Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Установление и характеристика нового ксенотрансплантата рака молочной железы, полученного у женщины, несущей мутацию зародышевой линии BRCA2

Establishment and characterisation of a new breast cancer xenograft obtained from a woman carrying a germline BRCA2 mutation
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2967069/

Ген BRCA2 ответственен за большое количество наследственных раков молочной железы и яичников, а исследования биологических функций BRCA2 ограничены отсутствием моделей, которые напоминают особенности опухоли у пациента. Целью этого исследования было установить и охарактеризовать новый ксенотрансплантат карциномы молочной железы человека, полученный от женщины, несущей мутацию зародышевой BRCA2.

Трансплантируемый ксенотрансплантат был получен путем прививки образца рака молочной железы голым мышам. Биологические и генетические профили ксенотрансплантата сравнивали с биологической опухолью пациента с использованием гистологии, иммуногистохимии (IHC), секвенирования BRCA2, сравнительной геномной гибридизации (CGH) и qRT-PCR. Была оценена реакция опухоли на стандартные химиотерапии.

Гистологический профиль идентифицировал опухоль как базально-подобный трехкратно отрицательный рак молочной железы. Целевое выделение ДНК ККК22 ксенотрансплантата показало наличие мутации, ранее идентифицированной в носителе. Сравнительные профили геномной гибридизационной структуры первичной опухоли и ксенотрансплантата выявили большое количество подобных генетических изменений. Терапевтическая оценка ксенотрансплантата показала чувствительность к химиотерапии на основе антрациклина и устойчивость к доцетакселу. Ксенотрансплантат также был очень чувствителен к лучевой терапии и лечения на основе цисплатина.

В этом исследовании описывается новый ксенотрансплантат рака молочной железы человека, полученный от пациента с мутацией BRCA2. Этот ксенотрансплантат представляет собой новую модель для доклинического развития лекарств и изучения биологической основы ответа на лекарственные средства.

Мутации Germline BRCA2 у женщин-носителей приносят кумулятивный риск рака молочной железы в возрасте 70 лет 49% (95% ДИ: 40-57%), риск рака яичников составляет 18% (95% ДИ: 13-23%) и умеренный повышенный риск развития рака поджелудочной железы (Chen and Parmigiani, 2007).

Хотя имеющихся доказательств недостаточно для решительного заключения о том, что клинический результат женщин с раком молочной железы BRCA1 / 2 значительно отличается от таковых у женщин со спорадическими опухолями, связанный с BRCA1 рак молочной железы часто проявляет неблагоприятные исходные признаки.

Создание доклинических моделей, которые точно отражают генетические и фенотипические особенности первичных опухолей и их реакцию на лечение, является важным шагом в выявлении новых терапевтических целей и тестировании новых методов лечения. Новые стратегии могут использовать специфические дефекты восстановления ДНК, присущие клеткам с дефицитом BRCA, такие как дефект гомологичной рекомбинации. Фактически, большая часть информации о функциях белка BRCA2 включала в себя основные идеи исследований мышей с использованием нацеливания генов и исследований измененных эмбриональных клеток мыши (Evers and Jonkers, 2006).

BRCA2 играет ключевую роль в восстановлении разрыва двух нитей ДНК и контроле клеточного цикла. Связанные с BRCA2 дефекты связаны с хромосомными аномалиями, отличительной чертой геномной нестабильности, которая может способствовать развитию опухоли. Более того, BRCA2 участвует в регуляции митоза и цитокинеза, что способствует количественной стабильности хромосом.

Хотя обычные, не условные мышиные мутанты могут быть использованы для моделирования семейных форм рака, они не имитируют спорадический тумурогенез, потому что инициирующая мутация присутствует во всех клетках организма, включая те, которые составляют микроокружение опухоли.

Более того, эмбриональная летальность и развитие неэпителиальных опухолей являются еще одним важным ограничением генетически мутированных мышей Brca2. Некоторые мышиные модели опухолей мутантов Brca2 развивают опухоли молочной железы с гистопатологическими особенностями, которые значительно отличаются от их человеческих аналогов. Хотя в некоторых исследованиях сообщается о поразительно сходной гистопатологии в новообразованных опухолях BRCA1 у мышей и людей (Dennis, 1999; Xu et al, 1999), их значимость для ситуации в человеке еще предстоит продемонстрировать. Наиболее часто используемая модель BRCA2 с мутацией человека представляет собой линию клеток поджелудочной железы CAPAN1, которая в основном используется для понимания резистентности к лекарственным средствам в носителе мутации BRCA1 / 2, а также в определении функционально важных доменов в BRCA2 (Edwards et al, 2008). На сегодняшний день доступен только один криогенный рак молочной железы BRCA2 (MX1) (Donawho et al, 2007), но его характеристики не были описаны подробно.

Генетическое тестирование для идентификации мутаций BRCA1 / 2 широко доступно и широко используется. В результате все большее число женщин осознают, что они являются носителями мутаций во время диагностики рака. К сожалению, нынешних знаний недостаточно для обеспечения конкретных местных или системных методов лечения, которые адаптированы к носителям мутаций BRCA1 / 2. Фактически, имеющиеся исследования, изучающие вопрос о том, следует ли рассматривать BRCA1 / 2-ассоциированный рак молочной железы по-разному от спорадически происходящих, не семейных заболеваний, почти исключительно ретроспективны и ограничены небольшими размерами и различными отклонениями в установлении.

В последнее время ингибиторы репарационных белков ДНК, поли (ADP-рибоза) полимеразы 1 и 2 (PARP1 / 2), как было показано, являются избирательно цитотоксичными для опухолевых клеток с дефицитом BRCA1 или BRCA2. Доклинические данные, в том числе полученные с помощью ограниченного набора ксенотрансплантатов линии опухолевых клеток, предполагают, что ингибиторы PARP могут действовать как отдельные агенты для избирательного уничтожения раков с мутациями BRCA1 или BRCA2, а результаты клинических испытаний фазы I подтверждают, что ингибиторы PARP имеют какой-то один агент активность в раках с мутациями BRCA1 / 2 (Fong et al, 2009). Однако мало известно о долгосрочных последствиях этих препаратов, и представляется вероятным, что некоторые опухоли могут обладать сопротивлением de novo или приобретенной резистентностью (Ashworth, 2008). Таким образом, окончательные ответы остаются неуловимыми, и доклиническая оценка новой целевой терапии ограничена отсутствием подходящих доклинических моделей (Robson, 2007a).

Здесь мы сообщаем о создании и характеристике нового ксенотрансплантата, ксенотрансплантата рака молочной железы человека (HBCx-17), установленного при раке молочной железы у женщины, несущей мутацию зародышевой линии BRCA2. Мы показываем, что этот ксенотрансплантат точно отражает генетические и фенотипические особенности первичной опухоли, тем самым обеспечивая новую модель для тестирования новых методов лечения пациентов с мутацией BRCA2.

Образец рака молочной железы был получен с информированного согласия пациента, перенесшего операцию. Свежие фрагменты опухоли были привиты в межкапсулярную жировую клетку 8-12-недельных самцов швейцарских голых мышей под анестезией. Мышей поддерживали в специфическом без патогенов животном жилье (Institut Curie, Paris, France) и получали эстроген (8 мкг мл-1), разбавленный в питьевой воде. Ксенотрансплантаты появились на месте прививки примерно через 1 месяц после прививки. Затем один ксенотрансплантат трансплантировали с мыши на мышь и хранили в замороженном виде в сыворотке DMSO-фетальной телячьей сыворотки или замораживали в азоте для дальнейших исследований, а фрагмент фиксировали в 10% -ном формале фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) для гистологических исследований. Экспериментальный протокол и животное жилище соответствовали институциональным руководящим принципам, изложенным Французским этическим комитетом (Соглашение B75-05-18, Франция).

Морфологию опухолевой ткани пациентов и ксенотрансплантата сравнивали с использованием парафинов и стандартных протоколов (Vincent-Salomon et al, 2007). Опухоли удаляли с мышей и сразу фиксировали в 10% -ном растворе формола / PBS.

Определение рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, ERBB2, Ki67, цитокератина (CK) 5/6 и статуса рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) по IHC проводили в соответствии с ранее опубликованными протоколами (Vincent-Salomon et al, 2007).

Для поиска спонтанного метастазирования легких ксенотрансплантата HBCx-17 мышей убивали, когда опухоль достигла этического размера (около 2500 мм3), а легкие фиксировались формально для тотальной гистологической оценки.

Доксорубицин, 2 мг кг-1 (адриамицин, Teva Pharmaceuticals, Париж, Франция) и циклофосфамид, 100 мг кг-1 (Эндоксан, Бакстер, Морепас, Франция), разбавленный в 0,9% NaCl и доцетаксел, 20 мг кг-1 (Taxotere, Sanofi-Aventis, Paris, France), разведенные в его специфическом эксципиенте, получали путем внутрибрюшинного (ip) маршрута с интервалом в 3 недели. Ифосфамид, 90 мг кг-1 (Holoxan, Baxter), получали в соответствии с насто щим изобретением. маршрут в течение трех последовательных дней каждые 3 недели. Цисплатин, 1 мг кг-1 (Mylan, Hoeilaart, Belgium) разбавляли 0,9% NaCl и подавали еженедельно с помощью i.p. маршрут. Капецитабин (Xeloda, Roche, Basel, Switzerland), 540 мг на кг в день, разводили в глюкозе 5% и вводили перорально в двух введениях в день. Лучевую терапию применяли локально с дозой 8 Гр или две недельной фракции доз 8 и 7 Гр соответственно для общей дозы 15 Гр. Эксперименты по облучению проводились с использованием источника цезия с мощностью дозы 2,15 Гр / мин.

Терапевтические оценки проводили, как описано в другом месте (Marangoni et al, 2007). Вкратце, объем опухоли был рассчитан как V = axb2 / 2, a — самый большой диаметр и b — самый маленький. Лечение началось, когда опухоли в каждой группе достигли среднего объема ~ 170-200 мм3. Для каждой опухоли Vs сообщали об исходном объеме как относительный объем опухоли (RTV). Были рассчитаны средства (и т. Д.) RTV в одной группе лечения, а кривые роста были установлены как функция времени. Оптимальное ингибирование роста опухоли (TGI) обработанных опухолей против контролей было рассчитано как отношение среднего RTV в обработанной группе к среднему RTV в контрольной группе одновременно. Статистическую значимость TGI рассчитывали по t-критерию парного Стьюдента путем сравнения отдельных RTV в обработанных и контрольных группах. Мыши были этически убиты, когда объем опухоли достиг около 2500 мм3.

Скрининг для точечных и малых размеров мутаций BRCA2 проводили путем анализа геномной ДНК из опухоли пациента. Всего 100 г ДНК амплифицировали с использованием Taq ABgene 0,025 U мкл-1 (ABgene UK, ref: http://www.abgene.com), 4 × 0,2 м dNTP, 1,5 м MgCl2 и 0,3 μ каждого праймера в конечном реакционном объеме 50 мкл. Амплификацию проводили с начальной стадией денатурации при 94 ° С в течение 5 мин с последующим 35 циклами ПЦР: денатурацией при 94 ° С в течение 30 с, отжигом при 54 ° С в течение 30 с и удлинением при 72 ° С в течение 30 с.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозном геле, очищали (Macherey Nagel, Düren, Germany) и секвенировали с использованием одного из ПЦР-праймеров (обычно переднего праймера, за исключением случаев плохого качества последовательности). Реакции секвенирования большого количества красителей и автоматизированный секвенсор ABI3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Программное обеспечение Seqscape (Applied Biosystems) использовалось для анализа последовательности.

Аллельную потерю анализировали амплификацией двух микросателлитных маркеров, фланкирующих ген BRCA2: D13S260 и D13S1701. Была сравнена ДНК зародышей, полученная из образца крови, и ДНК опухоли и ксенотрансплантата. Всего 100 г ДНК амплифицировали с использованием AmpliTaq Gold 5 U мкл-1 (Applied Biosystems), 4 × 0,2 м dNTP, 1,5 м MgCl2 и 0,3 μ каждого праймера в конечном объеме реакции 10 мкл. Амплификацию проводили с начальной стадией денатурации при 94 ° С в течение 5 мин с последующим 30 циклами ПЦР: денатурацией при 94 ° С в течение 30 с, отжигом при 55 ° С в течение 30 с и удлинением при 72 ° С в течение 30 с. В общей сложности 1 мкл продуктов ПЦР смешивали с 19 мкл Formamide Hi-Di (Applied Biosystems) и 0,5 мкл стандарта размера Genescan 400 ROX (PE Applied Biosystems) и разделяли на автоматическом секвенсере ABI3130XL (Applied Biosystems). Программное обеспечение Genemapper (Applied Biosystems) использовалось для анализа генотипов.

Количественная мультиплексная ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов является чувствительным методом для обнаружения больших делеций генов или дублирования. Он основан на одновременной амплификации коротких геномных фрагментов с использованием красительно меченных праймеров в количественных условиях (Casilli et al, 2002; Tournier et al, 2004). Продукты ПЦР анализировали на платформе секвенирования, используемой в режиме анализа фрагментов, где обе высоты и площади пиков пропорциональны количеству шаблона, присутствующего для каждой целевой последовательности. Девять ампликонов BRCA2 между 180 и 300 пар оснований усиливались в той же мультиплексной реакции. В качестве внутреннего контроля мы включали в каждую реакцию фрагмент разного гена, в котором делеция не ожидалась (MLH1 экзон 14). Один праймер из каждой пары праймеров был 5′-меченым флуорохромом 6-FAM.

Всего 100 г геномной ДНК из ксенотрансплантата, двух нормальных контролей и одного мутантного с BRCA2 контролем амплифицировали в конечном объеме 25 мкл, включая 0,06-0,24 мкмоль-1 для каждого праймера и 12,5 мкл хозяина QIAGEN mix (комплект для ПЦР серии QIAGEN). После начальной стадии денатурации образцы подвергали 23 циклам (30 с при 95 ° С, 40 с при 54 ° С и 60 с при 72 ° С). После мультиплексных реакций фрагменты ДНК отделяли на автоматическом секвенсере ABI3130XL и анализировали с использованием программного обеспечения Genemapper (Applied Biosystems).

Для этого анализа мы использовали визуальное сравнение выборки. Мы оценили дозировку аллелей, наложив электроферограмму испытуемого образца на соответствующее изображение для контрольного образца ДНК после регулировки вертикальной шкалы внутреннего контрольного ампликона. Аллельные потери одного или нескольких ампликонов представлены двукратным уменьшением интенсивности (пиковых высот) ампликона анализируемого образца. Аллельное дублирование одного или нескольких ампликонов представлено 0,5-кратным увеличением интенсивности (пиковых высот) ампликона анализируемого образца.

Цельноклеточные белковые экстракты получали из образцов опухоли путем гомогенизации ткани в буфере RIPA (10 м Трис-Cl, pH 7,5, 150 м NaCl, 1 м ЭДТА, 1% Nonidet P40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, протеазы ингибиторы). Концентрации белка измеряли с помощью реагента Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Франция). Иммунопреципитации проводили путем инкубации гранул протеина G (Sigma, Steinheim, Germany), 1-2 мг предварительно очищенного клеточного лизата и моноклонального антитела Ab-1 мыши против BRCA2 (разведение 1: 200, Merck) в течение ночи при 4 ° C. Затем бусины трижды промывали в буфере для холодного лизиса, после чего добавляли 2 × загрузочный буфер и образцы кипятили в течение 2 мин перед SDS-PAGE. Для анализа вестерн-блоттинга лизаты подвергали электрофорезу на сборных гелях Novex (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) и иммуноблоттировали в течение ночи при 4 ° C со следующими антителами: анти-BRCA2 и анти-β-тубулином T4026 (Sigma). За этим последовала инкубация с пероксидазой против IgG-хрена и усилением хемилюминесцентного детектирования (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Уппсала, Швеция). В качестве контроля, полноразмерный BRCA2 был обнаружен в лизатах, генерируемых из клеток 293T.

Общая экстракция РНК и синтез кДНК проводили, как описано выше, из 1 мкг общей РНК (de Cremoux et al, 2004). Показатели ERα, Ki67 и ERBB2 количественно определяли с использованием количественных анализов обратной транскрипции-ПЦР (RT-PCR) в реальном времени. Последовательности нуклеотидов и зондов и условия ПЦР были описаны ранее (de Cremoux et al, 2007). Результаты были выражены как N-кратные различия в экспрессии гена-мишени относительно эталонного гена, определенного как «N-мишень».

Геномный ресурс флуоресценции флуоресценции in situ 5244, отображенный, секвенированный BAC и PAC-клоны, проверенный на содержание гена и маркера, был представлен в виде иммобилизованных цепей ДНК на стеклянных слайдах для анализа CGH на основе массива, позволяя при среднем разрешении 0,5 Мб генома. Каждый клон был замечен в четырех экземплярах на слайде, подготовленном Интеграгеном (Эври, Франция) и разработан Национальным институтом де-ла-де-ла-де-ла-рекрехский медицинский отдел U830. После экстракции 1,5 мкг каждого тестового и контрольного образцов ДНК расщепляли ферментом DpnII (Ozyme, Saint-Quentin en Yveline, France) и очищали с помощью набора для очистки PCIA QIAquick (Qiagen, Courtaboeuf, France). Затем их маркировали случайным праймированием с использованием набора для маркировки ДНК Bioprime (Invitrogen) с соответствующим цианиновым красителем (Cy3 или Cy5, PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Контрольную и тестируемую ДНК соосаждали с ДНК Cot-1 (Invitrogen), денатурировали и ресуспендировали в буфере для гибридизации (50% формамида). Конкурентная когибридизация была выполнена на слайдах массива CGH. После 24-часовой гибридизации слайды промывали SDS и физиологическим раствором цитрата, сушили и отсканировали, используя сканирование 4000B (Axon, Orleans, CA, USA). Анализ изображений выполнялся с помощью программного обеспечения Genepix 5.1 (Axon) и обрабатывался с использованием программного обеспечения, разработанного в Институте Кюри (La Rosa et al, 2006). Исключен любой BAC с менее чем двумя репликами, отмеченными за невыполнение качественных критериев пятна. Отношение <0,8 считалось потерей, отношение> 1,2 рассматривалось как коэффициент усиления, а коэффициент> 1,5 рассматривался как амплификация (Auger et al, 2006).

Анализ данных основывался на нормализованных соотношениях сигналов Cy5 / Cy3, наблюдаемых для каждого клона BAC, который ранее прошел процедуру оценки флага. Для аутосомных хромосом потеря данного локуса определялась отношением ⩽0.8, коэффициент усиления определялся отношением ⩾1.2 и <2.0, а ампликон определялся отношением ⩾2.0. Для Х-хромосом потеря была определена отношением ⩽1.2, коэффициент усиления определялся отношением ⩾1.7, а ампликон определялся отношением ⩾2.5. Анализ данных проводился в соответствии с ранее опубликованными протоколами (Vincent-Salomon et al, 2007).

Мутационный носитель BRCA2, у которого был получен ксенотрансплантат HBCx-17, был 37-летней женщиной, которой в возрасте 32 лет поразила первая инвазивная протоковая карцинома (III) III степени, которую лечили хирургическим вмешательством FEC100, и радиотерапии. Через 6 лет она разработала контралатеральный IDC и лечилась хирургическим вмешательством, а затем шесть циклов доцетаксела и лучевой терапии. Ксенотрансплантат был создан из второй карциномы. Опухоль пациента была отрицательной с C-ERBB2, эстроген- и прогестерон-рецептором с высоким митотическим индексом. У пациента была сильная семейная история рака груди и яичников. Испытание гена BRCA1 / 2, выполненное с информированного согласия пациента, идентифицировало мутацию в гене BRCA2: c.6033_6034delTT; p.ser2012GlnfsX5.

Гистопатологический анализ проводили с первичной опухолью и ксенотрансплантатом HBCx-17 в проходе 6. Как показано на рисунках 1A и B, гистология исходной опухоли сохранялась в ксенографе. Действительно, HBCx-17 показал инфильтрационную проточную карциному с типичной потерей образования канальцев, значительным ядерным плеоморфизмом и митотической активностью. Нерегулярная инфильтрация стромы наблюдалась как у пациентов, так и для ксенотрансплантатов. Оценка пролиферации опухоли с использованием окрашивания Ki67 показала высокую пролиферативную скорость в первичной опухоли, которая была увеличена в ксенотрансплантате (рис. 1C и D). Как первичные, так и опухолевые ксенотрансплантаты были отрицательными для CK5 и CK6 (данные не показаны), но положительны для экспрессии CK14, как показано на рисунке 1E и F. Оба образца опухоли и HBCx-17 являются отрицательными для ERBB2 и эстрогена, а также рецептора прогестерона, а клинические образец показал сильное окрашивание EGFR, что ксенотрансплантат не был (данные не показаны).

Для поиска спонтанного метастазирования легких ксенотрансплантата HBCx-17, мышей легкие анализировали с помощью гистохимии. На рисунках 1G и H показаны два примера небольших метастазов: кластеры опухолевых клеток препятствовали просвечиванию небольшого количества легочных артериол (раковые эмболы) без очевидного вычитания артериолярной среды. Метастазы легких были обнаружены у 23% мышей (шесть положительных животных на 26).

Клинический образец и ксенотрансфузированные опухоли в проходах 0, 6 и 8 были охарактеризованы для генетических параметров с использованием метода массива CGH (рисунок 2). Сравнительный анализ геномной гибридизации показал очень большое количество изменений и весьма схожих изменений числа копий генов. Геномные профили первичной опухоли и разных проходов в ксенотрансплантате были очень похожи, разделяя большие области амплификаций ДНК. Общие выходы и делеции ДНК описаны в таблицах 1 и 2. Эти амплификации описаны в таблице 1, такие как ампликоны хромосомы 1q и 8p.

Гистологическая классификация HBCx-17 как тройной отрицательной опухоли была подтверждена количественным RT-PCR-анализом рецепторов ER, PR и ERBB2 (таблица 3). Как клинический образец, так и опухоли ксенотрансплантата были отрицательными для трех рецепторов. Напротив, базальноподобные CK5 и CK6 не были выражены, но классификация базальноподобного рака молочной железы проводилась на экспрессии CK14, как определено IHC (рисунок 1).

Было обнаружено, что статус TP53 мутирован в опухоли ксенотрансплантата, как определено функциональным анализом Fasay (данные не показаны).

Секвенирование ДНК первичной опухоли и Р0 и Р8 из ксенотрансплантата HBCx-17 показало наличие мутации зародышевой BRCA2, идентифицированной у пациента (c.6033_6034delTT; p.Ser2012GlnfsX5; Рисунок 3A). Информативность двух изученных маркеров, расположенных в локусе BRCA2, D13S260 и D13S1701, позволила обнаружить наличие двух аллелей на уровне ДНК зародышевой линии, тогда как первичная опухоль и ДНК ксенотрансплантата показали потерю одного аллеля. Потеря гетерозиготности (LOH) в локусе BRCA2 была подтверждена в ксенографе при P0 с использованием двух фланкирующих микросателлитных маркеров для BRCA2, D13S260 и D13S1701 (рисунок 3B).

Чтобы оценить влияние LOH на белок BRCA2, белковый анализ проводили вестерн-блоттингом на клеточном лизате, полученном из ксенотрансплантата контрольной молочной железы (без мутации BRCA2) и из ксенотрансплантата HBCx-17. Как показано на фиг. 3C, мутантный ксенографический лизат BRCA2 содержит усеченную форму белка BRCA2 и потерял белок дикого типа.

Количественная мультиплексная ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов использовалась для определения количества копий BRCA2. На рисунке 3D показаны электрофореграммы ДНК зародышевой линии и ДНК P0 и P7 (оранжевый и черный). Мутированные (BRCA2 дублированные) ДНК использовались в качестве контролей (соответственно зеленый и красный). Образцы ксенотрансплантата и контрольные образцы были прекрасно наложены после нормализации, что указывает на дублирование мутантного BRCA2 аллеля.

Опубликованы параметры роста ксенотрансплантата HBCx-17 (латентность опухоли и опухоли) (Marangoni et al, 2007). Изучены реакции опухолей на стандартные химиотерапии, используемые при лечении рака молочной железы и лучевой терапии. Как показано на рисунке 4A, ксенотрансплантат HBCx-17 был высоким ответчиком AC, с пятью из восьми полных регрессий и TGI 98%. Модель HBCx-17 также чувствительна к терапии на основе капецитабина с TGI 98% через 4 недели после начала лечения. Реакция доцетаксела не наблюдалась, как показано на рисунке 4B. Комбинация цисплатин / ифосфамид давала также важное ингибирование роста (98%) с 7 из 10 полных регрессий на 50-й день (рисунок 4C). Радиотерапевтические анализы проводили с источником облучения цезием. Мыши получали либо 8, либо 15 Гр локально в двух фракциях 7 и 8 Гр. Ксенотрансплантат был высоким ответчиком на облучение TGI 73 и 75% при 8 и 15 Гр соответственно (Рисунок 4C).

В этой работе мы сообщаем характеристику ксенотрансплантата опухоли молочной железы человека, полученную от женщины, несущей мутацию BRCA2. Базальноподобная морфология опухоли пациента была сохранена в ксенотрансплантате, включая стромальный компонент и тканевую архитектуру. Окрашивание Ki67 было выше в опухоли ксенотрансплантата, чем в первичной опухоли, что указывает на то, что при трансплантации опухоли могут быть выделены сильно пролиферирующие раковые клетки. Исследования по крупным сериям связанных с BRCA2 раком молочной железы показывают, что эти опухоли являются преимущественно полноценными IDC без особого подтипа маркера и что они чаще всего являются эстроген- и прогестерон-рецепторными позициями (Lakhani et al, 2002; Brekelmans et al, 2007; Palacios et al, 2008). Как большинство BRCA2-дефицитных клеток, опухолевые клетки содержат только усеченный белок BRCA2, что указывает на то, что LOH произошел вследствие инактивирующей мутации во втором аллеле. Это то, что обычно происходит в большинстве мутантных BRCA2 опухолей, где инактивация аллеля дикого типа происходит LOH, отменяя нормальную экспрессию белка (Smith et al, 1992; Collins et al., 1995). Кроме того, мультиплексная ПЦР короткого фрагмента показала, что потеря гена дикого типа была связана с дублированием мутированного гена BRCA2. LOH и аномалии числа копий часто связаны с BRCA1 и BRCA2-ассоциированным раком молочной железы или яичников (Staff et al, 2000).

Согласование между клиническим образцом и ксенотрансплантатом также было показано анализом матрицы CGH. Генетические профили были очень похожи не только между опухолью пациента и ксенотрансплантатами, но и при сравнении ксенотрансплантатов в разных проходах, что указывает на то, что, хотя чрезвычайно изменен, генетический профиль ксенотрансплантата HBCx-17 был стабильным во время последующих проходов. Клинический образец и опухоли ксенотрансплантата представляют собой некоторые изменения хромосом, которые уже часто описываются в геномных профилях опухолей BRCA2 с мутацией, как увеличение 8q и 20q, и потеря 13q (Palacios et al, 2008). Усиление генов MYST3 и AP3M2 было уже описано как рецидивирующие ампликоны, связанные с уменьшением продолжительности выживания при раке молочной железы (Chin et al, 2006).

Усиления в областях 1q32-q41, 8q22.1-24.3 и 20q12-q13, а потери в области 8p23.3-p21.2 происходят как в первичных опухолях, так и в ксенотрансплантатах, а также были обнаружены в первичных опухолях BRCA2 различными авторы (Gronwald et al, 2005; Jonsson et al, 2005).

Тем не менее, ни один из этих регионов не был подтвержден у большого числа пациентов и в исследованиях независимых семейств семей, и необходимы более обширные исследования, чтобы найти изменения, специфичные для опухолей BRCA1 / 2.

Существует значительное количество доклинических данных, которые поддерживают гипотезу. Клетки BRCA1 / 2 с дефицитом чувствительны к некоторым химиотерапевтическим агентам, чем клетки с интактными белками BRCA1 и BRCA2 (Foulkes, 2006). В соответствии с этим, ксенотрансплантат HBCx-17 показал выраженную чувствительность к химиотерапии на основе антрациклинов, при этом> 50% мышей имели полный ответ (рецидива опухоли), а также комбинации цисплатина и ифосфамида. Хотя дефицит BRCA2 не был широко изучен, некоторые предыдущие работы показали, что снижение функции BRCA2 связано с повышением чувствительности in vitro к цисплатину, митомицину, доксорубицину и этопозиду (Foulkes, 2006; Robson, 2007a). Ксенотрансплантат HBCx-17 был очень устойчив к доцетакселу. Хотя некоторые эксперименты повышают вероятность того, что клетки, дефицитные BRCA1, могут быть устойчивыми к противораковым агентам, нацеленным на микротрубочки (такие как алкалоиды винка и таксаны), никакие доклинические исследования in vivo никогда не демонстрировали резистентность к таксону в клетках с дефицитом BRCA2 (Foulkes, 2006) , Robson, 2007b). Аналогичным образом, некоторые недавние клинические анализы показывают, что первичная резистентность к химиотерапии на основе доцетаксела коррелирует с высокой частотой мутаций BRCA1. Нет никаких указаний на опухоли молочной железы, происходящие в носителе мутации BRCA2. Наши данные свидетельствуют о том, что, как и BRCA1, BRCA2 дикого типа может потребоваться для ответа in vivo на митотические ядрышки веретена и что устойчивость доцетаксела может быть связана с вовлечением BRCA1 / 2 в таксано-индуцированный путь ответа на стресс.

В клинике имеющихся доказательств недостаточно для заключения о том, что BRCA1 / 2-ассоциированный рак молочной железы дифференциально чувствителен к конкретным обычным химиотерапевтическим агентам. В настройке адъюванта выбор режима лечения не изменяется в зависимости от наличия такой предрасположенности. В настоящее время проводятся клинические испытания для дальнейшего решения этой проблемы. Тем не менее, результат наследственного рака молочной железы остается неудовлетворительным, рассматривая вопросы потенциальных новых стратегий, которые используют преимущества специфических дефектов восстановления ДНК, присущих клеткам с дефицитом BRCA. Ингибирование PARP1 потенцирует активность ДНК-разрушающих агентов, таких как алкилирующие лекарственные средства, платины, ингибиторы топоизомеразы и радиация в моделях in vitro и in vivo. Опухоли с дефектами восстановления ДНК, такими как те, которые возникают у пациентов с мутациями BRCA1 / 2, более чувствительны к ингибированию PARP (Bryant et al., 2005; Farmer et al, 2005; Fong et al, 2009). В этом контексте модель HBCx-17 может улучшить доклинические анализы ингибиторов PARP, которые обычно выполняются у мышей с нокаутом BRCA1 / 2 или в раковых клетках поджелудочной железы. Различные агенты проходят фазы I и II клинические испытания в BRCA1 / 2-ассоциированной груди и раке яичников, а новые соединения входят в ранние доклинические настройки. В этой перспективе создание этого нового криогенного рака молочной железы BRCA2, воспроизводившего в последующие поколения характеристики пациента с точки зрения гистологии, генетического профиля и биологических характеристик, может способствовать доклиническому развитию инновационных схем терапии.

Софи Пиперно, Оливье Делаттре, Натали Огер (Институт Кюри, Париж), Летиция Дюран, Вин-Чынь Луи за их полезный вклад; Винсент Бордье (Institut Curie, Париж) и Луи-Франсуа Пласса (больница Сент-Луис, Париж) за их техническую помощь, а также Национальную лигу против рака за поддержку массива сравнительной геномной гибридизационной платформы.

Репрезентативные гематоксилин-эозиновые участки пациентов и опухоли ксенотрансплантатов. Секции гематоксилин и эозин Gx100 (A и B), KI67 (C и D) и CK14 (E и F). Метастазы легких показаны в картинах G и H (стрел) кластеров опухолевых клеток препятствуют просвечиванию небольшого количества легочных артериол (раковые эмболы) без очевидного вычитания артериолярных сред.

HBCx-17 опухолевого массива CGH профилирование пациента (сверху) и ксенотрансплантата (снизу). Потеря (зеленые точки), усиление (красные точки) или усиление (синие точки) хромосомного материала. Повторяются изменения количества копий (ось y) для каждого зонда, выровненного вдоль оси x в хромосомном порядке.

(A) Хроматограммы опухоли и нормальной ткани молочной железы, показывающие мутацию BRCA2: (c.6033_6034delTT / p.Ser2012GlnfsX5). ДНК дрожжей (GDNA) показывает как мутантный, так и аллель дикого типа. Потеря аллеля дикого типа с удержанием мутантного проявляется в первичной опухоли и при прохождении 0 (P0) и 8 (P8) ксенотрансплантата. (B): Усиление двух микросателлитов (D13S260 и D13S1701), фланкирующих BRCA2, показывает потерю гетерозиготности в P0. (C) Иллюстрирует иммунопреципитацию против BRCA2 на лизатах, полученных из клеток HBCX-17 и 293T опухолевого образца. Вестерн-блот-анализ выявил полноразмерный BRCA2 в образцах 293T и усеченный продукт BRCA2 прогнозируемого размера в образце опухоли. (D) количественная мультиплексная ПЦР короткого фрагмента показывает, что мутированный аллель дублируется, тогда как аллель дикого типа теряется.

Кривые роста опухоли ксенотрансплантата HBCx-17 в зависимости от времени: мышей HBCx-17 обрабатывали двумя циклами AC (A), комбинацией доксорубицина (2 мг кг-1 мк каждые три недели) и циклофосфамида (100 мг кг-1 мкг каждые три недели), с доцетакселом (▵) (20 мг кг-1 мкг каждые три недели) или капецитабином (◊) (540 мг кг-1 в течение 5 дней в неделю два раза) (B) или с комбинация цисплатина (1 мг кг-1 в 1 раз в неделю) и ифосфамида (90 мг кг-1, 3 последовательных дня каждые 3 недели) (▵) по сравнению с 15 Гр (⧫) или 7 Гр (◊) облучением (C ). Элементы управления (○) не обрабатывались. Мышей лечили на 1-й день, и объем опухоли измеряли два раза в неделю. Рост опухоли оценивали путем расчета среднего значения RTV ± s.d. (каждая группа состояла из 10 мышей) со временем после первого лечения.

Браузер генома UCSC на собрании майского мая; позиции указаны в мегабассейнах.

Браузер генома UCSC на собрании майского мая; позиции указаны в мегабассейнах.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *