Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Экспрессия miR-21 и ее мишеней (PTEN, PDCD4, TM1) при плоской эпителиальной атипии груди по отношению к карциноме протоков in situ и инвазивной карциноме

Expression of miR-21 and its targets (PTEN, PDCD4, TM1) in flat epithelial atypia of the breast in relation to ductal carcinoma in situ and invasive carcinoma
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2695476/

Плоская эпителиальная атипия (FEA) груди характеризуется несколькими слоями слабо атипичных эпителиальных клеток просвета. Генетические изменения, обнаруженные при карциноме протоков in situ (DCIS) и инвазивный протоковый рак молочной железы (IDC), также обнаруживаются в FEA, хотя и при более низкой концентрации. До сих пор изменения экспрессии miRNA, связанные с инвазивным раком молочной железы, такие как miR-21, не изучались в FEA.

Мы провели miRNA in situ гибридизацию (ISH) на 15 случаях с одновременным присутствием нормальной ткани груди, FEA и / или DCIS и еще 17 случаев с IDC. Экспрессия миридных мишеней PDCD4, TM1 и PTEN исследовалась иммуногистохимией.

Два из пятнадцати случаев показали положительное окрашивание для miR-21 в нормальном грудном эпителии, семь из пятнадцати случаев были положительными в компоненте ВЭД, и девять из двенадцати случаев были положительными в компоненте DCIS. Положительное окрашивание miR-21 наблюдалось в 15 из 17 случаев IDC. В 12 случаях все три компонента присутствовали в одном блоке ткани, и увеличение количества miR-21 от нормальной груди до FEA и DCIS наблюдалось в пяти случаях. В трех случаях компонент FEA был отрицательным, тогда как компонент DCIS был положительным для miR-21. В трех других случаях нормальные компоненты FEA и DCIS были отрицательными для miR-21, и в последнем случае все три компонента были положительными. В целом мы наблюдали постепенное увеличение процента положительных случаев miR-21 от нормальных, до FEA, DCIS и IDC. Иммуногистохимическое окрашивание для PTEN не выявило очевидных изменений интенсивностей окрашивания в нормальных, FEA, DCIS и IDC. Цитоплазматическое окрашивание PDCD4 возрастало от нормального до IDC, тогда как ядерное окрашивание уменьшалось. TM1 окрашивание уменьшилось с положительного в нормальной груди до отрицательного в большинстве случаев DCIS и IDC. В FEA образец окрашивания TM1 был похож на нормальную ткань груди.

Урегулирование miR-21 из нормальных протоковых эпителиальных клеток груди в FEA, DCIS и IDC параллельна морфологически определенному канцерогенезу. Не было обнаружено четкой связи между картиной окрашивания miR-21 и ранее указанными генами-мишенями.

Плоская эпителиальная атипия (ВЭД) впервые была предложена как организация в 2003 году в классификации Всемирной организации здравоохранения опухолей молочной железы [1]. Он определяется как внутриутробное новообразование, характеризующееся заменой оригинальных эпителиальных клеток на один или 3-5 толстый слой слабо атипичных клеток с потерей поляризации. Однако недавние исследования показывают, что FEA фактически состоит из расширенных дольков, а не расширенных протоков [2]. При широком применении маммографического скрининга у женщин чаще обнаруживается FEA, поскольку кальцификация относительно распространена в FEA. Хотя FEA интенсивно изучается, по-прежнему существуют разногласия относительно того, как справиться с этим при оказании клинической помощи пациентам, поскольку только немногие пациенты, у которых был диагностирован только FEA, развивали последующий рак молочной железы [3,4]. Пациенты с протоковой карциномой in situ (DCIS), известное предраковое поражение, которое необходимо лечить, показывают одновременное ВЭД у примерно 30% пациентов. По этой причине интересно изучить вопрос о том, следует ли рассматривать FEA как истинное предраковое поражение или только как повреждение предшественника, имеющее или не связанное с DCIS.

Потери гетерозиготности на 3p, 9q, 10q, 11q, 17p, 17q и рекуррентные коэффициенты усиления на 15q, 16p и 19 наблюдались в приблизительно от 10 до 50% FEA [5-7]. Эти геномные аберрации также обнаруживаются в DCIS и инвазивной протоковой карциноме (IDC) и предполагают, что FEA действительно может считаться предраковым поражением, которое может развиться в DCIS или IDC. Недавние исследования в области онкогенеза показали, что микроРНК (miRNAs) могут играть решающую роль в злокачественной трансформации, действующей как onco-miRNAs или опухолевые супрессорные miRNAs [8].

МиРНК представляют собой небольшие некодирующие одноцепочечные РНК, содержащие около 21-23 нуклеотидов, которые отрицательно модулируют экспрессию белка путем нацеливания транскриптов мРНК и вызывают либо репрессию трансляции, либо деградацию РНК [9-12]. МиР-21 (miR-21) является одной из наиболее изученных миРНК в раке и очень сильно регулируется при раке молочной железы по сравнению с нормальной тканью [13,14]. Уровни Мир-21 были выше в 2 и 3 классах по сравнению с IDC 1-го уровня [14].

До настоящего времени было идентифицировано только несколько мишеней-миров-21 мишеней в нескольких типах рака, включая рак молочной железы. Zhu et al. показало, что miR-21 нацеливает ген супрессора опухоли, Tropomyosin 1 (TM1) [15]. Франкель и др. [16] продемонстрировали, что ингибирование запрограммированной клеточной смерти 4 (PDCD4) в клетках MCF-7 значительно уменьшало антипролиферативный эффект ингибирования miR-21. Chan et al. показали, что miR-21 действует как антиапоптотический фактор в клетках глиобластомы человека [17]. При гепатоцеллюлярном раке miR-21 регулирует экспрессию гена фосфатазы гена-супрессора опухоли и гомолога-тензина (PTEN) [18].

Хотя в нескольких исследованиях основное внимание уделяется выражению miR-21 при раке молочной железы, нет исследований экспрессии miR-21 в FEA. Мы выполнили miRNA ISH, что позволяет точно и прямое обнаружение miR-21 в нормальной ткани FEA, DCIS и IDC. Экспрессию экспериментально подтвержденных генов-мишеней, PTEN, PDCD4 и TM1 изучали в нормальных, FEA, DCIS и IDC.

Двадцать пять пациентов с синдромом FEA и DCIS были идентифицированы в серии из 270 случаев DCIS, диагностированных с января 2004 года по декабрь 2006 года в Отделе патологии и исследовательской лаборатории рака молочной железы, Раковой больнице Тяньцзиньского медицинского университета, Тяньцзинь, Китай. Двадцать одного случая IDC были отобраны из университетского медицинского центра Гронинген (UMCG), Гронинген, Нидерланды. Все образцы фиксировали 10% формалином и вставляли в парафин. Пятнадцать пациентов с одновременно FEA и / или DCIS были выбраны для miR-21 РНК-ISH на основе сильного и гомогенного положительного окрашивания для β-актина с использованием РНК-ISH, что указывает на хорошее качество РНК в тканевых блоках. Семнадцать из 21 IDC (включая три этапа 1, девять этапов 2 и девять этапов 3) содержали качественную РНК и также демонстрировали гомогенную окрашивающую структуру по участкам ткани, как определено посредством β-актина РНК-ISH. Этот критерий отбора важен для этого исследования, поскольку мы хотим сравнить интенсивности окрашивания в разных тканевых компонентах в одном и том же блоке ткани. FEA был морфологически определен, как описано в справочной информации. Кроме того, его существование было иммуногистохимически подтверждено с использованием панели цитокератинов (CK8 / 18, CK5 / 6 и CK14). Только мономорфная и монотипическая пролиферация CK8 / 18 с положительной внутриклеточной клеткой рассматривалась как FEA, тогда как смеси положительных клеток CK8 / 18 вместе с CK5 / 6 или CK14-положительными клетками рассматривались как (доброкачественная) гиперплазия протоков [1,2,19,19 ]. DCIS и инвазивная карцинома были морфологически определены с использованием стандартных критериев [1]. Все протоколы исследований были одобрены местным медицинским этическим комитетом Медицинского центра университета Гронинген. Для образцов тканей из Китая протоколы были одобрены Административной группой Университета Тяньцзинь по медицинским исследованиям и институциональными обзорными советами Института исследований рака Тяньцзинь.

β-актин-РНК-ISH проводили на регулярно фиксированных парафиновых тканевых срезах с использованием стандартных лабораторных протоколов. Короче говоря, секции парафиновой ткани депарафинизировали и сушили на воздухе в течение 10 мин. Слайды обрабатывали протеиназой K (Roche, 15 мкг / мл) при 37 ° C в течение 1 часа. После промывания PBS слайды инкубировали с 1 нг / мкл антисмыслового зонда с β-актином DIG (Roche, Mannheim, Germany) в гибридизационном растворе, состоящем из раствора 5 × Денхардта, 2 × SSC, 10% декстрансульфата , 30% формамида, 1 мг / мл т-РНК и 2 мг / мл ДНК спермы лосося, в течение ночи при 55 ° С. После промывания слайды обрабатывали РНКазой 10 мг / мл (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) при 37 ° С в течение 30 мин, промывали и инкубировали с фрагментами Fab-фрагментов щелочной фосфатазы с анти-DIG (Roche) в течение 1 часа 0,1 М буфера малеиновой кислоты, содержащего 0,15 М NaCl, 2% блокирующего буфера и 1% Triton X-100. Реакцию окрашивания проводили в течение ночи с помощью 4-нитро-синего тетразолиевого хлорида (NBT) (Roche) и X-фосфата / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP) (Roche) в 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl , 50 мМ MgCl2 pH = 9,7 буфера. Во всех экспериментах был включен отрицательный контроль, то есть окрашивание без зонда β-актина.

MicroRNA-ISH проводили на регулярно фиксированных парафиновых тканях. Секции парафиновой ткани депарафинизировали ксилолом, регидратировали серией разбавления этанолом и обрабатывали 15 мкг / мл протеиназы K (Roche) при 37 ° C в течение 15 минут. После стадии промывки с 0,2% глицина в PBS слайды фиксировали 4% формальдегидом и промывали фосфатным буферным раствором (PBS) и 2 × SSC. После сушки слайды инкубировали с гибридизационным буфером, состоящим из 50% формамида, 0,25 мг / мл ДНК спермы лосося, t-РНК 1 мг / мл, 0,01 М дитиотреитола (ДТТ) (Roche), 10 × раствора Денхардта, 10% декстрансульфата , 4 × SSC при 37 ° С в течение 2 часов. Затем слайды гибридизовали с 20 нМ меченым диодом miR-21 (Exiqon, Copenhagen, Denmark), разбавленным в буфере для гибридизации при 51 ° C в течение ночи. После промывки слайды обрабатывали блокирующим буфером (2% сыворотки овец, 0,1% Твин в PBS) при 37 ° С в течение 30 мин. Слайды инкубировали с фрагментами анти-DIG-AP Fab в блокирующем буфере при 37 ° C в течение 1 часа и промывали 0,1% Tween в PBS и AP-буфере (100 мМ Tris-HCl, 100 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 0,05% Твин 20, pH = 9,5), miR-21 визуализировали в реакции окрашивания раствором NBT / BCIP (4,5 мкл NBT, 3,5 мкл BCIP, 1 мкл левамизола в 1 мл AP-буфера). Последний шаг обновляли 3 раза в течение 1 — 3 дней, пока не было видно пятно. Во всех экспериментах был включен отрицательный контроль, т. Е. Окрашивание без зонда miR-21.

Слайды оценивались независимо двумя наблюдателями, и положительные случаи определялись, когда более 10% представляющих интерес клеток проявляли цитоплазматическое окрашивание. Дискриминация слабого и сильного положительного окрашивания была основана на интенсивности, наблюдаемой у разных компонентов в той же области участка ткани, чтобы исключить изменение интенсивности окрашивания, вызванное различиями во время процедуры фиксации. В общем, сигналы для β-актина были более выраженными, чем сигналы для miR-21, поддерживая наши критерии предварительного отбора. Однако в некоторых случаях окрашивание miR-21 оказалось более выраженным, чем окрашивание β-актином.

Встраиваемые парафином секции (3 мкм) депарафинизировали, регидратировали и окрашивали с использованием стандартных лабораторных протоколов. Выделение антигена и разведение антител суммированы в таблице 1. Эндогенная пероксидаза была заблокирована 0,3% перекисью водорода в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в течение 30 минут, а эндогенный биотин был заблокирован с использованием блокирующего набора (Vector Laboratories, Burlingame, США). Секции инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с антителами, разведенными в 1% BSA в PBS. Затем секторы инкубировали с вторичными и третичными антителами (все от DAKO) в течение 30 минут. Окрашивание визуализировали 3,3′-диаминобензидином в виде хромогена в течение 10 минут, а слайды контрастировали с гематоксилином. Нормальная ткань груди использовалась в качестве положительного контроля для PTEN и TM1 и нормальной ткани толстой кишки для окрашивания PDCD4. Образцы окрашивания для всех трех антител сравнивали с ранее описанными рисунками окрашивания в этих тканях для оценки специфичности окрашивания [20-22]. Для PTEN мы использовали те же антитела, которые использовались ранее для рака предстательной железы [23]. Для PDCD4 и TM1 специфичность антител была показана ранее Вестерн-блот [24,25]. Для PDCD4 нормальный кишечный эпителий служил положительным и кишечным типом карциномы толстой кишки служил отрицательной контрольной тканью (дополнительный файл 1). Для толстой кишки TM1 служили также контрольной тканью, слизистой оболочкой мускулатуры и гладким мышечным слоем вокруг капилляров как положительный, а кишечный эпителий — отрицательным контролем (дополнительный файл 1). Отрицательный контроль был получен путем пропуска первичных антител от процедуры окрашивания.

Детали процедуры иммуногистохимии

Окрашивание оценивали независимо двумя наблюдениями и классифицировали как: (-) отрицательное окрашивание; (+) слабое положительное окрашивание 10% или более интересующего типа ячейки; (++) умеренное положительное окрашивание в 10% или более интересующего типа клетки; (+++) сильное положительное окрашивание 10% или более представляющих интерес клеток. PTEN продемонстрировал ядерное окрашивание, TM1 цитоплазматическое окрашивание и PDCD4 показали как цитоплазматическое, так и ядерное окрашивание, которое оценивалось независимо.

Статистический анализ для сравнения между нормальной грудной клеткой, FEA, DCIS и IDC для положительных показателей miR-21 проводился с использованием одностороннего точного теста Фишера или критерия Хи-квадрат. Значения P менее 0,05 считались значительными.

Пятнадцать из 25 тканевых блоков показали положительную и гомогенную окраску у β-актина РНК-ISH, которая показала, что качество образцов ткани и процедура фиксации привели к получению достаточно качественной РНК для ISH во всей области ткани. IDC показал положительное окрашивание β-актином в 17 из 21 случая. Десять FEA и четыре IDC показали отсутствие или только очень слабую и фокальную (ограниченную внешними участками ткани, а не в центральных областях) сигнал для β-актина и были исключены из-за плохой качественной РНК в блоке ткани.

Мы наблюдали окрашивание miR-21 в цитоплазме нормального грудного эпителия в двух из 15 случаев (13%). FEA присутствовал во всех случаях и был окрашен положительным в семи случаях (47%). Для шести из этих семи случаев компонент FEA окрашивался положительно для miR-21, тогда как нормальная компонента окрашивалась отрицательно. DCIS присутствовал в 12 случаях и был окрашен положительным в девяти случаях (75%) (таблица 2). В 12 образцах все три компонента присутствовали в участке ткани. Заметное увеличение интенсивности окрашивания наблюдалось от нормальной груди до FEA и DCIS в пяти случаях (№ 4, 5, 10, 11, 15) (фиг.1). В трех случаях (№ 1, 7 и 9) окрашивание в ВЭД было отрицательным, тогда как индекс DCIS был положительным, в трех случаях (№ 9, 12, 14) окрашивание было отрицательным во всех трех компонентах, и в одном случае окрашивание было положительным во всех трех компонентов (# 2). IDC показал устойчивый сильный положительный сигнал в 15 из 17 случаев (88%) (рис.2). В общем, процент случаев, демонстрирующих экспрессию miR-21, был низким в нормальной ткани (13%) и увеличивался в FEA (47%), DCIS (75%) и IDC (88%). Используя точный критерий Фишера, мы обнаружили, что процент положительных случаев miR-21 был значительно выше в IDC и DCIS по сравнению с нормальной грудной клеткой (P = 0,000 и P = 0,002 соответственно). Более того, увеличение процента положительных случаев miR-21 наблюдалось также в FEA (47%), хотя оно не достигало значительных уровней (P = 0,054).

Экспрессия miR-21 у 5 пациентов, одновременно с нормальным грудным эпителием, FEA, DCIS РНК ISH. Экспрессия miR-21 была обнаружена преимущественно в цитоплазме в просветных клетках. Увеличение интенсивности окрашивания miR-21 наблюдалось от нормали к FEA и DCIS у этих 5 пациентов. Интенсивность окрашивания в FEA и DCIS была одинаковой в 4 из 5 случаев (200 ×).

Экспрессия miR-21 в IDC РНК ISH. Репрезентативный пример IDC, демонстрирующий сильное цитоплазматическое окрашивание в подавляющем большинстве опухолевых клеток (200 ×).

Экспрессия miR-21 в норме, FEA и DCIS, обнаруженная РНК-ISH

na, компонент DCIS не присутствует в блоке ткани

Нормальная ткань груди во всех 15 случаях показала сильную ядерную экспрессию белка PTEN. Компоненты FEA, DCIS и IDC также окрашиваются положительно для PTEN, хотя и с различной интенсивностью (таблица 3, рис.3).

Окрашивание трех предсказанных генов мири-21 мишени в нормальных тканях FEA, DCIS и IDC. PTEN показал ядерное окрашивание и сильно выражен в нормальных условиях, FEA, DCIS и IDC. Выражение TM1 в норме, FEA, DCIS и IDC показало цитоплазматическое окрашивание и наблюдалось снижение от нормали к FEA, DCIS и IDC. PDCD4 экспрессировался главным образом в ядрах в нормальной груди, в то время как картина окрашивания постепенно смещалась от ядерной к цитоплазматической в ​​FEA, DCIS и IDC (увеличение 400 × для всех).

Экспрессия окрашивания иммуногистохимии miR-21, PTEN, PDCD4, TM1 в нормальных условиях, FEA, DCIS и IDC

Цитоплазматическое окрашивание ТМ1 наблюдалось во всех случаях в просветных клетках нормальной ткани молочной железы. Подобно нормальной ткани груди, FEA также показал положительное окрашивание во всех случаях. В DCIS окрашивание наблюдалось в десяти из 12 случаев, хотя и при меньших интенсивностях по сравнению с нормальным и FEA. В IDC только 7 из 21 (33%) случаев продемонстрировали положительное окрашивание для TM1. Кроме того, экспрессия белка TM1 также наблюдалась в цитоплазме миоэпителиальных клеток в некоторых случаях.

Окрашивание PDCD4 наблюдалось в ядрах и цитоплазме люминальных клеток. Экспрессия PDCD4 находилась преимущественно в ядрах в нормальной ткани молочной железы (73% положительности в ядре против 13% положительности в цитоплазме) и FEA (93% против 13%), тогда как в DCIS и IDC положительное цитоплазматическое окрашивание наблюдалось примерно в половине случаи и ядерное окрашивание уменьшились (таблица 3, рис. 3).

Исходя из процента положительных случаев, наблюдается обратная тенденция для TM1 и miR-21, тогда как это менее очевидно как для PTEN, так и для PDCD4 с miR-21. Чтобы дополнительно исследовать возможную обратную связь между шаблоном окрашивания miR-21 и шаблонами окрашивания, мы также провели анализ каждого случая. В IDC окрашивание TM1 обычно отрицательно и miR-21 положительно, тогда как в нормальной ткани TM1 обычно положительный и miR-21 отрицательный. В FEA и DCIS наблюдается тенденция к тому, что самые сильные сигналы TM1 наблюдались в случаях отсутствия miR-21 (дополнительный файл 2). Для PTEN положительное окрашивание наблюдалось во всех четырех компонентах (нормальный, FEA, DCIS и IDC), тогда как наблюдалось явное увеличение miR-21 для процента положительных случаев от нормального до FEA, DCIS и IDC (дополнительный файл 3). Для PDCD4 сочетание интенсивности сигнала для ядерного и цитоплазматического окрашивания с окрашиванием miR-21 также не показало четкой тенденции. Однако ядерный образец окрашивания PDCD4 показывает обратное отношение к шаблону окрашивания miR-21 для нормального и IDC. Для FEA и DCIS такое отношение не было очевидным (дополнительный файл 4).

FEA обнаруживается все чаще, из-за программ скрининга рака молочной железы. Хотя в нескольких исследованиях указывается, что ВЭД можно рассматривать как предраковое поражение независимо от того, развивается ли прогрессирование в DCIS, данные клинических наблюдений недвусмысленно подтверждают этот вывод [3,4]. Настоящее исследование подтверждает отсутствие экспрессии miR-21 в подавляющем большинстве образцов нормальной ткани молочной железы и положительности в большинстве случаев IDC, как сообщалось ранее [13,14]. FEA и DCIS выражают miR-21 в 47 и 75% случаев соответственно.

Недавние исследования показали, что по крайней мере некоторые miRNAs действуют как онкогены, играя роль в регуляции пролиферации и апоптоза. MiR-21 постоянно усиливается при инвазивном раке молочной железы с заметным увеличением IDC 2/3 степени по сравнению с 1-м номером IDC [14]. В одном исследовании RNA-ISH с использованием флуоресцентно меченных зондов применяли при раке молочной железы, демонстрируя, что экспрессия miR-21 часто увеличивается в IDC по сравнению с нормальной грудной клеткой [26]. В нашем исследовании прогрессирующее увеличение процента положительных случаев miR-21 наблюдалось от нормальных (13%) до FEA (47%), DCIS (75%) и IDC (88%). Наблюдался один исключительный случай (# 8) с положительным окрашиванием в нормальном состоянии и DCIS, но не в компоненте FEA. Исходя из увеличения числа положительных случаев от нормального, к FEA, DCIS и IDC, возникает соблазн предположить, что увеличение miR-21 в FEA может свидетельствовать о пред-злокачественном фенотипе FEA. Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали несколько геномных аберраций в низком проценте FEA [5-7].

До настоящего времени два экспериментальных гена miR-21 были экспериментально подтверждены при раке молочной железы, то есть TM1 [15] и PDCD4 [16,27,28]. Третий потенциальный геном-миром miR-21, PTEN, был идентифицирован при печеночном клеточном раке и до сих пор не был протестирован при раке молочной железы [18]. Прямые эффекты функции miR-21 при раке молочной железы были получены в двух последних исследованиях путем ингибирования miR-21, что привело к уменьшению инвазии и метастазирования легких в MDA-MB-231 и подавлению клеточного роста клеток MCF-7 как in vitro, так и in vitro в модели мыши ксенотрансплантата [27,28].

PTEN — ген супрессора опухоли, связанный с отрицательной регуляцией в пути фосфоинозитид-3-киназы (PI3-киназы) [29]. Meng et al. показали, что экспрессия PTEN снижалась в нормальных человеческих гепатоцитах после индукции miR-21. Более того, используя репортерный анализ люциферазы, они продемонстрировали, что PTEN непосредственно нацелен на miR-21 [18]. В нашем исследовании уровни экспрессии PTEN были +++ во всех нормальных компонентах и ​​++ или +++ в подавляющем большинстве отделений FEA, DCIS и IDC. Небольшие различия в интенсивности окрашивания для PTEN в этих компонентах вместе с сильным увеличением, наблюдаемым для miR-21 от нормали к IDC, не подтверждают заметную роль индуцированного miR-21 репрессии ПТЕН при раке молочной железы. Более того, согласованный анализ miR-21 и PTEN на один компонент и в каждом случае также не показал обратной корреляции. Предыдущие исследования показали потерю экспрессии белка PTEN в IDC [20,30] и в одном исследовании также в DCIS, хотя и в более низком проценте случаев по сравнению с IDC [31]. В нашей серии потеря ПТЕН не наблюдалась, вероятно, из-за нашей относительной небольшой серии.

PDCD4 был идентифицирован как новый ген супрессора опухоли, и было установлено, что он был подавлен в нескольких типах рака человека. Франкель и др. [16] продемонстрировали, что miR-21 нацеливает PDCD4 на репортерный анализ на основе люциферазы. Более того, они также продемонстрировали, что подавление PDCD4 в клетках MCF-7 значительно уменьшало антипролиферативный эффект ингибирования miR-21, что указывает на существенную роль PDCD4 в качестве медиатора биологических эффектов miR-21 в клетках рака молочной железы. При раке молочной железы наблюдалась снижение экспрессии PDCD4 по сравнению с нормальной грудной клеткой. Экспрессия PDCD4 была главным образом локализована в ядрах в DCIS, тогда как она была преимущественно экспрессирована в цитоплазме в нормальной ткани молочной железы [32]. Напротив, мы обнаружили, что экспрессия PDCD4 смещалась от ядер к цитоплазме с прогрессированием грудной ткани от нормали к IDC, тогда как ядерная экспрессия PDCD4 уменьшалась от нормальной груди до FEA, DCIS и IDC. При колоректальном раке наблюдался переход от ядерного к цитоплазматическому окрашиванию из нормальной ткани, аденомы толстой кишки и колоректального рака [22] в соответствии с нашими результатами. До сих пор литература о местонахождении PDCD4 все еще противоречива и нет четких данных, демонстрирующих специфическую функцию цитоплазматического или ядерного PDCD4. Поскольку мы наблюдали только переход от цитоплазмы к ядру или наоборот, а не заметное изменение общего количества белка, маловероятно, что PDCD4 является прямой мишенью miR-21. Однако мы не можем исключить косвенный эффект miR-21, регулируя белок, который участвует в локализации PDCD4.

TM1 относится к семейству тропомиозинов (ТМ) и действует как супрессор клеточного преобразования [33]. Таргетирование TM1 на miR-21 было показано снижением регуляции экспрессии TM1 при индукции miR-21 и повышением экспрессии TM1 при лечении анти-miR-21 в клеточной линии рака молочной железы [15]. Наши результаты показали, что было отмечено заметное снижение процентной доли положительных случаев ТМ1 с прогрессированием, т. Е. Большинство случаев были положительными как в нормальном, так и в ВЭД, а меньшинство случаев было положительным в IDC. Образец окрашивания в нормальном и IDC показывает обратное отношение к шаблону окраски miR-21, согласующемуся с нацеливанием TM1 на miR-21. Для компонентов FEA и DCIS это обратное отношение менее очевидно.

В недавней работе Talotta et al. показали, что транскрипция первичного транскрипта miR-21 индуцируется AP-1 в ответ на RAS в индуцируемой RAS линии клеток FRTL-5 / ER-RAS [34]. В этой модели клеточной линии индукция miR-21 отвечала за подавление PDCD4 и PTEN. Не наблюдалось снижения уровня белка TM1. Эти данные не согласуются с нашими результатами окрашивания, демонстрируя неизменно высокий уровень экспрессии для PDCD4 и PTEN в нормальных, FEA, DCIS и IDC. Напротив, шаблон окрашивания для TM1 показывает обратный шаблон окрашивания по сравнению с рисунком miR-21. Является ли эта модель актуальной для развития рака молочной железы сомнительной.

Процент положительных случаев miR-21 постепенно увеличивался с нормального уровня до FEA, DCIS и IDC. Наши результаты показывают, что в пяти из 12 случаев с одновременным представлением нормальных FEA и DCIS компоненты FEA и DCIS имеют сходный профиль miR-21. Это согласуется с предыдущими публикациями, свидетельствующими о сходных генетических аберрациях в FEA и DCIS. Обратный шаблон окрашивания наблюдался для miR-21 и TM1 в нормальных и IDC-компонентах, но не в FEA и DCIS. Эти данные могут поддержать нацеливание TM1 на miR-21 при раке молочной железы.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

GH, LPT и SH проводили РНК-ИШ. TS и IP проводили иммуногистохимические окраски. AB контролировал эксперименты miRNA ISH. HH и JB отвечали за оценку окрашивания. LF участвовал в сборе материала, а LQ отвечал за сбор данных, статистический анализ и подготовку рукописи. HH, JB и AB отвечали за дизайн исследования и за подготовку рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Доступ к этой публикации можно получить здесь:

хттп://ввв.биомедцентраль.ком/1471-2407/я/163/препуб

Пост и отрицательный контроль TM1 и PDCD4 в ткани толстой кишки. PDCD4 в нормальном кишечном эпителии (положительный контроль) и в карциноме толстой кишки кишечника (отрицательный контроль). Тропомиозин 1 окрашивает в толстой кишке, гладкую мускулатуру слизистой оболочки мускулатуры и капиллярной стенки в качестве положительного контроля, тогда как эпителий и лимфоидные клетки являются отрицательным контролем.

Нажмите здесь для файла

Сравнение miR-21 и TM1. Прямое сравнение экспрессии miR-21 и TM1 в разных тканевых компонентах для каждого случая отдельно.

Нажмите здесь для файла

Сравнение miR-21 и PTEN. Прямое сравнение экспрессии miR-21 и PTEN в разных тканевых компонентах для каждого случая отдельно.

Нажмите здесь для файла

Сравнение miR-21 и PDCD4. Прямое сравнение экспрессии miR-21 и PDCD4 в разных тканевых компонентах для каждого случая отдельно.

Нажмите здесь для файла

LQ поддерживается стипендией Бернулли (UMCG), и это исследование было частично поддержано Комитетом высшего образования Тяньцзиня в Китае. (Номер проекта: 20040218).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *