Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Фосфонооксиметильное пролекарство триптолида: синтез, физико-химическая характеристика и эффективность в аденокарциноме кишечника человека и ксенотрансплантатах рака яичников

Phosphonooxymethyl Prodrug of Triptolide: Synthesis, Physicochemical Characterization, and Efficacy in Human Colon Adenocarcinoma and Ovarian Cancer Xenografts
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4678411/

Динатрийфосфонооксиметил
пролекарство противоопухолевого средства триптолид
получали из природного продукта в три этапа (выход 39%) и
показал превосходную растворимость в воде при рН 7,4 (61 мг / мл) по сравнению
к натуральному продукту (17 мкг / мл). Расчетный срок хранения
(t90) для гидролиза пролекарства при
4 ° С и рН 7,4 было установлено, что он составляет два года. В мышиной модели
аденокарцинома толстой кишки человека (HT-29), пролекарство, вводимое внутрибрюшинно
был эффективен в снижении или устранении опухолей ксенотрансплантата в дозе
до 0,3 мг / кг при ежедневном назначении и 0,9 мг / кг, когда
реже. При введении через внутрибрюшинный и оральный пути
при ежедневных дозах 0,6 и 0,9 мг / кг пролекарство также эффективно
и хорошо переносится в мышиной модели рака яичников у человека (A2780).

Триптолид (1, фиг. 1), дитерпеновый
триэпоксид, был сначала выделен из
лекарственное растение Tripterygium wilfordii Hook F
(TWHF) и структурно охарактеризован в 1972 году. В последующие 43 года, как сообщается,
vitro путем ингибирования пролиферации и индуцирования апоптоза различных
раковых клеточных линий и как предотвращение роста опухоли и метастазов в
vivo.2 В последнее время триптолид был
оказалась эффективной против различных видов рака, таких как рак поджелудочной железы, 3 нейробластомы, 104 груди
рак, 105 и рак предстательной железы18.

Механизмы действия триптолида
были широко исследованы, 5,4 и доказательства
что триптолид может ковалентно модифицировать
белки, предположительно, при реакциях открытия эпоксидного кольца.1,2,6-8 Это было недавно
показало, что триптолид ингибирует АТФазную активность человеческого XPB (ксеродермия
пигментной B) путем ковалентного связывания Cys342 XPB с 12,13-эпоксидом.6,7 Поскольку XPB является частью транскрипционного фактора THFIIH, опосредованной полимеразой РНК II
транскрипция и восстановление репликации ДНК ингибируются.6 Многие из наблюдаемых противоопухолевых эффектов можно объяснить
по этому механизму, но были обнаружены другие механизмы9, такие как эпигенетические модификации, подавляющие
киназы и экспрессия Hsp70.3,10,11 Сообщалось также, что триптолид является первым DCTPP1 (dCTP пирофосфатаза)
ингибитор.12 Интересно отметить
что это нековалентное взаимодействие триптолида с мишенью
белка. Кроме того, соединение имеет множество биологических активностей
которые могут иметь ценность в других терапевтических областях.2,13 Триптолид
как сообщалось, стимулирует открытие канала поликистин-2, тем самым восстанавливая
кальция и приводит к затуханию образования кисты в
мышиной модели поликистозной болезни почек.14 Он также известен своими обратимыми мужскими эффектами антифертильности.15 Кроме того, показано, что триптолид сохраняет
когнитивная функция в моделях трансгенных мышей Альцгеймера
болезни.16,17 Противоопухолевые и другие виды активности триптолида
таких как его иммунодепрессивные и противовоспалительные свойства,
более подробно описаны в последних обзорах.18,5,9 Недавние исследования сосредоточены на разработке
триптолида и его производных в качестве потенциальных антилейкемических 19 и противоопухолевых средств.54,223

Несмотря на многообещающую биоактивность, слабую растворимость в воде,
дозозависимое
токсичность, узкое терапевтическое окно и отсутствие патентной защиты
триптолида являются препятствиями для его доклинического развития и клинических
успех. Два ранних клинических испытания триптолида в качестве потенциального
препарат для ревматоидного артрита был проведен в США более десяти лет
назад.20,21 5-гидрокситриптолидное производное 5-гидрокситриптолид
(LLDT-8, 2, рис. 1) в настоящее время находится в фазе I клинических испытаний в Китае для
ревматоидный артрит.13

Структуры триптолида
(1), 5-гидрокситриптолида
(2), омтриптолид (3) и динатрий
фосфонооксиметилового пролекарства триптолида (4).

Пролекарственные стратегии, включающие карбоксильные и аминогруппы
сложные эфиры кислот,
были использованы ранее с намерением достичь желательных
водорастворимость триптолида.22,23 Хотя несколько пролекарств
триптолида описаны в литературе, сукцинат триптолида
(омтриптолид, F6008, PG490-88, 3, рис. 1) является единственным сообщенным
клинические испытания.24 К сожалению, расщепление
фрагмента пролекарства было медленным и неполным, и значительный промежуточный
изменчивость. 25 Это не
дисконтировать стратегию пролекарства, но предлагает, чтобы другие пролекарства, которые
обеспечить надежный выпуск триптолида. Нетоксичный, водорастворимый,
химически стабильный и патентоспособный пролекарственный подход будет жизнеспособным
вариант для преодоления некоторых физико-химических ограничений триптолида
для клинического развития этого натурального продукта.

Исторически,
использование фосфатной группы в качестве промотирования успешно
преодолевают многочисленные проблемы с доставкой потенциальных лекарств.26-28 Эти пролекарства образуются либо прямой связью фосфата
фрагмент на гидроксильную группу исходного лекарственного средства в виде фосфомоноэфира
или путем прикрепления его к исходному лекарственному средству с помощью химического линкера. Фосфат
промотирование ионизируется при физиологическом рН, что приводит к значительному
увеличение растворимости в воде слаборастворимых фенольных и спиртосодержащих
родительских препаратов.29-32 Кроме того, эти пролекарства фосфомоноэфира обычно стабильны
с длительным сроком годности и подвергаются щелочной фосфатазе (EC 3.1.3.1) -катализированной
биоконверсии in vivo для высвобождения исходного спиртового или фенольного лекарственного средства
и неорганический фосфат. Многочисленные пробиотики фосфомоэфира показали
хорошее in vitro33-35 и in vivo36-38 превращение в родительский препарат
в присутствии щелочных фосфатаз.

Вышеупомянутое
омтриптолид оказался неэффективным в клинических испытаниях
из-за его неполной и медленной биоконверсии in vivo. 25 Мы предположили, что непосредственное применение сукцината
к 14-ОН-группе триптолида не было бы легко доступным для
ферментативное расщепление из-за стерического скопления. Поэтому предпосылки
для новой пролекарственной стратегии триптолида были в три раза: улучшены
растворимость в воде, химическая стабильность и быстрая полная биоконверсия
in vivo. Мы стремились достичь этих целей, включив
фосфонооксиметила, поскольку он обладает благоприятной комбинацией
высокой растворимости в воде и химической стабильности. Эта стратегия
были успешными для улучшения растворимости паклитаксела и пропофола,
и в обоих случаях предложение было прикреплено к пространственно затрудненному
гидроксильной группы.39 Ранее синтез
и оценка фосфонооксиметильного производного триптолида 4 (фиг. 1) для рака поджелудочной железы40,41 и нескольких других доклинических
были опубликованы раковые модели.246-249. В настоящее время мы описываем улучшение
синтез для 4, его физико-химическая характеристика,
и его фармакодинамическая оценка при аденокарциноме кишечника человека и
ксенотрансплантаты рака яичников через внутрибрюшинные и оральные пути и
используя менее частые графики дозирования, чем в предыдущих исследованиях.

Наши первоначальные попытки
получают 4 в два этапа из триптолида либо путем О-алкилирования
с диэфирами хлорметилфосфата или прямым алкилированием гидроксильных
группа с хлороидметаном не удалась.31,42,43 Следовательно, альтернативная стратегия40 на основе метилтиометилирования гидроксила
(Схемы 1 и 2) для получения ключевого промежуточного продукта 5.44 Мы наблюдали полную конверсию
триптолида во время перегруппировки Пуммера, но смесь
продуктов. Продукты разделяли колоночной хроматографией
и идентифицировали с помощью ЯМР. Хотя целевой метилтиометиловый эфир 5 является основным компонентом (выход 50-52%), ацетоксиметил
эфир 6 был идентифицирован как основной побочный продукт (выход 38%),
и триптонид (7), образованный в 10% (схема 1).

Эта композиция
аналогично тому, что было ранее отмечено для
этот тип реакции с использованием фенилсульфонилпроизводных.45 Наши попытки провести основной гидролиз
ацетоксиметилового эфира 6 приводит к разложению
продукта, но триптолид может быть выделен кислотным гидролизом
из 6 с выходом 75-80%. Альтернативный подход
(Схема 2) на основе
лечение триптолида диметилсульфидом и бензоилпероксидом в
ацетонитрил приводит к аналогичному выходу соединения 5 (51%) с триптонидом в качестве единственного побочного продукта в 46%. Эта методология,
однако позволило значительно сократить время реакции от
От 5 дней до 2 часов, а также облегчить очистку 5.

На следующем этапе (схема 2) превращение метилтиометилового эфира 5 в дибензилфосфат 8 было достигнуто с использованием нуклеофильного смещения, опосредованного N-йодосукцинимидом (NIS)
с дибензилфосфатом в CH2Cl2 / THF в
наличие молекулярных сит 4 Å.39 В то время как выход был высоким (91%), хроматографическая очистка на
силикагель был затруднен из-за выраженного разложения вследствие
нестабильность бензиловых эфиров фосфата. 50-100
миллиграммовые флэш-хроматографические эксперименты показали приблизительно 20%
деградация. Однако в крупномасштабных препаратах, где контакт между
соединение и силикагель требуются в течение более длительного периода времени,
60-100% -ная деградация наблюдалась в зависимости от количества
субстрат и уровень дезактивации силикагеля. попытки
для использования альтернативных сорбентов, таких как Florisil или оксид алюминия, а также
дезактивация триэтиламина силикагелем, привели к аналогичным уровням
деградации. Не удалось избежать очистки до
гидрирование из-за различных производных серы, образующихся во время
ход синтеза. Эти соединения, даже в небольших количествах,
может отравить катализатор Pd / C, используемый в расщеплении бензилового эфира. Эта
привело к увеличению каталитической нагрузки и увеличению времени реакции, что
в свою очередь, привело к большему количеству и количеству примесей, которые
загрязненный конечный продукт. Кроме того, во время формирования
дибензилфосфата 8, 7-10% сукцинимида
был получен из реагента NIS, который был элюирован при колоночной хроматографии.
Была разработана альтернативная методология очистки с использованием
последовательность экстракций, описанных в экспериментальной
Раздел, который удаляет большую часть примесей, избегая
разложение продукта. Эта методология доказала надежность, эффективность,
и масштабируемым. Это приводит к удалению большинства производных серы
и сукцинимид без использования хроматографической очистки.

На предпоследней стадии дибензилфосфат 8 был
подвергают гидрированию в присутствии 10% Pd / C. Полученный результат
фосфат превращали в 4 путем обработки натрием
карбонат. Конечный состав продукта включал до 6%
триптолида в результате гидролиза во время конечного химического
шаг. Поскольку продукт разлагается при колоночной хроматографии на силикагеле,
он был выделен с чистотой 99% с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием колонки С18.
Материал сильно гигроскопичен и хранится в атмосфере азота или
аргоновый газ.

Физико-химические характеристики
из 4 были проведены для оценки его растворимости и химического
стабильность.

Регулирующее решение
рН может быть простым
и эффективный способ повышения растворимости в воде слабо
кислотный или основной инъекционный препарат. Однако регулировка рН не является жизнеспособной
подход к увеличению растворимости таких молекул, как триптолид
которые не имеют ионизируемых групп. Для таких соединений различные стратегии
включая использование сорастворителей, поверхностно-активных веществ и комплексообразователей
(например, парентерально безопасные циклодекстрины) были использованы для преодоления
водной растворимости. Однако некоторые из этих методов
могут в значительной степени способствовать токсичности. В идеале фосфонооксиметил
пролекарства будут иметь хорошую растворимость в воде, особенно при физиологическом
рН. Избегая крайних значений рН и / или сорастворителя, можно
быстрого парентерального вливания без риска осаждения лекарств.
Используя ВЭЖХ, растворимость в воде (буферизованная до рН 7,4 с помощью Tris at
комнатной температуры) триптолида было определено равным 17 мкг / мл
а у 4 — 61 мг / мл. Таким образом, путем образования пролекарства,
растворимость была увеличена 3600 раз. Мы также оценили вторую
константа диссоциации (pKa2), равная 4. В растворе, в зависимости от рН, пролекарство будет существовать
в его диацидных, одноосновных или двухосновных состояниях, как представлено на схеме 3. pKa1 имеет ограниченную фармацевтическую значимость, поскольку рН
большинства физиологически приемлемых растворов обеспечит ионизацию
диацидных видов. Однако pKa2 является значительным, учитывая его влияние на растворимость в воде, химические
стабильности и эффективности в качестве ферментного субстрата для обеспечения биоконверсии.
Поэтому в пределах фармацевтически значимого диапазона рН 4 будет существовать в равновесии между его одноосновным и двухосновным
виды. Таким образом, титрование равновесной смеси этих двух видов
дает константу ионизации кислоты pKa2, значение которой соответствует точке перегиба. Оценка
этот pKa2 с использованием 31P ЯМР
выгодно, так как изотоп 31P имеет высокое природное изобилие
(100%), и его химический сдвиг свидетельствует об изменении ионизации
состояние фосфорной части.46 Спектр ЯМР 31P 4 был получен как функция
от рН. Экспериментальные данные, показанные для изменения наблюдаемого фосфора
химические сдвиги 4 в растворах при переменном рН (рисунок 2) использовали для определения
pKa2 (экв 4, экспериментальная часть). Зависимость рН этого наблюдаемого
химическое смещение привело к сигмоидальной кривой, которая
типичный для кислотно-основного титрования. Значение pKa2 4 было найдено равным 6,61, что сравнивает
благоприятно оценивается из литературы.47-49. При рН 7,4 4 существовало бы преимущественно как дианион, обеспечивая тем самым высокий
растворимость.

31P-титрование для второй диссоциации
константа (pKa2) из ​​4. Кривая
подгонки экспериментальных данных к уравнению 4 (в экспериментальной части)
оценивает химический сдвиг одноосновного (δmb) и двухосновного
(δdb) фракции 4 при -6,0 м.д. и -0,62
м.д., соответственно. PKa2 4 составляет 6,61 при 25 ° C.

После устного дозирования,
пролекарства подвергаются широкому диапазону рН в тракте GI,
кислый в желудке до нейтрального в толстой кишке. Кроме того, широкий массив
гидролитических ферментов, таких как пепсин и панкреатин, присутствуют
в тракте GI. Эти ферменты имеют естественную функцию переваривания
макромолекулы для использования в качестве питательных веществ, но они также могут связывать и гидролизовать
лекарственные соединения. Поэтому пролекарства должны быть стабильными в кислой,
основные и ферментативные состояния тракта GI для перорального введения in vivo.
Эксципиенты в препарате также могут способствовать разложению пролекарства.
Поэтому in vitro физиологическая стабильность пролекарств в различных
буферов (pH 1-9) и в смоделированных желудочно-кишечных жидкостях следует
оцениваться для получения информации о стабильности пролекарств. Таким образом, 4 инкубировали с имитацией желудочной жидкости (SGF), моделировали
кишечной жидкости (SIF) и различных буферов (pH 1-9). пероральный
дозировка выделяет соединения с рН 1-2 в желудке, рН 4,5 при
начало тонкой кишки, рН 6,6 в среднем для небольшого
кишечника и рН 5-7 в толстой кишке. Время опорожнения желудка
варьируется от 0,5-1 ч в состоянии голодания до нескольких часов после
тяжелая еда. SGF имитирует желудочную жидкость и включает кислотные
и условия ферментативного гидролиза. SIF имитирует рН и гидролиз
ферменты в кишечнике. Инкубация 4 в этих растворах
является быстрым способом определить, будет ли 4 устойчивым в
условия, обнаруженные в тракте GI. Соединение 4 продемонстрировало
рН-зависимая стабильность и быстро деградирует с превращением в триптолид
в моделируемой желудочной жидкости и при очень низких значениях рН (1-2)
и в смоделированной желудочной жидкости, тогда как она была заметно стабильной при более высоких
значения рН (3-9) и в моделируемой кишечной жидкости (таблица 1). Более короткий период полураспада
при низком значении рН для 4 может привести к опосредованному кислотой удалению
из промотирования в желудке. Однако 4 могут быть «защищены»,
из желудочной кислоты путем энтеросолюбильного покрытия.

Пролекарства по своей природе имеют тенденцию быть менее химически
стабильный, чем
родительских препаратов. Чтобы быть практически полезными, пролекарства должны обладать
адекватной химической стабильности в условиях их использования. Пролекарства
предназначенные для внутривенного введения, должны иметь адекватное решение
стабильности, так что готовый к использованию препарат с разумным
может быть сформулирован длительный срок хранения (т. е. 2 или более лет). Если
стабильность состояния раствора неадекватна, препарат можно сформулировать
в виде сухого порошка (обычно путем лиофилизации) и
решение перед администрацией. Например, Сафади и его сотрудники
описал развитие фосфонооксиметилкарбонатов как новых,
водорастворимые пролекарства затрудненных спиртов. Однако отсутствие
адекватная химическая стабильность ограничивает коммерческий и клинический потенциал
этой пролекарственной концепции.34 Химическое
гидролиз 4 наблюдался при рН 7,4, поскольку
нейтральный диапазон рН идеально подходит для доставки рецептуры из
физиологическая перспектива. Мы обнаружили, что гидролиз 4 следовал кинетике псевдо-первого порядка. Использование псевдо-первого порядка
константы скорости, определенные при нескольких температурах между 40 и
70 ° C (таблица 2), график Аррениуса был составлен (не показан). Из этого сюжета
энергия активации (Ea)
до 63,4 кДж / моль. Экстраполируя график на более низкие температуры,
кобс при 25 и при 4 ° С были
получен. Это позволило рассчитывать период полураспада (t1 / 2) и срок годности (t90)
4 при 25 и 4 ° С (таблица 3).

Срок годности (t90) = время для
10% потеря 4.

Таким образом, химическая стабильность 4 при нейтральном рН была
оказалось вполне удовлетворительным, что дало предполагаемый срок хранения приблизительно
2 года (при 4 ° C). Таким образом, предсказана композиция 4 в лиофилизированной форме или в виде водного раствора при рН 7,4
иметь приемлемый срок годности.

Необходимым условием для успешного фосфата
стратегия пролекарства — это преобразование
катализируемый щелочной фосфатазой. В общем, фосфомоноэфиры,
такие как фосфонооксиметильные пролекарства, являются хорошими субстратами для обоих
кислотных и щелочных фосфатаз, которые встречаются в самых разнообразных
живые организмы, включая бактерии, растения и животные. 50 Щелочная фосфатаза встречается на протяжении всей
тело и в основном связано с плазматическими мембранами кишечника,
плаценты, кости, печени и почек при высоких концентрациях.51 Этот фермент участвует в гидролазе / трансферазе
реакции на различные фосфатсодержащие соединения при физиологических
условия. Для in vitro оценки дефосфорилирования 4, щелочная фосфатаза из слизистой оболочки кишечника крупного рогатого скота была
выбран. Как видно из его названия, этот фермент обладает максимальной активностью в
щелочной области (рН 9,8). Анализ in vitro на фосфатный моноэфир
пролекарства обычно выполняются при рН 9,8, оптимальное значение рН для активности
щелочных фосфатаз. Оценка кинетики биоконверсии
однако, имеет более важное значение, если его проводить при физиологическом рН. Таким образом,
изменение рН реакционной среды до 7,4 может, в принципе, уменьшать
каталитическая эффективность фермента. Однако для доказательства концепции,
подтверждая, что 4 действительно является субстратом щелочного
фосфатаза была первостепенной. Ясно, что если 4 вводится
парентерально у людей, подавляющее присутствие щелочного фосфата
in vivo должна гарантировать биоконверсию.

Ферментативный in vitro
Недавно была отмечена лабильность 4. Мы провели биоконверсию 4 в триптолид в присутствии щелочной фосфатазы в глицине
буфер при рН 9,8 (схема 4). Воздействие 4 на фосфатазы расщепляет
фосфатной группы и высвобождает гидроксиметильное производное 9, которое является химически неустойчивым и спонтанно высвобождает триптолид
и формальдегид. Выпуск формальдегида из пролекарств может
вызывают беспокойство из-за воспринимаемой токсичности52. Однако хорошо известно, что оборот
формальдегида в организме человека от производства эндогенного формальдегида
нормальным метаболизмом и экзогенным воздействием (например, из
пища) находится в диапазоне 31-59 г в день.52 Поскольку пролекарства выпускают только миллиграмм формальдегида
из фосфонооксиметильных пролекарств в день небольшое количество формальдегида
очень мало добавляет к исходному воздействию количества произведенных грамм
при нормальном метаболизме. Кроме того, учитывая короткий период полураспада 1,5
мин для формальдегида, который превращается в муравьиную кислоту, подвергается воздействию
к формальдегиду, продуцируемому пролекарством, будет ограничено примерно
10 мин.52

И исчезновение 4 и
образование триптолида
были измерены. Деградация соединения 4 была первой
обработать. Период полураспада (t1 / 2) 4 определяли равным 2 мин в присутствии щелочной фосфатазы,
демонстрируя быстрое превращение модифицированного лекарственного средства в его исходное соединение.
Кроме того, было установлено, что 4 был стабильным в течение 1 часа в аналогичном
анализ проводили в отсутствие щелочной фосфатазы. Короткая
период полувыведения 4 в этом анализе указывает на то, что ферментативно
катализированная пробой 4 произошла с высокой скоростью. Короче
период полувыведения для 4 соответствует нашей гипотезе о том, что
метиленовое фосфатное пролекарство будет быстро высвобождаться и
не препятствовать стерическим препятствием, как видно с проклёбом сукцината
omtriptolide. Стереологическое препятствие было отмечено в биоконверсии
ряда фосфатных и фосфонооксиметильных пролекарств.33, 53

Ранее сообщалось, что соединение 4 может уменьшить рост опухоли, предотвратить прогрессирование опухоли и улучшить
выживаемость в нескольких моделях мышей поджелудочной железы. 40,41. Эффективность 4 также была продемонстрирована в доклинических
модели остеосаркомы, карциномы легкого немелкоклеточного рака, положительного папилломавируса человека
рак плоскоклеточного рака головы и шеи и рак яичников.246-249. Эти исследования оценивали эффективность 4 после ежедневного
внутрибрюшинное (IP) введение. Здесь мы использовали ксенотрансплантат опухоли
модели для оценки эффективности 4 при введении
на менее частый график и при введении пероральным путем.

Это исследование предназначено для оценки потенциальной эффективности и
токсичность 4 при ежедневном введении IP (КТ)
диапазон доз и при введении в разных графиках в течение 28 дней.
Моделью животного, использованной в исследовании, была аденокарцинома толстой кишки человека HT-29
клеточной линии, имплантированной в женских бестимусных голых мышей подкожно
опухоли. Группы лечения с десятью мышами в группе включали четыре дозы
(0,1, 0,3, 0,6 и 0,9 мг / кг) и пяти дозах
4-недельный период лечения (ежедневно [КТ] в течение 4 недель, КТ в течение 2 недель
то нет лечения в течение 2 недель; КТ на 1 и 3 недели без лечения
в течение недель 2 и 4; 3 раза в неделю в течение 4 недель; QD в течение 2 недель, затем
3 × / неделю). Было обнаружено, что соединение 4 вводили ежедневно.
быть эффективными в снижении или устранении опухолей ксенотрансплантата
аденокарцинома толстой кишки человека HT-29 в этой модели на уровне доз
от 0,3 до 0,9 мг / кг (фиг. 3). Схемы доз, в которых 0,9 мг / кг 4
менее часто, чем ежедневно, или с перерывом от ежедневного
Было установлено, что дозировка также эффективна (рис. 4). В группах, которые получали 0,9 мг / кг
ежедневно в течение 4 недель или 0,9 мг / кг в день в течение 2 недель, затем 3 раза в неделю,
все мыши, которые выжили до конца исследования (7/10 и 9/10,
соответственно) были без опухолей. Соединение 4 обычно
хорошо переносится у самок голых голых мышей с единственным испытуемым
связанных с смертностью у мышей, получавших дозы 0,9 мг / кг для
как минимум 14 дней подряд (3 в «QD на 4 недели»)
группа и 1 каждый в «QD на 2 недели» и «QD
в течение 2 недель, а затем 3 раза в неделю «). Клинические признаки токсичности
были отмечены у некоторых мышей в группах с более высокой дозой после 14 дней дозирования.
Частота смертности и тяжести неблагоприятных клинических признаков
эскалации с уровнем дозы и частотой. Мыши, получающие ежедневно
доза 0,9 мг / кг имела наименьшее среднее групповое увеличение массы и самую высокую
распространенность раздражения и некроза кожи к концу исследования.
Группы, получающие более низкую дозу 4 или 0,9 мг / кг на
прерывистый график имел меньше клинических признаков токсичности и выше
увеличение веса в течение исследования.

Эффективность и переносимость
из 4 в модели мыши
аденокарцинома толстой кишки человека с ежедневным IP-администрированием. Соединение 4 доставляли ИП каждый день в указанной дозе. (A) Среднее значение
Объем твердой опухоли НТ-29 с течением времени; (B) вес опухоли при вскрытии;
(C) выживание с течением времени.

Эффективность и переносимость 4 в мышиной модели
аденокарцинома толстой кишки человека с прерывистыми графиками дозирования. Соединение 4 вводили IP при 0,9 мг / кг по указанному графику.
(A) средний объем опухоли HT-29 с течением времени; (B) вес опухоли при вскрытии;
(C) выживание с течением времени.

Это исследование было разработано для оценки эффективности и переносимости
из 4 в мышиной модели рака яичника человека при введении
через внутрибрюшинный и оральный. Модель животного, используемая в этом
исследование было линией клеток рака яичника человека A2780, имплантированной в женскую
атимичные голые мыши в качестве подкожной опухоли. Лечение ежедневно
дозы 4 в диапазоне от 0,1 мг / кг до 1,2 мг / кг (десять мышей
на группу). Введение 4 путем внутрибрюшинной инъекции
был эффективен и хорошо переносился у самок голых голых мышей с
подкожные опухоли ксенотрансплантата карциномы яичника человека A2780
при ежедневных дозах 0,6 или 0,9 мг / кг (данные не показаны). администрация
4 при помощи перорального желудочного сока также эффективны при ежедневных дозах
0,6 или 0,9 мг / кг, но с несколько более высокими показателями заболеваемости и
(рис. 5). Частота смертности и тяжести неблагоприятных клинических признаков
эскалации с уровнем дозы и только двумя мышами в пероральном приеме 1,2 мг / кг
группа доз выживала после 5-го дня (данные не показаны). Клинические признаки
острая токсичность включала анорексию, обезвоживание и умеренное состояние
или смерти. В контрольной группе на транспортном средстве 8 из 10 мышей подвергали эвтаназии
до окончания исследования, поскольку объем опухоли превзошел
конечная точка объема опухоли. Однако в группах 0,6 мг / кг и 0,9 мг / кг,
большинство мышей выжили до конца исследования (7 из 10 и
6 из 10 соответственно), и все, кроме одного в каждой группе, были без опухолей.

эффективность
и переносимость соединения 4 в мыши
модель карциномы яичника человека с ежедневным оральным введением. Соединение 4 вводили перорально каждый день в указанной дозе.
(A) средний объем опухоли во времени; (B) вес опухоли при вскрытии; (С)
выживание с течением времени.

к
преодолевать проблемы растворимости, связанные с натуральными продуктами,
получали динатрийфосфонооксиметильное пролекарство триптолида.
Синтез, физико-химическая характеристика и эффективность in vivo
в мышиных моделях аденокарциномы толстой кишки человека и карциноме яичника человека
продемонстрировал, что 4 имеет подходящие свойства как клинические
кандидат. Поскольку синтез может быть выполнен в три этапа
от натурального продукта, расширение этого метода для клинических
использование пролекарства не представляет проблемы. Химическая стабильность
из 4, с прогнозируемым сроком годности около 2 лет при
4 ° C, позволит хранить пролекарство в течение длительного времени
период. В моделях мыши in vivo аденокарциномы толстой кишки человека и
карцинома яичника человека дает дополнительную информацию об эффективности
и переносимость 4, предполагая, что ежедневное введение
может не потребоваться, и что 4 может быть эффективным, если
вводится перорально. После дополнительной доклинической безопасности и токсичности
испытания, соединение 4 вводило клинические испытания фазы I в
2013 для оценки в продвинутых желудочно-кишечных опухолях.262

Если не указано иное, все материалы,
реагенты и растворители были получены от коммерческих поставщиков и
были использованы без дополнительной очистки. Прогресс синтетического
контролировали, по возможности, методом тонкослойной хроматографии
(ТСХ) и представляющие интерес соединения были визуализированы коротковолновыми
УФ-лампу или церий-аммоний-молибдат. ТСХ проводили на диоксиде кремния
гель 250 мкм, пластины F254. Все растворители удаляли с использованием стандартных
технологии роторного испарителя. Проведена колоночная флэш-хроматография
на силикагеле. Спектры 1H-ЯМР регистрировали на 400 МГц
и 13C-ЯМР-спектры регистрировали на 100 МГц спектрометре.
Химические сдвиги сообщаются в частях на миллион (ppm), используя
(CDCl3) остаточный пик в качестве внутреннего стандарта
(для 1 H ЯМР: 7,27 м.д. и 13C ЯМР: 77,2
частей на миллион). Константы связи (J) сообщаются в герцах.
Кратности сигналов назначаются с использованием следующих
аббревиатуры: s = синглет, d = дублет, t = триплет, br = широкий,
m = мультиплет. Проведена масс-спектрометрия высокого разрешения (HRMS)
Университетом Миннесоты. ВЭЖХ
используемая система состояла из ВЭЖХ с мостиками Waters 2695 с Waters 2996
фотодиод Матричный детектор (Милфорд, Массачусетс). Столбец, используемый для анализа
был размером частиц Phenomenex C18 (2) 150 × 4,6 мм, размером 5 мкм
колонке (Торранс, Калифорния). Для анализа триптолида и 4 подвижная фаза состояла из ацетонитрила (от 10% до 70% об. / Об.) И
10 мМ одноосновного буферного раствора фосфата натрия, доведенного до рН
7 с 1 н. Раствором NaOH (от 90% до 30% об. / Об.) Для градиентного элюирования над
20 мин. Его закачивали со скоростью 1,0 мл / мин. Впрыск
объем составлял 20 мкл с детектированием при 218 нм. Время удерживания
были 6,0 и 13,5 мин для 4 и триптолида соответственно.
Чистота 4 составляла> 95%.

Раствор триптолида (1; 2,0 г, 5,6 ммоль)
в уксусной кислоте (100 мл, 1,8 моль) и в растворе
уксусного ангидрида (20 мл, 220 ммоль) в ДМСО (30 мл, 420 ммоль) были
перемешивают и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 дней.
Затем реакционную смесь выливают в воду (1 л) и нейтрализуют
с добавлением порционного бикарбоната натрия. Смесь экстрагировали
с этилацетатом (4 × 250 мл) и объединенным органическим экстрактом
сушили над безводным сульфатом натрия. Растворитель удаляли под
пониженное давление. Маслянистый остаток очищали флеш-хроматографией
(этилацетат-гексаны 1: 5) с получением соединения 5 (1,21 г, 52%) в виде белой пены. Данные ЯМР соответствовали тем, о которых сообщалось.54 HRMS, рассчитанным для (C22H28O6SNa), требуемого m / z [M
+ Na] + 443,1505, найдено m / z 443.1507. Кроме того, ацетоксиметиловый эфир 6 (896 мг,
38%) и триптонид 7 (55) (191
мг, 10%) были выделены и идентифицированы.

1 H ЯМР (400 МГц, CD 2 Cl 2) δ
0,80 (д, 3H, J = 6,9 Гц), 0,94 (д, 3H, J
= 7,0 Гц), 1,05 (с, 3H), 1,21 (м, 1H), 1,53 (тд, 1H, J1 = 12,5, J2 = 5,6,
и J3 = 1,3 Гц), 1,91 (т, 1H, J = 14,1 Гц), 2,06 (с, 3H), 2,14-2,27 (м, 4H), 2,68
(м, 1H), 3,30 (д, 1H, J = 5,4 Гц), 3,49 (д, 1H, J = 3,1 Гц), 3,58 (с, 1H), 3,77 (д, 1H, J = 3,1 Гц), 4,65 (м, 2H), 5,30 (д, 1H, J = 6,5 Гц),
5,44 (д, 1H, J = 6,5 Гц) м.д.; 13C-ЯМР
(100 МГц, CD2Cl2) & delta; 14,0, 17,1, 17,4,
17,6, 21,4, 24,0, 27,2, 30,2, 36,3, 40,9, 55,3, 55,7, 60,5, 61,6,
64,1, 64,4, 70,6, 80,3, 89,7, 125,8, 160,7, 170,9, 173,7 м.д.; HRMS
рассчитанный для (C23H29O8), требуемый m / z [M + H] + 433.1862, найденный m / z 433,1850.

к
раствор триптолида (19,95 г, 55,36
ммоль) в безводном ацетонитриле (560 мл) при 0oC диметилсульфида
(31,8 мл, 433 ммоль, 8 экв.). Затем перекись бензоила (53,7
г, 221 ммоль, 4 экв.) порциями в течение 2
час После этого реакционную смесь перемешивали при 0 ° С в течение 2
ч, разбавляют этилацетатом (1200 мл), промывают разбавленным натрием
карбонат (насыщенный Na2CO3: H2O,
1: 2) (2 × 150 мл) и рассолом (150 мл) и сушили над сульфатом натрия
с ночевкой. Затем растворитель удаляли при пониженном давлении и
полученную в результате вязкую массу, содержащую кристаллы, фильтровали через
стеклянный фильтр и промывали холодным этилацетатом (50 мл). Собранный
твердое вещество сушили на воздухе, получая триптонид (7,701 г).
Объем фильтрата удаляли при пониженном давлении и
остаток сушили в течение ночи в высоком вакууме с получением 47,4
г сырого продукта. Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией
на силикагеле, используя EtOAc-гексаны (1: 2), а затем смеси EtOAc-CH2Cl2 (1: 1 и 2: 1) в качестве элюентов к
получают целевое соединение 5 (11,97 г, 51,4%) и дополнительное
количества триптонида (7,2,10 г, общий выход
триптонид составл ет 9,11 г, 46%).

К раствору соединения 5 (6,0 г, 14,3 ммоль) в сухом
дихлорметана (240 мл) добавляли порошкообразные молекулярные сита с молекулярной массой 4 Å
(6,0 г). Реакционную смесь помещали в сухом азоте, а затем
раствор дибензилфосфата (4,78 г (17,2 ммоль) и N-иодсукцинимида (3,86 г, 17,2 ммоль) в безводном тетрагидрофуране
(240 мл) медленно добавляли при 15-20 ° С. После добавления
, реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение периода
3 ч, фильтруют и разбавляют дихлорметаном (2400 мл).
раствор встряхивали 0,1 М тиосульфатом (240 мл) до полного обесцвечивания
и затем промывают насыщенным бикарбонатом натрия (240 мл) и рассолом
(240 мл). Органический раствор сушили над сульфатом натрия в течение 0,5
ч и фильтруют, а затем растворитель удаляют при пониженном давлении.
Остаток растворяли в безводном ацетонитриле (900 мл) и
раствор экстрагировали пентаном (4 × 200 мл). Ацетонитрил
раствор выпаривают на роторном испарителе, а затем в высоком вакууме
сушка на ночь. Выход: 8,42 г (91%) дибензилового эфира 8, который использовали непосредственно на следующей стадии без дополнительной очистки.
Небольшой образец очищали флеш-хроматографией на силикагеле (50%
EtOAc / гексаны) с получением соединения 8 в виде белой пены. 1 H ЯМР (400 МГц, CDCl 3) δ 0,72 (д, 3H, J = 6,8 Гц), 0,89 (д, 3H, J = 6,8 Гц)
1,05 (с, 3H), 1,27 (м, 1H), 1,48 (м, 1H), 1,82 (дд, 1H, J1 = 14,7 и J2 = 13,4 Гц), 2,03-2,35
(м, 4H), 2,64 (м, 1H), 3,14 (д, 1H, J = 5,5 Гц),
3,46 (д, 1H, J = 3,1 Гц), 3,65 (с, 1H), 3,76 (д,
1H, J = 3,1 Гц), 4,65 (м, 2H), 5,02 (м, 4H), 5,27
(м, 1H), 5,47 (м, 1H), 7,34 (м, 10H) м.д.; 13C ЯМР (100
МГц, CDCl3) & delta; 13,6, 16,8, 17,0, 23,3, 26,2, 29,62,
29,67, 35,7, 40,3, 54,7, 55,2, 59,3, 61,1, 63,6, 64,0, 69,36, 69,39,
69,42, 69,45, 69,9, 78,2, 92,9, 93,0, 125,5, 127,9, 128,0, 128,6,
135,5, 135,6, 160,1, 173,2 м.д.; Для HRMS, рассчитанного для (C35H39O10PNa), требуется m / z [M + Na] + 673,2179, найдено m / z 673,2176. Аналитическая ВЭЖХ tR = 8,5 мин.

В круглодонную колбу емкостью 1 л, снабженную перегородками и мешалкой
бар добавляли Pd / C (1,8 г) и безводный тетрагидрофуран (10 мл).
Колбу охлаждали на ледяной бане и насыщали газообразным водородом
используя барботер при перемешивании до полной замены воздуха.
барботер удаляли и в колбу добавляли раствор дибензилового эфира 8 (8,42 г, 12,94 ммоль) в сухом ТГФ (700 мл)
через канюлю при перемешивании и охлаждении колбы со льдом
ванна. Затем реакционную смесь снова насыщают водородом
и оставляют при перемешивании в атмосфере водорода в течение 3 часов. Реакция
Смесь контролировали с помощью ТСХ (EtOAc-гексаны, 3: 2) до исчезновения
дибензилового эфира 8. После завершения реакции реакционную смесь
продували азотом и фильтровали через слой целита.
ТГФ-раствор охлаждали до 10-12 ° С и охлаждали ледяным раствором
безводного карбоната натрия (1,235 г, 11,65 ммоль) в деионизированной воде
(240 мл) медленно добавляли при перемешивании, чтобы поддерживать температуру ниже
18oC. Затем растворители удаляли на роторном испарителе
с последующим выпариванием в высоком вакууме с получением слегка мутной водной
решение. Раствор помещали в оборудование для непрерывной экстракции
с дихлорметаном и подвергали экстрагированию в течение 72 часов. Затем водный
раствор отделяют от CH2Cl2 и экстрагируют
с этилацетатом (4 × 30 мл). Следы органического растворителя были
удаляют путем ротационного испарения и пропускают водный раствор
через 0,2 мкм Acrodisc-шприцевой фильтр, чтобы получить прозрачный водный
решение. Раствор лиофилизировали, получая 4 (5,64
г; 85%). Продукт включает 6% триптолида. Очистка препаративной
ВЭЖХ, элюированная 15% метанолом в воде, обеспечивает чистоту 99% 4 в виде бесцветного гигроскопичного порошка. 1H ЯМР (400 МГц, D2O) & delta; 0,81 (д, 3H, J = 6,8 Гц), 1,00
(д, 3H, J = 6,8 Гц), 1,03 (с, 3H), 1,35 (м, 1H),
1,50 (м, 1H), 2,00 (дд, 1H, J1 = 14,7
и J2 = 13,4 Гц), 2,08-2,61 (м,
4H), 2,85 (м, 1H), 3,63 (д, 1H, J = 5,5 Гц), 3,81
(д, 1H, J = 3,1 Гц), 3,86 (с, 1H), 4,12 (д, 1H, J = 3,1 Гц), 4,92 (м, 2H), 5,07 (м, 2H) м.д.; 13C ЯМР (100 МГц, D2O) & delta; 12,9, 16,0, 16,3, 16,5, 22,3,
25,5, 28,9, 35,2, 39,8, 55,4, 56,1, 61,0, 61,5, 65,1, 65,5, 71,9,
77,6, 91,7, 123,8, 164,2, 177,3 м.д.; HRMS, рассчитанный для (C21H26O10P), требуется m / z [M + 1] + 469,1264, найдено m / z 469,1267.

Приблизительно 5 мг
каждого соединения взвешивали в 2 мл стеклянных флаконах (в трех повторностях);
0,2 мл трис-буфера (рН 7,4) добавляли для образцов 4 и 2 мл для образцов триптолида. Каждый буферный раствор был насыщенным
с 4 или триптолидом. Затем флаконы закрывали, обрабатывали ультразвуком,
и встряхивают перед погружением при постоянном встряхивании температуры
ванна (100 капель / мин при 25 ° С) для 24
ч, после чего избыток твердого лекарственного средства удаляли из насыщенного
раствор путем центрифугирования и фильтрации. Ясные фильтраты были
затем отбирают и соответствующим образом разбавляют для количественной оценки с помощью ВЭЖХ.

4 мМ раствор 4 получали в 10%
D2O в изотоническом растворе для приготовления исходных растворов
объемом 15 мл. Образцы различного рН получали путем добавления небольших
объемов (мкл) 1 н. HCl или 1 н. раствора NaOH и записи
(Denver Instrument, Bohemia, NY). Аликвоты (0,5 мл) были
выведенного из исходного раствора после каждого изменения рН и
переносится в ЯМР-трубки. От 12 до 15 таких образцов для анализа
были получены в диапазоне рН 3-10. Решения были проанализированы
с помощью ЯМР-спектроскопии 31P с использованием ЯМР-спектрометра 400 МГц.
Изменение химического сдвига регистрировалось как функция рН. Датчик 31P был откалиброван с использованием 85% H3PO4 в качестве внешнего стандарта для химического сдвига.

В решении,
в зависимости от рН и константы диссоциации (Ka) 4 существует в своем диацидном, одноосновном,
или двухосновных фракций, как показано на схеме 3. Доля 4 в ее диацидной
фракцию можно игнорировать, учитывая низкое и маловероятное значение рН такого раствора
в физиологическом сценарии. Доля 4 в
одноосновная форма (fmb) и фракция
в двухосновной форме (fdb) может, следовательно,
выражаются соответственно уравнениями 1 и 2: 12

[H +] представляет
концентрация молярного водорода.
Наблюдаемый химический сдвиг (δobsd) сигнала 31P является продуктом мольной доли пролекарственных форм
умноженный на его химический сдвиг и выражается выражением 3,3δmb и
δdb представляют собой химические сдвиги для одноосновных
и двухосновной
фракции 4, соответственно. Подставляя уравнения 1 и 2 в 3, получаем eq 4.4

Полученные экспериментальные данные указывают на сдвиг
в химическом сдвиге 31P с изменением рН. Эта
изменение наблюдаемого
химический сдвиг в зависимости от рН подходит для eq 4 с использованием графического программного обеспечения GraphPad Prism
(Версия 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) для оценки
вторая константа диссоциации (pKa2) 4.

20,0 мг
из 4 растворяли в инъекции хлорида натрия USP,
и объем был
до 100 мл. Аналогичным образом растворяли 3,00 мг 4
в инъекции хлорида натрия USP и объем составил до 100 мл.
Эти две составляли «высокий» и «низкий»,
концентрации, соответственно. Ампулы стерилизовали,
к каждой ампуле добавляли 0,5 мл раствора 4,
и затем они были запечатаны огнем. Ампулы хранились в поддерживаемых печах
при 70, 60, 50 и 40 ° С. Решения, хранящиеся при 70 ° С, были
отбирали 4, 8, 10, 14 и 24 часа после хранения. Решения, сохраненные в
60 ° С отбирали 8, 14, 24, 32, 48 и 72 ч после хранения.
Растворы, хранящиеся при 50 ° С, отбирали 2, 4, 6, 8 и 11 дней
после хранения. Растворы, хранящиеся при 40 ° С, отбирали 4, 8, 13,
17 и 21 день после хранения. Растворы анализировали с помощью ВЭЖХ
как описано в Экспериментальной секции.

симулированный
желудочная жидкость (SGF): жидкость была получена путем приготовления раствора
хлорида натрия (0,20 г), концентрированной HCl (0,70 мл) и пепсина
(Sigma, P-7000, 0,32 г) в деионизированной воде (95 мл). Окончательный объем
доводят до 100 мл добавлением деионизированной воды. Имитированный кишечный
жидкость (SIF): жидкость была получена путем приготовления раствора одноосновного
фосфат калия (KH2PO4, 0,68 г), 0,1 N
водным раствором гидроксида натрия (38 мл) и панкреатином (Sigma, P-1625, 1,0
г) в деионизированной воде (57 мл). PH раствора регулировали
до 7,5 добавлением 1 н. водного гидроксида натрия, а затем конечным
объем доводили до 100 мл путем добавления деионизированной воды.

Источник
клеточных линий для ксенотрансплантатов опухолей был криоконсервированный флакон
по ATCC. Была установлена ​​клеточная линия колоректальной аденокарциномы человека HT-29
из опухолевой ткани 44-летней взрослой самки. Клетки выращивали
в качестве монослоя в одноразовых колбах, обработанных клеточной культурой, и культивируемых
в культуральной среде HyClone McCoy 5A, дополненной 10% об. / об.
фетальная бычья сыворотка. Оригинальный флакон оттаивали и культивировали для создания
основной банк ячеек (MCB). Пробирки MCB были протестированы на предмет загрязнения
микоплазменными организмами и для группы выбранных патогенов грызунов
и подтвердили отрицательный результат до культивирования клеток для имплантации
в исследованиях животных. Мышам вводили подкожно справа
фланг с опухолевыми клетками 1,74 × 106 НТ-29 в растворе
из 50% Martigel / 50% невыполненной культуральной среды McCoy’s 5A
в объеме 0,1 мл с использованием иглы 25 калибра.

Человек A2780
клеточная линия рака яичника была установлена ​​из опухолевой ткани из
нелеченный пациент. Источник клеточной линии для ксенотрансплантатов опухолей
в этом исследовании был выполнен криоконсервированный флакон, заказанный у ECACC (европейский
Коллекция клеточных культур) через поставщика Sigma-Aldrich. Клетки были
выращенных в виде монослоя в одноразовых колбах, обработанных клеточной культурой, и
культивировали в культуральной среде RPMI 1640, дополненной 10% об. / об. эмбета
бычьей сывороткой. Оригинальный флакон оттаивали и культивировали для создания
MCB. Пробирки MCB тестировали на заражение микоплазмой
организмов и для панели выбранных патогенов грызунов и подтвердили
отрицательный до культуры клеток для имплантации у исследуемых животных.
Каждый раз мышам вводили подкожно на правом или левом фланге
с 2,5 × 106 опухолевыми клетками в растворе 50% Matrigel / 50%
невосстановленной культуральной среды RPMI 1640 в объеме 0,1 мл.

Женские атимические голые мыши, возраст от 7 до 9 недель, получали от
Таконические фермы (Олбани, Нью-Йорк). Животных обследовали и взвешивали
на следующий день после получения, а вес измерялся и регистрировался
два раза в неделю после этого. Всем животным разрешалось акклиматизировать
лабораторная среда в течение не менее 7 дней до подкожного
инъекции раковых клеток. Средний объем опухоли при рандомизации
было 110 мм3 для исследования HT-29 и 188 мм3 для
исследование A2780. В каждой группе было 10 мышей, а продолжительность
лечения было 28 дней для исследования HT-29 и 30 дней для A2780
изучение. Концентрация доз для каждого животного основывалась на среднем
измерения массы тела для всех животных в соответствующих
доза. Доза карбоплатина в исследовании A2780 составляла 60 мг / кг
дважды в неделю. Испытуемое изделие было приготовлено в USP физиологическом растворе и
поставляется в объеме 0,2 мл.

Следующие параметры и
были оценены конечные точки: объем опухоли,
изменения объема опухоли, массы опухоли в конце исследования, клинических признаков, выживаемости,
веса тела и изменения массы тела. Измерения опухоли выполнены
не реже двух раз в неделю после первого появления опухолей.
калиброванный цифровой суппорт использовался для измерения длины и ширины
каждой опухоли. Объем опухоли рассчитывали по формуле L × W2 / 2, где W — наименьшая измеренная величина. Объемы опухолей и
вес опухоли выражается как среднее ± SEM.

Поддерживающая информация
предоставляется бесплатно на веб-сайте ACS Publications в DOI: 10.1021 / acs.jmedchem.5b01329.1H
ЯМР и 13C ЯМР-спектры дл
новые соединения 6, 8 и 4 и 31P ЯМР-спектр для соединения 4 (PDF)

jm5b01329_si_001.pdf

Все авторы
участвовал в составлении и / или пересмотре рукописи. Индивидуальный
: Сатиш Патил разработал синтез 4, разработал и провел исследования устойчивости и был вовлечен
в анализе и интерпретации данных. Лев Лис разработал
метод обобщенного синтеза для 4. Роберт Шумахер разработал
и направил исследования in vivo и провел анализ и интерпретацию
данных исследования in vivo. Беверли Норрис провела исследования in vivo
и участвовал в анализе и интерпретации исследования in vivo
данные. Моник Морган провел исследования in vivo и участвовал
в анализе и интерпретации данных исследования in vivo. Ребекка
Куэльяр способствовал анализу и интерпретации данных. Брюс
Блазар внесла свой вклад в развитие исследований in vivo и
анализ и интерпретация данных исследования in vivo. Радж Сурьянараяна
участвовал в исследованиях устойчивости и участвовал в анализе
и интерпретации данных. Вадим Дж. Гурвич участвовал в разработке
метода обобщающего синтеза для 4 и анализа
и интерпретации данных. Гунда Георг участвовал в разработке
пролекарства, его синтез, исследования устойчивости и анализ
и интерпретации данных.

Авторы заявляют
нет
конкурирующие финансовые интересы.

Авторы благодарны
в центр масонского рака (NIH)
P30 CA77598), Центр переводческой медицины и Колледж
Аптеки за щедрое финансирование, предоставленное для этого исследования. Эти
исследования были также поддержаны Президентом Винса и Макнайта
Председатели (до Г.И.Г.) и Фонд пожертвований Уильяма и Милдред Петерс
(Raj S.). Мы благодарим Мэри А. Смарт за очистку 4 ВЭЖХ, Майклом Махером и Винсент Ланькто за помощь в
исследования ксенотрансплантации и Цзин Ван за помощь в исследованиях устойчивости.

максимальный
концентрация крови

(dCTP пирофосфатаза 1)

энергия активации

константа скорости уничтожения

псевдо-первого порядка
константа скорости

константа скорости реверсии

банк основных сот

N-йодсукцинимид

вторая константа диссоциации

стандартное отклонение

смоделированная желудочная жидкость

имитированная кишечная жидкость

период полураспада

срок годности

Фармакопея США

ксеродермия пигментная B

фактор транскрипции
II H

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *