Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генерация, характеристика и применение антител, направленных против белков HERV-H Gag в образцах колоректалов

Generation, Characterization and Application of Antibodies Directed against HERV-H Gag Protein in Colorectal Samples
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4847760/

Конкурирующие интересы: CSM, MH, MK, SP и ML не имеют конфликта интересов для объявления. VC, GO, MG, SD и FM являются сотрудниками bioMérieux SA. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: FM ML CSM. Выполнены эксперименты: CSM MH VC GO MG SD MK SP. Проанализированы данные: CSM VC ML FM MG SD. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: ML FM MG SD. Написал статью: CSM ML FM.

Значительная часть человеческого генома происходит от переносимых элементов, остатков древних ретровирусных инфекций. Примерно 8% человеческого генома состоит из примерно 400 000 элементов LTR, включая последовательности эндогенных ретровирусов человека (HERV). В основном, взаимодействие между эпигенетическими и посттранскрипционными механизмами, как полагают, приводит к молчанию экспрессии HERV в большинстве физиологических контекстов. Интересно, что аберрантная реактивация нескольких локусов HERV-H, по-видимому, специфична для колоректальной карциномы (CRC).

Экспрессию белков HERV-H Gag (Gag-H) оценивали с использованием новых моноклональных антител против Gag-H мыши. В экране проточной цитометрии четыре клона антител тестировали на панели первичных линий клеток CRC, а наиболее хорошо выполняемые были впоследствии проверены в Вестерн-блот-анализе. Наконец, экспрессию белка Gag-H анализировали с помощью иммунной гистологии на цитоспинах клеточной линии и на клинических образцах. Там мы обнаружили гетерогенный окрашивающий рисунок без фонового окрашивания эндотелиальных, стромальных и инфильтрирующих иммунных клеток, но диффузное окрашивание цитоплазмы для положительной опухоли и нормальных клеток крипты кишечного эпителия.

В совокупности клон (-ы) антител к Gag-H представляет собой ценный инструмент для окрашивания клеток с колоническим происхождением и тем самым формирует основу для будущих более подробных исследований. Наблюдаемое окрашивание белка Gag-H в клетках клеточного эпителия толстой кишки требует глубокого анализа потенциальной роли Gag-H в нормальной физиологии человеческого кишечника.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Эндогенные ретровирусы человека (HERV) являются реликтами ретровирусных инфекций. Около 200 000 копий в геноме человека, примерно составляющие 5% хроматина, расположены, по меньшей мере, в 31 семействе [1,2]. На сегодняшний день все элементы HERV, которые были охарактеризованы, являются дефектными для репликации вируса, и принято считать, что HERV молчат из-за мутации и эпигенетической регуляции [3]. Их структура состоит из генов gag, pol и env, фланкированных длинными концевыми повторами на их 5 ‘и 3’ концах [4]. Белки гага являются первичными ретровирусными структурными белками, продуцирующими вирусную сердцевину [5,6]. Точнее, белки Gag опосредуют внутриклеточный перенос клеточной мембраны, прямой сбор и облегчают почкование вирусных частиц [5]. Сам белок обычно локализуется в цитоплазме [7] и достаточен для образования вирусоподобных частиц [8].

Разрешительная реактивация HERV часто ассоциируется с патологическими контекстами, включая рак [9]. Например, транскрипты и белки, происходящие из локусов HERV-K HML-2, были связаны с меланомой [10], лейкемией и лимфомой [11,12], а также с опухолями груди [11,13] и яичниками [14]. Кроме того, экспрессия семейства HERV-E была связана с раком предстательной железы [15], были обнаружены отдельные локусы из группы HERV-W, активированные в семиноме [16], и транскрипты из семейства HERV-R были обнаружены при раках печени и легких [9]. Поразительно, что выражение нескольких локусов HERV-H было описано как колоректальный рак (CRC) [17-21].

CRC остается второй причиной смертей от рака в Европе и Соединенных Штатах. Его появление тесно связано с генетическим фоном, хроническим воспалением, стилем жизни и диетическими привычками [22]. При изучении общего уровня мутации, специфических мутаций и других молекулярных изменений в настоящее время хорошо известны по крайней мере три молекулярных подтипа CRC: (I) хромосомные нестабильные опухоли (это микросателлитные стабильные (MSS)), (II) микросателлитные нестабильные (MSI ) опухолей и (III) опухолей, представляющих фенотип метилирования островков CpG [23].

Анализ экспрессии HERV-H до сих пор был ограничен уровнем РНК. Для анализа белков HERV-H (на клетках CRC) были получены HERV-H семейные мышиные мышиные моноклональные антитела против Gag. Анализ полученных клонов включал их основную характеристику, скрининг экспрессии HERV-H Gag-белка (Gag-H) на линии с низким прохождением CRC-клеток, выбор наиболее эффективного клона (-ов) и окрашивание ткани пациента CRC (опухоль и нормальные соседние пары толстой кишки). Это, наконец, обеспечило более детальную картину субклеточной локализации белков Gag-H в клетках толстой кишки.

В целом, мы могли бы решить вопрос, если, где и в какой степени белки HERV-H Gag экспрессируются в опухолевых и нормальных тканях толстой кишки. Новый описанный здесь новый клон (-ы) антитела Gag-H эффективен для оценки экспрессии белка HERV-H в моделях опухолей CRC, а также образцов пациентов и представляет собой ценный инструмент для последующего анализа.

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике медицинского факультета в Ростокском университете (Ethikkommission an der Medizinischen Fakultät der Universität Rostock, St.-Georg-Str. 108, 18055 г. Росток, Германия, номер ссылки II HV 43/2004) в в соответствии с руководящими принципами использования человеческого материала. Форма информированного согласия была получена в письменной форме для всех пациентов.

Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными в науке. Протокол был одобрен Министерством высшего образования и исследований Франции (номер разрешения 01004.01), и все усилия были направлены на минимизацию страданий животных. Для иммунизации использовались 3 мышиные мыши Balb / C. Они были предоставлены лабораториями Чарльз Ривер. Животные содержались в стандартных клетках с 14-часовым светом и 10-часовыми темными циклами и свободным доступом к воде, а также к гранулам. Мышей регулярно проверяли два раза в неделю. Наконец, животных подвергали эвтаназии путем ингаляции СО2.

Последовательность HERV-H Gag (на хромосоме 3, 46368229-46373908 (сборка 37/19)) была амплифицирована ПЦР ((I) наружная: передний праймер (616R): 5′-GCA GGA GGT TAG TGT CAG-3 ‘и обратный праймер (617R): 5’-GGT TAA TTT GCA GAC ACT AAC-3 ‘; (II) внутренний: прямой праймер (623R): 5′-CCA TGG GCA GCC TTC CAC C-3′ и обратный праймер (624R): 5’-AAG CTT ACT AAT TTG GGA GAG GTC AGA TAA AGT AAA-3 ‘) из геномной ДНК здорового женского добровольца. Продукт PCG Gag-H вставляли в вектор pCRII и оттуда клонировали Nco1 / Xba1 в вектор экспрессии pGEX-3X. Рекомбинантный HIS-меченный GST-Gag-H белок экспрессировали в E. coli BL21, выделенный и очищенный. Мышей инокулировали 50 мкг рекомбинантного белка GST-Gag-H (для полной аминокислотной последовательности см. Фиг.1) в дни 0, 14, 28 и 102 с полным адъювантом Фрейнда в дни 103, 104, 105 и 106 мышей повышали 100 мкг рекомбинантного белка Gag-H и неполного адъюванта Фрейнда. Мышей приносили в жертву, собирали селезенку и очищали сыворотку. Спленоциты сливались с клетками миеломы; полученные гибридомные клетки высевали, отбирали в среде HAT и затем клонировали. Полученные антитела были аффинно очищены на колонке с белком А, используя хроматографическую систему AKTA (GE Healthcare, Velizy-Villacoublay, France).

Изображены типичные гистограммы для картирования эпитопов. Верхний левый: клон 1B3H7, правый верхний: клон 1D7D11, нижний левый: клон 14H11G1 и правый нижний: клон 2H2D6.

Специфическую реакционную способность белка HERV-H Gag для моноклональных антител Gag-H оценивали, покрывая пластины ELISA (I) рекомбинантным белком Gag-H, используемым для инокуляции мышей, (II) нерелевантным слитым белком Gag-H (GST-RRM1) , (III) только GST-белок, (IV) HERV-E (матрица), (V) HERV-K HML-2 (матрица), (VI) HERV-K HML-2 (капсид), (VII) HERV- K HML-5 (матрица), (VIII) HERV-W (матрица), (VIIII) HERV-W (капсид). Кроме того, для проверки целостности рекомбинантного белка использовали анти-His (Qiagen, Venlo, Netherlands), анти-GST-клон B-14 (Santa Cruz Biotechnology, Даллас, США), матричный клон 9H6F6 против HERV-E, анти-HERV-K HML-2 матричный клон 1B2G10, анти-HERV-K HML-2 капсидный клон 4B12A8, анти-HERV-K HML-5 матричный клон 4H12B7, анти-HERV-W матричный клон 2G5E12, анти-HERV-W капсидный клон 1C2F8. Если не указано иное, белки и антитела были получены от bioMérieux (Marcy l’Etoile, France).

Библиотека биотинилированных пептидов была синтезирована с использованием химии Fmoc и предназначена для покрытия последовательности рекомбинантного белка Gag-H. Библиотека состояла из 69 синтетических пептидов с длиной 18 остатков и перекрытием 15 аминокислот. Девяносто шесть лунок-майориб-пластин покрывали стрептавидином (10 мкг / мл в PBS-1h при 37 ° C) и блокировали PBS / BSA (ночь при комнатной температуре). Добавляли биотинилированные пептиды (1 мкг / мл) и инкубировали (1 ч при 37 ° С). Добавляли очищенные моноклональные антитела (1 мкг / мл в PBS-90 мин при 37 ° С). Плиты инкубировали с вторичным антителом (конъюгированный с кошачьей кошачьей косой кошкой 90 мин при 37 ° С) до добавления субстрата (пара-нитрофенилфосфат); Реакционную смесь блокировали 1 М NaCl, и планшеты считывали при 405 нм.

HEK293 получали из CLS (Cell Lines Service GmbH, Эппельхайм, Германия). CRC-клеточные линии (HROC18, HROC24, HROC32, HROC40, HROC87 T0 M2, HROC113 cT0 M1, HROC126, HROC147 T0 M1, HROC147Met, HROBMC01, HHC6548 T1 M1) [24-26] и клеточные линии GBM (HROG04, HROG07 и HROG38) [27-28] были получены в нашей лаборатории из опухолей у пациентов хирургической клиники. Все клеточные линии культивировали в DM12 / Ham’s F12, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой и 2 мм L-глутамином. Клетки инкубировали при 37 ° С в 5% СО2. Все пластмассы клеточной культуры были приобретены в биомассе Грейнера (Фриккенхаузен, Германия) и культуральных средах, а также добавки от Pan-Biotech (Айденбах, Германия). Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли из крови трех здоровых доноров центрифугированием плотности сахарозы-эпихлоргидрина и сополимера. Они были увековечены EBV для генерации B-LCL, как описано ранее [24].

Для цитоплазматического окрашивания клеток 5 × 105 клеток фиксировали 2% Formafix и затем обрабатывали буфером P (0,1% сапонин, 0,01 М Hepes, 1% FCS в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре для проницаемости клеточной мембраны. Клетки инкубировали с 1 мкг антитела против Gag-H или с равным количеством несоответствующего антитела (2G2B3, антитело против His) в течение 30 мин при комнатной температуре и промывали буфером P. Вторичное флуоресцентное меченое антитело против козьего антитела (DakoCytomation , Glostrup, Дания) добавляли в буфер P для дополнительной 30-минутной инкубации при комнатной температуре. Клетки промывали и ресуспендировали в 2% Formafix при конечном объеме 200 мкл. Клетки обрабатывались одинаково, но без добавления первичного антитела служили отрицательными контрольными элементами.

Протеиновые экстракты из замороженных клеточных гранул клеток (3 × 106 клеток) разделяли SDS-PAGE, переносили на PVDF-мембраны и зондировали антителами против Gag-H (1 мкг, клоны 14H11G1, 1B3H7 или 1D7D11) против нерелевантного эпитопа (1 мкг анти- Его, клон: 2G2B3) как отрицательный контроль и против бета-актина (1: 5000, Cell Signaling Technology, Danvers, USA) в качестве контроля загрузки. Протеины, представляющие интерес, были обнаружены с помощью флуоресцентной козьей антимышины (Gag-H и нерелевантных антител) или антител против кроликов (бета-актиновых антител) (1: 5000, LI-COR, Lincoln, США) и визуализировались с помощью имиджера Odyssey ( LI-COR).

Для препаратов цитоспина 3х104 клеток на пятно центрифугировали на предметном слайде и фиксировали в течение 10 мин ледяным ацетоном. Секции из четырех мкм вырезали из блоков FFPE и переносили в стеклянную слайдерную систему с клеем (Instrumedics Inc, Hackensack, NJ, USA).

Иммуногистохимическое окрашивание проводили с помощью автостайнера (EnVisionTM FLEX, DAKO) в соответствии со стандартным протоколом изготовления с первичными антителами 5 мкг / мл (клоны против Gag-H 14H11G1 и 1B3H7) и нерелевантными антителами (анти-His, клоном 2G2B3 и анти-ВИЧ P24, клон 3D8C6E7). Диамонбензидин использовали в качестве хромогена для всех иммунореакций. Цитоспины обрабатывали таким же образом без предварительной обработки слайдов.

Антитела генерировались против большой рамки с открытым считыванием из локуса на хромосоме 3 (46368229-46373908, сборка 37/19) путем иммунизации мышей рекомбинантным слитым белком GST-Gag-H (для цельной последовательности аминокислот (АА) см. S1 Fig). Было получено семь клонов и скрининг на специфичность белка Gag-H с помощью ELISA. Поскольку рекомбинантный слитый белок GST-Gag-H содержал два тега, GST на N-конце и His на С-конце, целостность белка могла быть протестирована с использованием антител против тегов. Хотя полученные специфичные для метки сигналы были ниже, чем те, которые наблюдались для контрольных белков, содержащих обе метки (например, HERV-W (матрица) и только GST-белок), а также пять дополнительных контрольных белков HERV, содержащих только тег His, значительная реакционная способность выше был найден фон для слитого белка GST-Gag-H (таблица 1). Целостность белков HERV, используемых в качестве контролей, также может быть продемонстрирована с помощью моноклональных антител, специфичных для соответствующих белков (таблица 1).

Значения OD405 в столбцах контрольных антител дают информацию о целостности используемых белков, которые названы в первом столбце. Используемые антитела (выделенные в контрольных и анти-Gag-H клонах) приведены в заголовках. Подчеркнутые значения в столбце GST можно считать фоном, поскольку тестируемые белки не имеют метки GST. Целостность всех используемых белков демонстрируется со значениями выше фоне антител против His, антитела против GST (против белков только с тегами GST) и различных антител, направленных против контрольных белков HERV.

Также была протестирована кросс-реакционная способность клонов антител против Gag-H с другими белками семейства HERV. Как правило, значения были на уровне фона, за исключением 1D7D11, против HERV-K HML-5 (матрица), поэтому мы можем исключить перекрестную реактивность, за исключением 1D7D11 для HERV-K HML-5 (матрица). n.d., не сделано.

Впоследствии семь клонов антител были протестированы на предмет специфичности против метки GST. Три клона антитела, реагирующие на тег GST, были отброшены (данные не показаны).

Остальные четыре клона антитела (1B3H7, 1D7D11, 2H2D6 и 14H 11G1) дополнительно анализировали на предмет перекрестной реактивности по отношению к белкам других семейств HERV (таблица 1). Только один из четырех клонов антител против Gag-H (1D7D11) перекрестно реагирует с матричным белком HERV-K HML-5. Однако все четыре клона антитела дали сильный сигнал к слитому белку Gag-H, используемому для начальной иммунизации.

Все полученные антитела против Gag-H были изотипом IgG1 каппа (данные не показаны).

Эпитопное картирование было выполнено для четырех клонов антител Gag-H с использованием 18-мерных пептидов белка Gag-H с 3-мерным сдвигом (рис. 1 и таблица S1). Были идентифицированы четыре различных эпитопа с клонами 1B3H7, 1D7D11, а также 2H2D6, состоящий из отдельных девяти или шести месяцев соответственно; тогда как эпитоп для клона 14H11G1 представляется более сложным (состоящим из двух частей эпитопа). Одна идентифицированная эпитопная область 14H11G1 очень похожа на шестимерный эпитоп клона 2H2D6, но с тремя дополнительными AA на N-конце. Кроме того, был идентифицирован второй 16-мерный эпитоп с 57% гомологией с первым, расположенный на С-конце белка для клона 14H11G1. Эпитопы и их соответствующие положения на рекомбинантном белке показаны на фиг. 2.

Протеиновые функции, предсказанные с помощью гениального 7.1.4 [37], предъявляются следующие требования: альфа-спираль (желтая спираль), бета-лист (синий зигзаг), область расщепления сигнала (красная волнистая линия) и антигенная область (полужирный). Эпитопы определяли с использованием последовательной библиотеки перекрывающихся пептидов. Минимальные эпитопы, определенные как аминокислотная последовательность, разделяемая всеми пептидами, обнаруженными антителом, помечены в ящиках и указаны названия моноклональных антител.

На экране гомологии биоинформатики семейства HERV-H была исследована реакционная способность Gag-H для антител клонов (таблица S2). Учитывая численный охват (% длины эпитопа) и сохранение идентичности АА (% АА-гомологии), только эпитоп PPHTQSSLW (14H11G1), отображаемый в две геномные области (на chr.3 и chr.13). Однако при установлении идентичности АА по меньшей мере на 80% для коротких эпитопов было обнаружено до 7 дополнительных геномных мест (в случае длинного 16-мерного эпитопа обнаружены 44 дополнительных локуса).

Экспрессию белков HERV-H Gag оценивали с помощью скрининга проточной цитометрии одиннадцати низкочастотных линий клеток CRC, полученных в лабораторных условиях [24-26]. В качестве контролей служили мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от трех здоровых доноров, клеток HEK293 и три линии клеток глиомы с низким проходом, также созданные в нашей лаборатории [27,28]. Клетки, окрашенные только вторичным антителом и клетками, окрашенными несоответствующим антителом, служили в качестве контроля антител. Клон 14H11G1 был наиболее хорошо зарекомендовавшим себя во всех анализируемых клеточных линиях CRC (рис. 3 и S2 Рис.), В целом следуют 1B3H7, 1D7D11 и 2H2D6. CRC-клеточные линии HROC18, HROC32, HROC87, HROC126 и HHC6548, а также линия метастатических клеток мозга HROBMC01, как правило, показали самое сильное окрашивание. HROC147, полученный из первичного CRC и HROC147Met, установленного из его соответствующих метастазов в печени, часто проявлял маргинальное окрашивание. У HROC40 всегда была самая слабая интенсивность (рис. 4). Практически никакого экспрессии не наблюдалось в РВМС от здоровых доноров, клеточных линий глиомы или эмбриональных клеток почек человека (HEK293). У двух из трех линий B-лимфоидной клетки (B-LCL) у пациентов с CRC также не было существенного окрашивания; однако один B-LCL был пограничным положительным с клоном 14H11G1 (S3 Fig).

Экспрессию белков Gag-H оценивали по проточной цитометрии. MFI для каждого клона антитела и линии клеток CRC изображена на диаграмме диаграммы. Неакцептивное контрольное антитело (анти-His, 2G2B3) окрашено в светло-серый цвет, тогда как различные клоны антител против Gag-H (1B3H7, 1D7D11, 2H2D6 и 14H11G1) представлены темно-серыми.

Наложение гистограмм, полученных проточным цитометрическим анализом 11 линий клеток CRC без первичного антитела (заполненная светло-серая поверхность), нерелевантного антитела (анти-His, 2G2B3, серая линия) и антитела против Gag-H (клон 14H11G1, черная линия) представлены на рисунке.

Выращивание белков HERV-H Gag линий клеток HROC дополнительно анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием клонов 14H11G1, 1B3H7 и 1D7D11 по сравнению с нерелевантным антителом. Соответствующие контрольные полосы бета-актина 45 кДа, анализируемые как контроль загрузки, могут быть легко обнаружены во всех четырех блотах. Примерный размер узнаваемой полосы для клона 14H11G1 составляет 58 кДа, тогда как пятна, окрашенные нерелевантными антителами или анти-Gag-H клонами 1B3H7 и 1D7D11, вообще не обнаруживают полос (S4 Fig).

Для последующих процедур окрашивания клоны 14G11G1 и 1B3H7 антител против Gag-H использовали по сравнению с контрольным антителом. Иммуногистохимическая процедура была впервые установлена ​​на цитоспинах линий клеток HROC (7 случаев MSS, 5 случаев MSI). В общем, все цитоспины не окрашивали контрольным антителом. Цитоплазматическое иммуноокрашивание отмечалось во всех семи клеточных линиях, протестированных с клоном 14H11G1, и в 7/11 линиях, протестированных с помощью клона 1B3H7 (таблица 2, рис. 5). В четырех клеточных линиях, окрашивающих негатив с помощью клона 1B3H7, окрашивание клоном 14H11G1 всегда было положительным (таблица 2). В большинстве случаев иммуноокрашивание было очень неоднородным с некоторыми совершенно неокрашенными клетками, другие были слабыми, а некоторые даже очень положительными (рис. 5K). Такая разнообразная картина делает неспецифическое окрашивание двумя клонами против Gag-H маловероятными. По крайней мере, в линиях клеток CRC, и по неизвестным причинам уровни экспрессии Gag-H, таким образом, кажутся различными. Установленная иммуногистохимия Gag-H с клоном 14H11G1 переносилась в клинические образцы (парафиновые секции из архивных блоков). Мы проанализировали 13 случайно выбранных пар CRC и соответствие нормальной ткани (7 случаев MSS, 6 случаев MSI). Как и в случае с цитоспинами, иммуноокрашивание не было обнаружено с помощью контрольного антитела. Подробно, 11/13 опухолей и 10/13 нормальных тканей показали умеренное иммуноокрашивание клоном 14H11G1. В одной опухоли и 3 нормальных тканях отмечалось только слабое иммуноокрашивание; тогда как одна опухоль была полностью отрицательной (табл. 2). Иногда обнаруживалось более сильное окрашивание. Относительно результатов цитоспинов отмечалось диффузное иммуноокрашивание цитоплазмы опухолевых и нормальных клеток крипты. Не было обнаружено явных различий в интенсивности окрашивания между нормальными и опухолевыми клетками. Кроме того, ни инфильтрационные лимфоциты, ни эндотелиальные, ни стромальные клетки не дали положительных сигналов окрашивания. Однако образец иммуноокрашивания в ткани FFPE был другим и более сильным, чем тот, который отмечен в цитоспинах линий клеток CRC. Представительные изображения иммуногистохимии против Gag-H для анализируемых случаев MSI и MSS представлены на рисунках 6 и 7. Наконец, мы не обнаружили существенных различий между случаями этих двух молекулярных классов.

Цитоспины HROC126 (AC), HROBMC01 (DF) и HROC32 (GI) показали слабую (HROC32) или сильную (HROC126 и HROBMC01) цитоплазматическую экспрессию Gag-H (B, E, H по объекту x20, C, F, I по x40 объектив) и никакой реакции с контрольным антителом 2G2B3 (A, D, G на 20x объектив). Сравнение экспрессии Gag-H двух анти-Gag-H-клонов 14H11G1 и 1B3H7 в HROC147Met (J-L по объекту x40); без реакции с контрольным антителом 2G2B3 (К по 20-кратным объектам).

Верхний ряд представляет собой опухоль, а нижний ряд — нормальную ткань. Оба случая: № 6 (AF) и № 13 (GL) показали сильное цитоплазматическое иммуноокрашивание Gag-H в опухоли и в нормальной ткани (B, E, H, K по объекту x20, C, F, I, L на x40). Отрицательное иммунное окрашивание достигалось с помощью контрольного антитела 3D8C6E7 (A, D, G и J по объекту x20).

Верхний ряд представляет собой опухоль, а нижний ряд — нормальную ткань. Оба случая: № 8 (AF) и № 11 (GL) показали сильное цитоплазматическое иммуноокрашивание Gag-H в опухоли и в нормальной ткани (B, E, H, K по объекту x20, C, F, I, L на x40). Отрицательное иммунное окрашивание достигалось с помощью контрольного антитела 3D8C6E7 (A, D, G и J по объекту x20).

Контроль: антитела 2G2B3 и 3D8C6E7; MSI, микросателлит нестабилен; MSS, устойчивость к микросателлиту; (+), умеренное выражение; (++), сильное выражение; (-), никакого выражения; T, опухоль; N, нормальная ткань; n.d., не сделано

Уникальная экспрессия нескольких локусов HERV-H в образцах CRC (ткани и клеточные линии) была ранее установлена ​​[17-21]. До настоящего времени большинство анализов были основаны исключительно на исследовании РНК либо с помощью экспериментов с ОТ-ПЦР, либо на специализированных анализах чипов экспрессии HERV. Только в одном исследовании были получены поликлональные антитела против HERV-H Env и повышенная экспрессия поверхности HERV-H Env была продемонстрирована на В-клетках и моноцитах пациентов с активным рассеянным склерозом [29]. В настоящем исследовании моноклональные антитела были получены против последовательности белка Gag семейства HERV-H, чтобы получить инструмент для анализа белка HERV-H Gag. Сгенерированные клоны антител, по-видимому, являются (по крайней мере в определенной степени) пан-специфическими, поскольку идентифицированные эпитопы (с минимальным изменением) отображают несколько локусов HERV-H в геноме человека. Наблюдаемое цитоплазматическое распределение белка Gag-H соответствует опубликованной ретровирусной локализации белка Gag [7,30]. Ретровирусные белки Gag обычно синтезируются в виде полибелка, который затем расщепляется вирусной протеазой для получения матрицы основных структурных белков, капсида и нуклеокапсида [5,6]. Uncleaved Gag позволяет собирать и выпускать вирус, но частицы незрелые, представляют собой измененную морфологию и не являются инфекционными [5]. Однако, в отличие от мышиных моделей [31], в CRC человека, производство вирусоподобных частиц, либо закодированных HERV, либо других вирусов, в настоящее время не поддерживается данными из литературы. Наблюдаемая полоса в Вестерн-блоттинге с использованием клона 14H11G1 против Gag-H имеет размер между полноразмерным и промежуточным продуктом белка эндогенных ретровирусных белков свиньи свиньи, как признано моноклональным антителом, полученным Чангом и сотрудниками [30]. Эти данные несколько противоречивы. Из-за отсутствия образования вирусоподобных частиц представляется безопасным сделать вывод о том, что в CRC не производятся ни функциональные, ни расщепленные Gag, ни нерасщепленные Gag-белки. Вестерн-блот-данные 14H11G1 подразумевают, что белки с по меньшей мере высоким сходством с Gag-H присутствуют в цитоплазме клеток толстой кишки. Остается неуловимым, если антитела против Gag-H распознают фактический Gag-H-белок или эпитопы предполагаемых слитых белков Gag-H. Неспецифическая реакционная способность 14H11G1 может быть исключена (I) из-за точного картирования эпитопа белка (ов) Gag-H и (II) отсутствия перекрестной реактивности с другими семействами HERV. Наблюдаемая пан-толстая экспрессия HERV-H Gag также соответствует результатам Sacha и коллег, которые обнаружили HERV-K Gag, экспрессирующихся в эпителиальных клетках и железах тонкой кишки [32].

До сих пор Syncytins, которые выражаются в контексте генерации синцитиотрофобластов событиями клеточного синтеза в плаценте человека [33,34], являются единственными белками, полученными из HERV с физиологической функцией. Точный характер / локус специфически выраженных толстой кишки Gag-H (слияния) будет (с помощью 14H11G1) быть предметом будущих исследований, направленных на распутывание функциональной роли HERV-H-кодированных белков в кишечнике.

Было показано, что HERV-H индуцирует эпителиальный переход к мезенхимному, поддерживает метастазы и помогает набирать иммуносупрессивные иммунные клетки в опухолевый сайт [35]. Эта функциональность была приписана последовательностям и пептидам, кодируемым env генами HERV-H. Подобные уровни экспрессии и структура Gag-H в нормальных колоноцитах и ​​в клетках CRC вызывают сомнения в специфической функциональной роли белков Gag-H в развитии или поддержании CRC.

Другим загадочным результатом было пограничное выражение Gag-H в одной анализируемой EB-трансформированной линии В-клеток (B-LCL). Было показано, что различные вирусные инфекции положительно влияют на экспрессию HERV, как, например, активация HERV-K ВИЧ [36] и активация кодирующего Syncytin и MS-ассоциированного HERV-W с помощью EBV. Таким образом, возможно, что EBV, используемый для иммортализации B-клеток периферической крови, является возбудителем для выражения Gag-H здесь. Однако, по аналогии с наблюдаемой экспрессией белка HERV-H Env у пациентов с рассеянным склерозом [29], экспрессия HERV-H Gag также может быть вызвана раковым заболеванием пациента, из которого был получен B-LCL.

Хотя наш анализ не продемонстрировал специфичность рака для экспрессии Gag-H, антитела против Gag-H могут по-прежнему быть полезными для определения происхождения толстой кишки (например, при метастазах неизвестного происхождения и рака неизвестного первичного) метастатических клеток. Более того, антитела против Gag-H могут быть пригодны для скрининга циркулирующих опухолевых клеток в образцах крови, сыворотки или мочи. Это существенно добавит к репертуару неинвазивных подходов к скринингу для CRC.

Наконец, исследование экспрессии белка Gag-H в двоеточие (нормальные и раковые) эпителиальные клетки, возможно, вызвало ряд вопросов относительно конкретной роли белков Gag-H в кишечнике и функционального участия в кишечных эпителиальных клетках. В настоящем исследовании была установлена ​​начальная точка для более подробного анализа. Уникальность экспрессии белка Gag-H для тканей толстой кишки (параллельно с толстой и CRC-ограниченной экспрессией РНК из локусов HERV-H [20,21]) первоначально может быть решена с помощью qPCR и подтверждена при окрашивании IHC срезов ткани и дополнить наш данные проточной цитометрии на РВМС, почках, глиомах и B-LCL. Также может быть исследована потенциальная корреляция с состоянием клеточного цикла экспрессии белка Gag-H и участием белка в приобретении или поддержании определенного состояния клетки.

В этой рукописи описывается генерация первых моноклональных антител, направленных на белки Gag семейства HERV-H. Эксперименты с начальной характеристикой выявили частую цитоплазматическую экспрессию Gag-H в клеточных линиях CRC и клинических случаях, а также в нормальных колоноцитах. Последнее является довольно неожиданным нахождением, поскольку оно подразумевает потенциальную физиологическую роль Gag-H в нормальном кишечнике.

На фигуре изображена аминокислотная последовательность рекомбинантного гибридного белка GST-Gag-H, используемого для генерации антител. Последовательность GST окрашена в синий цвет, последовательность Gag-H — черным цветом, а тег His — красным.

(РРТ)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Экспрессия белков Gag-H оценивали в одиннадцати клеточных линиях CRC, используя все четыре моноклональных мышиных антитела против Gag-H-антител. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) изображена на гистограмме. Результаты представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов по проточной цитометрии и стандартного отклонения.

(PPTX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Экспрессия белков Gag-H для РВМС трех здоровых добровольцев (A) была проанализирована три клетки глиомы, полученные из трех пациентов (B) B-LCL из трех пациентов с CRC (C) и линии клеток эмбриональной почки человека HEK293 (D). Экспрессия клеток, окрашенных несоответствующим контрольным антителом (анти-His, 3G3B2, верхний ряд) и наиболее хорошо проявляемый клон антитела против Gag-H (14H11G1, нижний ряд), изображена в диаграммах точек и гистограмм.

(РРТ)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Экспрессия белков Gag-H в клеточных линиях CRC оценивали в вестерн-блот-анализах с использованием клонов антител против Gag-H 14H11G1, 1B3H7 и 1D7D11 (красный). Достаточную загрузку белка проверяли с использованием антиактинового антитела (зеленый). Приводятся приблизительные размеры.

(PPTX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(XLS)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим Марка Босса и Кэтрин Потион за то, что они обменялись опытом в области генерации антител и идентификации эпитопов. Далее мы хотели бы поблагодарить Лоуренса Геннерана за ее отличную техническую поддержку, особенно с анализом ELISA.

аминокислота

B лимфоидная клеточная линия

колоректальная карцинома

Протеиновый белок HERV-H

эндогенный ретровирус человека

микросателлитная нестабильность

стабильный микросателлит

мононуклеарные клетки периферической крови

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *