается в моделях, вызывающих сетевое мембранное осаждение на переднем крае (для недавнего обзора , см. Bretscher, 2014). Поляризованное отсутствие эндоцитоза на передней кромке, однако, не представляется достаточным для обеспечения мембраны, необходимой для движения вперед. Вместо этого требуется поляризованная активация экзоцитоза. Наши наблюдения в реальном времени, демонстрирующие относительно небольшой вклад покрытых везикул в поток мембран на передней кромке, обеспечивают дополнительную поддержку таким моделям.

Наше использование 3D-визуализации в реальном времени с высоким пространственным и временным разрешением позволило нам однозначно установить сильную асимметрию формирования каркаса с покрытием на близко расположенных дорзальных и вентральных поверхностях на передних кромках мигрирующих клеток. Мы предполагаем расширенное использование 3D-изображений, используя расширенное пространственное и временное разрешение решетчатого светового микроскопа для изучения субклеточных событий, таких как описанные здесь в более естественной трехмерной среде органоидов и многоклеточных организмов.

U373 клетки человеческой глиобластомы, стабильно экспрессирующие σ2-EGFP, выращивали в DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), пенициллина и стрептомицина. Временная экспрессия крысы Tomato-LCa (Massol et al., 2006; Saffarian et al., 2009) и LifeAct-mCherry была проведена путем трансфекции Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в Optimem (Life Technologies, Grand Island, NY) в соответствии с инструкции изготовителей. SUM159 клетки карциномы молочной железы человека были отредактированы по генам, чтобы заменить оба аллеля субъединицы σ2 AP2 на σ2, слитый на своем C-конце, до EGFP с использованием протокола-активатора, подобного эффекторной нуклеазе (TALEN) (Sanjana et al., 2012 , Cocucci et al., 2014). Здесь мы использовали клон D8, именуемый SUM-AP2.1 (неопубликованные данные). Клетки анализировали через 24 ч после трансфекции.

Примерно 1 × 105 клеток U373 высевали за 16 часов до изображения на 25 мм (диаметр). 1,5 стеклянных покровных стекла. Средство для визуализации представляло собой фенол-красную DMEM, дополненную 10% FCS и 20 мМ HEPES (pH 7,4). Для изображений (Kural et al., 2012) покровные стекла помещали в контролируемую температурой 5% СО2 увлажненную камеру (20/20 Technology, Wilmington, NC), смонтированную на пьезоэлектрической управляемой стадии системы визуализации Mariana (Intelligent Imaging Innovations, 3I, Denver, CO) на основе инвертированного микроскопа Axiovert 200M (Carl Zeiss, Thornwood, NY), конфокального блока спиннинг-диска CSU-X1 (Yokogawa Electric Corporation, Токио, Япония), устройства для коррекции сферической аберрации (SAC, Infinity Photo-Optical, Boulder, CO) и объектив с объективом 63 × (Plan-Apochromat, NA 1.4, Carl Zeiss). SAC был помещен между объективом на масляной основе и камерой для разрешения сферической аберрации, вызванной несоответствием показателя преломления между живыми клетками и стеклянной оптикой. Трехмерные временные ряды были получены с помощью Slidebook 5 (Intelligent Imaging Innovations).

Клетки высевали за 5 ч до изображения на 5 мм (диаметр). 1,5 стекла и были отображены при 37 ° С в DMC без фенола без крахмала с добавлением 10% FCS и 20 мМ HEPES (pH 7,4) в отсутствие CO2. Трехмерную решетчатую световую микроскопию проводили с использованием приборов, описанных в Chen et al. (2014). Клетки сканировали постепенно по 15-миллиметровому световому листу с шагом 210 нм, используя стадию быстрого пьезоэлектрического изгиба, эквивалентную ~ 210 нм по отношению к объекту обнаружения, и были отображены с использованием камеры sCMOS (Orca Flash 4.0, Hamamatsu, Бриджуотер, Нью-Джерси). Композитные объемные данные (рис. 6) для ячеек 1 и 2 были получены из временных рядов 500 и 343 с по длительности, полученной с использованием экспозиции / кадра 15 и 30 мс, а стопки 101 и 85 плоскостей, полученные каждые 3,5 с. Составные объемные данные для ячеек 3-6 были получены из временных рядов 210 с по длительности, полученной с использованием 20 мс (ячейки 3-5) или экспозиции / кадра в 25 мсек (ячейка 6), а стопки 79-91 плоскости, полученные каждые 2,1 с ,

Скорость миграции передней кромки lamellipodium определяли с использованием Matlab 7 (Mathworks, Natick, MA) из изменения положения медианного положения ламеллиподия вдоль направления миграции; ламеллиподий визуализировали в кимографах, представляющих максимальную проекцию изображений, скорректированных фоновой флуоресценцией. Средняя скорость миграции ламеллиподия была рассчитана из трех кимографов, полученных из разных мест по его ширине.

Трехмерное расположение флуоресцентных пятен с ограничением дифракции, соответствующих покрытым ямкам и везикулам, определялось по их расположению вдоль осей x и y и вдоль оси z (из z-стеков) для каждой точки времени в фильмах (Kural et al. ., 2012; Kural and Kirchhausen, 2012).

Эта статья была опубликована онлайн перед печатью в MBoC in Press (http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E15-01-0055) 7 апреля 2015 года.

* Настоящий адрес: Исследовательский центр прикладных наук, Академия Синика, Тайбэй 11529, Тайвань.

Мы благодарим Эрика Марино за поддержание Ресурса Imaging, используемого в этом исследовании, Патрика Ривза для создания плазмиды экспрессии для LifeAct и членов нашей лаборатории для полезных обсуждений. C.K. был получателем стипендии Фонда Хелен Хэй Уитни. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения грантами GM-075252 (до T.K.) и U54 AI057159 (Региональный центр передового опыта в области биозащиты и развивающейся инфекционной болезни, Core Imaging Facility). B.-C.C., W.R.L и E.B. были профинансированы Медицинским институтом Говарда Хьюза. Т.К. с благодарностью признает поддержку программы посетителей Janelia.

трехмерный

эмбриональная сыворотка теленка

устройство коррекции сферической аберрации

легкая цепь клатрина А, конденсированная на своем N-конце до помидора.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *