Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Митохондриальные полиморфизмы NADH-дегидрогеназы связаны с раком молочной железы в Польше

Mitochondrial NADH dehydrogenase polymorphisms are associated with breast cancer in Poland
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3990858/

Комплекс I NADH-оксидоредуктаза-убихинон переносит восстановительные эквиваленты из восстановленной формы NADH в убихинон (кофермент Q-CoQ). Целью этого исследования было проанализировать мутации в генах MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3 и MT-ND6 и их влияние на биохимические свойства, структуру и функционирование белков у пациентов с опухолями молочной железы. В исследовательских материалах у 50 пациентов выявлено 28 общих полиморфизмов и пять мутаций. Большинство обнаруженных полиморфизмов (50%, 14/28) наблюдались в гене MT-ND2. Большинство из них были молчаливыми мутациями. В базе данных не существует пяти полиморфизмов (m.G3916A, m.C4888T, m.A4918G, m.C5363T, m.C10283T). Было обнаружено в общей сложности пять мутаций у 13 пациентов (13/50), в том числе два, не описанных в литературе: m.C4987G и m.T10173C. Не исключено, что через мутации и влияние полиморфизма на структуру белка они могут вызывать митохондриальную дисфункцию и способствовать появлению других изменений в мтДНК. Результаты нашего исследования показывают наличие гомологических изменений в последовательности мтДНК как при раке молочной железы, так и при некоторых митохондриальных заболеваниях. Мутации в исследуемых генах рака молочной железы могут влиять на клетку и вызывать ее дисфункцию, как это имеет место при митохондриальных заболеваниях.

Участие митохондрий в опухолегенезе было впервые предложено Варбургом в 1932 году. Его объяснение было распространенностью анаэробного гликолиза в раковых клетках. Митохондриальная ДНК состоит из пар оснований 16569 (Andrews et al., 1999). Почти каждый нуклеотид кодирует генетическую информацию. МТДНА кодирует гены для двух типов рРНК, 22 типа тРНК и 13 белков. Две цепи мтДНК, как светлые, так и тяжелые, являются целями кодирования. Большинство генов расположены в тяжелой цепи. Гены кодированной легкой цепи представляют собой всего лишь восемь типов генов тРНК и один из комплекса I дыхательной цепи (MT-ND6). Тяжелая цепь других генов кодирует комплекс I (MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND4L и MT-ND5), а остальные 13 белков участвуют в митохондриальном окислительном фосфорилировании (OXPHOS ). В мтДНК первая мутация, связанная с раком, была описана в почечно-клеточной карциноме (RCC). Он касался гена MT-ND1 для окислительного фосфорилирования (Welter et al., 1989). Важность изменений, происходящих в митохондриях в процессе канцерогенеза, предполагает, что связывание муравьиных мутаций в гене SDHC у Caenorhabditis elegans связано с увеличением производства реактивных видов кислорода (ROS), которые являются очень важными факторами в инактивации белки, связанные с апоптозом и неоплазией, такие как p 16INK4a и p53 (Grzybowska — Szatkowska и Slaska 2012a). Целью этого исследования было проанализировать мутации в генах MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3 и MT-ND6 и их влияние на биохимические свойства, структуру и функционирование белков у пациентов с опухолями молочной железы.

Испытуемым материалом была ДНК, выделенная из образцов протоковой карциномы (карцинома протокале) Tp1-2 Np0-1Mp0 и крови, взятой у 50 пациентов, которые также подверглись хирургическому вмешательству при раке молочной железы. Пациенты не получали химио- или гормональной терапии. Все они были перименопаузальными. Кровь отбирали у каждого пациента и помещали в стерильные вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт дикалий-этилендиаминтетрауксусной кислоты. ДНК выделяли с использованием автоматизированной системы экстракции нуклеиновой кислоты — QIACube (Qiagen, Hilden, Germany). Он был извлечен из всей периферической крови с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), а набор ДНК QIAamp DNA Kit (Qiagen) был использован для извлечения ДНК из ткани. Проанализированы последовательности генов MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3 и MT-ND6 (таблица 1). Основываясь на митохондрии Homo sapiens, полная последовательность генома (AC_000021), праймеры для фрагментов тестовых генов (таблица 1) были разработаны с использованием программы Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/). Продукты амплификации визуализировали в 2% агарозном геле. Обе нити конкретных генов были секвенированы. Ампликон были секвенированы с использованием набора для циклического циклирования BigDye Terminator (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) в системе PCA GeneAmp 9700 (Applied Biosystem). Затем образцы очищали на колонках CentriSep в соответствии с протоколом изготовителя или осаждали этанолом и ацетатом натрия в соответствии с протоколом производителя BigDye Kit. Продукты расширения были разделены на автоматизированный секвенсор ABI 377 (Applied Biosystem). После установления консенсусной последовательности для каждой анализируемой последовательности последовательности генов сравнивали с Кембриджской контрольной последовательностью человеческой митохондриальной ДНК (AC_000021). Для идентификации гаплотипов использовали одиночные нуклеотидные полиморфизмы, установленные для конкретных фрагментов гена. Полиморфизмы считались изменениями, происходящими как в крови, так и в нормальных клетках молочной железы и опухолевых клетках у одного и того же пациента. Мутация — это изменение, характерное только для раковых клеток и не встречающееся в крови пациента / нормальной груди. Табличные последовательности 1Primer, используемые в амплификации и секвенировании ПЦР

Влияние на физические и биохимические свойства пептидов. Вероятность вредных мутаций, то есть функциональный эффект несинонимического (аминокислотного изменения) белкового кодирующего SNP, определялась с использованием системы классификации Panther (http://www.pantherdb.org/), которая оценивает значение (subPSEC) и вероятность пагубного влияния на функцию белка (Pdeleterious, Вероятность функционального ухудшения) на основе выравнивания эволюционно определенных белков. Оценки PANTHER subPSEC — это непрерывные значения от 0 (нейтральный) до примерно -10 (скорее всего, это вредно); -3 — ранее обозначенная точка отсечки для функционального значения. Обрезание -3 соответствует 50% вероятности того, что оценка является вредной. Из этого следует, что вероятность того, что данный вариант приведет к пагубному влиянию на функцию белка, оценивается Pdeleterious, так что оценка subPSEC -3 соответствует Pdeleterious 0.5. Определение спиральности на остаток для пептидов проводили с использованием программы AGADIR (http://agadir.crg.es/). GRAVY и теоретический pI были получены с помощью программного инструмента ProtParam (http://web.expasy.org/). Заболеваемость аминокислоты в каждом положении последовательности белка оценивали с использованием скоринговой матрицы с определением положения (PSSM). Оценки PSSM обычно показаны как положительные или отрицательные целые числа. Положительные оценки показывают, что данная аминокислотная замена происходит чаще в выравнивании, чем ожидалось случайно, в то время как отрицательные оценки указывают на то, что замена происходит реже, чем ожидалось. Большие положительные оценки часто указывают на критические функциональные остатки, которые могут означать остатки активного сайта или остатки, необходимые для других межмолекулярных взаимодействий (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/Structure/pssm/pssm_viewer.cgi).

Комиссия по институциональному контролю в Медицинском университете Люблина специально одобрила это исследование. Номер утверждения KE-254/141/2009.

Результаты показаны в таблицах 2, 3, 4 и 5. В исследовании 50 пациентов имели общее количество 28 полиморфизмов и пять мутаций (таблица 2). Большинство полиморфизмов (50%, 14/28) происходило в последовательности гена MT-ND2. Большинство из них были молчаливыми мутациями. В базе данных не существовало пяти полиморфизмов (m.G3916A, m.C4888T, m.A4918G, m.C5363T, m.C10283T). Полиморфизмы m.G3916A, m.C4888T, m.A4918G, m.C10283T имеют пропущенный тип, а в случае двух из них Pdt был выше 0,5, что указывает на то, что эти изменения неравнодушны к функции белка (таблица 4 ). Всего у 13 пациентов (13/50) было обнаружено пять мутаций, в том числе два, не описанных в литературе (m.C4987G, m.T10173C). Только изменение p.C39R в MT-ND3, по-видимому, влияет на функционирование белка, Pdt subPSEC = 0,86366 -4,84604 (таблица 4). Аминокислоту цистеина, содержащую сульфгидрильную группу, которая также очень необычна в белках, была заменена здесь аргинином, содержащим гуанидиновую группу. Эта мутация преобразует высококонсервативный цистеин (оценка PSSM = 11) в argnine (оценка PSSM = -5) (таблица 5). Табличные 2D-различия в последовательностях генов MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3 и MT-ND6 между эталонным Кембриджем последовательность и исследуемый материал

aPositions, в которых мутации или полиморфизмы были описаны в литературе впервые

Сравнение свойств белка в несинонимом белково-кодирующем SNP у женщин с раком молочной железы

Вероятность функционального эффекта на несинонимом белок-кодирующем SNP

Частоты остатков и оценка PSSM определяются с помощью программы просмотра PSSM

Митохондриальная электронная транспортная цепь состоит из четырех крупных комплексов респираторных ферментов. Мутации в генах OXPHOS в мтДНК вызывают нарушения в переносе электронов через дыхательную цепь. Комплекс I называется оксидоредуктазами-НАДХ-убихиноном. Он состоит из нескольких флавин-мононуклеотидных полипептидов и белков железа-серы. Целью комплекса является транспортировка восстановительных эквивалентов из восстановленной формы NADH в убихинон (кофермент Q-CoQ). Мутации в генах мтДНК OXPHOS вызывают нарушения в переносе электронов через дыхательную цепь, приводящую к смерти зрительного нерва и полной слепоте (Brown et al., 1992). Тяжесть симптомов зависит от объема и места мутации (Komaki et al., 2003; Mitchell et al., 2006; Grzybowska-Szatkowska и Slaska 2012a).

Хотя большинство патогенных мутаций при митохондриальных заболеваниях описываются как гомоплазматические, некоторые также являются гетероплазматическими. Наиболее часто встречаются в LHON (наследственная оптическая невропатия Leber), синдром Кернса — Сайре (Moraes et al., 1989; Brown et al., 1992) и инсулиннезависимый диабет (Perucca — Lostanlen et al., 2002). Они также описаны в собачьих опухолях (Slaska et al., 2013a, b). Tan et al. (2002) сообщили о четырех соматических изменениях в системе OXPHOS при раке молочной железы. В трех случаях они были связаны с MT-ND2 (тихие мутации). Изменение положения m.T3398C MT-ND1, описанного при раке молочной железы, также наблюдается у пациентов с прогрессирующей внешней офтальмоплегией и кардиомиопатией (Jaksch et al., 1996; Carelli et al., 2004). С другой стороны, Bai et al. (2000) обнаружили уменьшенную экспрессию мРНК для этого комплекса в случае мутаций в комплексе МТ-ND5 I в клетках рака легкого. Авторы считают, что это может быть вызвано нарушениями регуляции транскрипции (повышающей регуляции), стабильности мРНК или ухудшением селективной деградации мутантной мРНК.

При карциноме рака молочной железы анализ последовательности всех генов, кодирующих mt-тРНК, выявил восемь полиморфизмов и две мутации, обнаруженные у 34% пациентов (Grzybowska-Szatkowska и Slaska 2012b). Переходы m.A15924G и m.A12308G имели место только в неопластических клетках, но не в крови, поэтому мутации можно отнести строго к неопластическому процессу. Авторы предполагают, что это может быть результатом структуры вторичной и третичной тРНК и что полиморфизмы могут приводить к дисфункции митохондрий и способствовать выявлению других изменений в мтДНК (Grzybowska-Szatkowska and Slaska 2012b). Два других полиморфизма m.G10398A и m.T10400C также связаны с высоким риском развития рака молочной железы (Mims et al., 2005; Czarnecka et al., 2010; Sultana et al., 2011).

Полиморфизм m.G10398A является маркером гаплогруппы IJK. Setiawan et al. (2008) отрицают связь между полиморфизмом m.G10398A и раком молочной железы. Кроме того, полиморфизм MT-ND2: m.A4769G и m.G5460A обнаружен при раке молочной железы (Czarnecka et al., 2010). В этой статье полиморфизм m.G10398A наблюдался у трех пациентов в материале, тогда как m.A4769G присутствовал в 27 случаях, а m.G5460A — у одного пациента (таблица 2). Полиморфизм m.A4769G в отличие от двух других является синонимами и не изменяет аминокислоту в белок. Оба перехода m.G10398A (приводящие к изменению аминокислоты p.T114A) и m.G5460A (приводящие к изменению аминокислоты p.A331T) не присутствуют в высокой области сохранения, а Panther Pdt — меньше 0,5 (таблица 4).

Замена полярного треонина аланином приводит к уменьшению неполярного алифатического индекса белка, а аминокислотный аланин менее предпочтителен в таком положении, чем треонин (таблица 5). Полиморфизм m.G5460A описан при болезни Альцгеймера (AD), хотя обсуждается связь между AD и полиморфизмом (Mitchell et al., 2006). Испытуемый материал (таблица 2) также обнаружил два полиморфизма, описанных в LHON (Johns et al., 1991; Fauser et al., 2002) и дистония начала появления у взрослых. Митохондриальная гаплогруппа J / T (Herrnstadt et al., 2002) определяется переходом в позиции m.T4216C. Этот полиморфизм описан как вторичная мутация в LHON (Carelli et al., 2004), а также связан с резистентностью к инсулину и диабетом типа 2 (Crispim et al., 2006).

Этот полиморфизм относится к спирали 8 и изменяет ее процент от 6,59 до 3,71 (таблица 3). При резистентности к инсулину и диабете типа 2 он часто встречается вместе с переходами в MT-ND2 в положении 4917 (Johns et al., 1991). В изученном нами материале не было перехода в положение 4917, но в положении m.A4918G (таблица 2), что привело к изменению аминокислоты в том же кодоне (p.N150S) (Johns et al., 1991; Crispim et al., 2006). Этот переход сопровождался полиморфизмом в m.T4216C у двух пациентов (табл. 2).

Переход m.A4918T описан в литературе как естественный вариант мтДНК (Marzuki et al., 1991), и он превращает высококонсервативный аргинин, содержащий амидную группу, в серин с гидроксильной группой. Кроме того, эволюционный анализ кодирования SNPs subPSEC был ниже -3, что указывает на то, что полиморфизм оказывает влияние на функционирование белка (таблица 4). Полиморфизм m.T4639C относится к высококонсервативной области и происходит в гаплогруппе M22 (таблица 2), а также относится к кодону, описанному в LHON.

В LHON полиморфизм в этом кодоне относится к позиции млекопитающих 4640 и замещается изолейцин метионином (p.I57M) (Volod’ko et al., 2006; Pereira et al., 2011). Следует отметить, что замещение изолейцина на них изменяет процент второй спирали до 2,91 с 12,89 (таблица 3). Переход в положение мтДНК 4888 на MT-ND2 происходил как в опухолевых клетках, так и в крови, поэтому его следует рассматривать как полиморфизм (табл. 2). Полиморфизм до сих пор не описан в литературе и отсутствует в базе данных. Это приводит к превращению полярного лейцина в неполярный серин, и эволюционный анализ кодирующих SNPs subPSEC был меньше -3 (таблица 4), что указывает на то, что полиморфизм неравнодушен к функционированию белка.

Полиморфизм m.C3992T относительно редок в общей популяции и при связывании с митохондриальными гаплогруппами H, T, L (таблица 2) оказался мутацией при раке щитовидной железы (Maximo et al., 2002; Brandon et al., 2006) , В настоящее время мы знаем гены и области мтДНК, в которых полиморфизмы и мутации связаны с аналогичными видами рака в соответствующих тканях человека и собак (Ślaska et al., 2013). В разных типах опухолей у собак, в том числе грудного, существует ряд полиморфизмов, описанных в области D-петли, MT-CYTB, MT-COI и MT-ND1-ген, и миссенс-мутация в эпителиомой glandulae sebacei, приводящая к изменение аминокислоты p.T193N приводит к изменению MT-ND1 (Slaska et al., 2013a, b). Гетероплазматические изменения были обнаружены в MT-ND1 и MT-CYTB в эпителиомой glandulae sebacei и в MT-CYTB в центробластике лимфомы (Slaska et al., 2013).

Из пяти обнаруженных двух мутаций в литературе не сообщалось. Мутация m.A3796G (приводящая к изменению аминокислоты p.T164A), которая присутствует в литературе, была описана во взрослой дистонии (Simon et al., 2003; Mitchell et al., 2006). Модифицированная мутация m.G4580A была описана в раковых клетках поджелудочной железы (Jones et al., 2001). И мутация m.C4987G (приводящая к изменению аминокислоты p.T173S), так и m.T10173C (приводящая к изменению аминокислоты p.C39R) относятся к высококонсервативным аминокислотам. Мутация m.C4987G наблюдалась у десяти пациентов (табл. 2). В литературе описывается мутация в кодоне 173. Они были связаны с положением 4986. Эта мутация вызвала замещение треонина аланином. В клетках кишечных склепов (Taylor et al., 2003) и в случае рака полости рта — пролин (Tan et al., 2004).

Мутация m.T14166C (приводящая к изменению аминокислоты p.I70V) была описана в нейрогастроинтестинальной митохондриальной энцефаломиопатии (MNGIE) (Nishigaki et al., 2003). MNGIE — аутосомно-рецессивное расстройство, вызванное мутациями потери функции в гене, кодирующем тимидинфосфорилазу. Все изменения, обнаруженные в нашем исследовании, были гомоплазматическими (таблица 2). В случае изменений в опухолях нам часто приходится иметь дело с гомоплазией. В результате внутримитохондного отбора доминирование одного типа мтДНК происходит в митохондрии, так называемом функциональном преимуществе (Augenlicht and Heerdt 2001; Jones et al., 2001; Grzybowska-Szatkowska и Slaska 2012a). Во время клеточного деления клетка стремится к получению распространенности одного типа мРНК (гомоплазма — репликативная сегрегация) (Augenlicht and Heerdt 2001; Jones et al., 2001; Grzybowska-Szatkowska and Slaska 2012a).

Период, необходимый для репликации сегрегации, будет соответствовать фазе неопластической трансформации. Гомоплазма может также возникать в результате случайной сегрегации митохондрий во время деления клеток (Coller et al., 2001). В последующих поколениях клеток-предшественников гетероплазма может сохраняться или генетическим дрейфом может иметь место гомоплазма (Coller et al., 2001; Jones et al., 2001).

В результате генетического дрейфа происходит устранение или стабилизация редких вариантов мтДНК. Похоже, что это может быть причиной канцерогенеза. Возникновение и тяжесть симптомов при митохондриальных заболеваниях зависит от соотношения между нормальной и мутантной ДНК. Преобладание мутантной мтДНК в клетке приводит к нарушениям в производстве энергии в процессе окислительного фосфорилирования, что может привести к повреждению клеток и тканей. Клинические проявления этих нарушений зависят от типа дефектов в митохондриальной ДНК и от степени чувствительности расстройств гетероплазматической ткани, связанных с клеточным дыханием. Когда есть преимущество мутантной мтДНК, возникают симптомы, прогрессивные по характеру.

Мутации в генах митохондриальных белков вызывают широкий спектр симптомов. Изменения мтДНК накапливаются с возрастом из-за длительного воздействия свободных радикалов, генерируемых в митохондриях (Liu et al., 1998; Czarnecka and Bartnik 2011). Отсроченное начало и прогрессирующий характер митохондриальных заболеваний указывают на прогрессирующее ухудшение с возрастом в функции митохондрий (Liu et al., 1998). Вот почему некоторые митохондриальные заболевания встречаются в среднем или старости (Brown et al., 1992; Lyamzaev et al., 2004).

В исследуемом материале мы обнаружили полиморфизмы, возникающие у пациентов с синдромом LHON и при дистонии у взрослых. На этапе клинического выявления рак имеет объем около 1 см3 и содержит 109 клеток. Среднее время доклинической фазы длится от 15 до 20 лет или намного дольше, даже 50 лет. Это ставит вопрос о том, являются ли мутации, присутствующие в митохондриальной ДНК, первичными по отношению к раку или являются результатом произведенных изменений и процессов, происходящих во время канцерогенеза. Их первоначальный характер обозначается их раскрытием в виде клинических признаков после длительного периода (при достижении распространенности мутантной мтДНК) и медленной прогрессирующей природы симптомов, как это имеет место с митохондриальными заболеваниями.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *