Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Trichostatin A нацеливает митохондриальную респираторную цепь, увеличивая производство митохондриальных реактивных видов кислорода для запуска апоптоза в клетках рака молочной железы человека

Trichostatin A Targets the Mitochondrial Respiratory Chain, Increasing Mitochondrial Reactive Oxygen Species Production to Trigger Apoptosis in Human Breast Cancer Cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3953478/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: SJS DM PW. Выполняли эксперименты: SJS YYH. Проанализированы данные: JFZ. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: JL YF YT. Написал статью: SJS DM PW.

Ингибиторы ингибиторов гистоновой дезацетилазы (HDACI) стимулировали интерес через их противоопухолевую активность, включая индукцию апоптоза, остановку клеточного цикла, клеточную дифференциацию и аутофагию. Однако механизмы ассоциированной с HDACI противоопухолевой активности еще недостаточно четко определены. Цель этого исследования состояла в том, чтобы исследовать ключевые события Trichostatin A (TSA), классического агента HDACI, против клеток рака молочной железы.

Клеточные линии MCF-7, MDA-MB-231 и MCF-10A оценивали с помощью анализа колониеобразования и жизнеспособности клеток. Апоптоз и распределение клеточного цикла были обнаружены проточной цитометрией. Митохондриальная функция была измерена с помощью биохимических анализов, проточной цитометрии и просвечивающей электронной микроскопии.

TSA ингибирует жизнеспособность и пролиферацию рака молочной железы, не влияя на клетку MCF-10A. Апоптоз клеток рака молочной железы, индуцированный TSA, был инициирован остановкой G2-M и зависел от митохондриальных реактивных видов кислорода (ROS), полученных после снижения активности митохондриальной дыхательной цепи. Повышенное продуцирование и апоптоз митохондрий ROS в раковых клетках заметно ослаблялось антиоксидантами, такими как N-ацетилцистеин (NAC), восстановленный глутатион (GSH) и витамин С.

Настоящее исследование показало, что TSA-индуцированная гибель клеток путем остановки клеточного цикла в фазе G2-M и была зависеть от производства ROS, полученного из митохондрий, которая была получена из-за нарушения митохондриальной дыхательной цепи.

Несмотря на растущие успехи в адресной терапии и методов скрининга, рак молочной железы остается основной причиной злокачественной смертности у женщин [1]. Начало и прогрессирование рака молочной железы связаны как с генетическими, так и с эпигенетическими изменениями, а последние являются потенциально обратимыми процессами [2]. Ингибиторы гистондезацетилазы (HDACI), как самостоятельно, так и в сочетании с другими агентами, последовательно демонстрируют свои перспективы в клинических испытаниях при лечении рака молочной железы [3].

Несколько исследований показали, что Trichostatin A (TSA), который был первоначально идентифицирован как фунгицидный антибиотик и был классическим средством HDACI [4], проявлял токсичность клеток рака молочной железы дозозависимым образом как in vitro, так и in vivo [5] — [7]. HDACI существенно изменили экспрессию специфических генов, которые были важны для клеточных биологических исходов и митоза, чтобы способствовать гибели раковых клеток, но HDACI не были строго доказаны прежде всего для транскрипции, чтобы опосредовать их биологические эффекты [8]. Внутренний путь апоптоза является важным событием, связанным с противоопухолевой активностью TSA. Было показано, что Vorinostat и TSA увеличивают транскрипцию генов семейства Bcl-2 только BH3 [9] и, как показано, нарушают митохондриальный мембранный потенциал, вызывают высвобождение цитохрома c из митохондриального межмикровного пространства в цитоплазму и активировать каспазу-9 [10], [11]. Активные виды кислорода (ROS) играют важную роль в апоптозе, а HDACI способствуют производству ROS, тем самым способствуя апоптозу [12] — [15]. ROS представляет собой коллективную фразу, которая описывает множество молекул и свободных радикалов, включая перекись водорода (H2O2) и гидроксильные радикалы (HO⋅) [16]. Митохондриальная дыхательная цепь является жизненно важным местом производства ROS, и, как полагают, комплексы I и III являются основными источниками ROS [17], [18].

Однако в предыдущих исследованиях недостаточно изучены механизмы, которые лежат в основе активности TSA и селективности. Таким образом, целью нашего исследования было изучение того, как TSA ингибирует жизнеспособность клеток рака молочной железы и дает подтверждающие доказательства клинической комбинированной терапии. С этой целью мы использовали две линии клеток рака молочной железы, MCF-7 и MDA-MB-231, а также линию клеток эпителиальных клеток молочной железы MCF-10A. В этом исследовании мы первыми определили, что апоптоз, опосредуемый TSA в клетках рака молочной железы, был инициирован остановкой G2 / M и зависел от повышенного ROS, полученного из митохондрий, из нарушенной митохондриальной дыхательной цепи.

Клетки MCF-10A, MCF-7 и MDA-MB-231 были приобретены в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA, США). Клетки MCF-10A культивировали в DMEM / F12 с добавлением 20 нг / мл эпидермального фактора роста, 100 нг / мл холерного токсина, 0,01 мг / мл инсулина, 500 нг / мл гидрокортизона и 5% лошадиной сыворотки. Клетки MDA-MB-231 культивировали в среде L-15 Leibovitz. Клетки MCF-7 культивировали в DMEM с добавлением 0,01 мг / мл инсулина. Каждую клеточную линию поддерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО2.

Всего в логарифмической фазе роста 5000 клеток высевали в 96-луночные планшеты Costar. После 24 ч инкубации клетки подвергали воздействию различных доз TSA (T8552, Sigma) и инкубировали в течение указанного времени. Клетки анализировали МТТ, как описано ранее [19].

Клетки высевали в 6-см чашки в трех повторностях с плотностью 1000 клеток на чашку. Клетки подвергали TSA в течение 14 дней в увлажненном инкубаторе при 37 ° С. Колонии фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым и подсчитывали.

Уровни белка анализировали в целых клеточных лизатах, которые были получены с буфером для лизиса RIPA (Beyotime, Китай), и 50 мкг каждого образца разрешали на полиакриламидном геле SDS. Гели анализировали путем иммуноблоттинга антителами против цитохрома C, COX IV, Bcl-xL, Bcl-2, NDUFS1, NDUFS6, UQCRFS1, CYC1 (10993-1-AP, 11242-1-AP, 10783-1-AP, 12789- 1-AP, 19532-1-AP, 12444-1-AP, 14417-1-AP, 18443-1-AP, 10242-1-AP, соответственно, Proteintech, 1:000 разведений), GAPDH, Bax, расщепленный PARP , CyclinB1, Phospho-cdc2 (Thr161) (2118S, 5023, 9541, 4138, 9114 соответственно, Cell Signaling, 1:000 разведений), H3P (ab5176, 1-2000 разведений) и ацетилированный гистон H3 (06-599; Millipore; 1:000 разведений). Иммуноблоттинг-анализ проводили с использованием реагентов для определения Вестерн-блоттинга с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) (Pierce).

Клетки готовили, как указано. После уборки и промывки один раз в PBS клетки окрашивали комплектом обнаружения аппротонов Appin V-FITC / PI (KeyGen Bio-tech) в соответствии с инструкциями производителя, и анализ проводили на проточном цитометре (BD).

Клетки обрабатывали, как указано. Клетки собирали, фиксировали в 70% этаноле и хранили при -20 ° С в течение ночи. Для анализа образцы промывали один раз в PBS и окрашивали иодидом пропидия (PI, 50 мкг / мл) и RNaseA (2 мкг / мл) в течение 15 минут при комнатной температуре. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре (BD).

Клеточное фракционирование в цитозольные и митохондриальные фракции проводили с помощью комплекта изоляции митохондрий для культивируемых клеток (89874, Thermo Scientific). Выделение цитохрома c контролировалось иммуноблоттингом как супернатантной, так и митохондриальной фракций.

Посредством опосредованной митохондрией генерации ROS был обнаружен индикатор митохондриального супероксида MitoSOX-Red (Invitrogen). Клетки собирали, дважды промывали в PBS и инкубировали с 5 мкмоль / л MitoSOX-Red в течение 15 мин при 37 ° С с последующим анализом на проточном цитометре (BD, 10000 клеток / образец).

Расход кислорода (OCR) измеряли при 37 ° C с использованием набора для тестирования напряжений XF Cell Mito (Seahorse Bioscience, Part # 101706-100) и внеклеточного анализатора XF96 (Seahorse Bioscience). 6000 клеток высевали в 96-луночные планшеты. Через 6 часов клетки обрабатывали TSA в течение 18 часов и загружали в машину для определения концентрации O2. Клетки последовательно подвергали воздействию олигомицина (1 мкМ), карбонилцианидного п-трифторметоксифенилгидразона (FCCP, 300 нМ) и ротенона (100 нМ) и антимицина (100 нМ). После каждой инъекции OCR измеряли в течение 3 мин, среду перемешивали и снова измеряли в течение 3 мин. Каждая точка представляет собой среднее значение для 5 различных скважин. OCR рассчитывали, нормировали на число клеток.

Клетки обрабатывали, собирали и затем загружали 50 нмоль / л флуоресцентного потенциально-зависимого индикатора этилового эфира тетраметилборамина (TMRE, молекулярные зонды) в течение 20 мин при 37 ° С. Интенсивность флуоресценции регистрировали на проточном цитометре (BD, 10000 клеток / образец). Уровни внутриклеточного АТФ определяли с помощью коммерчески доступного набора колориметрических АТФ-анализов (Beyotime, Shanghai, China) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни АТФ были нормализованы до уровня белка.

Комплекс I, комплекс II, комплекс IV и активность комплекса V анализировали с помощью набора для комплексной микропланктонной ферментативной активности человека (Abcam) в соответствии с инструкциями производителя. Активность комплекса III анализировали с помощью комплекта обнаружения активности митохондриального комплекса III (GENMED, China).

Клетки собирали и фиксировали 2,5% глутаральдегидом в 0,1 моль / л натрий-какодиловом буфере, а затем фиксировали 2% -ным тетроксидом осмия в 0,1 моль / л натрий-какодилат-буфера плюс 0,3% ферроцианида калия. Клетки окрашивали 4% -ным водным ацетатом уранила, дегидратировали, инфильтрировали и внедряли в эпоксиэрезин. Ультратонкие срезы (80 нм) разрезали и визуализировали с помощью электронного микроскопа aFEI Tecnai G2.

Статистический анализ выполнялся с помощью программного пакета SPSS 16.0. Статистические сопоставления между двумя группами проводились с двухсторонним t-критерием Стьюдента или, если они не были распределены нормально, U-критерием Манна-Уитни. Однофакторный ANOVA использовался для многогрупповых сравнений. Значение P <0,05 было определено как статистически значимое.

Мы исследовали влияние TSA на жизнеспособность клеточных линий MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231 с помощью MTT-анализа. После воздействия различных концентраций TSA для разных временных точек (фиг. S1A), возможности линий клеток MCF-7 и MDA-MB-231 снижались зависимым от дозы и зависящим от времени образом, при этом IC50 составлял приблизительно 500 нмоль / л в течение 48 ч. Жизнеспособность клеточной линии MCF-10A снижалась лишь на 20%, когда концентрация TSA была увеличена до 1000 нмоль / л (рисунок 1A). H3-ацетилирование 500 нмоль / л TSA для MCF-7, MDA-MB-231 и 1000 нмоль / л для MCF-10A в разные моменты времени визуализировали вестерн-блоттингом. Было показано, что ацетилирование H3 было очевидным через 24 часа и 48 ч в клетках рака молочной железы, избавляя от нетрансформированных клеток (фиг. S1B). Во время лечения последовательными концентрациями TSA повышение уровня ацетилирования H3 наблюдалось в клетках рака молочной железы MDA-MB-231 и MCF-7, но не в клетке MCF-10A, что указывало на активность TSA (рисунок 1B). При дальнейшем исследовании влияния TSA на пролиферацию клеточной линии рака молочной железы клоногенные анализы in vitro показали, что количество колоний, подвергнутых воздействию 500 нмоль / л TSA, по сравнению с таковыми в контрольных культурах ДМСО, составило 115 против 404 и 74 против 478 в MDA-MB-231 и MCF-7 соответственно, и 309 против 407 в культурах клеток MCF-10A (фиг. 1C, D). В совокупности эти результаты показали, что TSA ингибирует жизнеспособность и пролиферацию рака молочной железы, но не влияет на клетку MCF-10A.

(A) Влияние TSA на жизнеспособность раковых клеток молочной железы. Экспоненциально растущие клетки обрабатывали указанными концентрациями TSA в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью MTT-анализа. Результаты анализа МТТ были представлены в процентах от жизнеспособных клеток по сравнению с обработанными ДМСО клетками. Графики были показаны как средство ± SD. (B) уровни ацетилированного H3-белка в клетках MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7 в ответ на 48-часовой градиент концентрации TSA. (C, D) Влияние TSA на пролиферацию клеток рака молочной железы. Пролиферацию клеток определяли с помощью клоногенных анализов in vitro. Представительные изображения (C) и числа колоний (D) показали, что TSA ингибирует рост клеток рака молочной железы. Данные гистограммы показали средние значения ± SD трехкратных результатов. ** P <0,01 по сравнению с ДМСО (контроль) с использованием t-теста Стьюдента.

Чтобы дополнительно исследовать роль TSA в ингибировании роста клеток рака молочной железы, прогрессирование клеточного цикла и апоптоз оценивали в проточном цитометрическом анализе. Клетки MCF-10A, MCF-7 и MDA-MB-231 обрабатывали TSA (1000 нмоль / л, 500 нмоль / л и 500 нмоль / л) в указанные моменты времени. MCF-7 и MDA-MB-231 при воздействии 500 нмоль / л TSA в течение 24 ч (фиг. 2А), арестованных в фазе G2-M, и исходные данные были представлены в таблице S1. Для дальнейшего подтверждения остановки фазы G2-M экспрессия CyclinB1, Phospho-cdc2 (Thr161) и H3P была обнаружена с использованием Вестерн-блоттинга. Усиленное выражение CyclinB1, Phospho-cdc2 (Thr161) и H3P в MCF-7 и MDA-MB-231 в ответ на TSA выявило остановку G2-M (рисунок 2B). Процент клеток MDA-MB-231, арестованных в фазе G2-M, уменьшился, в то время как клетки фазы subG1 начали накапливаться через 24 часа (рисунок 2C). Линия клеток MCF-7 показала аналогичные результаты (данные не были показаны). Чтобы определить, что пик subG1 был вызван апоптозом, а не некрозом, мы провели анализ проточного цитометрического апоптоза с использованием набора V-FITC / PI в приложении. Процентное содержание апоптозных клеток MCF-7 и MDA-MB-231 было минимальным в течение 24 ч (9,26% и 11,12% соответственно), но увеличилось до 54,79% и 43,6%, соответственно, через 48 часов; Клетки MCF-10A не были затронуты (рисунок 2D). Используя ингибитор пан-каспазы zVAD-fmk для защиты клеток MDA-MB-231 от апоптоза, арест G2-M не был затронут, хотя процент TSA-опосредованных апоптозных клеток был значительно снижен (рис. 2E, 2F) и сырой данные анализа клеточного цикла на рисунке 2F были дополнены таблицей S2. Таким образом, TSA арестовал рост клеток рака молочной железы в фазе G2-M и индуцировал апоптоз для ингибирования роста трансформированных клеток; последний произошел после ареста G2-M.

(A) Гистограммы показывают распределения клеточного цикла в клетках MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7 после 24-часовой обработки ДМСО (контроль) или TSA (1000 нмоль / л, 500 нмоль / л или 500 нмоль / л ). (B) Вестерн-блоттинг CyclinB1, Phospho-cdc2 (Thr161) и H3P в MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7. Представитель 3 экспериментов. (C) Распределение клеточного цикла в клетках MDA-MB-231 после воздействия 500 нмоль / л TSA в указанные моменты времени. (D) Изучение временного курса влияния 1000 нмоль / л, 500 нмоль / л и 500 нмоль / л TSA на проценты апоптотических клеток в клетках MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7 , соответственно. Апоптоз определяли с помощью проточного цитометрического анализа PI-позитивных и аффинно-V-позитивных клеток. Значения были показаны как средство ± SD, n = 3. ** P <0,01 по сравнению с группой 0 ч с использованием t-теста Стьюдента. Для защиты клеток MDA-MB-231 от апоптоза использовали ингибитор панкаспазы, zVAD-fmk; графики показывали процент апоптотических клеток при различных методах лечения (E) и распределениях клеточного цикла (F). ** P <0,01 по сравнению с группой, обработанной TSA, с использованием t-теста Стьюдента.

Центральные события индуцированного HDACI апоптоза включают активацию проапоптотических BH3-только белков семейства Bcl-2 и нарушения митохондриальной мембраны, что приводит к активации пути митохондриального апоптоза [9]. Чтобы подтвердить, что TSA индуцировал апоптоз клеток рака молочной железы через собственный путь, мы проанализировали экспрессию обоих антиапоптотических (Bcl-2 и Bcl-xL) и проапоптотических (Bax) белков путем вестерн-блоттинга в трех клеточных линиях. Мы также обнаружили локализацию цитохрома c в митохондриальных и цитоплазматических фракциях, выделенных из клеток MCF-10A, MCF-7 и MDA-MB-231. Как показано на фиг.3А, TSA сильно подавляет экспрессию Bcl-2 и Bcl-xL, вызывая экспрессию Bax в клетках MCF-7 и MDA-MB-231. TSA индуцировал выделение цитохрома c из митохондрий в цитоплазму в обеих линиях клеток рака молочной железы в зависимости от времени, но мало влиял на клетки MCF-10A (рисунок 3B).

(A, B) MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7 обрабатывали 1000 нмоль / л, 500 нмоль / л и 500 нмоль / л TSA соответственно в указанные моменты времени. Вестерн-блоттинг проводили для оценки экспрессии расщепленного PARP, Bcl-2, Bcl-xL и Bax в клеточных лизатах после воздействия вышеописанной обработки (A), и полученный осадок (Mit) и супернатант (Sup) были иммуноблоттированы для Цитохром c и COX-IV (контроль; B). Аналогичные результаты наблюдались в общей сложности 3 независимых эксперимента.

Предыдущее исследование показало, что TSA индуцирует накопление реакционноспособных видов кислорода (ROS), что может иметь важное значение для индуцированной HDACI трансформированной клеточной гибелью [20]. Таким образом, эксперименты были разработаны для изучения взаимосвязи между TSA-индуцированным апоптозом рака молочной железы и митохондриальными реактивными кислородными видами (ROS). Мы использовали ответы клеточной линии MDA-MB-231 для TSA, чтобы представить результаты, в то время как линия клеток MCF-7 дала аналогичные результаты, и данные не были показаны. Генерирование митохондриальных реакционноспособных видов кислорода (ROS) в клетках MDA-MB-231, обработанных TSA в указанные моменты времени, оценивали по окрашиванию Mito-SOX, которое является высокоселективным детектором супероксида в живых клетках митохондрий и проточной цитометрией. В соответствии с TSA-индуцированным апоптозом клеток рака молочной железы интенсивность флуоресценции Mito-SOX повышалась зависящим от времени образом и увеличивалась примерно в 4,36 раза за 36 часов (рисунок 4A). Затем мы исследовали, способствует ли митохондриальная РОС апоптозу. При введении с TSA, GSH, NAC и витамина C уменьшали интенсивность флуоресценции Mito-SOX примерно на 65,8%, 46,3% и 59,7% соответственно по сравнению с таковой в клетках, обработанных только TSA в течение 36 часов (рисунок 4B). Последовательно, GSH, NAC и витамин С придавали устойчивость к TSA-индуцированному апоптозу в клетках MDA-MB-231 (рис. 4C), мешали TSA-опосредованной экспрессии белков семейства Bcl-2 (рисунок 4D) и защищали выделение цитохрома C от митохондрий до цитоплазмы, индуцированной терапией TSA (рис. 4Е). Однако остановка фазы G2-M, вызванная TSA в MDA-MB-231, не подвергалась воздействию GSH, NAC и витамина C (рисунок 4F). В заключение, эти результаты показали, что апоптоз клеток, опосредуемых TSA, был зависим от производства ROS на основе митохондрий, которое происходило выше по течению от пути митохондриального апоптоза и могло блокироваться антиоксидантами.

(A) Временной ход интенсивности флуоресценции Mito-SOX (высокоселективный индикатор супероксида в живых клетках митохондрий) в MDA-MB-231, обработанный 500 нмоль / л TSA, обнаруженный методом проточной цитометрии. (B) Синергетические эффекты антиоксидантов и TSA на ROS на основе митохондрий в клетках рака молочной железы. Экспоненциально растущие клетки обрабатывали ДМСО (контроль) или 500 нмоль / л TSA с 10 ммоль / л NAC, 10 ммоль / л GSH и 100 мкмоль / л витамина С в течение 36 часов. На графике показана интенсивность флуоресценции Mito-SOX. (C) Синергетические эффекты антиоксидантов и TSA на апоптоз в клетках рака молочной железы. Графики показали процентное соотношение PI-позитивных и приектин-V-позитивных клеток. (D) Иммуноблоттинг белков семейства Bcl-2 в лизатах из клеток MDA-MB-231, которые культивировали в присутствии указанных обработок. (E) Выделение цитохрома c в указанных обработанных клетках анализировали с помощью Вестерн-блоттинга. β-актин, который был исключительно экспрессированным цитозолом, использовался в качестве контроля для загрузки и фракционирования. (F) Синергетические эффекты антиоксидантов и TSA на клеточный цикл в клетках рака молочной железы. Графики были показаны как средство ± SD.

Исследования показали, что генерация ROS является неизбежным побочным продуктом окислительного метаболизма митохондрий [16]. Чтобы дополнительно охарактеризовать, влияет ли TSA на ослабленный митохондриальный окислительный метаболизм для усиления ROS на основе митохондрий, мы измеряли уровни активности комплексов окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в контроле с ДМСО и обработанной TSA-обработанной MDA-MB-231 клеткой с 500 нмоль / л и MCF -7 в течение 24 ч. TSA заметно ослабило уровни активности комплексов I и III, основных источников ROS митохондриального происхождения в митохондриальной дыхательной цепи, по сравнению с контрольной обработкой ДМСО (рис. 5A). Чтобы проверить это далее, мы рассмотрели, было ли изменено выражение некоторых компонентов комплексов I и III с помощью TSA. Как показано на рисунке 5B, экспрессия NDUFS1, NDUFS6, которые были двумя ключевыми субъединицами комплекса I [21] и UQCRFS1, которые сыграли существенную роль в комплексе III [22], существенно уменьшилась в ответ на TSA, тогда как CYC1 не изменилось заметно. Мы также обнаружили экспрессию NDUFV1, NDUFA9, UQCRC1 и UQCRC2, которые показали небольшое изменение (данные не показаны). Чтобы продемонстрировать это подробно, TSA уменьшило экспрессию некоторых компонентов, чтобы ослабить активность комплекса I и комплекса III. Поэтому скорость потребления кислорода (OCR) снижалась более чем на 50% в ответ на TSN 500 нмоль / л в клетках рака молочной железы (Фиг. 5С). TSA-обработанные клетки рака молочной железы с уменьшенной интенсивностью флуоресценции TMRE в 36 часов (рис. 5D), а электронная микроскопия продемонстрировала, что TSA удлиняет митохондрии с более высоким разрешением крист, по сравнению с контролируемыми клетками (рис. 5Е). Ухудшение активности комплекса I и III, снижение интенсивности флуоресценции TMRE и удлиненных митохондрий, наблюдаемых в клетках рака молочной железы, обработанных TSA, показало, что клетки подвергались ускоренной гибели клеток. Таким образом, мы измеряли уровни АТФ в клетках рака молочной железы после воздействия TSA на 36 ч. Уровни АТФ в клетках MDA-MB-231 и MCF-7, обработанных TSA, снизились на 51,8% и 71,2% (рисунок 5F). В совокупности эти данные еще больше укрепили наш вывод о том, что TSA уменьшает экспрессию некоторых субъединиц комплекса I и III для снижения их активности и индуцирует митохондриальный ROS для активации пути митохондриального апоптоза.

Экспоненциально растущие клетки MDA-MB-231 и MCF-7 обрабатывали ДМСО (контроль) или 500 нмоль / л TSA. (A) Измерение активности митохондриального комплекса I, II, III, IV и V при воздействии TSA через 24 часа (n = 3). В столбцах ошибок указано SD; * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с обработкой DMSO (контроль) с использованием t-теста Стьюдента. (B) Экспрессия некоторых субъединиц митохондриального комплекса I и комплекса III в ответ на TSA через 24 часа. Представитель 3 экспериментов. (C) Коэффициент потребления кислорода (OCR) в клетках рака молочной железы, обработанных с помощью TSA в течение 24 часов и последовательно подвергающихся воздействию (a) олигомицина, (b) FCCP, (c) ротенона и антимицина. Среднее ± SD, n = 5. (D) Флуоресценция TMRE как мера митохондриального мембранного потенциала (n = 3). В столбцах ошибок указано SD; ** P <0,01 по сравнению с обработкой ДМСО в t-критериях Стьюдента. (E) Трансмиссионная электронная микроскопия показала различия в проявлениях митохондрий. Δ указывает митохондрии. Шкала шкалы = 500 нм. (F) содержание АТФ (n = 6). В столбцах ошибок указано SD; * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению с обработкой DMSO (контроль) с использованием t-теста Стьюдента.

Все более очевидно, что аномальная регуляция экспрессии генов является отличительной чертой опухолевого генеза [23]. Аберрантная регуляция экспрессии гена посредством изменения хроматина, по-видимому, является мишенью для профилактики и терапии, тем самым обогащая потенциал ингибиторов гистоновой дезацетилазы (HDACI) для оценки как лейкемии и лечения солидных опухолей [24]. HDACI проявляют различные противоопухолевые действия, включая индукцию остановки клеточного цикла, дифференцировку и апоптоз [9]. Центральным событием в опосредованной HDACI клеточной гибелью является активация собственного апоптотического пути, который включает активацию проапоптотических белков Bcl-2 только BH3 и нарушение митохондриальной мембраны [25]. Однако основные механизмы этой противоопухолевой активности остаются плохо определенными. Несколько систем показали, что при воздействии высоких доз HDACI раковые клетки переходили через границу G1 / S и накапливали содержание ДНК 4N до апоптоза, тогда как избыточная экспрессия p16INK4a для остановки клеток в фазе G1 позволила клеткам оставаться жизнеспособными [ 26], [27]. HDACI-опосредованный апоптоз опухолевых клеток восстанавливался сверхэкспрессией Bcl2, хотя остановка фазы G2-M не изменялась [28]. Следовательно, возможно, что дисрегулированный митоз может быть необходимым событием в опосредованном HDACI апоптозе. Кроме того, недавние исследования ядов веретена предложили модель «конкурирующих сетей» клеточной судьбы. Одна сеть поддержала бы митоз, избегая митотического арест, а другая активировала бы апоптоз. Во время задержки митоза обе сети были бы активны, а сеть, которая в конечном итоге преобладала, определяла бы судьбу клетки [29], [30]. Поэтому мы постулировали, что аберрантный TSA-опосредованный митоз активирует апоптоз и таким образом определяет клеточную судьбу. Основываясь на нашем исследовании, мы обнаружили, что противоопухолевая активность TSA в клетках рака молочной железы была инициирована остановкой G2-M и зависела от опосредованной митохондриальной ROS через ингибирование активности митохондриального комплекса I и III. После облучения высокими дозами TSA клетки MCF-7 и MDA-MB-231 были арестованы в фазе G2-M через 24 часа, после чего доля арестованных клеток G2-M уменьшалась, и клетки subG1 начали накапливаться. Используя ингибитор пан-каспазы zVAD-fmk для защиты клеток MDA-MB-231 от апоптоза, мы обнаружили, что арест G2-M не был затронут, хотя процент апоптотических клеток, опосредуемых TSA, заметно уменьшился. Следовательно, TSA-индуцированный апоптоз может быть инициирован остановкой фазы G2-M и может быть основным необходимым событием для индукции апоптоза. Недавно накопленные данные подтверждают вывод о том, что HDACI улучшают продукцию ROS [12], [13], [31], а митохондриальная дыхательная цепь является основным источником продукции ROS [17], [18]. Таким образом, мы предположили, что TSA нацеливается на митохондриальную дыхательную цепь, чтобы индуцировать продукцию ROS и, в конечном счете, апоптоз. Как показано в исследовании, TSA улучшало опосредованную митохондриальным ROS продукцию и апоптоз в клетках рака молочной железы, скорость которых была сильно снижена антиоксидантами. Однако арест G2-M, вызванный терапией TSA, не был затронут. Дальнейшие результаты показали, что TSA ослабляет митохондриальную активность дыхательной цепи, уменьшая экспрессию некоторых субъединиц комплекса I и комплекса III, которые являются основными источниками реакционноспособных видов кислорода (ROS). Это открытие показало, что TSA нацеливается на митохондриальную дыхательную цепь для усиления продукции митохондриального ROS, нарушает потенциал митохондриальной мембраны и индуцирует гибель клеток рака молочной железы.

В заключение, в настоящем исследовании было установлено, что апоптоз, индуцированный TSA, был инициирован остановкой G2-M и вызван усиленным опосредованным митохондриальным ROS, полученным из уменьшенной активности митохондриальной дыхательной цепи. Это было первое исследование, посвящённое связыванию пути митохондриального апоптоза и метаболизма митохондрий. Однако следует дополнительно изучить механизм влияния TSA на метаболизм митохондрий. Поскольку митохондрии в последнее время стали привлекательными терапевтическими мишенями для лечения рака, наши результаты могут поддержать обоснование применения TSA самостоятельно или в сочетании в качестве нового терапевтического подхода к раку молочной железы. Могут ли другие химиотерапевтические препараты также индуцировать гибель клеток путем активации этого пути, еще предстоит определить.

TSA влияет на жизнеспособность в клетках рака молочной железы. (A) Влияние различных концентраций TSA в разные моменты времени на жизнеспособность в трех клеточных линиях. График был представлен как среднее ± SD. (B) Экспрессия ацетилированного H3 в клетках MCF-10A, MDA-MB-231 и MCF-7 в ответ на TSN 500 нмоль / л в разные моменты времени. (См. Рис. 1).

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Исходные данные анализа клеточного цикла. (См. Рисунок 2A).

(XLS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Исходные данные анализа клеточного цикла. (См. Рисунок 2F).

(XLS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Цинцин Мо за обсуждение и помощь в пересмотре рукописи, а Цянь Чжан за помощь в проточной цитометрии.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *