Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Дикий тип и мутант p53 дифференциально регулируют NADPH-оксидазу 4 в TGF-β-опосредованной миграции человеческих эпителиальных клеток легких и груди

Wild-type and mutant p53 differentially regulate NADPH oxidase 4 in TGF-β-mediated migration of human lung and breast epithelial cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4021516/

Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМТ), что приводит к повышенной пластичности клеток в начале инвазии раковых клеток и метастазов. Механизмы, участвующие в TGF-β-опосредованной ЕМТ и подвижности клеток, неясны. Недавние исследования показали, что р53 влияет на опосредованную TGF-β / SMAD3 сигнализацию, миграцию клеток и опухолегенез. Ранее мы продемонстрировали, что Nox4, NADPH-оксидаза семейства Nox, представляет собой индуцируемый TGF-β / SMAD3 источник активных форм кислорода (ROS), влияющий на миграцию клеток и экспрессию фибронектина, маркер ЕМТ, в нормальных и метастатических эпителиальных клетках груди. В нашем настоящем исследовании исследуется участие p53 в TGF-β-регулируемой экспрессии Nox4 и миграции клеток.

Мы исследовали влияние белков p53 (WT-p53) дикого типа и мутантных протеинов p53 на TGF-β-регулируемую экспрессию Nox4 и миграцию клеток. NX4-мРНК и белок, продуцирование ROS, миграция клеток и активация очаговой адгезии киназы (FAK) были исследованы в трех разных моделях клеток, основанных на их мутационном статусе p53. H1299, p53-нулевая линия эпителиальных клеток легких, была использована для гетерологичной экспрессии WT-p53 или мутантного p53. Напротив, функциональные исследования с использованием siRNA-опосредованного нокдауна эндогенных p53 проводились в Mast-MB-231 метастатических грудных эпителиальных клетках, которые экспрессируют нормальные клетки груди p53-R280K и MCF-10A, которые имеют WT-p53.

Мы обнаружили, что WT-p53 является мощным супрессором индуцированного TGF-β-продуцированием Nox4, ROS и миграции клеток в p53-нулевых эпителиальных клетках легких (H1299). Напротив, связанные с опухолью мутантные протеины p53 (R175H или R280K) вызывали усиленную экспрессию Nox4 и миграцию клеток как в TGF-β-зависимом, так и в TGF-β-независимом пути. Кроме того, нокдаун эндогенного мутанта р53 (R280K) в TGF-β-обработанных MDA-MB-231 метастатических грудных эпителиальных клетках приводил к уменьшению белка Nox4 и снижению фосфорилирования FAK, ключевого регулятора подвижности клеток. Экспрессия WT-p53 или доминантно-отрицательного Nox4 уменьшала TGF-β-опосредованное фосфорилирование FAK, тогда как мутант p53 (R280K) увеличивал фосфо-FAK. Кроме того, нокдаун WT-p53 в нормальных грудных эпителиальных клетках MCF-10A увеличивал основную экспрессию Nox4, тогда как p53-R280K может переопределять эндогенную репликацию WN-p53 Nox4. Примечательно, что анализ иммунофлуоресценции показал, что клетки MCF-10A, экспрессирующие мутант p53-R280K, показали повышенную активность Nox4 как в сливных, так и в мигрирующих клетках.

В совокупности наши результаты определяют новые противоположные функции для WT-p53 и мутантных белков p53 в регуляции Nox4-зависимой сигнализации в опосредованной TGF-β-клетке подвижности.

Трансформирующий фактор роста-бета (TGF-β) является плюрипотентным цитокином с двойными опухолеподавляющими и стимулирующими опухоль эффектами. Во время прогрессирования опухоли трансформированные клетки перестают реагировать на подавляющие опухоль эффекты TGF-β и реагируют на стимулирующие опухоль эффекты, претерпевая изменения в морфологии, приводящие к увеличению подвижности клеток, инвазии и метастазирования (Xu et al, 2009; De Craene and Berx, 2013). Трансформирующий фактор роста-β считается основным регулятором эпителиально-мезенхимного перехода (ЕМТ). Трансформирующие транскрипционные изменения фактора роста-β превращают адгезивные поляризованные эпителиальные клетки в мигрирующий мезенхимальный фенотип, связанный с развитием органов, а также прогрессирование опухоли (Valcourt et al, 2005; Tian et al, 2011). Интересно отметить, что недавние сообщения показывают, что белки P53 (WT-p53) и мутантного белка p53 дикого типа могут взаимодействовать с сигналами TGF-β для совместной регуляции генов, участвующих как в TGF-β, так и в отношении опухолевых и опухолевых промоторных путей соответственно (Dupont et al. , 2004; Adorno et al, 2009; Termen et al, 2013).

Супрессор опухолей р53 действует в первую очередь как фактор транскрипции, ответственный за индуцирование генов-мишеней, ответственных за апоптоз. p53 является наиболее часто мутированным геном во многих формах рака с более чем 50% опухолей, экспрессирующих неактивный белок-супрессор опухоли. Эти мутации находятся главным образом в ДНК-связывающем домене, который может вызвать доминантно-негативный эффект или приобретенный способ усиления опухоли функции (Vousden and Prives, 2009). Недавно Cordenonsi et al (2003) продемонстрировали, что WT-p53 может взаимодействовать с активированным TGF-β-SMAD2 / 3, чтобы способствовать остановке клеточного цикла и апоптозу. Напротив, Adorno и др. (Adorno et al., 2009) продемонстрировали, как мутированный p53 влияет на переключение между TGF-β, действующим как супрессор опухоли, на опухолевый промотор, в результате которого мутантные комплексы p53 / SMAD работают вместе, чтобы способствовать миграции опухолей и метастазированию.

Фокальная адгезивная киназа (FAK) представляет собой нерецепторную тирозинкиназу, которая играет важную роль в связывании рецепторов интегрина с внутриклеточными сигнальными путями, участвующими в адгезии клеток, миграции и инвазии (Zhao and Guan, 2009). Фокальная адгезионная киназа является основным связующим звеном между внеклеточными матрикс-активированными рецепторами интегрина и внутриклеточными сигнальными путями, участвующими в регуляции транскрипции мезенхимальных и инвазивных маркеров (Thannickal et al., 2003). Предыдущие исследования показали, что индуцированная TGF-активация FAK необходима для прогрессирования ЭМТ и метастазирования опухолей (Luo and Guan, 2010). Интересно, что недавние исследования показали, что TGF-β, а также экспрессия мутантного р53 может усилить активацию активатора ФАК, мРНК и белков (Cicchini et al, 2008; Walsh et al, 2008). Более того, избыточная экспрессия FAK и мутации p53 сильно коррелируют с раком молочной железы человека (Голубовская и др., 2009).

Трансформирующий фактор роста-β индуцирует клеточные реактивные виды кислорода (ROS) во многих типах клеток. Увеличение ROS связано прежде всего с цитотоксичностью и апоптозом; однако исследования показали важность ROS как регуляторов сигнальных путей и транскрипции генов, участвующих в прогрессировании ЕМТ, миграции клеток и метастазов (Cannito et al, 2010). Реактивные виды кислорода являются сигнальными медиаторами, действующими через многочисленные механизмы, включая окисление цистеина и ингибирование белковых тирозинфосфатаз, активацию редокс-чувствительных факторов транскрипции (NFκ-B, p53 и AP-1) и окисление цитоскелетных белков, участвующих в подвижности клеток ( актин, кофилин и виментин) (Allen and Tresini, 2000; Fratelli et al., 2002; Chiarugi and Cirri, 2003; Kwon et al, 2004; Boivin et al, 2010; Frijhoff et al, 2013; Leoni et al, 2013) , Предыдущие исследования сообщили о корреляции между увеличением производства ROS и прогрессированием опухоли (Wu, 2006). Внутриклеточные ROS-генерирующие источники включают NADPH-оксидазные ферменты (семейство Nox), митохондрии, ксантиноксидазу и синтазу оксида азота (Thannickal and Fanburg, 2000).

ROS-генерирующие ферменты семейства Nox (Nox1-5 и Duox1-2) являются критическими медиаторами окислительно-восстановительной сигнализации. Предыдущие исследования показали, что NODPH-оксидаза-зависимое ROS-продуцирование может изменять подвижность клеток или потенцировать метастатическую прогрессию (Schroder et al., 2007; Sadok et al, 2008, 2009; Shinohara et al, 2010; Leoni et al, 2013). Из семи Nox-ферментов Nox4 уникален тем, что индуцируется TGF-β. Трансформирующий фактор роста-β-индуцированный Nox4 был вовлечен в дифференцировку остеобластов, пролиферацию фибробластов, перегруппировку цитоскелета эндотелиальных клеток, подвижность клеток, ЕМТ, легочный фиброз и индуцированный вирусом гепатита C гепатоцитарный окислительный стресс (Hu et al, 2005; Li et al. , 2008, Boudreau et al, 2009; Amara et al, 2010; Carnesecchi et al, 2011; Mandal et al, 2011; Boudreau et al, 2012). Nox4 представляет собой 578 аминокислот, шесть трансмембранных доменных флавоцитохромов, которые функционируют, транспортируя электроны из цитозольного NADPH через биологические мембраны в кислород, продуцирующий ROS. Geiszt et al (2000) впервые описали Nox4 в почках, но NX4 мРНК и экспрессия белка были обнаружены в других тканях человека и мыши, включая кость, сосудистую ткань, сердце, печень и легкое (Cheng et al, 2001; Hilenski et al. , 2004; Yang et al, 2004; Sturrock et al, 2006, 2007; Kuroda et al, 2010). Хотя TGF-β является регулятором Nox4 во многих тканях, восприимчивых к фиброзу и опухолегенезу, мало известно о задействованных механизмах.

Ранее мы сообщали, что Nox4 является основным источником индуцированных TGF-β-SMAD3 ROS в нормальных и метастатических эпителиальных клетках груди (Boudreau et al, 2012). Мы продемонстрировали, как Nox4 функционирует как критический медиатор событий, связанных с ЕМТ, включая клеточную мобильность и регуляцию гена фибронектина. Здесь мы демонстрируем, что WT-p53 и мутант p53 могут дифференциально регулировать экспрессию и активность Nox4. Мы обнаружили, что WT-p53 подавляется, в то время как связанные с раком мутантные p53 (R175H и R280K) белки усиливают экспрессию Nox4 как в TGF-β-зависимых, так и в независимых процессах. Более того, мы показываем, что мутант p53 и Nox4 необходимы для активации ФАР, опосредуемой TGF-β, и миграции эпителиальных клеток молочной железы и легких человека.

Человеческий эпителий легкого H1299 (p53-нуль), иммортализованный эпителий человека MCF-10A (p53-WT) и метастатические клетки молочной железы MDA-MB-231 (p53-R280K) были получены из АТСС (Rockville, MD, США). Клетки H1299 поддерживали в среде RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (HyClone / Thermo Scientific, Logan, UT, USA) и 100 мг мл-1 пенициллина-стрептомицина. Клетки MCF-10A поддерживали в минимальной существенной среде Dulbecco / F12 (DMEM / F12, Invitrogen), дополненной 5% лошадиной сывороткой (Sigma, St Louis, MO, USA), 500 мкг мл-1 гидрокортизона (Sigma), 20 нг мл -1 EGF (R & D Systems, Миннеаполис, MN, США), 100 нг мл-1 холерного токсина (Sigma), 10 мкг мл-1 инсулина (Sigma) и 100 мг мл-1 пенициллина-стрептомицина (Invitrogen). Клетки MDA-MB-231 поддерживали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 мг мл-1 пенициллина-стрептомицина. Все клетки выращивали в увлажненной атмосфере с содержанием 5% СО2 и 95% воздуха при 37 ° С. В некоторых экспериментах клеточные культуры обрабатывали 10 мкМ 616451 (EMD Millipore, Billerica, MA, США), I-специфическим ингибитором TGF-β-рецептора или 10 мкМ SIS3 (Sigma), SMAD3 -специфическим ингибитором.

Векторы, кодирующие полноразмерный человеческий Nox4 (номер доступа GenBank NM_016931) и усеченный, доминантно-отрицательный Nox4 (Nox4-DN; остатки 1-305), были получены с использованием кДНК, субклонированной в pcDNA3.1. pCMV-p53-R175H и p53-R280K генерировали из экспрессирующего вектора pCMV-p53-WT (Clontech, Mountain View, CA, USA) с помощью сайт-направленного мутагенеза. Все конструкции были проверены с помощью автоматизированного секвенирования ДНК (Macrogen, Rockville, MD, USA).

Клетки H1299 и MCF-10A трансфицировали Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, USA) с использованием протоколов производителя. Вкратце, 2,5 × 105 клеток высевали в 6-луночные планшеты для культивирования тканей (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) за 24 часа до трансфекции. Трансфекционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин в бессывороточной RPMI-1640 (H1299) или DMEM / F12 (MCF-10A) и затем добавляли по каплям к клеткам. Клетки MDA-MB-231 трансфицировали Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в соответствии с протоколами производителя. Вкратце, 2 × 105 клеток высевали на 6-луночные планшеты за 24 часа до трансфекции. Трансфекционные смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин в бессывороточной DMEM и добавляли по каплям к клеткам, содержащим бессывороточную среду. Через 4 часа среду заменяли на DMEM, содержащую сыворотку.

Для нокдауна эндогенных p53 в клетках MDA-MB-231 и MCF-10A использовали Dharmacon ON-TARGETplus SMARTpool siRNA TP53 (Dharmacon, Lafayette, CO, USA, L-003329-00-0005) или нецелевую контрольную сиРНК (D -001810-01-05; Dharmacon). Трансфекционный реагент DharmaFECT4 использовался для трансфекции siRNAs в соответствии с протоколами производителя. Клетки трансфицировали с плотностью 1 × 104 клеток на миллилитр с концентрацией siRNA 50 нМ и инкубировали в полностью свободной от антибиотиков полной среде в течение 72 часов перед уборкой. Ni44 siRNA также был приобретен у Dharmacon (ON-TARGETplus SMARTpool siRNA Nox4 (L-010194-00-0010)) и трансфицирован, как описано выше.

Измерения кинетической ROS-детектирования проводились хемилюминесценцией в 96-луночных планшетах при 37 ° С в течение 45-минутного времени с использованием люминометра Люминоскана (Dharmacon), как описано ранее (Boudreau et al, 2009). Вкратце, ~ 2,5 × 104 клеток собирали трипсинизацией и дважды промывали буфером соляного раствора Хэнка (Invitrogen) центрифугированием. SOD3-чувствительное продуцирование супероксида измеряли с использованием реагента Diogenes (National Diagnostics, Atlanta, GA, USA). Внеклеточный H2O2 измеряли методом хемилюминесценции на основе люминола / HRP.

Общая РНК из H1299, MDA-MB-231 или MCF-10A или клеток экстрагировалась из клеток Trizol (Invitrogen). Для термосклонной RT-PCR использовали один микрограмм общей РНК. Оба они проводились в соответствии с протоколами производителя (Invitrogen).

Выражение гена определяли количественно с помощью ПЦР в реальном времени с использованием системы ABI Prism 7500 RT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Одна микрограмма общей клеточной РНК была обратной транскрипции с помощью набора ThermoScript RT-PCR (Invitrogen). SYBR Green PCR mix (Invitrogen) использовали для определения экспрессии мРНК. Праймеры, предназначенные для обнаружения Nox4, Fibronectin и GAPDH человека, были использованы, как описано ранее (Boudreau et al, 2012). Результаты описаны как относительное количественное определение 2 — (- ΔΔCt). GAPDH использовался как внутренний контроль для нормализации.

Полные клеточные лизаты обрабатывали для вестерн-блоттинга, как описано ранее и исследовали с помощью следующих антител: моноклональный анти-Nox4 кролика (UOTR1B493) (Abcam, Cambridge, MA, USA); мышиный моноклональный анти-р53 (клон DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Даллас, Техас, США); моноклональный антифосфо-SMAD3 кролика (клон EP823Y, Abcam); кролик поликлональный антифосфо-SMAD2 (№ 3101, Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, США); кролик моноклональный против SMAD3 (клон EP568Y, Abcam); мышиный моноклональный анти-SMAD2 (№ L16D3; Cell Signaling); кроличьи моноклональные анти-фосфо-FAK (Y576; Invitrogen); кроличья поликлональная анти-FAK (№ 3285; сигнализация сотовой связи); (кроличьи поликлональные анти-GAPDH (Trevigen) и мышиные моноклональные антитела против V5 (Invitrogen).

Вкратце, клетки высевали и трансфецировали плазмидной ДНК или siRNA, как описано выше, затем трипсинизировали и промывали 24 ч (плазмидная ДНК) или 48 ч (siRNA) позже. Примерно 1,5 × 105 трансфецированных клеток высевали в верхние камеры 6-луночных культуральных планшетов BD Biocoat Matrigel (BD Biosciences) и инкубировали с нижними камерами, содержащими полную среду с TGF-β (5 или 10 нг мл-1). Через 24 ч клетки, не мигрирующие, очищали и мигрирующие клетки окрашивали Diff Stain (IMEB, San Marcos, CA, USA). Вторывающие ячейки подсчитывались из 10 случайных полей. Эксперименты Матригеля повторяли три раза.

Клетки MDA-MB-231 или MCF-10A высевали 3,0 × 104 на камеру Lab-Tek no. 1,5 боросиликатное восьмикамерное покрытие (Thermo Fisher Scientific, Rockville, MD, США) за 24 часа до трансфекции. Клетки трансфицировали GFP, чтобы отмечать трансфицированные клетки в дополнение к Nox4-DN, суммируя 0,5 мкг ДНК на камеру. Камеры обрабатывали 10 нг мл-1 TGF-β 24 ч после трансфекции в течение дополнительных 24 часов. Затем клетки фиксировали в 4% параформальдегиде, проницали 0,2% Triton X-100 в TBST и блокировали в течение ночи при 4 ° C в TBST, дополненной 5% BSA и 5% нормальной сывороткой козы. После блокирования клетки инкубировали либо с кроличьим анти-pY576 FAK-антителом (1: 2000), моноклональным моноклональным против Nox4 (1: 1000), либо моноклональным антителом против p53 мыши (1: 5000) в течение 1 часа, промывали и затем инкубировали с козьим анти-кроличьим конъюгатом Alexa Fluor (1: 200). Ядра были контрастированы с DAPI (Life Technologies — Molecular Probes, Grand Island, NY, USA) в течение 5 мин. Изображения собирали на конфокальном лазерном сканирующем флуоресцентном микроскопе Zeiss LSM 780 с использованием программного обеспечения Zen 2010 (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY, USA).

Данные представлены как средства ± s.d. результатов по меньшей мере трех независимых экспериментов. Для вычисления значимых значений использовался t-критерий ученика. Значимые значения указаны как * P-значение <0,05, ** P-значение <0,01 или *** P-значение <0,001.

Чтобы исследовать, была ли TGF-β-опосредованная экспрессия Nox4 подвергнута транскрипционной регуляции с помощью р53, мы трансфицировали p53-нулевые клетки эпителия легкого H1299 с помощью WT-p53 с последующей обработкой TGF-β в течение 24 часов. Мы обнаружили, что экспрессия WT-p53 ингибирует индукцию мРНК Nox4 с помощью TGF-β (фиг. 1A). Аналогично, уровни белка Nox4 были подавлены в клетках, трансфецированных WT-p53 либо в отсутствие, либо в присутствии TGF-β (фиг. 1B). Сверхэкспрессия WT-p53 не вызывала гибели клеток или не оказывала влияния на активацию пути TGF-β / SMAD3, как измерено фосфорилированием SMAD3. Мы использовали Nox4-специфические siRNAs для нокдауна эндогенного Nox4 для оценки специфичности Nox4-антитела. Используя этот подход, мы обнаружили единую полосу белка ~59 кДа, которая была специфически уменьшена после лечения сикрой Nox4 либо в присутствии, либо в отсутствие TGF-β (фиг. 1С).

Затем мы обнаружили, что трансфекция WT-p53 также подавляет активность оксидазы TGF-β. Для определения источника ROS, индуцированного TGF-β, клетки H1299 трансфицировали доминантно-отрицательной формой Nox4 (Nox4-DN). Nox4-DN не имеет C-концевых FAD и NADPH-связывающих доменов, необходимых для ферментативной активности. Мы и другие показали, что сверхэкспрессирование Nox4-DN в разных типах клеток значительно ингибирует эндогенную активность оксигеназы Nox4 (Mahadev et al, 2004; Boudreau et al, 2009; Mandal et al, 2011; Boudreau et al, 2012; New et al, 2012 ). Мы обнаружили, что Nox4-DN значительно уменьшает выработку внеклеточного супероксида TGF-β (в два раза меньше, чем векторное лечение), наблюдаемое в отсутствие WT-p53. Сверхэкспрессия WT-p53 также ингибировала продуцируемую TGF-β-супероксид (рис. 1D). Интересно, что H2O2 не подвергалась влиянию TGF-β-обработки или экспрессии WT-p53, что указывает на то, что опосредованный Nox4 внеклеточный супероксид, обнаруженный этим анализом, происходит на плазматической мембране и является относительно небольшой составляющей общего клеточного ROS (рисунок 1E). Мы также обнаружили, что увеличение количества трансфицированной экспрессии WT-p53 само по себе оказывает зависящее от дозы подавляющее действие на экспрессию белка Nox4 (данные не показаны). Эти результаты показывают, что экспрессия WT-p53 оказывает репрессивное действие на TGF-β-зависимые и TGF-β-независимые уровни Nox4 белка.

Корреляция между аберрантными сигналами p53 и TGF-β, связанными с повышенной миграцией и метастазами во многих раковых опухолях, побудила нас оценить влияние мутантного р53 на индукцию TGF-β Nox4. Для этого мы сгенерировали два разных мутантных белка p53 p53-R175H и p53-R280K. p53-R175H обычно встречается в p53-ассоциированных опухолях, тогда как R280K является эндогенным к линии эпителиальных клеток молочной железы человека MDA-MB-231, широко используемой модели клеток рака молочной железы. Эти missense мутации находятся в ДНК-связывающем домене p53, который рассматривается как «горячее пятно» для связанных с раком мутаций TP53 (Strano et al, 2007). Во-первых, мы исследовали экспрессию мРНК Nox4 в H1299 p53-нулевых эпителиальных клетках легких человека, трансфецированных p53-WT, p53-R175H, p53-R280K или контрольных векторах с или без лечения TGF-β в течение 24 часов. Последовательно, контроль клеток клеток с TGF-β привел к устойчивому увеличению мРНК Nox4. Nox4 мРНК также была активирована в клетках, экспрессирующих мутант р53, либо в отсутствие (p53-R175H, ~ 2-кратное, p53-R280K, ~ 10-кратное), либо в присутствии стимуляции TGF-β (p53-R175H, ~ 30 -pold-p53-R280K, ~ 40 раз) (рисунок 2A). Напротив, индукция TGF-β Nox4 была значительно снижена в трансфицированных WT-p53 клетках по сравнению с контрольными и p53-R175H- или p53-R280K-трансфецированными клетками. Интересно, что мутантные белки р53 вызывали повышенный уровень белка Nox4 либо в отсутствие, либо в присутствии TGF-β, что указывает на TGF-β-независимую положительную регуляцию Nox4, тогда как WT-p53 сохраняет репрессивный эффект на TGF-β-индуцированный Nox4 (рисунок 2B). Величина индукции белка Nox4, наблюдаемая через 24 часа лечения TGF-β, была ограничена по сравнению с изменениями мРНК Nox4, что свидетельствует о значительных различиях в мРНК Nox4 и синтезе белка и коэффициентах текучести, в соответствии с зарегистрированными ответами Nox4 на другие индукторы, которые дифференциально влияют на мРНК Nox4 и уровни белка (Peshavariya et al, 2009b). Мы обнаружили, что TGF-β-индуцированное фосфорилирование SMAD3 не зависит от экспрессии WT-p53 или мутантного р53. Чтобы определить влияние p53 на TGF-β и Nox4-зависимую генерацию супероксида, мы совместно трансфицировали клетки H1299 с Nox4-DN или контрольным вектором вместе с WT-p53 или мутантом p53. Оба p53-R175H и p53-R280K вызывали повышенную Nox4-зависимую активность оксидазы (то есть чувствительную к Nox4-DN) в клетках, обработанных TGF-β (фиг. 2C). Напротив, экспрессия WT-p53 уменьшала TGF-β-опосредованную активность оксигеназы Nox4, сравнимую с клетками, которые были необработаны, или клетки, которые экспрессировали неактивный Nox4-DN.

В нескольких сообщениях показано, что некоторые аберрантные белки p53 способствуют миграции клеток и метастазированию опухолей (Adorno et al, 2009; Muller et al, 2011). Поэтому мы использовали анализ миграции Матригеля для измерения влияния р53 на TGF-β-стимулированную, Nox4-зависимую клеточную миграцию. Клетки H1299, трансфицированные WT-p53, ингибировали миграцию клеток TGF-β (рисунок 2D). Хотя мутантные сверхэкспрессирующие клетки p53-R175H реагировали на моделирование TGF-β, аналогичные контролю, клетки, экспрессирующие p53-R280K, ответили значительным увеличением по сравнению с обработанными вектором клетками (вектор / TGF-β vs p53-R280K / TGF-β, P <0,05 ). При совместном трансфекции с Nox4-DN клетки не могли мигрировать в ответ на стимуляцию TGF-β, что еще больше подтвердило критическую роль Nox4 в миграции эпителиальных клеток человека.

Ранее мы продемонстрировали Nox4-опосредованную регуляцию мРНК фибронектина в нормальных и метастатических эпителиальных клетках груди, подвергающихся TGF-β-стимулированной ЕМТ (Boudreau et al, 2012). Nox4 также участвует в экспрессии фибронектина в диабетических почках и эпителиальных клетках легких (Gorin et al, 2005; Hecker et al, 2009). Фибронектин является хорошо известным геном-мишенью TGF-β / SMAD3, который регулируется клетками во время EMT (Maschler et al, 2005; Chen et al, 2013). В предыдущем докладе было показано, что WT-p53 транскрипционно подавляет экспрессию фибронектина в клетках Hela (Iotsova and Stehelin, 1996). Для дальнейшего обоснования p53 в сигнале TGF-β и экспрессии гена EMT мы исследовали влияние WT и мутантного p53 на экспрессию фибронектина, индуцированного TGF-β, в клетках H1299. Мы обнаружили, что WT-p53 подавляет индуцированную TGF-β мРНК фибронектина по сравнению с клетками, трансфицированными пустым вектором или p53-R280K (рис. 2E). Обработка специфическим фармакологическим ингибитором TGF-β-рецептора-1 (616451) или SMAD3 -специфическим ингибитором (SIS3) отменила TGF-β-фибронектин и Nox4 мРНК в клетках, обработанных вектором и p53-R280K, что указывает на TGF-β / SMAD3-зависимый механизм (рисунок 2F). Вместе эти данные подразумевают, что мутантные формы p53 (R175H и R280K) поддерживают более высокую TGF-β-стимулированную NX4 мРНК и экспрессию белка, последующую активность оксидазы, а также мобильность клеток, тогда как WT-p53 подавляет все эти эффекты. Более того, TGF-β и мутантные p53-опосредованные Nox4 и фибронектиновые мРНК активируются зависимым от SMAD3 образом.

Мы сообщили, что TGF-β-зависимая миграция эпителиальных клеток грудной клетки MDA-MB-231 включает усиленную экспрессию Nox4 и активность оксидазы (Boudreau et al, 2012). MDA-MB-231 является агрессивной метастатической клеточной линией, в которой p53-R280K эндогенно экспрессируется. Поэтому мы хотели подтвердить наши результаты индукции Nox4 экзогенным p53-R280K в клетках, экспрессирующих эндогенный p53-R280K. Истощение p53-R280K р53-специфическими siRNAs существенно уменьшало как TGF-β-индуцированную Nox4 мРНК, так и экспрессию белка Nox4 (фиг. 3A и B) и нарушало Nox4-зависимое продуцирование супероксида (фиг. 3C). В соответствии с эндогенным белком Nox4 в эпителиальных клетках легких H1299 клетки эпителия молочной железы MDA-MB-231 также экспрессируют Nox4-белок ~59 кДа, который индуцируется TGF-β и подавляется S-РНК, ориентированной на Nox4 (рисунок 3D).

Ранее мы продемонстрировали, что клетки MDA-MB-231, экспрессирующие Nox4-DN, демонстрируют снижение миграции клеток TGF-β. В сочетании с нашими предыдущими результатами значительно меньше клеток MDA-MB-231, истощенных p53-R280K, мигрировали при стимуляции TGF-β (фиг. 3Е). Чтобы дополнительно подтвердить, что Nox4 модулируется с помощью TGF-β / SMAD3-специфичного способа, мы обрабатывали MDA-MB-231 с помощью TGFBR1- (616451) или SMAD3 (SIS3) -специфических ингибиторов или носителя (ДМСО), а затем TGF- β-стимуляция. Ингибирование TGFBR1 или SMAD3 значительно уменьшало экспрессию белка Nox4 и мРНК (рис. 3F и G). В совокупности эти данные показывают, что эндогенный мутант р53 (R280K) способствует опосредованной TGF-β-экспрессии Nox4, активности оксидазы и подвижности клеток в клетках рака молочной железы человека.

Чтобы лучше понять основы репрессии WT-p53 у Nox4, мы использовали клетки MCF-10A, иммортализованную линию эпителия груди человека, которая экспрессирует эндогенный WT-p53. Ранее мы показали, что TGF-β индуцирует Nox4 в этой модели клетки (Boudreau et al, 2012). Во-первых, мы сверхэкспрессируем WT-p53, p53-R175H или p53-R280K, чтобы определить, сможет ли мутант p53 преодолеть репрессивный эффект эндогенного WT-p53. В этих экспериментах мы включили клетки, экспрессирующие WT-p53, поскольку клетки MCF-10A проявляют относительно низкую экспрессию WT-p53. Примечательно, что трансфекция p53-R280K потенцированной TGF-β-транскрипционной индукции Nox4 (рисунок 4A). Эндогенный белок Nox4, обнаруженный в двух предыдущих моделях раковых клеток (p53-нулевой H1299 и экспрессирующий p53-R280K-MDA-MB-231) был видом ~59-кДа, который был индуцирован TGF-β и чувствителен к SiRNA Nox4. Интересно, что мы обнаружили, что нормальная линия эпителиальных клеток груди MCF-10A продуцирует белок Nox4 со слегка более высокой кажущейся молекулярной массой ~ 65 кДа (рисунок 4B), что близко к теоретическим предсказаниям для полноразмерной последовательности Nox4. КДНК Nox4, трансфецированная в MCF-10A, также демонстрировала кажущуюся молекулярную массу ~65 кДа (фиг. 4В), тогда как гетерологично экспрессированный Nox4 продуцировал меньшие виды в H1299 и MDA-MB-231 (не показаны). Предыдущие исследования показали молекулярные массы белка Nox4 вестерн-блот-анализа в диапазоне от 55 до 80 кДа (Shiose et al, 2001; Hilenski et al, 2004; Hwang et al, 2005; Martyn et al, 2006; Ago et al, 2010) , Последовательность аминокислот Nox4 содержит предполагаемый сайт расщепления N-концевого сигнального пептида, а также предсказанные сайты гликозилирования, которые могут составлять наименьший и самый большой молекулярно-массовый вид соответственно (Cheng et al, 2001; Martyn et al, 2006; Bedard and Krause, 2007). Таким образом, переменные молекулярные массы могут быть вызваны посттрансляционной модификацией Nox4 в зависимости от типов клеток или нормальных или трансформированных клеточных фенотипов.

Как показано на фиг. 4С, siRNA-опосредованное истощение WT-p53 приводит к увеличению уровней белка Nox4 как в отсутствие, так и в присутствии TGF-β, тем самым дополнительно поддерживая эффекты WT-p53 как отрицательного регулятора Nox4. Эти данные показывают, что оба мутантных белка p53 могут переопределять эффекты эндогенного WT и потенцировать TGF-β-индукцию Nox4.

В альтернативном подходе мы обрабатывали клетки MCF-10A в течение 24 ч с увеличением концентрации нутлина-3, антагониста, который стабилизирует р53, предотвращая его взаимодействие с и деградацией HDM2 E3-лигазой (Vassilev et al, 2004). Как показано на рисунке 4D, 10 мкМ Nutlin-3 было достаточным для защиты эндогенного WT-p53 от протеасомальной деградации. В соответствии с эффектами экзогенной экспрессии белка Nox4, восстанавливающего WT-p53, усиленная стабилизация WT-p53 коррелирует с уменьшенными уровнями белка Nox4. Кроме того, мы наблюдали увеличение TGF-β-опосредованной миграции экспрессирующих p53-R280K клеток MCF-10A, тогда как сверхэкспрессия p53-WT уменьшала миграцию клеток. Более того, совместная трансфекция с Nox4-DN уменьшала количество мигрирующих клеток, что еще раз подтверждало роль Nox4 в миграции TGF-β-зависимых клеток (рис. 4E). Интересно, что siRNA-опосредованное истощение WT-p53 лишь незначительно повлияло на миграцию клеток с использованием или без лечения TGF-β, что указывает на то, что в подвижности клеток MCF-10A участвуют дополнительные факторы (рисунок 4F).

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток MCF-10A, экзогенно сверхэкспрессирующих p53-R280K, выявило поразительную индукцию эндогенного белка Nox4 (рисунок 5). Мы наблюдали, что Nox4 в клетках, сверхэкспрессирующих р53-R280K, локализованных в плазматической мембране, перинуклеарной и ядерной областях. В условиях недостаточной концентрации мутантные p53-трансфицированные клетки, окрашенные высокой экспрессией Nox4, были обнаружены во всех расширяющихся клетках при миграции границ (верхняя панель). Ячейки MCF-10A, экспрессирующие p53-R280K в слитом монослое, также окрашиваются с увеличением Nox4 по сравнению с окружающими незатрансфицированными клетками (нижняя панель). В совокупности эти данные показывают, что репрессия базального Nox4 эндогенным WT-p53 может быть преодолена экспрессией мутанта р53 и что избыточная экспрессия p53-R280K вызывает увеличение белка Nox4 в мигрирующих и немигрирующих клетках.

Мы и другие доказали, что Nox4 участвует в миграционных процессах различных типов клеток (Haurani et al, 2008; Meng et al, 2008; Pendyala et al, 2009; Nam et al, 2010; Boudreau et al, 2012). Предыдущие исследования показывают, что Nox4 связан с изменениями цитоскелета и фокальной адгезией в сосудистых гладкомышечных клетках (Hilenski et al, 2004; Lyle et al, 2009). Фокальная адгезионная киназа, критический координатор сигналов, связанных с миграцией клеток, инвазией и метастазами, дифференциально регулируется р53 (Schlaepfer and Mitra, 2004; Голубовская и др., 2008, 2009). Основываясь на этих выводах, мы рассмотрели, была ли Nox4 роль в регуляции TGF-β и p53 фосфорилирования FAK-Y576, что свидетельствует об ее активации (Zhao and Guan, 2009). Мы обратились к этому с помощью избыточного экспрессии Nox4-DN или контрольного вектора в клетках MDA-MB-231. Через 24 часа после обработки TGF-β экспрессия Nox4-DN значительно уменьшала количество фосфорилирования FAK-Y576, предполагая, что активность оксигеназы Nox4 участвует в активации FAK (рисунок 6A). Затем мы использовали pi-нацеленные siRNAs для уменьшения экспрессии эндогенного p53-R280K для оценки его эффектов на FAK-Y576. Мы обнаружили, что истощение p53-R280K снижает TGF-β-протеин Nox4 и уровни фосфо-FAK (рис. 6B). Кроме того, иммунофлуоресцентная визуализация фосфо-FAK в клетках MDA-MB-231, совместно трансфицированная Nox4-DN, и маркер GFP показали аналогичные результаты. Выражение Nox4-DN, обозначенное клетками, отмеченными GFP, уменьшало количество фосфо-FAK, индуцированного TGF-β, по сравнению с соседними GFP-негативными клетками (фиг. 6C). Мы наблюдали аналогичные эффекты на фосфорилирование FAK в клетках MCF-10A. Мутант p53-R280K увеличивал активность FAK в присутствии или в отсутствие TGF-β, который затуплен Nox4-DN (фиг.6D). Аналогично, TGF-β-опосредованный Nox4-зависимый фосфо-FAK был увеличен в клетках H1299, экспрессирующих p53-R280K, и уменьшался в присутствии Nox4-DN (фиг. 6E). Кроме того, Nox4-DN уменьшал иммунофлюоресценцию фосфо-FAK в клетках H1299, обработанных TGF-β (фиг. 6F).

Представленная здесь работа показывает, что TGF-β-индуцированный Nox4 отрицательно регулируется WT-p53 в опухолевых клетках легких человека и в нормальных и опухолевых грудных эпителиальных клетках. Потеря этой репрессивной функции мутантными формами p53 (R175H, R280K) сопровождается усиленной ROS-переносимостью Nox4, миграцией клеток и активацией FAK, что дополнительно объясняет инвазивное поведение, обычно связанное с мутациями p53. Во-первых, мы наблюдали, что избыточная экспрессия WT-p53 в p53-нулевых клетках (H1299) затуманивает TGF-β-опосредованную активность Nox4-оксидазы, Nox4-зависимую клеточную миграцию и FAK-фосфорилирование (рис. 1, 2 и 6). И наоборот, нормальные эпителиальные клетки MCF-10A, обедненные эндогенным WT-p53 силовым геном siRNA, показали увеличение базальной экспрессии мРНК Nox4 и белка (рисунок 4). Кроме того, клетки MCF-10A, обработанные Nutlin-3, специфическим для MDM2 E3-убиквитином лигазой ингибитором, который останавливает деградацию WT-p53, показали повышенную стабильность р53, что привело к уменьшению эндогенного белка Nox4 (рисунок 4).

Примечательно, что общие мутации мутанта р53, связанные с раком, p53-R175H и p53-R280K, активировали Nox4 в присутствии или в отсутствие TGF-β (фиг. 2). Мы обнаружили, что мутантная p53-R280K потенцированная TGF-β-индуцированная экспрессия Nox4 (мРНК и белок), миграция Nox4-depdendent клеток и фосфорилирование FAK. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены в клетках MDA-MB-231, обедненных эндогенным р53-R280K, где TGF-β-индуцированная экспрессия Nox4, продуцирование супероксида и клеточная миграция были значительно притуплены (рисунок 3). Более того, эктопическая экспрессия p53-R280K в клетках MCF-10A была достаточной для преодоления репрессивного эффекта эндогенного WT-p53 на экспрессию мРНК Nox4 и миграцию Nox4-зависимых клеток (рисунок 4). Анализ иммунофлуоресценции показал, что экспрессия p53-R280K коррелирует с увеличением уровней белка Nox4 и миграцией клеток (рисунок 5). Фармакологическое ингибирование TGFBR1 или SMAD3 последовательно ингибирует Nox4 мРНК и индукцию белка, подтверждая важность оси TGF-β / SMAD3 в транскрипционной регуляции Nox4 (фиг. 2 и 3).

ROS, индуцированные Nox4, участвуют в миграции клеток, пролиферации, гипертрофии, заживления ран и модуляции маркеров ЕМТ в различных типах клеток (TGF-β-опосредованная клеточная миграция) (Sturrock et al, 2006, 2007; Ismail et al., Bondi и др., 2010; Boudreau et al, 2012; Sancho et al, 2012; Chan et al, 2013; Hagler et al, 2013). Недавно мы идентифицировали Nox4 как основной источник продуцирования супероксида, индуцированного TGF-β / SMAD3, который играет роль важного фактора в клеточной миграции и регуляции гена фибронектина в нормальных и метастатических эпителиальных клетках груди (Boudreau et al, 2012). Наше настоящее исследование демонстрирует, как статус p53 оказывает дифференциальное воздействие на активность Nox4 как в нормальных экспрессирующих WT-p53, так и в метастатических мутантах p53 (R280K), экспрессирующих модели эпителиальных клеток груди. Мы также показали, что экспрессия WT-p53 или мутант p53 дифференциально модулирует Nox4 в H1299 p53-нулевых эпителиальных клетках легких. Мы наблюдали, что p53 может индуцировать изменения экспрессии Nox4 и активности вниз по потоку оксидазы как TGF-β-зависимым, так и TGF-β-независимым образом. Кроме того, мы обнаружили, что мутант p53 и Nox4 имеют решающее значение для TGF-β-опосредованного фосфорилирования FAK и клеточной миграции.

Трансформирующий фактор роста-β представляет собой многофункциональный регуляторный цитокин, который контролирует многие аспекты клеточной функции, включая пролиферацию клеток, миграцию, апоптоз и прогрессию ЭМТ. Эпителиально-мезенхимальный переход — это процесс, при котором эпителиальные клетки подвергаются транскрипционным и морфологическим изменениям в мезенхимальноподобных клетках с повышенной клеточной пластичностью и подвижностью (Thiery et al, 2009). Несколько групп показали, что TGF-β может индуцировать ЕМТ, но задействованные механизмы не полностью поняты.

Несколько механизмов в перекрестном разговоре между TGF-β и p53 участвуют в регуляции ЕМТ и метастатической прогрессии. Adorno и др. (Adorno et al., 2009) ранее сообщали о том, что TGF-β вместе с онкогенным Ras и мутантом p53 работают совместно с SMAD2 / 3-зависимым образом для содействия миграции клеток, инвазии и метастазирования опухолей. Они также продемонстрировали, что p63, член семейства транскрипционных факторов p53, антагонизирует TGF-β-опосредованный прометаллический эффект.

Роль p53 в качестве основного регулятора подавления опухолей была хорошо установлена. В отличие от WT-p53, аберрантные белки p53 могут потерять свои функции супрессора опухоли и создать высоко стабилизированные мутантные белки с приобретенным усилением функции, участвующей в ЕМТ и прогрессировании опухоли (Oren and Rotter, 2010; Kogan-Sakin et al, 2011 , Termen et al, 2013). Большинство связанных с раком мутаций p53 происходят в ДНК-связывающей области, что делает белки как дефектные супрессоры опухолей. Различные мутации p53 были связаны с усилением генов, вовлеченных в миграцию и пролиферацию клеток, и снижение регуляции генов, связанных с ингибированием роста и апоптозом (Kong et al, 2001; Coradini et al, 2012). Точные механизмы, участвующие в регуляции Nox4 TGF-β и p53, требуют дальнейшего изучения, поскольку Nox4 ассоциируется с пролиферацией клеток, а также ингибирование роста и апоптоз в различных контекстах (Geiszt et al, 2000; Peshavariya et al, 2009a Eid et al, 2010; Weyemi et al, 2011; Sancho et al, 2012; Koziel et al, 2013).

Несмотря на усилия, направленные на выявление мутантных р53-специфических сайтов связывания ДНК, проблемы, связанные с мутантными формами р53 в качестве добросовестных факторов транскрипции, остаются спорными. Анализ областей промотора некоторых генов, чувствительных к TGF-β / р53, предполагал, что наличие перекрывающихся регуляторов p53 и SMAD важно для совместной регуляции (Sun et al, 1999; Wilkinson et al, 2008). Другие указали, что WT-p53 может работать непрямым механизмом, таким как связывание с корепрессором, влияющим на регенерацию гена-энцефалографа (Ho et al, 2005). Было показано, что как SMAD2, так и SMAD3 взаимодействуют непосредственно с p53 in vivo, и было высказано предположение, что это взаимодействие образует мостик между сайтом-энхансер-р53-связыванием и SMAD-связывающим элементом для регуляции транскрипционной репрессии TGF-β (Cordenonsi et al. , 2003; Adorno et al, 2009). Другие сообщения указывают на то, что гены, подвергнутые p53, могут быть подавлены гистоном и промотором метилирующего ферментативного рекрутирования с p53-зависимым образом или что p53 может препятствовать транс-активаторам связывать элементы ответа внутри промоторов через белок-белковые взаимодействия или конкурировать за ДНК (Murphy et al, 1999).

Ранее мы продемонстрировали, что SMAD3 является мощным регулятором промотора Nox4 человека. Мы показали, что TGF-β-индуцированная активность промотора Nox4 была значительно снижена с помощью SIS3, SMAD3-специфического ингибитора и что экспрессия конститутивно активных или доминантно-отрицательных форм SMAD3 существенно индуцировала или ингибировала активность промотора Nox4 соответственно (Boudreau et al, 2012). Возможно, что либо WT, либо мутант p53 служит в качестве транскрипционного корегулятора мРНК Nox4, где он функционирует при образовании комплекса с другими регуляторами транскрипции, такими как SMAD3. Альтернативно, мутант p53 может функционировать как сам транскрипционный фактор, связываясь с неканоническими элементами p53-ответа в промоторе Nox4. Этот отчет свидетельствует о том, что ROS, основанный на Nox4, требуется при мобильности раковых клеток, особенно когда функциональный WT-p53 был нарушен или подавлен. Учитывая, что транскрипция гена — это процесс, который требует координации между несколькими факторами и кофакторами, вероятно, что другие факторы транскрипции, со-активаторы и корепрессоры участвуют в регуляции Pox Nox4. Требуется ли ДНК-связывающий домен р53 для прямого связывания ДНК с промотором Nox4 или если взаимодействие p53 с другими белками, такими как SMAD3, требуется для подавления Nox4, в настоящее время исследуется.

Наше настоящее исследование дает дополнительное представление о Nox4- и редокс-зависимых механизмах, участвующих в активации FAK, облегчаемых TGF-β и мутантом p53. Предыдущие сообщения включали Nox4 в ремоделирование цитоскелета и фокальную адгезию (Lyle et al, 2009). Фокальная адгезивная киназа представляет собой не рецепторную цитозольную белок тирозинкиназу, которая объединяет факторы роста и интегрин, способствующие миграции клеток и метастазированию (Zhao and Guan, 2009). Трансформирующий фактор роста-β был связан с активацией ФАК и последующей регуляцией маркеров мезенхимальной и инвазивной активности (Schlaepfer et al., 2004; Cicchini et al, 2008). Голубовская и др. (2008, 2009) недавно сообщили, что WT-p53 связывается с промотором FAK и ингибирует его транскрипционную активность, тогда как мутант p53 способствует экспрессии FAK. Кроме того, они сообщили о корреляции между увеличением экспрессии FAK в опухолях рака молочной железы с мутациями р53. Недавние исследования описали Nox и редокс-зависимую регуляцию клеточной миграции с участием FAK в других контекстах и ​​другим агонистом (Schroder et al., 2007; Sadok et al, 2008; Shinohara et al, 2010; Leoni et al, 2013).

В заключение подчеркнем, что TGF-β и p53 играют решающую роль в регулировании сигнальной и подвижности Nox4-зависимых клеток. Поскольку p53 был установлен как кофактор транскрипции SMAD2 / 3 ниже TGF-β, мы предлагаем модель, в которой мутант p53 взаимодействует с SMAD3 для усиления транскрипции Nox4 для содействия последующей оксигеназной активности Nox4, которая участвует в окислительно-восстановительной регуляции активации FAK и подвижность клеток (рис. 7). Напротив, но, возможно, в механически связанном процессе WT-p53 защищает эпителиальные клетки от TGF-β-индуцированного ЕМТ и метастазов. Лучшее понимание активированных Nox4 сигнальных путей, участвующих в ЕМТ и опухолегенезе, может выявить новые молекулярные мишени для профилактики или лечения прогрессирования опухолей и метастазов.

Эта работа была поддержана фондами из Инфрастративной исследовательской программы NIH, Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (ZO1-AI-000614). Мы хотели бы поблагодарить доктора Люси Годли и Шарона Х Джексона за их тщательный обзор этой рукописи и Джозефа Брзостовского для обучения микроскопии и использования средства формирования изображений LIG.

Эта работа публикуется по стандартной лицензии для публикации соглашения. Через 12 месяцев работа станет свободно доступной, и условия лицензии перейдут на лицензию Creative Commons Attribution-NonCommercial-Share Alike 3.0 Unported.

Дикий тип p53 (WT-p53) подавляет индуцированный TGF-β Nox4 в p53-нулевых эпителиальных клетках легкого H1299. (A) клетки H1299 трансфицировали только вектором или кДНК WT-p53. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) в течение 24 часов. Человеческие Nox4- и GAPDH-специфические праймеры использовали для ПЦР-амплификации полной кДНК обратной транскрипции из клеток (n = 3). Результаты описаны как относительное количественное определение мРНК Nox4 относительно необработанной экспрессии с использованием GAPDH в качестве внутреннего контроля для нормализации. Вставка показывает иммуноблот-анализ экспрессии белка р53 в клетках H1299, трансфицированных только с помощью вектора или плазмид p53-WT. (B) Белок Nox4 ослабляется экспрессией p53-WT. Клетки H1299 трансфицировали и обрабатывали, как описано в A. Сорок микрограммов полного клеточного лизата анализировали путем вестерн-блоттинга. Иммуноблот последовательно зондировали антителами против Nox4, p53, фосфо-SMAD3 и общего SMAD3. (C) клетки H1299 трансфецировали с помощью нецелевого контроля или SMIRpool Nox4-специфических siRNAs (50 нМ) в течение 72 часов и либо не обрабатывали, либо обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) в течение дополнительных 24 часов. Экспрессию белка Nox4 анализировали путем вестерн-блоттинга. Иммуноблоты зондировали анти-Nox4 с последующим антителом против GAPDH. (D) клетки H1299 трансфицировали только вектором или p53-WT или ко-трансфицировали с доминантно-отрицательной кДНК Nox4 (Nox4-DN). Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) в течение 24 часов. Клетки собирали и анализировали на получение супероксида с помощью супероксидспецифического реагента Диогена в течение 1 ч (n = 3 в трех повторах). (E) клетки H1299 трансфицировали либо с помощью векторного контроля, либо плазмид p53-WT, и обрабатывали TGF-β, как в D, и собирали и анализировали для продуцирования H2O2 люминолом / HRP (n = 3 в трех повторностях). Значения значения обозначаются как * P-значение <0,05 или *** P-значение <0,001.

Мутантные белки p53 поддерживают TGF-β-индуцированный Nox4 и миграцию клеток. (A) клетки H1299 трансфицировали векторной контрольной плазмидой, мутантными мутантами p53 (WT-p53), p53-R175H дикого типа или мутантными p53-R280K. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) или оставляли необработанными в течение дополнительных 24 часов. Nox4-специфические праймеры использовали для количественной ПЦР в реальном времени. Nox4- и GAPDH-специфические праймеры использовали для количественной ПЦР (n = 3). Результаты описаны как относительное количественное определение мРНК Nox4 по сравнению с контрольной группой без лечения. (B) Белок Nox4 дифференциально регулируется WT и экспрессией мутанта p53. Клетки H1299 трансфицировали и обрабатывали, как описано в A. Сорок микрограммов полного клеточного лизата анализировали путем вестерн-блоттинга. Ботт последовательно зондировали антителами против Nox4, p53, фосфо-SMAD3 и общего SMAD3. (C) клетки H1299 трансфицировали только одним вектором, p53-WT, p53-R175H или p53-R280K, и ко-трансфектировали либо с векторным контролем, либо с доминантно-отрицательными Nox4 (Nox4-DN) плазмидами. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) в течение 24 часов. Затем клетки собирали и анализировали для получения супероксида (n = 3, в трех экземплярах). (D) клетки H1299 трансфицировали, как в С в течение 24 часов. Затем клетки повторно сеяли в верхней камере транслюмината Матригеля и инкубировали в нижней камере, содержащей среду RPMI-1640, содержащую TGF-β 5 нг мл-1. Через 24 ч мигрирующие клетки фиксировали, окрашивали и подсчитывали из 10 случайных полей (n = 3). (E, F) клетки H1299 трансфицировали векторным контролем, p53-WT или p53-R280K. Через 24 ч клетки обрабатывали 616451 (10 мкМ), I-специфическим ингибитором TGF-β-рецептора или SIS3 (10 мкМ), SMAD3 -специфическим ингибитором в течение 4 часов перед обработкой TGF-β в течение 20 часов. Фибронектин- (E) или Nox4 (F) -специфические праймеры использовали для количественной ПЦР-амплификации в реальном времени общей кДНК, обратной транскрипции из клеток. Результаты описаны как относительная количественная оценка по сравнению с нелеченным контролем. GAPDH-специфические праймеры использовали в качестве внутреннего контроля (n = 3, в трех экземплярах). Значимые значения указаны как * P-значение <0,05, ** P-значение <0,01 или *** P-значение <0,001.

Эндогенный мутант p53 (R280K) поддерживает TGF-β / SMAD-зависимую индукцию Nox4 в эпителиальных клетках MDA-MB-231. (A) клетки MDA-MB-231 трансфицировали с помощью контрольных siRNAs (50 нМ) или р53-специфических siRNAs (50 нМ) в течение 72 ч, затем имитировали TGF-β (5 нг мл-1) в течение 24 часов. В реальном времени количественный ПЦР-анализ экспрессии мРНК Nox4 определяли из клеток MDA-MB-231, обработанных как в A (n = 3, в трех экземплярах). (B) Клетки MDA-MB-231 обрабатывали, как в А, с последующим анализом экспрессии белка путем иммуноблоттинга 40 мкг общего клеточного лизата. Блот последовательно исследовали антителами против Nox4, p53, фосфо-SMAD3 и общего SMAD3. (C) Клетки MDA-MB-231 трансфецировали с контролем без направленного контроля (50 нМ) или SMARTpool Nox4-специфическими siRNAs (50 нМ) в течение 72 ч и либо не лечили, либо обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) в течение дополнительных 24 часов. Экспрессию белка Nox4 анализировали путем вестерн-блоттинга. Иммуноблоты зондировали анти-Nox4 с последующим анти-GAPDH. (D) клетки MDA-MB-231 обрабатывали, как описано, и анализировали на получение супероксида супероксидспецифическим реагентом Диогена в течение 1 часа (n = 3 в трех повторностях). (E) Клетки MDA-MB-231 обрабатывали только трансфекционным реагентом или трансфицировали с помощью контрольных или р53-специфических сиРНК. Через 72 ч клетки повторно сеяли в верхней камере транслюмината Матригеля и инкубировали в нижней камере, содержащей среду RPMI-1640, содержащую TGF-β 5 нг мл-1 в течение 24 часов. Мигрирующие клетки подсчитывались из 10 случайных полей (n = 3). (F) Клетки MDA-MB-231 не обрабатывали или обрабатывали ДМСО (носителем), 616451 (10 мкМ) или SIS3 (10 мкМ) в течение 4 ч перед добавлением TGF-β (5 нг мл-1) для 24 ч. Экспрессия белка анализировали путем иммуноблоттинга 40 мкг общего клеточного лизата и последовательно исследовали указанные антитела. (G). Общая РНК, экстрагированная из клеток, обработанных как в F, была обратной транскрибирована для количественного ПЦР-анализа экспрессии мРНК Nox4 в реальном времени. Результаты описаны как относительная количественная оценка мРНК Nox4 относительно необработанного контроля (n = 3, в трех повторениях). Значимые значения указаны как * P-значение <0,05 или ** P-значение <0,01.

Экспрессия Mutant p53 (R280K) коррелирует с экспрессией Nox4 и отменяет репрессию p53 (WT-p53) дикого типа Nox4 в эпителиальных клетках MCF-10A. (A) Клетки MCF-10A трансфицировали пустым векторным контролем, плазмиды p53-WT, p53-R175H или p53-R280K в течение 24 часов с последующей обработкой TGF-β (10 нг мл-1) или без него для дополнительных 24 час Nox4- и GAPDH-специфичные праймеры использовали для количественной ПЦР-амплификации в реальном времени полной кДНК, обратной транскрипции из клеток. Результаты описаны как относительное количественное определение мРНК Nox4 по сравнению с контрольной группой без лечения (n = 3). (B) Обнаружение белка Nox4 путем вестерн-блоттинга. Клетки MCF-10A трансфецировали с контролем без направленного контроля (50 нМ) или SMARTpool Nox4-специфическими siRNAs (50 нМ) в течение 72 часов и либо не обрабатывали, либо обрабатывали TGF-β (5 нг мл-1) для дополнительных 24 h (левая панель). Контрольные пятна (правые панели) обнаруживают трансфицированный кДНК Nox4 такого же размера. Иммуноблоты зондировали анти-Nox4 с последующим антителом против GAPDH. (C) Клетки MCF-10A трансфецировали с помощью контрольных siRNAs (50 нМ) или р53-специфических siRNAs (50 нМ) в течение 72 часов с последующей обработкой TGF-β (10 нг мл-1) или без него в течение 24 часов. Экспрессия белка анализировали путем иммуноблоттинга 40 мкг общего клеточного лизата и последовательно зондировали антителами против Nox4, p53, фосфо-SMAD3 и общего SMAD3. (D) Клетки MCF-10A обрабатывали 10 или 20 мкМ Nutlin-3 в течение 24 часов. Экспрессия белка анализировали путем иммуноблоттинга 40 мкг общего клеточного лизата и последовательно исследовали антитела против Nox4, p53 и GAPDH последовательно. (E) клетки MCF-10A были совместно трансфицированы только с помощью вектора только или Nox4-DN и p53-WT, или p53-R280K-плазмид. Через 24 часа после трансфекции клетки повторно сеяли в верхней камере транслюмината Матригеля и инкубировали с нижней камерой, содержащей среду DMEM / F12 с TGF-β 10 нг мл-1. Через 24 ч мигрирующие клетки фиксировали, окрашивали и подсчитывали из 10 случайных полей (n = 3). (F) Клетки MCF-10A обрабатывали только трансфекционным реагентом или трансфицировали с помощью контрольных или р53-специфических сиРНК. Через 72 ч клетки повторно сеяли в верхней камере транслюмината Матригеля и инкубировали в нижней камере, содержащей среду DMEM / F12, с TGF-β 5 нг мл-1 в течение 24 часов. Мигрирующие клетки подсчитывались из 10 случайных полей (n = 2 в трех экземплярах).

Экзогенная экспрессия мутантного р53 (R280K) индуцирует Nox4 в сливных и подвижных клетках MCF-10A. Клетки MCF-10A трансфицировали p53-R280K в течение 48 часов. Изображения флуоресцентной микроскопии были взяты с краю суб-конфлюентного слоя клеток (верхний ряд) и из конфлюентного монослоя (нижний ряд). Слева направо клетки окрашивали анти-р53-антителами, обнаруживающими высокую экспрессию трансфецированных p53-R280K (левая панель), эндогенная экспрессия белка Nox4 была обнаружена антителами против Nox4 (средняя панель) и окрашиванием DAPI ядер (справа панель). Пунктирная белая линия на верхних панелях указывает краю монослоя ячеек в субконфлюентной лунке из позолоченного стекла.

Nox4 и мутант p53 (R280K) модулируют индуцированную TGF-β активацию фокальной адгезии киназы (pFAK). (A) Сверхэкспрессия Nox4-DN уменьшает фосфорилирование FAK. Клетки MDA-MB-231 трансфицировали либо с помощью векторного контроля, либо с V5-помеченным Nox4-DN в течение 24 часов с последующей стимуляцией TGF-β (5 нг мл-1) в течение дополнительных 24 часов. Полные клеточные лизаты, собранные для иммуноблот-анализа, с использованием антител против Nox4, p53, фосфо-FAK (pFAK) и общего FAK и V5. (B) клетки MDA-MB-231 трансфицировали с помощью контрольных siRNAs (25 нМ) или р53-специфических siRNAs (25 нМ) в течение 72 ч, затем имитировали TGF-β (5 нг мл-1) в течение 24 часов. Экспрессия белка анализировали путем иммуноблоттинга с полным лизатом клеток с помощью антител против Nox4, p53, фосфо-FAK (pFAK) и общего FAK. (C) клетки MDA-MB-231 трансфицировали Nox4-DN и GFP в течение 24 часов с последующей обработкой TGF-β в течение дополнительных 24 часов. Верхняя панель: ячейки GFP (Nox4-DN) против фосфо-FAK-окрашивания. Нижняя панель: клетки, экспрессирующие Nox4-DN (стрелки), уменьшают окрашивание фосфо-FAK по сравнению с окружающими незатрансфицированными клетками. (D) клетки MCF-10A были совместно трансфицированы одним вектором или Nox4-DN, а плазмиды p53-WT или p53-R280K обрабатывали TGF-β в течение 24 часов. Анализ иммуноблоттинга показывает экспрессию белка фосфо-FAK, FAK, V5-метки Nox4-DN и p53. (E) p53-нулевые клетки H1299 ко-трансфицировали, трансфицировали, обрабатывали и анализировали на экспрессию белка, а фосфорилирование FAK, как и в клетках D. (F) H1299, трансфецировали в течение 24 часов, как в C, затем обрабатывали TGF-β или оставляли необработанными в течение дополнительных 24 часов. Изображения микроскопии показывают клетки GFP / Nox4-DN вместе с фосфо-FAK-окрашиванием.

Дикий тип p53 (WT-p53) и мутант p53 дифференциально регулируют экспрессию Nox4 как в TGF-β-зависимых, так и в независимых механизмах. Дикий тип p53 подавляет базальную Nox4 и TGF-β-индуцированную экспрессию Nox4, тогда как мутант p53 (R175H и R280K) положительно регулирует или усиливает эффект TGF-β / SMAD3 на Nox4. Экспрессия только мутантного р53 может регулировать экспрессию мРНК Nox4 и белка. Нижестоящие эффекты Nox4-зависимого ROS способствуют увеличению мРНК фибронектина, фосфорилированию и активации FAK, а также последующей миграции и инвазии клеток. Этот путь может быть ингибирован специфическими химическими ингибиторами для TGF-β-рецептора-1 и SIS3, или избыточная экспрессия Nox4-DN может уменьшить TGF-β-индукцию этих событий. Более того, истощение эндогенного WT-p53 с помощью siRNA увеличивает экспрессию Nox4, тогда как истощающий эндогенный мутант p53-R280K уменьшает экспрессию Nox4. В совокупности Nox4 является медиатором промигрирующих событий ниже TGF-β и мутантного p53 и, таким образом, выступает в качестве привлекательной цели для управления или подавления метастатического заболевания.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *