Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Новый тритерпеноид, изолированный от корневой коры Ailanthus excelsa Roxb (Дерево Неба), AECHL-1 как потенциальный антираковый агент

A Novel Triterpenoid Isolated from the Root Bark of Ailanthus excelsa Roxb (Tree of Heaven), AECHL-1 as a Potential Anti-Cancer Agent
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671403/

Задуманные и разработанные эксперименты: SK SLS. Выполнял эксперименты:
                        MSL SK. Проанализированы данные: MSL SK SHM SLS. Внесенный
                        реагенты / материалы / инструменты анализа: SHM SLS. Написал газету: SK SLS.

Мы сообщаем здесь об изоляции и характеристике нового соединения Ailanthus
                        экстрацелла хлороформ-1 (AECHL-1)
                        (C29H36O10, молекулярная масса 543,8) из
                        корковая кора Ailanthus excelsa Roxb. Соединение
                        обладает противораковой активностью против ряда раковых клеточных линий
                        другой изначальный.

Обработка AECHL-1 в течение от 12 до 48 часов ингибировала пролиферацию клеток и индуцировала
                        смерть в клетках B16F10, MDA-MB-231, MCF-7 и PC3 с минимальным ростом
                        ингибирование в нормальном НЭК 293. Противоопухолевое действие AECHL-1 было сопоставимым
                        с обычными противоопухолевыми препаратами паклитаксел и цисплатин.
                        Ингибирование роста AECHL-1 связано с S / G2-M
                        аресты в камерах MDA-MB-231, MCF-7 и PC3 и остановке G1 в
                        B16F10. Мы наблюдали нарушение микротрубочек в клетках MCF-7, обработанных
                        AECHL-1 in vitro. По сравнению с контролем, подкожная инъекция AECHL-1
                        к сайтам опухоли меланомы мыши B16F10, имплантированной в мышей C57BL / 6 и
                        клетки MCF-7 рака молочной железы человека у голых голых мышей привели к значительному
                        уменьшение объема опухоли. В опухолях B16F10 AECHL-1 при 50
                        мкг / мышь в день в течение 15 дней приводили к увеличению экспрессии
                        белки супрессоров опухолей P53 / p21, снижение экспрессии
                        онкоген c-Myc и downregulation циклина D1 и cdk4. Дополнительно,
                        Обработка AECHL-1 приводила к фосфорилированию р53 в серине 15 в
                        B16F10, которые, по-видимому, проявляют р53-зависимое ингибирование роста
                        ответы.

Настоящие данные демонстрируют активность тритерпеноида AECHL-1, который
                        обладают широким спектром активности против раковых клеток. Мы предлагаем здесь
                        что AECHL-1 — футуристический противораковый препарат, терапевтический потенциал которого
                        необходимо широко изучить для химиотерапии против рака.

По данным Всемирной организации здравоохранения, основанной на заболеваемости, смертности,
                бремя и эмоциональные трудности, рак можно считать самым обременительным здоровьем
                проблема, поражающая людей во всем мире [1]. В настоящее время более 22,4
                миллионы людей в мире страдают от рака. Приблизительно 10,1 млн.
                в новых случаях ежегодно диагностируется рак, и более 6,2 млн. человек умирают от
                болезни в 2000 году [2]. Это увеличение
                19% заболеваемости и 18% смертности с 1990 года. Важный
                Цель исследований рака — найти терапевтические соединения, имеющие высокую специфичность для
                раковые клетки / опухоль и меньше побочных эффектов, чем используемые в настоящее время
                цитостатические / цитотоксические агенты.

Многочисленные растительные соединения, используемые при химиотерапии рака, включают винбластин,
                винкристин, производные камптотецина, этопозид, полученный из эпиподофиллотоксина,
                и паклитаксел (таксол®) [3]. Однако большинство этих соединений проявляют клетку
                токсичности и может индуцировать генотоксические, канцерогенные и тератогенные эффекты в неопухолевых
                клеток, а некоторые из них не удались в более ранних клинических исследованиях [4], [5]. Другой наиболее широко используемый
                В настоящее время препарат на основе металлов на фоне различных видов рака является цисплатином [6], но
                использование цисплатина в лечебной терапии было связано с некоторыми серьезными клиническими
                проблемы, такие как тяжелая нормальная тканевая токсичность и устойчивость к лечению
                    [7].
                Эти побочные эффекты ограничивают их использование в качестве химиотерапевтических средств, несмотря на их высокую
                эффективность при лечении злокачественных клеток-мишеней. Следовательно, новые методы лечения и
                стратегии лечения этого заболевания необходимы для лечения пациентов с этим
                болезни. Таким образом, поиск альтернативных лекарств, которые эффективны в
                лечение рака, а также нетоксичные для нормальной ткани — важное исследование
                line [8].

Терпеноиды широко используются для их ароматических качеств. Они играют определенную роль в
                традиционные травяные средства и находятся под следствием для антибактериальных,
                противоопухолевых и других фармацевтических функций. Природные тритерпеноиды, такие как
                олеанолевой кислоты и урсоловой кислоты, являются соединениями с противоопухолевыми и
                противовоспалительные свойства [9]. Синтетические производные тритерпеноида, такие как
                2-Циано-3,13-диоксолеана-1,9 (11) -диен-28-овой кислоты (CDDO) [10] и ее производного
                1- [2-циано-3-, 12-диоксоолеана-1,9 (11) -диен-28-оил] имидазол
                (CDDO-Im) [11] также обладают противоопухолевой активностью. Коренная кора
                    Ailanthus excelsa Roxb (Дерево Небес), дерево, принадлежащее
                семья Simaroubaceae широко используется в аюрведе, о чем свидетельствует
                фитотерапия [12]. Другие виды из этого семейства хорошо известны
                за их противораковые мероприятия [13]. Химические составляющие А.
                excelsa включают некоторые тритерпены и алкалоиды [14]. В настоящем исследовании мы
                оценили in vitro и in vivo
                противораковой активности нового тритерпеноида, AECHL-1, выделенного из коры корня
                растение и оказалось очень эффективным в раковых клетках разной линии.

Коренная кора A. excelsa была ботанически проверена
                    Профессор Шрихари Мишра (один из авторов настоящей рукописи) и
                    экстракция и фракционирование сушат на воздухе порошкообразной корковой корой, используя
                    хлороформ. Выделение AECHL-1 проводили с использованием колоночной хроматографии на силикагеле
                    и характеризуется ультрафиолетовым (Shimadzu 1700), инфракрасным (Perkin Elmer
                    Spectrum RX1), ядерный магнитный резонанс (спектрометр Bruker Avance I NMR) и
                    масс-спектроскопия (масс-спектрометром Jeol SX 102). Чистота AECHL-1
                    оценивали с помощью ВЭЖХ на колонке RP C-18 Phenomenex, используя метанол-воду
                    (90:10, объем для объема) в качестве подвижной фазы. Очищенное соединение,
                    AECHL-1 растворяли в ДМСО в качестве исходных растворов.

Нормальная линия клеток эмбриональной почки человека (HEK 293), клетки меланомы мыши B16F10
                    (B16F10), карциному молочной железы человека (MDA-MB-231), аденокарциноме молочной железы человека
                    (MCF-7) и клетки предстательной железы человека (PC3) были получены из АТСС (Manassas, VA).
                    Клетки HEK 293, MCF-7 и B16F10 культивировали в модифицированном Дульбекко
                    Средство Eagle и PC3 в среде Ham’s F-12 (Gibco) в
                    37 ° С и менее 5% СО2. Клетки MDA-MB-231 культивировали
                    в Лейбовице L-15 (Gibco), дополненном 10% FCS
                    (Gibco), 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина в
                    увлажненную атмосферу при 37 ° С.

Прямое взаимодействие между различными концентрациями AECHL-1 (0-200
                    мкМ) и МТТ в бесклеточной системе не наблюдалось, поэтому МТТ
                    анализ использовался для проверки жизнеспособности клеток в текущей системе. HEK 293, B16F10,
                    Клетки PC3, MCF 7 и MDA-MB-231 (4 × 103 / лунка) культивировали
                    в 96-луночных планшетах и ​​через 24 часа обрабатывают различными концентрациями
                    AECHL-1 (0-200 мкМ), цисплатин (0-100 мкМ)
                    или паклитакселом (0-50 мкМ) в течение 12, 24 и 48 ч при
                    37 ° С. Жизнеспособность клеток оценивали методом МТТ (0,5 мг / мл) в виде
                    описанных ранее [15].

Пролиферацию клеток MCF-7 определяли измерением (3H)
                    тимидина. Вкратце, аликвоты полной среды, содержащей
                        4 × 103 клетки распределяли в 96-луночный слой
                    культуры. Через 24 часа среду заменяли различными концентрациями
                    AECHL-1 (0-100 мкМ), цисплатин (0-100
                    мкМ) или паклитакселом (0-50 мкМ). Через шесть часов после
                    лечение 1 мкКи / лунку (3H) тимидин (правление радиации и
                    Изотопная технология, Мумбаи, Индия) и культуры инкубировали
                    далее в течение 42 часов при 37 ° C. Клетки промывали и собирали в
                    сцинтилляционной смеси и радиоактивности, включенной в ДНК, было
                    определяемый с помощью жидкого сцинтилляционного счетчика (Canberra Packard).

B16F10, MDA-MB-231 и MCF-7 (3 × 105 / мл)
                    с различными концентрациями AECHL-1 (0-40 мкМ) в течение 24 часов
                    при 37 ° С. Клетки собирали через 24 часа, апоптоз определяли
                    с использованием набора для обнаружения апоптоза инстинкта V-FITC (Calbiochem, США) с потоком
                    цитометрии (FACS Vantage-BD Sciences, США). Данные были проанализированы с использованием
                    Cell Quest для определения процента апоптотических клеток.

B16F10, PC3, MDA-MB-231 и MCF-7 (3 × 105 / мл) были
                    обрабатывают различными концентрациями AECHL-1 (0-100 мкМ),
                    или паклитакселом (0-10 мкМ) в течение 24 часов. Анализ клеточного цикла был
                    как описано ранее [16], с потоком
                    цитометрии (FACS Vantage-BD Sciences, США). Данные были проанализированы с использованием
                    Программное обеспечение Cell Quest.

Клетки MCF-7 фиксировали 3,7% параформальдегидом, а затем инкубировали
                    с анти-α-тубулиновыми антителами (1:10000, Sigma, St. Louis,
                    MO). После вымывания антител клетки инкубировали с
                    alexa-сопряженные вторичные антитела (1: 2500; Sigma, St. Louis, MO).
                    Изображения были захвачены конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (Zeiss
                LSM510).

Мужчины C57BL / 6 (6-8 недель) и женские голые голые мыши, NIH,
                    nu / nu Swiss (10 недель) поддерживались в соответствии с Центральным животным
                    Этические процедуры и руководящие принципы Комитета. B16F10 меланомы были
                    собирали, суспендировали в PBS и подкожно вводили в правый фланг
                        (2 × 106 клеток / фланг) мышей C57BL / 6 и клеток MCF-7
                        (5 × 106 клеток / фланг) в женских бестимусных голых мышей. каждый
                    бестимусная мышь была имплантирована подкожно с 0,72 мг
                    17-β-эстрадиола, за 2 недели до инокуляции клеток MCF-7 [17],
                        [18]. Размер опухоли измеряли каждые 3-4 дня
                    объемами сустава и опухоли, определяемыми длиной (L) и
                    ширина (W):
                        V = (LW2) / 2
                        [19]. Через две недели AECHL-1 (50 мкг),
                    AECHL-1 (100 мкг), цисплатин (100 мкг) и PBS в качестве носителя
                    контроль вводили подкожно к месту опухоли в течение 15 дней в C57BL / 6
                    мышей (n = 6) и AECHL-1 (5 мкг),
                    AECHL-1 (10 мкг), паклитаксел (20 мкг) и PBS в качестве носителя
                    контроль вводили подкожно к месту опухоли в день в течение 10 дней в
                    женских безжизненных мышей (n = 6). Объем опухоли
                    измеряли с регулярным интервалом во время исследования. В конце эксперимента
                    опухоли и других органов были расчленены для гистологического анализа и западных
                    кляксы.

Ткани и органы C57BL / 6 и голых мышей фиксировали в спиртовом формалине в течение 24
                    ч и внедрен в парафин, как описано ранее [20]. Тканевые секции
                    (5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином (H & E),
                    визуализируется и фотографируется с помощью инвертированного микроскопа (Nikon, ECLIPSE,
                    TE2000-U, Япония).

Опухолевую ткань гомогенизировали в буфере RIPA (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 120
                    мМ NaCl, 1,0% Triton × 100, 0,1% SDS,
                    1% дезоксихолата натрия, 10% глицерина, 1 мМ ЭДТА и
                    1 × коктейль ингибитора протеазы, Roche) белки были выделены в
                    солюбилизированную форму и концентрации измеряли с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad
                    набор для анализа белка). Солюбилизированный белок (60 мкг) денатурировали в
                    2 × SDS-PAGE буфер (сигма), разрешенный в 10%
                    SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, а затем
                    блокирование мембраны 5% обезжиренным молочным порошком (мас. / об.) в TBST (10 мМ
                    Трис, 150 мМ NaCl, 0,1% Твин 20). Мембраны инкубировали с
                    кроличьи поликлональные анти-р21 и антитела против рр53 (1:000, Санта
                    Cruz, CA), мышиные моноклональные анти-CDK4, антициклин D1-антитела
                    (1:000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA), мышиный моноклональный
                    анти-c-Myc-антитело и мышиное моноклональное антитело против р53 (1:000;
                    Abcam, USA), а затем HRP-конъюгированные соответствующие вторичные антитела и
                    визуализируется с помощью усовершенствованной системы обнаружения хемилюминесценции (Pierce). Мембраны
                    были удалены и повторно исследованы с помощью β-актинового первичного антитела
                    (1:10000; MP Biomedicals, Ohio, USA) в качестве контроля загрузки белка.

Данные о объемах опухолей представлены в виде среднего ± SEM.
                    Статистические различия определялись с помощью ANOVA и применяли посттестирование
                    Тьюкей-Крамер.

ИК (KBr): 3425, 3419 (гидроксильная группа), 2972, 2966, 2923, 2873 (алкил С-Н
                    стретч), 1733 (& delta; лактон), 1718 (Bi ацетил), 1680
                    (C = O-конъюгация с алкеном), 1652
                    (-C = С), 1600 (ароматический), 1492,
                    1454, 1394 (метильное растяжение), 1222 (& delta; лактон), 1184, 1110, 1051, 1031
                    (ацетали), 1018 нм (алканы). 1H-ЯМР (ДМСО, 400 Гц), & delta;: 0,95
                    (3H, т, 4′-CH3), & delta ;: 1,15 (3H, д,
                    H-24), & delta ;: 1,235 (3H, д, 5′-CH3), & delta ;: 1,5 (2H,
                    ddd, 5′-CH2), & delta ;: 1,73 (3H, ддд, H-21), & delta ;:
                    1,83 (1H, с, H-9), & delta ;: 1,87 (1H, с, H-14), & delta ;: 1,9 (2H, с, H-18)
                    δ: 2,16 (3H, с, H-18), δ: 2,3 (3H, д, H-19), & delta;: 2,71 (2H,
                    с, H-20), & delta ;: 3,45 (2H, дд, H-23), & delta;: 3,65 (2H, д, H-22)
                    δ: 3,95 (1H, т, H-12), δ: 4,05 (2H, с, H-22), δ: 5,30
                    (1H, с, H-15), & delta ;: 5,46 (1H, с, OH-2), & delta ;: 5,73 (1H,
                    д, OH-2 ‘), & delta ;: 6,89 (1H, с, H-3), & delta ;: 8,82 (1H, с,
                    ОН-11).

Массовая спектроскопия бомбардировки быстрыми атомами: m / z: 1068 из-за диммера
                    образование. Фактический (M +) считался равным 543,8, 463,3
                        (M-C4H1O2), 461,4
                        (M-C4H2O2), 459,4
                        (M-C4H4O2), 361,2
                        (M-C9H11O4) (фиг. 1B) и масс-спектры (фиг. S1).
                    AECHL-1 представляет собой твердое вещество, т.пл. 248-250 ° С обладает молекулярным
                    формула C29H36O10, как указано EI и ES
                    масс-спектров. ИК-спектр показал присутствие гидроксила (s) (3425 нм, 3419
                    нм), δ лактон (1733 нм) и ароматический фрагмент (1600 нм). УФ-спектр
                    дал характерный максимум поглощения при 235 нм, что указывает на наличие
                    оксохромные группы, такие как гидроксил и кетон. Спектр 1H-ЯМР
                    AECHL-1 обнаружил присутствие ароматического протона δ 6,89 и синглет
                    при δ 5,30, что характерно для сложноэфирной функции при C-15. Н-22
                    как система АВ в виде синглета при δ 4,05 и дублет при δ
                    3,65 и Н-12 проявлялись как триплет при δ 3,95. Метильная группа H-19 на
                    ароматическое кольцо проявлялось как синглет при δ 2,3. Дублет при δ
                    1.235 для шести протонов назначается при H-5 ‘. H-4 ‘появился как
                    триплет при δ 0,95. Метильная группа H-18 проявлялась как синглет при
                    δ 2,16 (фиг. 2).

Одиночный пик показал, что препарат был> 99%
                            чистый.

Эффект AECHL-1 на жизнеспособность клеток B16F10, PC3, MDA-MB-231 и MCF-7 был
                    оценены. AECHL-1 ингибировал клеточный рост клеток MCF-7 в концентрациях и
                    зависящим от времени методом MTT-анализа (рисунок 3A). AECHL-1 ингибировал рост клеток в разных раковых клетках
                    линии с минимальным ингибированием роста в HEK 293 через 48 часов (рис. 3B). HEK 293, обработанный 200
                    μM AECHL-1 демонстрирует высокую выживаемость (> 90%), поскольку
                    по сравнению с раковыми клетками. Было установлено, что AECHL-1 более эффективен для MCF-7 в
                    сравнение с B16F10, PC3 и MDA-MB-231 в ингибировании пролиферации клеток как
                    наблюдаемый поглощением (3H) тимидина через 48 часов (рис. 3C). Кроме того, AECHL-1
                    оказалось более сильным, чем паклитаксел или цисплатин в клеточной пролиферации
                    ингибирование в клетках MCF-7 через 48 часов (рисунок 3D).

(A). Рост клеток методом МТТ в клетках MCF-7 обрабатывали различными
                            концентрации AECHL-1 (10, 20, 40 и 100 мкМ) для 12, 24
                            и 48 ч и жизнеспособность клеток определяли методом МТТ; (B) Ячейка
                            рост методом МТТ в клетках B16F10, PC3, MDA-MB-231 MCF-7 и HEK-293.
                            Клетки обрабатывали различными концентрациями AECHL-1 (10, 20, 40
                            100 и 200 мкМ) в течение 48 ч, и определяли жизнеспособность клеток
                            методом МТТ; (C) Пролиферацию клеток (3H) тимидином
                            включение в ячейки B16F10, PC3, MDA-MB-231 и MCF-7. Клетки были
                            обрабатывают различными концентрациями AECHL-1 (10, 20, 40 и 100
                            мкМ) в течение 48 ч, и пролиферацию клеток определяли
                                (3H) тимидина; (D) Сравнение AECHL-1
                            с другими химиотерапевтическими препаратами. Клетки MCF-7 обрабатывали
                            различные концентрации (5, 10, 20 и 50 мкМ) паклитаксела,
                            цисплатин и AECHL-1 в течение 48 ч, и определяли пролиферацию клеток
                            путем включения (3H) тимидина. Данные
                            означает ± SEM трех независимых экспериментов.

Конъюгированное с присадкой FITC и пропидиум иодид (PI) использовали для анализа
                    общий процент апоптотических клеток, индуцированных AECHL-1. Следователь
                    идентифицировать ранние апоптотические клетки (приекция V-FITC положительная, отрицательная PI), клетки
                    которые находятся в позднем апоптозе (Annexin V-FITC и PI positive), некротические клетки
                    (Только для PI-положительных) и жизнеспособных клеток (приложение V-FITC и PI отрицательное).
                    Общий процент апоптотических клеток увеличился до 36,25% и
                    37,18% при 20 мкМ в клетках B16F10, MDA-MB-231 соответственно
                    и 60,66% при 5 мкМ в клетках MCF-7 (фиг. 4).

Обнаружение апоптоза проводили с помощью обнаружения апоптоза приложением V-FITC
                            комплект в соответствии с инструкциями производителя, а затем
                            анализируется проточной цитометрией: UR указывает процентное соотношение
                            апоптотические клетки (приюты V и PI-положительные клетки), а LR указывает на
                            процент ранних апоптотических клеток (положительные клетки приекиса V). Данные
                            представлены в дот-блоттингах с изображением аннексина / флуоресцеина изотиоцианата
                                (ось x) против окрашивания PI (ось y).
                            Отображается процент клеток в каждом квадранте. Результаты
                            представитель трех независимых экспериментов.

Чтобы определить фазу клеточного цикла, при которой AECHL-1
                    ингибирующий рост эффект, экспоненциально растущие B16F10, PC3, MDA-MB-231 и
                    Клетки MCF-7 обрабатывали различными концентрациями AECHL-1 в течение 24 часов и
                    анализируется проточной цитометрией (таблица
                        1). Мы наблюдали, что клетки B16F10, обработанные AECHL-1, показали
                    увеличение популяции в фазе G1 (52,18-72,08
                    %) с сопутствующим снижением процента клеток в S-G2 / M
                    (47,98-26,16%), что свидетельствует об аресте G1. В
                    контрастность, количество клеток PC3, MDA-MB-231 и MCF-7 в фазе S-G2 / M
                    увеличился с 42,91% до 57,62%, 49,40%
                    77,16% и 45,13% до 70,97% соответственно
                    ответ на лечение AECHL-1 и снижение фазы G1 от
                    55,65% — до 39,02%, 49,54% — 22,82%,
                    53,67% до 27,85% соответственно, что указывает на арест роста
                    в фазе S-G2 / M в клетках PC3, MDA-MB-231 и MCF-7. Паклитаксел показал
                    увеличение популяции клеток MCF-7 в фазе G2 / M (29,30%
                    72,55%) с уменьшением процента клеток в фазе G1
                    (48,30% до 4,62%), что указывает на остановку роста в фазе G2 / M
                        (Таблица 1). Эти
                    результаты показывают, что ингибирование прогрессирования клеточного цикла может быть одним из
                    молекулярные события, связанные с избирательной противораковой эффективностью AECHL-1 в
                    раковые клетки.

Влияние AECHL-1 на прогрессирование клеточного цикла в B16F10, PC3, MDA-231,
                                MCF-7 и паклитаксел в клетках MCF-7 за 24 часа лечения. клетка
                                циклы анализировали с использованием иодида пропидия. Содержание ДНК
                                анализируется с использованием FACS для определения распределения клеточного цикла.

Окрашивание микротрубочек в контроле и клетки, обработанные AECHL-1 и паклитакселом,
                    показали, что как AECHL-1, так и паклитаксел привели к нарушению микротрубочек с
                    увеличение плотности клеточных микротрубочек и образование толстых
                    пучки микротрубочек, окружающие ядро, по сравнению с необработанными
                    контрольных клеток (рисунок 5).

Клетки MCF-7 обрабатывали транспортным средством в качестве контроля, AECHL-1 (5
                            мкМ) и паклитакселом (5 мкМ) в качестве положительного контроля для
                            24 ч, а микротрубочки (красные) визуализировались косвенными
                            иммунофлюоресценции. DAPI использовали для окрашивания ядер клеток (синий).
                            Представитель 25-30 клеток каждый в 3 отдельных
                        эксперименты.

Мы также изучили влияние AECHL-1 на рост первичных опухолей in vivo.
                    Наши предварительные исследования показали, что из различных доз AECHL-1 (0,5-5
                    мг / кг), вводимого внутрибрюшинно у мышей C57BL / 6, максимальная переносимая доза была
                    разовая доза 0,5 мг / кг, которая не обнаружила явных признаков токсичности при наблюдении
                    на один месяц. Исходя из этого, выбранная доза составляла 50 и 100
                    мкг / кг / день (доза, которая составляла 10-20% от этого максимума
                    допустимая доза). На 18-й день значительное увеличение объема опухоли в контрольной группе
                    (р <0,001), и регрессия в объеме опухоли была очевидна у обработанных мышей                     с 50 мкг AECHL-1 (44,303 ± 5,20%                     (p <0,001)) и 100 мкг AECHL-1                     (51,014 ± 1,27% (р <0,001)). Опухоли, обработанные 100                     μg цисплатин показал уменьшение объема опухоли                     (93,13 ± 0,539% (p <0,001)). Однако AECHL-1 (50                     мкг) против AECHL-1 (100 мкг), как было установлено, не имеет значения                     (Р> 0,05). При контроле 24 дня AECHL-1 (50 мкг) и AECHL-1 (100
                    мкг) мышей показали дальнейшее увеличение объема опухоли
                    (р <0,001), но мышам, получавшим цисплатин, было показано уменьшение опухоли                     объем (p <0,001). Однако, хотя цисплатин показал дальнейшее снижение                     объем опухоли, ущерб, причиненный другим органам, был больше, чем в                     AECHL-1 (50 и 100 мкг) у мышей C57BL / 6 (фиг. 6A и 6B).

(A) Фотографии мышей C57BL / 6 с 4-недельным ростом опухоли аллотрансплантата
                            клетками B16F10; ниже, вырезанные опухоли с соответствующими
                            мышей; (B) Объем опухоли определяли с временными интервалами, как описано в
                                «Материалы и
                            Методы». Объем опухоли подопытных животных после
                            обработка 50, 100 мкг AECHL-1 и 100 мкг
                            цисплатин сравнивали с объемом опухоли контрольных животных; (С)
                            Фотографии бестимусных голых мышей с 4-недельной опухолью ксенотрансплантата
                            рост клеток MCF-7; ниже, вырезали опухоли с
                            соответствующие мыши; (D) Объем опухоли экспериментальных животных после
                            лечение 5, 10 мкг AECHL-1 и 20 мкг паклитаксела
                            сравнивали с объемом опухоли контрольных животных. Результаты представляют
                            среднее ± SE шести стартовых животных в каждой группе.
                            Значительные различия между * Intra group на каждом
                            точка времени представлены как: ns p> 0,05,
                                * Р <0,05,                             ** P <0,01,                                 *** P <0,001 и                             # В группе в разных дозах представлены                             ns P> 0,05, # <0,05,                             ## P <0,01, ### P <0,001.

Поскольку цитотоксические дозы AECHL-1 для клеток MCF-7 in vitro были очень низкими,
                    дозы, выбранные для ксенотрансплантатов опухоли у женщин без голых голых мышей, которым вводили
                    Клетки MCF-7 составляли 5 и 10 мкг. Эти дозы показали регресс в опухоли
                    объем: 35,72 ± 0,05% для 5 мкг (р <0,001)                     и 28,55 ± 0,06% для 10 мкг (р <0,001)                     тогда как опухоли, обработанные 20 мкг паклитаксела, показали регрессию в                     объем опухоли (14,19 ± 0,32% (p <0,05)), что было меньше                     чем группа, обработанная AECHL-1 (рис. 6C и 6D).

Мы оценили влияние лечения AECHL-1 на экспрессию опухоли
                    супрессорный р53, регуляторный белок клеточного цикла Cyclin D и cdk4 и
                    онкоген c-Myc. Как показано на фиг. 4Е, AECHL-1 при 50 мкг / мышь в день
                    B16F10-имплантированные опухоли у мышей C57BL / 6 приводили к увеличению
                    экспрессию белка р53 дикого типа и затем уменьшали при более высокой концентрации
                    (100 мкг / мышь / день). Уровень p53 был больше в
                    AECHL-1, чем в группе, получавшей цисплатин, что указывает на то, что
                    противоопухолевое действие AECHL-1 отличается от цисплатина. Поскольку фосфорилирование
                    на остатке Ser-15 p53 имеет решающее значение для p53-зависимой активации клетки
                    циклических регуляторных белков для остановки G1, мы определили фосфорилирование
                    статус p53 и cyclin D1 и cdk4. Результатом лечения AECHL-1 стало увеличение
                    в фосфорилировании р53 в остатке серина 15 в опухолях при 50
                    мкг / мышь в день с одновременным увеличением уровня р21 и
                    уменьшилось на 100 мкг / мышь в день. Вестерн-блот-анализ показал, что
                    лечение 50 и 100 мкг / мышь / день AECHL-1 вызвало значительный
                    снижение циклических регуляторных белков cyclin D1 и cdk4. Лечение 50
                    и 100 мкг / мышь / день AECHL-1 также вызвали значительное снижение
                    онкоген c-Myc, что указывает на то, что ингибирование клеточного цикла может быть
                    ответственный за противоопухолевые эффекты AECHL-1 (рисунок 7).

Лизаты опухолевых тканей подвергали SDS-PAGE, за которыми следуют западные
                            иммуноблоттинг. Мембраны зондировали анти-p53, pp53, p21, c-myc,
                            cyclin D1, cdk4 и β-актином, за которыми следуют
                            конъюгированных с пероксидазой соответствующих вторичных антител и визуализированных
                            с помощью усовершенствованной системы детектирования хемилюминесценции. Эксперименты были
                            повторяется трижды с аналогичными результатами и показано представительное пятно
                            для каждого белка.

Гистологическое исследование опухоли у контрольных мышей C57BL / 6 показало хорошо развитые
                    кровеносные сосуды, повышенная неоваскуляризация, плотность клеток и наличие
                    геморрагические области с вероятными признаками ангиогенеза с повышенной вероятностью
                    метастазов (рис. 8.1А).
                    Лечение опухолей 50 мкг AECHL-1 не оказало большого влияния на
                    опухолевая васкуляризация, но показала меньшее количество геморрагических областей,
                    снижение плотности опухолевых клеток и появление пикнотических / некротических клеток в
                    центр опухоли (рис.
                    8.1B). Обработка 100 мкг AECHL-1 показала увеличение
                    некротические клетки, исчезновение неоваскуляризации, геморрагические области и низкие
                    плотность клеток по сравнению с контролем (рис. 8.1C), что указывает на то, что AECHL-1 предотвращает прогрессию
                    ангиогенеза и риска метастазов путем блокирования неоваскуляризации. Цисплатин
                    обработанная группа показала значительное увеличение количества некротических клеток, уменьшение опухоли
                    плотность и объем ячейки (рис.
                        8.1D).

(1) Типичные H & E-окрашенные участки из B16F10 аллотрансплантата
                            опухоли и характеристики этих опухолей были проанализированы
                            (1A-1D). Морфологические характеристики сердца
                            (1E-1H), почки (1I-1L), печени (1M-1P) и
                            селезенка (1Q-1T), шесть мышей использовались в каждом наборе экспериментов.
                            (2) Типичные H & E-окрашенные участки из Ксенотрансплантата MCF-7
                            опухоли и характеристики этих опухолей были проанализированы
                            (2A-2D). Морфологические характеристики сердца
                            (2E-2H), почки (2I-2L) и печени (2M-2P),
                            селезенки (2Q-2T), три мыши использовали в каждом наборе
                            эксперименты.

По сравнению с контролем, сердечная ткань мышей, обработанных 50 мкг
                    AECHL-1 показал нормальную структуру, тогда как 100 мкг
                    некроза миокарда и сокращающих полос. Фрагментация и размазывание
                    мышечных волокон, характерных для коагуляционного некроза (рис. 8.1Е-8.1G).
                    Мыши, обработанные цисплатином, также проявляли некроз миокардиального волокна, незначительный
                    лимфоцитарная инфильтрация, а также фрагментация и размазывание мышцы
                    волокон (рисунок 8.1Н).

По сравнению с контролем, почки мышей, обработанных 50 мкг
                    AECHL-1 показала небольшую трубчатую вакуолизацию и трубчатую дилатацию с
                    геморрагические области с нормальными клубочками, появляющимися в нижней части. лечение
                    с 100 мкг AECHL-1 показали трубчатую вакуолизацию, трубчатую дилатацию,
                    геморрагическое состояние и рассеянные хронические воспалительные клеточные инфильтраты (рис. 8.1I-8.1K).
                    Мышей, получавших цисплатин, были обнаружены рассеянные лимфоциты в сосуде и вокруг него.
                    Многие нейтрофилы также наблюдались в канальцах и интерстиции, т.е.
                    пиелонефрит (фигура
                    8.1L).

По сравнению с контролем печень мышей, обработанных 50 мкг AECHL-1
                    не повлияли на нормального архитектора. Мыши, обработанные 100 мкг AECHL-1
                    сохранил нормального архитектора печени (рис. 8.1M-8.1O). В цисплатине
                    однако были обнаружены обширный некроз гепатоцитов. Стрелка в
                    на правой стороне показаны мертвые гепатоциты, и этот рисунок можно увидеть с помощью
                    разнообразие гепатотоксинов, где очаговый некроз гепатоцитов с лимфоцитами
                    происходит проникновение. В этих тканях поражения выглядят аналогично
                    Болезнь Тиззера, характеризующаяся некрозом в разной степени
                    воспаление в ответ на некроз. Острые поражения печени состоят из
                    некротические очаги, окруженные минимальным, прежде всего нейтрофильным, воспалением (рис. 8.1Р).

Представительные секции селезенки от Control и мышей, обработанных 50 мкг
                    AECHL-1 показала нормальную архитектуру селезенки и мышей, обработанных 50 мкг
                    AECHL-1. Контроль и мыши, обработанные 100 мкг AECHL-1 и цисплатин
                    показала гиперплазию белой целлюлозы, особенно в краевой зоне
                    (Ψ). Гистология показала повышенное количество гранулоцитов в маргинальном
                    зон (рис.
                    8.1Q-8.1T).

Опухоли от контрольных мышей показали выраженную неоваскуляризацию на протяжении всей
                    раздел, окруженный высокоплотными клетками и отсутствие некротических клеток (рис. 8.2А). AECHL-1 в 5
                    μg показала снижение плотности опухолевых клеток и лакуны на протяжении всей
                    опухолевая область. Он также показал потерю неоваскуляции и отсутствие геморрагических
                    (рисунок 8.2B). AECHL—
                    при 10 мкг было показано много пустых пространств, появление геморрагических областей было
                    но уменьшение васкуляции не наблюдалось (рис. 8.2C). Лечение паклитакселом
                    снизила плотность опухолевых клеток с появлением многих пустых пространств и некротических
                    области в разделе (рис.
                    8.2D).

Лечение 5 мкг AECHL-1 не показало никаких изменений в нормальном
                    миокарда, тогда как 10 мкг AECHL-1 и Paclitaxel показали некроз
                    миокарда. Паклитаксел показал обширный некроз миокарда,
                    фрагментация и размазывание миокарда (рис. 8.2E-H). Никаких существенных
                    изменение наблюдалось в структуре почек из обработанных AECHL-1 групп, тогда как
                    лечение паклитакселом показало признаки дилатации вакуумирования трубчатой ​​формы
                    геморрагические области (рис.
                        8.2I-8.1L). Оба AECHL-1 и Paclitaxel не показали никаких
                    изменение нормальной структуры печени (рисунок 8.2M-8.2P) и селезенки
                    разделы (рисунок
                        8.2Q-8.2T).

В настоящем исследовании сообщается о новом противораковое соединение AECHL-1, выделенное из
                корневая кора растения Ailanthus excelsa. AECHL-1 характеризовался
                по УФ, ИК-ЯМР и масс-спектроскопии, а чистота была согласована с помощью ВЭЖХ. Это
                тритерпеноид с высокой полярностью и молекулярным весом 453,8 (фиг. 1 и фиг. 2). Ген гена-супрессора р53 играет
                жизненно важную роль в развитии различных видов рака. По оценкам
                50% всех видов рака развиваются из-за мутаций в p53 [21] — [23].
                Поэтому мы впервые протестировали эффект цитотоксичности и пролиферации AECHL-1 в
                четыре различные раковые клеточные линии с различным тканевым происхождением, которые содержат либо
                дикого типа или мутантного p53, а также p53 null. Клетки B16F10 и MCF-7 содержат дикие
                тип p53, клетки MDA-MB-231 содержат мутантные клетки p53, а клетки PC3 имеют значение p53. Цисплатин,
                сильно повреждающий ДНК агент и паклитаксел, антимитотический агент на основе тубулина
                используется как положительный контроль.

Мы обнаружили, что AECHL-1 ингибирует рост клеток MCF-7 в концентрации
                зависимым образом в 12, 24 и 48 ч (фиг. 3А). Цитотоксичность также наблюдалась в других раковых клетках при
                48 ч в различной степени с минимальным ингибированием роста нормального человека
                эмбриональная клеточная линия почек, HEK-293 (рисунок 3B). Степень цитотоксичности была
                MCF-7> B16F10> PC-3> MDA-MB-231> HEK-293 (фиг. 3B) и ингибирование клеток
                пролиферация была MCF-7> B16F10> MDA-MB-231> PC-3 (рисунок 3C).

По сравнению с паклитакселом и цисплатином, AECHL-1 показал большую активность в MCF-7
                    (Рисунок 3D), B16F10 и
                MDA-MB-231 ингибирование пролиферации клеток через 24 и 48 часов (данные не показаны). Эти
                результаты показывают, что в MCF-7, B16F10 и MDA-MB-231 клеточная линия AECHL-1 больше
                эффективный в ингибировании пролиферации клеток, чем цисплатин или паклитаксел. Однако,
                в клетках PC-3 паклитаксел эффективнее цисплатина и AECHL-1.

Было обнаружено, что в клетках B16F10 AECHL-1 значительно индуцирует остановку клеточного цикла в G1
                фазы, в то время как в клетках MCF-7, MDA-MB-231 и PC3 он обнаружил остановку в фазе S-G2 / M в
                MCF-7 (таблица 1).

Задержка клеточного цикла в клетках MCF-7, обработанных AECHL-1, сопровождалась концентрацией
                зависимый апоптоз, но процент смерти клеток зависел от типов
                Сотовые линии. По сравнению с клетками B16F10 и MDA-MB-231, AECHL-1 был высокоэффективен в
                MCF-7 в высоких и низких концентрациях (рисунок 4).

Широко используется терапевтическое вмешательство в митотический шпиндельный аппарат
                обоснование лечения опухолей. Сеть микротрубочек, необходимая для митоза
                и клеточная пролиферация была нарушена дитерпеноидным паклитакселом
                    [24]. Было также показано, что нарушение микротрубочек
                повышает уровень белка р53 [25]. Наше иммунофлуоресцентное окрашивание тубулина
                показали, что, подобно паклитакселу, AECHL-1 ингибирует сборку микротрубочек (рис. 5).

Наши результаты in vitro показывают, что AECHL-1 может выступать в качестве нового класса микротрубочек
                разрушающий агент, останавливающий прогрессирование клеточного цикла в митотической фазе и индуцирующий
                апоптоз. AECHL-1 тестировали in vivo у мышей C57BL / 6 allograft
                с меланомой, B16F10 и ксенотрансплантацией голых мышей с клетками рака молочной железы человека, MCF-7.
                Было установлено, что инъекции AECHL-1 в опухолевые участки ингибируют рост опухоли в обеих
                моделей. В случае модели меланомы B16F10 суточная доза 50 мкг и 100
                мкг показал значительный противоопухолевый эффект, что привело к регрессии
                (фиг. 6A и
                6B); цисплатин был более эффективным, чем AECHL-1, но AECHL-1 показал
                менее токсичность для почек и сердца, в то время как цисплатин показал больший ущерб почкам,
                сердце, печень и селезенка (рис.
                8,1). В модели рака молочной железы MCF-7 суточная доза составляет 5 и 10 мкг
                показал значительный противоопухолевый эффект, что привело к регрессии установленных опухолей
                    (Фиг. 6С и 6D).

Чтобы понять основные пути in vivo, через которые AECHL-1 может индуцировать
                подавление опухоли, мы изучали экспрессию опухолевого супрессора, клеточного цикла
                регуляторных белков и онкогена в меланоме B16F10. Наш клеточный цикл in vitro
                анализ на B16F10 показал сильную остановку G1 в результате лечения AECHL-1.
                Кроме того, механистическое исследование in vivo в опухоли B16F10 показало, что и 50
                мкг AECHL-1 и цисплатина регулировали экспрессию р53 (фиг. 7). Однако AECHL-1
                индуцированное гиперфосфорилирование р53 при ser-15. Фосфорилирование р53 при помощи ser15
                в сильном связывании p53 с ДНК для регуляции регуляции клеточного цикла
                белков, которые помогают в подавлении роста опухоли [26]. Цисплатин также повышается
                регулируемый p53, но фосфорилирование при ser-15 не наблюдалось (рис. 7). Это может быть связано с тем, что
                цисплатин подавляет рост опухолевых клеток повреждением ДНК и апоптозом [27].
                наблюдение, что фосфорилирование ser-15 требуется для индукции p21, побудило нас
                исследовать его роль в аресте G1 [26], [28]. Мы обнаружили увеличение выражения р21 в
                опухоли, обработанные AECHL-1. p21 образует комплекс с CDK2 / CDK4 / CDK6 и ингибирует
                CDK-циклин-киназной активности [28], [29] и остановки клеток в фазе G1. c-Myc — это
                онкогена, который регулируется в раковых клетках и помогает в росте опухоли [30]. Мы
                что лечение AECHL-1 привело к заметному снижению c-Myc, CDK-4 и
                циклина D1, который, как известно, останавливает клетку в G1 [31]. Уменьшает уровень c-Myc
                как известно, участвует в понижающей регуляции циклина D1 и CDK4 [32] (рисунок 7). Это также уменьшает
                киназной активности и остановки клетки в фазе G1.

В заключение наши данные ясно показывают, что AECHL-1 менее токсичен, более избирателен и
                более эффективны при лечении рака по сравнению с противораковым раком растений
                сложный паклитаксел и соединение цисплатина на основе металлов. Он эффективен в
                ингибирование пролиферации широкого спектра раковых клеток, а также твердых
                опухоли. Установлено, что новое соединение AECHL-1 непосредственно взаимодействует с тубулином,
                задерживают клеточный цикл и индуцируют апоптоз опухолевых клеток. Противоопухолевое действие
                AECHL-1 был сравним с или даже превосходил обычный химиотерапевтический
                тестируемые лекарства. Положительные результаты такого исследования in vitro и in vivo могут
                сильная основа для развития AECHL-1 в качестве нового средства для лечения рака человека
                профилактики и / или вмешательства.

(154 КБ DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим д-ра G. C. Mishra, директора Национального центра клеточных наук (Пуна, Индия)
                за поддержку и поддержку, д-р М.К. Бхат за предложение и техническую поддержку,
                Г-жа А. Н. Атре за помощь в получении изображений на конфокальном микроскопе, г-н
                Swapnil для анализа FACS и персонала экспериментального
                Национальный центр клеточных наук.

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: Это исследование было поддержано Департаментом биотехнологии Министерства науки
                    и технологии, правительство Индии, Нью-Дели. Сантош Кумар получил
                    исследовательская стипендия от Индийского совета медицинских исследований и Маниш
                    Лавхале из Комиссии грантов университета. Финансисты не играли никакой роли в учебе
                    разработки, сбора и анализа данных, принятия решения о публикации или подготовки
                    рукопись.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *