Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генерация и функциональная характеристика слитого белка антитела против трансферинового рецептора — GAL4 (TfRscFv-GAL4)

Generation and functional characterization of the anti-transferrin receptor single-chain antibody-GAL4 (TfRscFv-GAL4) fusion protein
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3560209/

Разработка векторов для доставки клеток, специфичных для клеток, является основной целью генной терапевтической стратегии. Рецептор трансферрина (TfR) является эндоцитарным рецептором и идентифицирован как относительный по отношению к опухоли из-за его избыточной экспрессии на большинстве опухолевых клеток или тканей, а TfR связывается и поглощает комплекс трансферрин-железо. Ранее мы генерировали одноцепочечные вариабельные фрагменты анти-TfR иммуноглобулина (scFv), которые были клонированы из гибридомы, продуцирующего антитело против TfR, связанного с 20-а-длинной линкерной последовательностью (G4S) 4. В настоящем исследовании одноцепочечное антитело против TfR (TfRscFv) сливалось с ДНК-связывающим доменом фактора транскрипции дрожжей GAL4. Ожидается, что рекомбинантный слитый белок, обозначенный как TfRscFv-GAL4, опосредует введение ДНК-белкового комплекса в целевые опухолевые клетки.

Слитый белок TfRscFv-GAL4 экспрессировали в бактериальной экспрессирующей системе E.coli и извлекали из тел включения с последующей очисткой с помощью хроматографии на основе хелата. Полученные белки были преимущественно мономерными и после рефолдинга становились растворимым биологически активным бифункциональным белком. В биологических анализах антигенсвязывающая активность белка re-natured, TfRscFv-GAL4, была подтверждена специфическим связыванием с различными раковыми клетками и опухолевыми тканями. Скорости связывания клеток, как показывает анализ проточной цитометрии (FCM), варьировали от 54,11% до 8,23% в семи различных клеточных линиях карциномы человека. Он показал сходную аффинность и связывающую способность, как у родительских полноразмерных мышиных анти-TfR-антител. Положительные скорости связывания с опухолевыми тканями с помощью анализов тканевых микрочипов (ТМА) составляли 75,32% и 63,25%, но он показал слабое связывание с печеночной тканью в 5 случаях и нормальные ткани, такие как сердце, селезенка, кровеносный сосуд коры надпочечников и желудок. Кроме того, повторно используемый гибридный белок TfRscFv-GAL4 использовался в ELISA с кроличьим анти-GAL4-антителом. Функциональный анализ GAL4-ДНК посредством комплементарного конъюгации GAL4 с плазмидой GAL4rec-GFP-pGes для проверки активности GLA4 и GAL4-признанных функций специфичности. Он также показывает, что комплекс, TfRscFv-GAL4-GAL4rec-GFP-pGes, может быть взят в эндохилема, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP) с эффективностью трансфекции от 8 до 10 раз.

Результаты нашего исследования показали, что биофунциативность генетически модифицированного слитого белка TfRscFv-GAL4 была сохранена, так как слитый белок мог переносить плазмиду GAL4rec-pGes и связывать TfR с опухолевыми клетками. Этот продукт способен трансфицировать клетки-мишени эффективно иммуно-специфическим образом, что приводит к экспрессии переходных генов. Этот белок, который может применяться в качестве эффективной терапевтической и диагностической доставки опухоли с использованием эндогенной транспортной системы с потенциальной широко распространенной полезностью.

Разработка эффективных и нетоксичных векторов для доставки клеток, специфичных для клеток, является серьезной проблемой в терапевтических исследованиях генов. Значительный прогресс был достигнут в создании невирусных векторов, которые сочетают различные функции, необходимые для переноса генов в искусственном комплексе, поскольку потенциальные преимущества такой системы включают в себя простоту использования, экономически эффективное крупномасштабное производство, чистоту, однородности, а также меньших и более четко определенных проблем регулирования
[1,2]. Однако альтернативные подходы, основанные на активности природных или рекомбинантных белков-носителей ДНК для достижения поглощения и внутриклеточной доставки плазмидной ДНК, не были разработаны.

Перцеприн (Tf) играет важную роль в поглощении клеточного железа. Как только Tf связывается с рецептором трансферрина (TfR, CD71) на поверхности клетки, его вводят в эндосому в кислом состоянии. Во время этого процесса железо выделяется и комплексы TfR-apo-Tf затем снова циркулируют в клеточной поверхности. При диссоциации TfR apo-Tf снова восстанавливает способность связывания с железом. TfR представляет собой клеточный мембранный гликопротеин, участвующий в клеточном поглощении железа и в регуляции роста клеток
[3], и он предпочтительно экспрессируется в клетках с высоким потенциалом для пролиферации. Следовательно, замечательная и стабильная экспрессия TfR может быть обнаружена в различных опухолевых клетках, таких как клетки карциномы гепатомы и клетки лейкемии
[4-7]. Учитывая его обилие в злокачественных тканях и его значимость в поглощении клеточного железа, TfR может поэтому использоваться в качестве биомаркера для опухолевых клеток в дополнение к его значимости в отношении рака и его внеклеточной доступности. Эти характеристики также делают TfR превосходным антигеном для лечения рака на основе антител
[8]. Действительно, многие TfR-специфичные антитела (mAb) были разработаны и использованы для уничтожения злокачественных клеток in vitro и in vivo [9-11]. Ранее мы успешно разработали несколько антител против TfR, включая химерное антитело человека-мышь, внутриклеточное антитело и двухвалентное одноцепочечное вариабельное фрагментное (bsFv) антитело
[6,12-14]. Все эти антитела проявляли опухолеспецифическое биораспределение с существенной противоопухолевой активностью. Мы также использовали систему доставки трансферрин-полиэтиленимин (Tf-PEI) для переноса HR-1α-shRNAs в отдаленные опухоли. Наши исследования показали, что опосредуемый TfR эндоцитоз может индуцировать глушение HIF-1α и приводить к нарушению роста кенографа меланомы in vivo [15]. Вместе эти исследования подтверждают возможность того, что антитела, специфичные для TfR, могут быть использованы в качестве допустимого носителя генов для нацеливания на опухолевую терапию или диагностику. Однако, по сравнению со всем антителом или молекулой переноса, scFv имеет меньший размер для лучшего проникновения в опухолевые клетки. Действительно, низкомолекулярное одноцепочечное антитело может быть конъюгировано с различными терапевтическими или диагностическими молекулами для создания целевого комплекса. Кроме того, интернализованный TfR-комплекс может способствовать развитию опухолевой терапии или визуализации.

Ядерный белок GAL4 является положительным регулятором для выражений, индуцированных галактозой, таких как GAL1, GAL2, GAL7, GAL10 и MEL1
[16]. Ранее было показано, что высокое сродство хорошо охарактеризованного ДНК-связывания GAL4 сохраняется при размещении в контексте гетерологичного партнера по слиянию или используется для усиления доставки гена посредством конъюгации лиганда и других катионных полимеров
[1,2,17]. GAL4 обладает высокой аффинностью связывания для конкретной олигонуклеотидной последовательности 17 п.о. (5′-cggrnnrcynyncnccg-3 ‘, GAL4rec) и действует как сигнал ядерной локализации (NLS)
[18]. Самое главное, его специфический ДНК-связывающий домен (DBD) может связываться с плазмидой, содержащей ген против опухолей или конкретный ген-мишень для визуализации. Эти свойства делают его хорошим кандидатом для использования в качестве средства переноса генов.

В настоящем исследовании мы разработали особенно привлекательный подход для доставки генов с использованием рекомбинантных белковых транспортных средств, который состоит из ДНК-связывающего мотива, слитого с связывающим клетку TfR-scFv. Белок TfRscFv-GAL4 имеет двойную функцию: специфическое связывание ДНК через GAL4-DBD и GAL4rec ДНК-плазмиды и внутриклеточную доставку ДНК-мишени посредством транспорта TfR-scFv. Эта система доставки ДНК, опосредованная слиянием TfRscFv-GAL4, эффективно трансдуцировала pGFP-плазмиду и индуцированную экспрессию GFP в клетках млекопитающих. Мы также изучили его возможности для применения доставки лекарств, нацеленных на опухоль, и визуализации in vivo.

Плазмиду для слитого белка TfRscFv-GAL4 конструировали, как описано. Анализ секвенсирования вставок, соответствующих точно заданным последовательностям генов в базе данных (веб-сайт:
http://www.ncbi.nlm.nh.gov/blast). Полноразмерная последовательность для кодирующей области TfRscFv-GAL4 была идентична последовательности NcoI-scFv-EcoRI-GAL4-NotI (рисунок
1).

Стратегия построения вектора транскариотической экспрессии TfRscFv-GAL4. В качестве основы использовался вектор прокариотического экспрессии pET28-a, тяжелая цепь (VH) и легкая цепь (VL) ScFv были связаны с линкером (VH-линкер-VL), His-тегом домена связывания ДНК GAL4 (GAL4-DBD) сливали с 3′-концом VH-линкер-VL-последовательности, чтобы экспрессировать тег, конъюгированный с С-терминалом одноцепочечного антитела. Целую последовательность клонировали в сайт рестрикции NcoI-NotI, чтобы получить вектор прокариотического экспрессии TfRscFv-GAL4-pET. Шаги, предпринятые при построении каждой плазмиды, подробно описаны в Методах.

Высокие уровни TfRscFv-GAL4 экспрессии были индуцированы в pET28 / TfRscFv-GAL4 трансформированной BL21 (DE3) E. coli после добавления 1 мМ IPTG. Определяли оптимальную температуру индукции 30 ° С, чтобы обеспечить максимальный уровень экспрессии белка, как показано на дорожке 2 на рисунке
2А. Большая часть слитого белка (~ 90%) оказалась не растворимой, а содержащейся в телах включения. Следовательно, TfRscFv-GAL4, содержащий His-метку, очищали от тел включения, как описано в «Методах». Как показано на рисунке
2B, слитый белок TfRscFv-GAL4 затем очищали от клеточных лизатов в денатурирующих условиях с использованием колонки Ni-NTA и повторно подвергали диализу с градиентом мочевины. SDS-PAGE продемонстрировала единственную полосу повторно сложенного и очищенного слитого белка с приблизительной молекулярной массой 45 ~ 66,2 кДа в соответствии с ожидаемой молекулярной массой (46,7 кДа) для рекомбинантного слитого белка, а также высшей экспрессией были отмечены через 6 часов после индукции IPTG при 30 ° C. Напротив, в BL21 E. coli не была обнаружена реактивная полоса, трансформированная пустым вектором (рис.
2B). Концентрация повторного белка составляла 1,7 мг / мл, как было определено с помощью анализа белка BCA.

Экспрессия и очистка слитого белка TfRscFv-GAL4. A, SDS-PAGE, показывающий уровни слитого белка, присутствующие в телах включения после индукции IPTG при различной температуре. BL21 E.coli трансформировали плазмидой TfRscFv-GAL4-pET, и экспрессия гена была показана, что экстракт включенных органов после IPTG индуцировал 24 часа при 37 ° C (Lane1), 30 ° C (Lane2), 23 ° C (Lane3). Лейн М: маркер молекулярной массы белка. B, после того, как IPTG индуцирует 24 часа при 30 ° C в разное время, анализ вестерн-блоттинга слитый белок TfRscFv-GAL4, очищенный от тел включения IMAC, как показано в 0h (дорожка 1), 4h (дорожка 2), 6h (дорожка 3) , и BL21E.coli преобразован пустым вектором (дорожка 4). Наивысший уровень экспрессии белка составлял 6 ч после индукции.

Связывание TfRscFv-GAL4 с TfR изучали с помощью проточной цитометрии с использованием сверхэкспрессии TfR на линиях опухолевых клеток. Затем мы попытались определить антигенсвязывающую активность для слитого белка TfRscFv-GAL4 с различными опухолевыми клетками. Для этой цели был использован анализ проточной цитометрии. Было отмечено, что только группа TfRscFv-GAL4 (рисунок
3A, TfRscFv-GAL4) и положительные элементы управления (рис.
3A, Mouse anti-TfR) показали положительные результаты методом проточной цитометрии, в то время как отрицательные контрольные образцы не смогли обнаружить какие-либо положительные клетки (рис.
3A, мышиная группа IgG и группа GAL4). Как показано на рисунке
3B, скорость связывания для слитого белка TfRscFv-GAL4 с 7 различными опухолевыми клетками варьировалась от 8,23 до 54,11%, и была значительная разница в отношении скорости связывания между группой TfRscFv-GAL4 и отрицательной контрольной группой (p < 0.01). Он показал, что очищенный TfRscFv-GAL4 сохраняет свою иммунореактивность, сравнимую с таковой у родительского анти-TfR mAb.

Потоковая цитометрия продемонстрировала иммунореактивность TfRscFv-GAL4-TfR, экспрессируемую на поверхности различных опухолевых клеток. Клетки инкубировали с отрицательным контрольным мышиным неспецифическим IgG, моноклональным антителом мышиного против TfR с положительным контролем, слитым белком TfRscFv-GAL4 или антителом против GAL4 мыши, используемым для обнаружения домена GAL4, с последующим меченым FITC козьим антимышиной IgG. Доля FITC-положительной клетки во всей клетке была рассчитана, как показано в A. Статистические результаты показывают, что была значительная разница в скорости связывания между группой TfRscFv-GAL4 и отрицательными контрольными группами, как показано в B (p <0,01), эти результаты являются представителями четырех исследований, которые были сделаны.

Согласно стандарту разделов TMA, описанных в «Методах», для секций TMA для рака желудка (всего 140 случаев), имеющимися случаями было 115 для группы слитых белков TfRscFv-GAL4, 95 для мышиной анти-TfR-группы антител, были 116 и 113 в мышиной анти-GAL4-группе антител и мышиной неспецифической IgG-группе, соответственно. Доступные коэффициенты составили 85%, 70%, 85% и 83% соответственно. Для секретов TMA для рака желудка положительные отношения составляли 75,32%, 78,46%, 0% и 0% соответственно (рисунок
4A, C, E и G). Для двух разделов TMA для рака молочной железы (всего 112 случаев) имелись случаи, соответственно, 110, 108, 109 и 108; доступные коэффициенты составили 98%, 96%, 97% и 96% соответственно. Для двух разделов TMA для рака молочной железы положительные отношения составляли 63,25%, 64,57%, 0% и 0% соответственно (рисунок
4B, D, F и H). Доступные соотношения и положительные отношения для разделов TMA были показаны в таблице
1. Существовала значительная разница для положительного отношения между группой TfRscFv-GAL4 и отрицательной контрольной группой (мышиная группа против GAL4 и неспецифическая IgG-группа мыши) (p <0,01).

Связывающая активность слитого белка TfRscFv-GAL4 с раком желудка и раком молочной железы в TMA. 140 ткани рака желудка и 112 тканей рака молочной железы были помещены в ТМА, рассечены на 5 мкм и помещены на один предмет слайда для создания участков микрочипов ткани, для связывания с участками TMA (SP: × 400) AB были использованы одноцепочечные антитела TfRscFv-GAL4 , Мышиное антитело против GAL4 использовали для связывания одноцепочечного антитела, конъюгированного с HRP козьи антимышиного антитела и DAB использовали для обнаружения экспрессии белка TfR. В качестве положительного контроля (SP: × 400) C-D использовали антитело против TfR родительской мыши. Типичные результаты иммуногистологии положительной связывающей активности с опухолевыми тканями показаны в A-D (SP: × 400). Оба антитела против GLA4 и нормальный мышиный IgG использовали в качестве отрицательного контроля, были типичными результатами иммуногистологии отрицательной связывающей активности с опухолевыми тканями (SP: × 400) E-H. Таблица
1 показаны статистические данные всех тканей в результатах иммуногистологии.

Результаты окрашивания и положительная скорость различной опухоли TMA

В отличие от нормальных участков ткани, только 5 случаев печени для нормальных участков ткани были слабо положительными для группы слитых белков TfRscFv-GAL4 и мышиной анти-TfR-группы антител, тогда как другие ткани, включая сердце, селезенку, кость надпочечников, кровеносные сосуды и желудок были отрицательными для обеих групп (рис.
5A-F). Следует отметить, что все нормальные участки ткани были отрицательными для мышиной группы против GAL4 и мышиной неспецифической IgG-группы.

Связывающая активность слитого белка TfRscFv-GAL4 с нормальными тканями. Нормальное тканевое сердце (A), печень (B), селезенка (C), коре надпочечников (D), кровеносный сосуд (E) и желудок (F) рассекали до 5 мкм для создания тканевых слайдов, тестировали 10 отдельных образцов для каждого ткань. Одноцепочечное антитело TfRscFv-GAL4 использовалось для определения экспрессии TfR, используя антитело против TfR для мыши в качестве положительного контроля. Типичные результаты каждой ткани были указаны в A-F (SP: × 400).

Для измерения активности связывания домена GAL4 для очищенного слитого белка TfRscFv-GAL4 мы провели анализ ELISA. Результаты показали, что слитый белок TfRscFv-GAL4 и белок GAL4 связываются с антителом против GAL4 кролика, покрытым на поверхности микротитровальной пластины дозозависимым образом. Кроме того, значение OD495 увеличивалось с параллельным увеличением концентрации белка (0,078-10 мкг / мл), как показано на рисунке
6. Таким образом, часть GAL4 среди слитого белка TfRscFv-GAL4 сохраняла свою высокую авидность для связывания с кроличьим анти-GAL4-антителом, и он предположил, что повторная натурация слитого белка не ухудшает активность GLA4.

Обнаружение ДНК-связывающего домена GAL4 в TfRscFv-GAL4 с помощью ELISA. TfRscFv-GAL4 покрывали 96-луночными планшетами с разной концентрацией, белок GAL4 использовали положительный контроль. Поглощение OD495 нм было использовано для обнаружения желтых продуктов OPD, подвергнутых воздействию HRP.

Способность связывания белка с ДНК использовалась для оценки биологической активности GLA4 в слитом белке TfRscFv-GAL4. При наличии надлежащего конъюгирующего состояния очищенный белок затем добавляли к плазмидам с различной концентрацией для образования комплекса белок-ДНК, которые анализировали электрофорезом на 4,5% -ном градиенте естественного (не SDS) PAGE с последующим западным анализом, его показало, что только одна белковая полоса может быть замечена, но перемещенная полоса белка была дозозависимой с добавлением ДНК-плазмид с оптимальным молярным отношением белка к плазмиде составила 1: 2,5 (данные не показаны). Эти конститутивные белки также служили основой для сравнения активности слитого белка. Поток цитометрии использовали для анализа эффективности трансфекции комплекса белка-ДНК, опосредованного частью TfRscFv. После 48-часовой инкубации экспрессия репортерного гена GFP была обнаружена в (43,0 ± 1,85)% клеток HepG-2, которые были трансфицированы плазмидой экспрессии млекопитающих GAL4rec-GFP-pGes в комплексной группе (TfRscFv-GAL4 + GAL4rec-GFP-pGes), в (5,2 ± 0,23)% и (1,7 ± 0,18)% клеток, трансфицированных контролем, и в (3,9 ± 0,34)%, трансфицированных голой ДНК-плазмидой. Это указывало на то, что эндоцитоз TfRscFv-нацеленного комплекса к опухолевым клеткам был значительно выше, чем эндоцитоз, не содержащий TfRscFv в качестве молекулы-мишени. Кроме того,
7 в столбцах B, D, F и G также иллюстрирует, что способность TfRscFv-GAL4 опосредовать перенос плазмиды экспрессии GAL4rec-GFP-pGes в клетки HepG2 по сравнению с плазмидой GFP-pGes без GLA4, только TfRscFv не обнаруживает никакой ДНК что связывающая способность ДНК TfRscFv-GAL4 была строго функцией компонента GAL4.

Эффективность трансфекции различных комплексов в клетках HepG-2, определенных методом FCM Analysis. Во-первых, 1 × 105 клеток в 6-луночных планшетах подвергали воздействию комплекса белка-ДНК с молярным соотношением 1: 2,5 (белок к ДНК) с или без слитого белка, а затем их дополнительно инкубировали в течение 48 часов. Для проточной цитометрии клетки HepG-2 после трансфекции pCMV-GFP промывали, трипсинизировали и количественно определяли с использованием машины FACS, как описано в материалах и методах. Данные выражаются как относительный процент клеток GFP-экспрессии / суммарных клеток (среднее ± стандартное отклонение, полученное из трех повторных лунок). Колонки представляли эффективность трансфекции в различных комплексных группах: (5,2 ± 0,23)% для столбца A (1,7 ± 0,18)% для столбца B (43,0 ± 1,85)% для столбца C (2,9 ± 0,23)% для столбца D, (3,8 ± 0,32)% для столбца E (2,5 ± 0,15)% для столбца F (3,9 ± 0,34)% для столбца G (3,1 ± 0,26)% для столбца H. Эксперименты повторяли 3 раза с аналогичными результатами. Столбец C показал 8-10 раз выше, чем другие столбцы эффективности трансфекции (* p <0,01).

Недавно невирусные векторы подвергаются интенсивному исследованию в качестве более безопасной альтернативы генной терапии. Для успешной доставки эффективный и специфический таргетинг активного агента на желаемый сайт является критическим фактором для преодоления многих барьеров для переноса ДНК на ядерную локализацию и транскрипцию
[19]. Некоторые из наиболее распространенных невирусных векторов включают полиэтиленимин, дендримеры, хитозан, полилизин и многие типы пептидов, которые обычно являются катионными по своей природе и способны взаимодействовать с плазмидной ДНК посредством электростатических взаимодействий
[20]. Пептидные векторы выгодны по сравнению с другими невирусными стратегиями в том отношении, что присоединение пептидного лиганда к полиплексу позволит нацеливаться на специфические рецепторы и / или конкретные типы клеток, особенно в раковых клетках
[21]. Однако важным недостатком процедуры химической связи является трудность создания воспроизводимого и гомогенного продукта. Генетическая инженерия обеспечивает альтернативный подход для крупномасштабного производства гомогенных белков слитого белка Ab-GLA4.

Предыдущие исследования последовательно предполагали, что TfR экспрессируется более обильно в злокачественных тканях, чем в их здоровых аналогах
[3-8]. Аналогично, уровни сыворотки для растворимого рецептора трансферрина (sTfR) у пациентов с гепатомой и гематологическими злокачественными новообразованиями значительно увеличиваются по сравнению с уровнями нормального контроля
[22]. Введение анти-TfR-антител подавляло рост опухолевых клеток in vitro [23]. Самое главное, что TfR служил эндоцитотическим рецептором, который мог переносить вектор для поглощения опухолевыми клетками
[24]. Исходя из этих данных, антитело против TfR теперь рассматривается как альтернатива диагностике путем локализации визуализации и для лечения, нацеленного на опухоли
[9,25-30]. TfR-специфичные моноклональные или химерные антитела (mAb) были разработаны и использованы в качестве альтернативного терапевтического подхода для уничтожения злокачественных клеток как in vitro, так и in vivo [31-33]. Несмотря на многообещающий подход, этот подход требует создания уникальных химерных молекул для каждого конкретного применения или неспособности проникать в ткани для высокой массы молекулы полного человеческого химерного антитела TfR. Таким образом, он также сталкивается с огромной проблемой, которая иногда может привести к снижению активности или потере активности одного или обоих ковалентно сопряженных партнеров. Поэтому для преодоления этих ограничений желательно разработать универсальную систему доставки, которая устраняет необходимость в конкретной конструкции для каждого отдельного приложения.

Одноцепочечное антитело обладает свойством интегрироваться с различными белками для получения некоторых векторов, нацеливающих опухоль (например, комплекс, сконструированный методом химической связи или слитым белком, сконструированным методом генной инженерии). Другой важной особенностью одноцепочечного антитела является низкомолекулярный (около 27 кДа, 1/3 химерного антитела), что делает его с повышенной способностью проникать в ткани и клетки. Если TfRscFv вставляется в вектор экспрессии эукариоцитов, вектор будет гораздо более эффективно вводиться злокачественными клетками. TfRscFv может быть экспрессирован в опухолевых клетках вектором. Используя этот подход, эффективность лечения рака значительно улучшилась и дозировка противоопухолевых препаратов также может быть уменьшена
[34,35].

GAL4 представляет собой 881-аминокислотный белок с ДНК-связывающим доменом двуядерного кластера типа Zn-Cys, который является положительным регулятором для экспрессии гена, индуцированного галактозой
[36]. ДНК-связывающий домен может специфически связываться с мотивом распознавания последовательности 17bp (GAL4rec). Предыдущие исследования показали, что слитый белок GAL4 / Inv может использоваться в системе доставки ДНК для нацеливания на опухолевые клетки
[2]. Следовательно, GAL4 можно использовать в качестве носителя для плазмиды, содержащей последовательность гена GAL4rec.

В текущем исследовании мы сгенерировали и характеризовали бифункционально активную слияние TfRscFv-GAL4, полученную из плазмиды pUC19 и pABgal4. TfRscFv-GAL4 с гексагистидиновыми остатками на N-конце экспрессировали в E.coli и извлекали из тел включения с последующим применением аффинной хроматографии на основе хелата. Слитый белок, описанный в настоящем исследовании, является первым примером рекомбинантных одноцепочечных одновалентных антител TfR с ДНК-связывающей активностью GAL4, продуцируемой в прокариотической экспрессирующей системе, тогда как любой составляющий компонент рекомбинантного белка проявляет индивидуальную активность с помощью следующих анализов.

Анализ FCM показал, что слитый белок TfRscFv-GAL4 способен связываться с опухолевыми клетками, иммунная реактивность которых соответствует родительскому анти-TfR-моноклональному антителу. Поэтому наши исследования дали прямые доказательства того, что слитый белок TfRscFv -GAL4 вместо белка GAL4 может связываться с различными опухолевыми клетками. Мы также обнаружили, что скорость связывания слитого белка TfRscFv-GAL4 с семью различными линиями опухолевых клеток варьировала от 8,23% до 54,11%. Различия в отношении скорости связывания могут объяснять, что TfR обнаруживается преимущественно на стадии пролиферации или дифференцировки этих клеток, а не на стадии G0, что согласуется с результатами Crepin R et al.
[37] и наши собственные результаты ранее
[12]. Анализ ELISA показал, что слитый белок TfRscFv-GAL4 может связываться с антителом против GAL4. Таким образом, он показал, что слитый белок сохраняет активность GLA4 и может также служить маркером для оценки способности связывания TfRscFv с опухолевыми клетками. Используя антитело мыши против GAL4 и меченого FITC антимышиного антитела, для определения связывающей способности слитого белка с клетками, экспрессирующими TfR, применяли FCM-анализ. Аналогичным образом, антитело против мышиного HRP-меченого можно использовать для обнаружения связывающей способности слитого белка с тканями посредством анализа TMA. Иммуногистохимические исследования в TMA показали, что слитый белок TfRscFv-GAL4 и моноклональное антитело против TfR мыши могут связываться с раковыми клетками желудка, а также с клетками рака молочной железы. При резком контрасте ни белок GAL4, ни мышиный неспецифический IgG не проявляли такую ​​связывающую активность, что указывало на то, что связывающий белок TfRscFv-GAL4, связывающийся с клетками рака желудка человека и клетками рака молочной железы человека, осуществляется через домен TfRscFv, но не с доменом белка GAL4. Кроме того, за исключением 5 нормальных тканей печени с еженедельной связывающей активностью, слитый белок TfRscFv-GAL4 и антитело против TfR мыши не проявили никакой активности связывания с нормальными тканями, что указывает на то, что слитый белок TfRscFv-GAL4 относительно специфичен для опухолевых тканей.

Мы разработали ДНК-связывающий функциональный анализ для дальнейшего определения функции слитого белка. После конъюгирования TfRscFv-GAL4 с плазмидой GAL4rec-pGes, которая была сконструирована так, чтобы включать определенную длинную последовательность в восходящую активирующую последовательность (5′-cggrnnccynyncnccg-3 ‘, GAL4rec) и репортерный ген GFP, комплекс белка-ДНК, инкубированный с печеночной карциномой клеток HepG2 и экспрессия GFP в клетках была обнаружена флуоресцентной микроскопией. Клетки, обработанные сложным TfRscFv-GAL4-GAL4rec-GFP-pGes, показали сильный сигнал флуоресценции, но клетки, обработанные GAL4, не имеющие TfRscFv, или те, которые были обработаны TfRscFv без части GLA4 или одна голой ДНК, почти не флуоресцировали. Эти данные показали, что этот процесс был фактически распознаванием ДНК GLA4 и затем опосредовано посредством присоединения scFv к рецептору трансферрина на опухолевые клетки, а слитый белок обладает уникальной способностью опосредовать перенос гена. Взятые вместе, эта белковая ДНК может рассматриваться как перспективный кандидат на разработку новой доставки гена-опухоли, направленной на системную генную терапию различных раковых заболеваний человека.

Мы создали новый носитель для доставки ДНК, содержащий одноцепочечный вариабельный фрагмент рецептора антитрансферинового рецептора (TfRscFv) и ДНК-связывающего ДНК GLA (GAL4-DBD). GAL4-DBD способен связывать ДНК, содержащую ее специфическую связывающую последовательность, и TfRscFv связывание TfR с опухолевыми клетками может поглощать опухолевые клетки через клеточные мембраны для доставки ДНК. Этот подход предполагал ковалентно конъюгировать слитый белок TfRscFv-GAL4 с плазмидой через GAL4 на 3′-конце белка, распознающего GAL4rec на трансфецированной плазмиде (GAL4rec-GFP-pGes). Наши результаты показали, что этот рекомбинантный белок не ухудшает иммунологическую активность или нацеливающую способность TfRscFv, а также функциональную авидность GLA4, распознающую последовательность GAL4rec. TfRscFv-GAL4 нацеливал комплекс белка-ДНК на опухолевые клетки и повышал эффективность трансфекции in vitro, но он не проявлял активности связывания нормальных тканей. Потенциальная полезность и привлекательность этой доставки гена пептида заключается в его интернализации, способности контролировать природу его составных частей и простоте генерации. Вкратце, это исследование послужило основой для применений TfRscFv-GAL4 ориентации, трассировки, визуализации и целенаправленной терапии опухолей.

Все линии раковых клеток, такие как HepG-2 (клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы), HeLa (клеточная линия карциномы человека), MCF-7 (клеточная линия рака молочной железы человека), SLC-89 (клеточная линия аденокарциномы легких человека), MDA-MB -231 (линия клеток рака молочной железы), HL-60 (клетки промиелоцитарной лейкемии человека) и MKN-28 (линия клеток рака желудка) были приобретены у ATCC. Они хранились в нашей лаборатории и культивировались с базальной средой DMEM (GIBCO, США) или RPMI 1640 (GIBCO, США), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (GIBCO, США) при 37 ° C с 5% CO2. Для трансфекции 1 × 105 клеток изначально высевали в 1 мл среды в 12-луночные планшеты для культивирования и трансфецировали при 80% слияния.

Фрагмент для кДНК TfRscFv непосредственно амплифицировали с помощью ПЦР с использованием амплимеров 5′-CGGCCATGGCCCACGTTCAGCTGCAGCAGT-3 ‘и 5′-GGCGGAATTCTTTGATTTCCAGCTTGGTC-3′ из плазмиды pUC19, содержащей последовательность TfRscFv, как описано ранее
[12]. Фрагмент для GAL4 был высвобожден из плазмиды pABgal4 (любезно предоставленной доктором Бертом У. Малли, Медицинским колледжем Бейлора, Хьюстон, штат Техас) путем переваривания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и NotI (Thermo Scientific Fermentas). Использовали амплимеры: 5’-CCG-GTATGGCTAGCCTGCAGAAGCTACTGTCTTCTATCG-3 ‘и 5′-GAGCCGACCGGTACCTCAACTTACAGTCAACTGTC-3’. Оба фрагмента для TfRscFv и GAL4 вводили путем лигирования в вектор экспрессии pET28a (+) на сайте рестрикции NcoI и NotI соответственно. В полученной конструкции pET28a (+) гексагистидиновая последовательность была слита в рамке с ДНК-связывающим доменом GAL4 с последующей гибкой пептидной линкерной последовательностью (GGGGS) 3 и карбоксиконцевыми 228 аминокислотами TfRscFv (фиг.
1). Полученную плазмиду для прокариотической экспрессии обозначали как TfRscFv-GAL4-pET, которая затем трансфицировали в штамм E.coli BL21 (DE3) для приготовления плазмидной ДНК. Вставленные последовательности подтверждали расщеплением рестрикционным ферментом электрофорезом в агарозном геле и секвенированием ДНК с использованием ДНК-секвенсора ABI PRISM ® 377.

E. coli BL21, несущую плазмиду TfRscFv-GAL4-pET, выращивали при температуре A600 0,5-0,7 в течение ночи. Аликвоту по 0,5 мл инокулята добавляли к 20 мл среды Luria-Bertani (LB), содержащей 25 мкг / мл ампициллина и 50 мМ глюкозы (LBG). Синтез рекомбинантного слитого белка TfRscFv-GAL4 индуцировали 1,0 мМ IPTG (изопропил-β-D-тиогалакто-пиранозид) (Thermo Scientific Fermentas). После 6 ч инкубации при разных температурах 23 ° С, 30 ° С, 37 ° С клетки собирали центрифугированием при 5000 г в течение 10 мин при 4 ° С. Клеточные гранулы замораживали при -20 ° С и ресуспендировали в буфере для лизиса (6 М гуанидин-HCl, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,8, 500 мМ хлорида натрия), обрабатывали ультразвуком 3 × и 0,45 мкм для удаления нерастворимых обломков. Экстракт тел включения анализировали 12,5% полиакриламидным гель-электрофорезом (SDS-PAGE) в восстановительных условиях, описанных ранее
[2,12]. Поскольку векторы экспрессии TfRscFv-GAL4-pET вводят хвост (His) 6 на С-конце рекомбинантного TfRscFv-GAL4, солюбилизированный слитый белок очищают с помощью иммобилизованной аффинной хроматографии на основе металла (IMAC) путем связывания His-метки с Ni2 + -нитрилотриацетата (Ni-NTA) агарозы (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом изготовителя, как описано выше
[12,38] с незначительными изменениями. После того, как солюбилизированные тела включения пропускали через колонку, колонку промывали 10 объемами колонки 6М гуанидина, 0,1 М Трис-HCl (рН 7,0), а затем 10 объемов слоя 6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ имидазола и 20 объемов слоя 6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ имидазола. TfRscFv-GAL4 элюировали 20 мл (4 объема слоя) 6 М мочевины, 50 мМ Трис-HCl, 250 мМ имидазола и затем диализовали в ТЕА (0,4 М L-аргинин, 0,1 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, рН 7,0) в течение ночи. Оптимальные разведения определяли эмпирически, чтобы избежать агрегации во время рефолдинга. Повторная натурация белка основывалась на процедуре, разработанной для слитого белка GLA4
[39]. После диализа 60-75% повторного белка восстанавливали в растворимой фракции после центрифугирования. Концентрацию слитого белка рассчитывали с помощью анализа белка на основе бицинхониновой кислоты (BCA Protein Assay, Pierce, Rockford, IL) и плазмид pUC19, pABgal4 трансформировали E. coli BL21 для экспрессии белка в качестве контролей.

Лизаты E. coli BL21 и экстрагированные тела включения, которые были диализованы в TEA перед электрофорезом или очищены TfRscFv-GAL4, были разрешены в 12% SDS-PAGE (Bio-Rad) в восстановительных условиях для Вестерн-блоттинга. Анализ иммуноблота проводили с мышей mAb с эпитопом GLA4 (Sigma) в качестве первичного антитела, в качестве вторичного антитела к GLA4 использовали пероксидазу, помеченную коньютацией против мышиного IgG (Sigma), и результаты визуализировались с помощью DAB. Вестерн-блоттинг с человеческим TfR использовали для определения активности связывания очищенного TfRscFv-GAL4. TfR человека подвергали электрофорезу в SDS-PAGE и промокали, как описано выше. Мембрану последовательно инкубировали с TfRscFv-GAL4 (первичное антитело), ​​mAb GLA4, биотинилированным конъюгатом против мышиного IgG (вторичное антитело).

Антигенсвязывающую активность TfRscFv в слитом белке TfRscFv-GAL4 анализировали с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа, как описано выше
[12,38]. Вкратце, 2 × 105 клеток HepG-2, HeLa, MCF-7, HL-60, MDA-MB-231, MKN28 и SLC-89 собирали в логарифмической фазе. После промывания промывочным буфером (холодный PBS, 1% BSA, 1 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2) клетки инкубировали с TfRscFv-GAL4 в течение 20 мин при 4 ° С, затем обрабатывали антителом против GAL4 мыши и окрашивали козьим кошкам FITC антимышиный IgG. Затем клетки анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием программного пакета Cell Quest (Becton-Dickinson FACScalibur, США). Моноклональное антитело против TfR мыши использовали в качестве положительного контроля, в то время как белок GAL4 и мышиный неспецифический IgG использовали для контроля изотипа.

Образцы тканей, внедренные парафином, основаны на наличии резецированных тканей у 140 пациентов с раком желудка и 112 пациентов с раком молочной железы, которые были получены из архивов отдела патологии, медицинской школы Университета Цзянхан, больницы Тунцзи HUST и отдела патологии, медицины Школа Пекинского университета. Тканевые отделы, полученные из образцов аутопсии, таких как сердце, кровеносные сосуды, печень, кость надпочечников, селезенка и желудок, использовались в качестве нормального контроля (каждая ткань включала 5 случаев), которые были предоставлены Отделом патологии, Медицинской школы Университета Джиангэна и Больница Тунцзи. Фиксированные фиксированные в парафине тканевые блоки и соответствующие гистологические покрытые HE-слайды были наложены на выборку ткани TMA. Репрезентативные области опухолевых тканей были отмечены на слайдах. Инструмент для тканевой сортировки (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA) использовался для пробивки трех копий цилиндров диаметром 0,6 мм из выбранных областей рака отдельного донорского тканевого блока и повторного введения в парафиновый блок-реципиент в предопределенном положении , Затем из ткани TMA вырезали несколько участков (толщиной 5 мкм).

IHC использовали для измерения скоростей связывания Ag для слитого белка TfRscFv-GAL4 с различными участками TMA опухоли. Иммуногистохимическое исследование Ag-связывания проводили с использованием стандартного метода стрептавидин-пероксидазы, описанного ранее
[40]. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% H2O2 в течение 10 минут. Для получения антигена слайды погружали в 10 мМ цитратный буфер (рН 6,0) и кипятили в течение 15 минут в микроволновой печи. Неспецифическое связывание блокировалось 5% нормальной сывороткой козы в течение 10 минут. Слайды обрабатывали мышиным анти-GAL4-антителом после инкубации с TfRscFv-GAL4 против TfR, экспрессирующегося на TMA при 4 ° С в течение ночи во влажной камере с последующим инкубацией с меченым HRP козьим антимышиным IgG (Southern Biotechnology Associates, США) для 20 мин при 37 ° С, а затем конъюгатом стрептавидин-пероксидазы, каждый в течение 30 мин при комнатной температуре. В качестве положительного контроля использовали антитело против TfR для родительской мыши (Mouse anti-TfR group), а IgG-группа мыши и группа GAL4 использовали в качестве отрицательного контроля соответственно. ТМА окончательно окрашивали реагентами 3, 5-диаминобензидина (DAB) и инкубировали с гематоксилином для окрашивания ядер, и результаты оценивали под легким микроскопом. Для оценки окрашивания TMA использовался критерий полуколичественного скоринга, в котором была оценена как интенсивность окрашивания, так и положительный процент клеток. Индекс окрашивания (со значениями от 0 до 12) был получен как интенсивность окрашивания TfR (0 = отрицательный, 1 = слабо положительный, 2 = положительный, 3 = сильно положительный) раз доля иммуноположительных опухолевых клеток (0% = 0; <10% = 1; 10% ≤ до <50% = 2; 50% ≤ до <75% = 3; ≥75% = 4; обе кросс-продукты ≤1 оценивались как отрицательные и ≥2 как положительные Все гистологические оценки проводились двойным слепым методом двумя специалистами-патологами (DH и YQ).

Его использовали для анализа на основе ELISA для определения белковой активности домена GAL4 для слитого белка TfRscFv-GAL4 при связывании и не связанного с его специальным анти-GLA4-антителом. Вкратце, GAL4 или TfRscFv-GAL4 покрывали на 96-луночном планшете (100 мкл / лунку) при 4 ° С в течение ночи. После промывки PBS (содержащего 0,005% Tween-20) пластину блокировали в течение 2 ч при 37 ° С с последующей инкубацией с антителом против GAL4 кролика (0,1 мкг / мл, Invitrogen, США) в течение 2 ч при 37 ° С. Затем наносили HRP, помеченный козьим анти-кроличьим IgG (1: 5000, 100 мкл / лунку, Southern Biotechnology Associates, США) и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C. Свежеприготовленный раствор субстрата (100 мкл / лунку), наконец, добавляли и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, и результаты считывали с помощью фотометра с длиной волны 495 нм (TECAN, США) после применения стоп-раствора (50 мкл / лунку) для цвет развития. В качестве отрицательного контроля использовался обычный TfRscFv.

Комплекс белка-ДНК был получен до анализа связывания GAL4-ДНК. Экспрессирующие векторы млекопитающих GAL4rec-GFP-pGes (Shanghai BlueGene Biotech Co., Ltd. Shanghai, China), кодирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) с промотором цитомегаловируса человека (pCMV), получали лигированием консенсусной последовательности 17 п.о. (5 ‘-cggrnnrcynyncnccg-3’), распознающий GAL4. Полученные плазмиды, которые содержали восемь тандемных копий целевого олигонуклеотида и его последовательность, были идентифицированы нашей исследовательской группой ранее (неопубликованные данные), амплифицированы в штамме DH5 a E. coli и очищают в соответствии с EZNA®Plasmid Maxiprep Kit (OMEGA, США) и их концентрации измеряют с помощью УФ-счетчика (Gene Spec I, Japan).

Разбавления очищенного и повторного прироста TfRscFv-GAL4 в буфере повторной натуры были смешаны с плазмидной ДНК (плазмида GAL4rec-GFP-pGes или плазмида GFP-pGes) в общем объеме 20 мкл с различным отношением концентрации белка-ДНК между 0,5 до 10,0. Смеси конъюгировали в реакционной системе связывающего белок-ДНК буфера (25 мМ HEPES pH 7,6, 50 мМ KCL, 5 мМ MgCL2, 100 мкМ ZnCl2, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1% Nonidet P40, 10% глицерина, 200 мкг / мл BSA, 50 мкл / мл поли (dI-dC)) в течение 15 мин при 25 ° С. Раствор несколько раз перемешивали в течение 10 мин, осторожно инвертируя несколько раз, чтобы получить комплекс TfRscFv-GAL4 и GAL4rec-GFP-pGes. Затем для оценки оптимального молярного отношения белка к плазмиде использовали 4,5% -ный градиент (не SDS), а затем западный анализ, как 1: 2,5. В соответствии с протоколом комплексной трансфекции
[1], раковые клетки печени HepG-2 (5х105 / лунку) высевали в 12-луночные культуральные планшеты за 24 часа до трансфекции. Культуральную среду заменяли средой со свободным FBS RPMI-1640 до последовательного добавления 0,1 мл комплексов белка-ДНК TfRscFv-GAL4 и GAL4rec-GFP-pGes после инкубации в течение 5 часов в 5% СО2 при 37 ° С, 1 мл среды с 10% FBS и инкубировали в течение еще 48 ч. Альтернативно, очищенный белок GAL4, TfRscFv или векторный (GFP-pGes) комплекс в качестве различных контролей и забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) в качестве пустого контроля, соответственно. В день сбора клеток, трансфицированных pCMV-GFP, промывали PBS и трипсинизировали. Эффективность трансфекции оценивали путем подсчета процента клеток, экспрессирующих GFP, с использованием системы FACS Calibur (Becton-Dickinson). Эксперименты проводили в трех повторностях, и в каждом эксперименте подсчитывали 10 000 клеток.

Все результаты каждого эксперимента были выражены как среднее ± SEM с числом (n) наблюдений. Наборы данных сравнивались с анализом дисперсии (ANOVA) или t-критерием Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при P <0,01. Символы, используемые в рисунках, были (*) для P> 0,05 и NS без существенных различий. Все статистические тесты были выполнены с использованием GraphPad Prism версии 4.0 для Windows (программное обеспечение Graph Pad).

Материалы и методы нашего исследования были одобрены Комитетом по этике больницы Тунцзи Университета науки и технологии Хуачжун (HUST), Университета Джиангэна и Пекинского университета. Письменное информированное согласие было получено от каждого участвующего пациента (или опекуна пациента) до поступления в исследование. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

ZW, QY и HH разработали и провели исследование и составили рукопись. TL, JL, SZ помогли подготовить рукопись. XZ выполнил статистический анализ. ZH, CW, ZY и GS участвовали в его разработке и координации и помогли подготовить рукопись. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Мы благодарим доктора Чжан Цяна и Боба Ли (Школу медицины Северного университета Фейнберга) за письменную помощь и профессора Чун Ли (Калифорнийский университет в Ирвине) за пересмотр рукописи. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81173608 и № 81101944) и Программой научных исследований и разработок Hi-Tech в Китае (No.2012AA02A306 — P.L.) и Фондом семян HUST (No.2011JC038 до Z.H.W).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *