Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Сравнение стратегий сопряжения кросс-мостиковых макроциклических хелаторов с цетуксимабом для мечения меди и медь-64 с радиоактивной меткой и ПЭТ-визуализацией EGFR у колоректальных опухолевых мышей

Comparison of Conjugation Strategies of Cross-Bridged Macrocyclic Chelators with Cetuximab for Copper-64 Radiolabeling and PET Imaging of EGFR in Colorectal Tumor-Bearing Mice
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4224567/

Эпидермальный рецептор фактора роста
(EGFR) сверхэкспрессируется в широком
разнообразие твердых опухолей и служил хорошо охарактеризованной мишенью
для лечения рака и терапии. Cetuximab был первым таргетингом mAb
EGFR, одобренный FDA для лечения метастатической колоректальной
и рак головы и шеи. Предыдущие исследования показали, что 64Cu (T1 / 2 = 12,7 часа, β + (17,4%)), помеченные DOTA-cetuximab, показали, что PET-изображение
EGFR-положительных опухолей; однако стабильность in vivo
этого соединения было поставлено под сомнение. В этом исследовании два последних
разработанные кросс-мостиковые макроциклические хелаторы (CB-TE1A1P и CB-TE1K1P)
были конъюгированы с цетуксимабом с использованием стандартных процедур связывания NHS
и / или штамм-способствующие азид-алкин-циклоприсоединению (SPAAC).
Сравнивали оценку радиоактивной метки и in vitro / vivo полученных конъюгатов цетуксимаба.
Улучшена эффективность маркировки Cu-64 и высокая удельная активность (684
kBq / μg, распад, скорректированный до конца бомбардировки) были получены
с конъюгатом CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab. насыщение
анализ связывания показал, что полученные конъюгаты цетуксимаба имели
сопоставимое сродство (1,32-2,00 нМ) в человеческом колоректале HCT116
опухолевых клеток. В последующей оценке in vivo продемонстрировали 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab
более быстрый почечный клиренс с более высоким коэффициентом опухоли / без опухоли, чем
других 64Cu-меченых cetuximab-конъюгатов, и он показывает
Наилучшее обещание для визуализации и терапии EGFR-положительных опухолей.

Эпидермальный рецептор фактора роста (EGFR)
сверхэкспрессируется в широком
разнообразие твердых опухолей и служил хорошо охарактеризованной мишенью
для лечения рака и терапии, 1 и его
связано со многими человеческими злокачественными новообразованиями, включая голову и шею,
колоректального, немелкоклеточного легкого и рака молочной железы, среди прочих.2 Сверхэкспрессия EGFR в опухолях коррелирует
с агрессивным заболеванием, плохим прогнозом, плохим ответом и сопротивлением
к цитотоксической терапии в некоторых типах опухолей.3 Цетуксимаб (C225, Erbitux) представляет собой рекомбинантный человеческий / мышиный химерный
иммуноглобулина G1 (IgG1) моноклональное антитело (mAb), которое специфически связывается
к внеклеточному домену EGFR с высоким сродством. Он был одобрен
Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в 2004 году для лечения
пациентов с экспрессией EGFR, метастатическим колоректальным раком. Cetuximab
блокирует активацию EGFR, предотвращая лиганд-опосредованный тирозин
киназного фосфорилирования и последующей трансдукции сигнала, которая индуцирует
интернализация и возможная деградация EGFR.4. Несколько клинических испытаний показали, что цетуксимаб, либо
вводится отдельно или в сочетании со стандартной первой или второй линией
химиотерапия, улучшенная эффективность лечения метастатической колоректальной
рак без значительного увеличения токсичности.5-7

Там
имеет значительный интерес к радиоактивно меченому цетуксимабу, поскольку
немеченый препарат был одобрен FDA для лечения колоректального
рак. Цетуксимаб был радиоактивно мечен с 99mTc и 111In для изображений SPECT8,9 и 64Cu, 86Y и 89Zr для изображений PET.10-12 Copper-64 (T1 / 2 = 12,7 часа) является особенно перспективным, поскольку
его подходящего периода полураспада и уникальных характеристик распада: β + (656 кэВ, 17,4%) и β- (573 кэВ,
38,5%), а бета-распад делает этот радионуклид привлекательным для
терапия. 13-16. Радиационная маркировка при 37 ° C или ниже имеет решающее значение для поддержания
биологической целостности антител, поэтому DOTA была самой
общепринятый хелатор для радиоактивной метки 64Cu цетуксимаба
и другие антитела. Однако поведение in vivo
комплекса 64Cu-DOTA является менее оптимальным из-за диссоциации
из 64Cu из комплекса DOTA, и это может привести к относительному
плохая опухоль к неквалифицированным отношениям.10,17,18 Кросс-мостиковые макроциклические хелаторы (такие как CB-TE2A, CB-TE1A1P,
и CB-TE1K1P, рис. 1) показали впечатляющие
кинетическая инертность для комплексов Cu.19-22 Монокарбоксилат монофосфонат
хелатор CB-TE1A1P может быть помечен 64Cu при комнатной температуре
с сопоставимой устойчивостью in vivo к CB-TE2A, 21 и его пептидному конъюгату 64Cu-CB-TE1A1P-Y3-TATE
продемонстрировали улучшение направленности опухоли и биораспределение по сравнению
к конъюгату 64Cu-CB-TE2A-Y3-TATE в опухоли поджелудочной железы
модель крысиных подшипников.23 Недавно разработанная
CB-TE1K1P-хелатор, содержащий один метанфосфонат и один карбоксилат
подвеска, имеет преимущества, связанные с поддержанием карбоксилата
групповое постконъюгирование с биомолекулами, и этот хелатор может быть
улучшенный бифункциональный хелатор для маркировки медных радионуклидов
к моноклональным антителам, таким как цетуксимаб.22

сооружения
DOTA, CB-TE2A, CB-TE1A1P и CB-TE1K1P.

Здесь два кросс-мостиковых хелатора CB-TE1A1P и CB-TE1K1P
были конъюгированы с цетуксимабом с помощью обычного конъюгата сложного эфира NHS (N-гидроксисукцинимида) и / или промотированного штаммом азид-алкина
циклоспорификации (SPAAC), и полученные конъюгаты были
оценивали у голых мышей, несущих HCT116 человеческие колоректальные опухоли. Кроме
сравнение прямого конъюгации эфира NHS CB-TE1A1P
к цутуксимабу с использованием стандартных методов связывания с конъюгатами SPAAC
CB-TE1A1P и CB-TE1K1P до цетуксимаба, мы рассматриваем, является ли SPAAC
подход достигнет большей легкости радиоактивной маркировки в более высокой специфической
активности (SA) по сравнению со стандартными стратегиями конъюгации NHS-эфира.
Мы также исследовали, связано ли сопряжение хелатора CB-TE1K1P с
cetuximab приведет к улучшению таргетинга и биораспределения
к CB-TE1A1P, который использует один из карбоксилатов для конъюгации.

Если не указано, все химические вещества были приобретены
от Сигма-Олдрича
Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Медь-64 была куплена у Вашингтона
Университет (Сент-Луис, Миссури) и Университет Висконсина (Мэдисон,
WI). Эфир DBCO-PEG4-NHS и DBCO-амин были приобретены
от Click Chemistry Tools (Скоттсдейл, Аризона). CB-TE1K1P-PEG4-DBCO, CB-TE1A1P-DBCO и 3-азидопропионовой кислоты сукцинимидиловый эфир
были синтезированы, как сообщалось ранее.22 Концентраторы Centricon 100 были приобретены у Amicon (Beverly,
MA). Zeba спин-обессоливающие колонны были получены от Thermo Scientific (Rockford,
IL). Cetuximab был получен от ImClone Systems Incorporated (New
Йорк, Нью-Йорк). Гидрирование с высокой степенью исключения проводили на Superose 12 HR 10/300
колонка (Amersham Biosciences, Уппсала, Швеция), прикрепленная к Waters
600E (Milford, MA) с фотодиодом Waters 991
массивный детектор и модель Ortec 661 (EG & G Instruments, Oak Ridge,
TN). Мобильная фаза составляла 20 мМ HEPES, 150
мМ NaCl, pH 7,3, элюируя при скорости потока 0,5 мл / мин. Millenium 32
программное обеспечение (Waters, Milford, MA) использовалось при анализе хроматограмм ВЭЖХ.
96-луночные микротитровальные планшеты MultiScreen для анализа рецепторного связывания
были рассчитаны на 1450 Microbeta Trilux Liquid Scintillation и люминесценцию
счетчик (PerkinElmer Life Sciences).

NHS-эфир
автоматическое сопряжение CB-TE1A1P
к цутуксимаба показано на схеме 1. CB-TE1A1P
(5,8 мг, 15 мкмоль) смешивали с сульфо-N-гидроксисукцинимидом
(SNHS, 1,7 мг, 15 мкмоль) и HOBT (2,0 мг, 15 мкмоль) в 1
мл ДМФА. Соединительный реагент 1-этил-3- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимид
(EDC, 2,9 мг, 15 мкмоль) добавляли к смеси для запуска
реакция. После 30 мин перемешивания на льду реакционную смесь
выпаривают досуха. Концентрированный цетуксимаб (20 мг / мл) смешивали
с активированным CB-TE1A1P в молярном соотношении 100: 1 (CB-TE1A1P: цетуксимаб),
с последующим инкубацией при 4 ° С в течение 7 дней с вращением на конце конца.
Затем конъюгат переносили в Centricon 100, дважды промывали
с 0,1 М ацетатом аммония (рН 8,0) и концентрировали до
загружают в колонну обессоливания. Непрореагировавшие небольшие молекулы удалены
путем пропускания реакционной смеси 2-3 раза через обессоливание
колонны. Чистота и концентрация конъюгированного цетуксимаба были
определяемый с помощью ВЭЖХ с исключением размера. Количество хелаторов на антитело
определяли титрованием CB-TE1A1P-цетуксимаба с помощью [natCu] ацетата меди / 64Cu-ацетата с использованием опубликованного
метод.24 Для радиоактивной маркировки добавляли 64CuCl2 к CB-TE1A1P-цетуксимабу в 0,1 M
ацетата аммония (рН 8,0) с последующей инкубацией при 40 ° С для
2 ч. Радиохимическая чистота 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба
определяли с помощью ВЭЖХ с размером исключения, а обессоливающие колонны
при необходимости используется для очистки.

синтез CB-TE1A1P и
CB-TE1K1P, присоединенный cetuximab конъюгатами через SPAAC, показан на схеме 2. Цетуксимаб (2,0 мг / мл, 20,0 мл) был функционализирован
с азидными группами путем смешивания с сукцинимидилом 3-азидопропионовой кислоты
сложного эфира (1,27 мг в 1,0 мл ДМФА) в буфере Na2HPO4
(0,1 М, pH = 8,2, 5,0 мл) в течение ночи при 4 ° С, а затем смесь
переносили в Centricon 100 и промывали 0,1 М аммонием
ацетата (рН 8,0) в 5-6 раз. Очищенный азид-цетуксимаб
(2,0 мг / мл) затем смешивали с 100-кратным избытком CB-TE1K1P-PEG4-DBCO или CB-TE1A1P-DBCO и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С,
с последующей инкубацией в течение ночи при 4 ° С с вращением на конце конца.
Реакцию переносили в Centricon 100, промывали 0,1 М
ацетата аммония (рН 8,0) в 3-4 раза и загружали в обессоливающийся
для удаления непрореагировавшего DBCO-хелатора. Чистота и концентрация
конъюгатов хелатор-цетуксимаб определяли путем исключения по размеру
ВЭЖХ. Титрование хелатор-цетуксимаба с помощью [natCu] меди / 64Cu-ацетата проводили для измерения количества
хелаторов на антитело. Медь-64-меченый клик-хелатор cetuximab
конъюгаты были получены добавлением 64CuCl2 к
конъюгат в 0,1 М ацетате аммония (pH 8,0) с последующей инкубацией
при 37 ° С в течение 30 мин для CB-TE1K1P-PEG4-DBCO-конъюгированного
антитело и 40 ° С в течение 60 мин для CB-TE1A1P-DBCO-cetuximab.
Чистота конъюгатов cetuximab класса 64Cu-click-chelator
был подтвержден с помощью ВЭЖХ с исключением по размеру.

Были выделены клетки HCT116
доктор Берт Фогельштейн (Университет Джона Хопкинса) и были культурными
в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 0,1% гентамицина в
37 ° C увлажненный 95% воздух, 5% CO2-инкубатор. Все животные
эксперименты проводились в соответствии с
Использовать комитеты (IACUC) в Вашингтонском университете и университете
из Питтсбурга. Были приобретены женские бестимусные голые мыши (5-6 недель)
от NCI (Фредерик, MD). Для исследований биораспределения и малых
животных PET / CT, 4 × 106 HCT116 клеток в 100
мкл 0,9% солевого раствора имплантировали подкожно в дорзальный
фланг каждого животного, и мыши подвергались биораспределению
и / или PET / CT, когда объем опухоли достиг 100-200 мм3 (2-3 недели).

Сродство
из 64Cu-меченых конъюгатов цетуксимаба для EGFR
путем анализа связывания насыщения на основе ранее опубликованных методов.25 Препараты клеточной мембраны HCT116 были разбавлены
в связывающем буфере [0,1% бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4),
5,0 ммоль / л MgCl2, 0,5 мкг / мл апротинина, 200 мкг / мл
бацитрацин, 10 мкг / мл леупептина и 10 мкг / мл пепстатина
A] и 15 мкг мембраны добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета
фильтровальная пластина (Multiscreen Durapore, Millipore, Billerica, MA).
Мембраны инкубировали с возрастанием концентрации меченых конъюгатами цетуксимаба с 64 Cu в течение 2 ч при комнатной температуре. неспецифический
связывание определяли насыщающими рецепторами с избытком цетуксимаба.
Когда равновесие достигнуто, несвязанная радиоактивность отфильтровывалась
и мембраны дважды промывали 200 мкл связывающего буфера.
Связанная радиоактивность измерялась жидкой сцинтилляцией и люминесценцией
(1450 Microbeta, PerkinElmer, Waltham, MA). Полная привязка
сайты (Bmax) и аффинность связывания (Kd) определялись нелинейной регрессией
пригодность связанных пептидов на мг белка в сравнении с концентрацией радиолиганда
используя GraphPad Prism v 5.0 (San Diego, CA).

Биораспределение
исследования проводили, как описано ранее.10 Медь-64-меченый цетуксимаб (~ 0,74 МБк, 1,0-6,0
мкг в 150 мкл) вводили через хвостовую вену в HCT116, несущую опухоль
мышей (7-9 недель). Через 24 и 48 ч после инъекции мыши были
пожертвованные и отобранные органы удаляли, взвешивали и подсчитывали
на счетчике γ (Beckman 8000; Irvine, CA). Исследование блокировки
также проводилось для изучения специфики поглощения in vivo. Цетуксимаб (1 мг) предварительно инъецировали в течение 24 ч перед мечением 64Cu cetuximab конъюгатами в мышей, несущих опухоль HCT116, через
хвостовая вена. Поглощение ткани измеряли через 24 ч после инъекции.

HCT116 опухолеобразующая самка
голым мышам (7-9 недель) вводили меченым 64Cu
цетуксимаб (~ 3,7 МБк, 6-30 мкг в 150 мкл).
Через 24 и 48 ч после инъекции мышей анестезировали 1-2%
изофлурана и визуализируется. Исследование блокировки проводилось в двух опухолеподобных
мышей, как описано выше. Блокирующие мыши были соединены с неблокированными
мышей и отображались в одно и то же время. Стандартные значения поглощения опухоли
(SUV) были получены путем измерения областей, представляющих интерес, из PET / CT
изображения и рассчитаны по формуле SUV = [nCi / mL] × [животное
вес] / вводимая доза [nCi] .20

Данные выражаются как средние
± SD. Когда сравнивалось более двух наборов данных, двухсторонняя ANOVA
был использован анализ с пост-тестами Бонферрони. Значения P
<0,05 считались статистически значимыми.

Сначала мы выполнили сопряжение CB-TE1A1P
и цетуксимаба с помощью обычной реакции, связанной с NHS, с образованием амида
связь между карбоновой кислотой CB-TE1A1P и первичными аминами
цетуксимаба. SA 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab
, сделанные реакцией NHS, варьировались от 60 до 129 МБк / мг (8700-19 000
MBq / μmol), скорректированный на окончание бомбардировки (EOB) для меди-64.
Отношение CB-TE1A1P: cetuximab было 1,5 для CB-TE1A1P-цетуксимаба
синтезируется с помощью NHS-алипидных реакций, по сравнению с 5 хелаторами / mAb для
ранее сообщенный DOTA-cetuximab.10 Низкое соотношение хелатора с антителом, вероятно, отвечает
для более низкого SA 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab по сравнению
к конъюгатам DOTA и CB-TE1K1P-PEG4-DBCO.

При сопряжении
CB-TE1K1P-PEG4-DBCO до азида-цетуксимаба, в 100 раз
избытка CB-TE1K1P-PEG4-DBCO использовали для обеспечения того, чтобы все
азиды в цетуксимабе были конъюгированы с хелатором. Результирующий
Конъюгат CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab очищали
Centricon 100 и колонны обессоливания, а затем радиоактивно мечены с 64Cu при выходе> 95% после инкубации в течение 30 минут при 37 ° C.
SA 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab
варьировали от 548 до 684 МБк / мг (от 80 000 до 100 000 МБк / мкмоль).
Соотношение конъюгации составляло в среднем 9 хелаторов на цетуксимаб, приблизительно
В 6 раз больше, чем для CB-TE1A1P-цетуксимаба. Даже при этом
высокий хелатор: отношение mAb, сродство связывания химии кликов
конъюгат не был скомпрометирован.

Использовали CB-TE1A1P-DBCO (100 экв.)
для реакции с азидо-цетуксимабом. Полученный CB-TE1A1P-click-cetuximab
конъюгат (9 хелаторов на mAb) очищали Centricon 100 и
колонна обессоливания, а выход радиоактивной метки был> 90% после
инкубация
в течение 60 мин при 40 ° С. SA 64Cu-CB-TE1A1P-click-cetuximab
варьировали от 206 до 321 МБк / мг (от 30 000 до 47 000 МБк / мкмоль). агрегирование
наблюдалось после радиоактивной маркировки CB-TE1A1P-click-cetuximab, поскольку
о чем свидетельствует ВЭЖХ, исключающая размер.

Диссоциация
константные (Kd) значения 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab, 64Cu-CB-TE1A1P-click-cetuximab, 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab и 64Cu-DOTA-cetuximab
для EGFR составляли 2,00 ± 0,60 нМ, 1,32 ± 0,42 нМ, 1,43 ±
0,41 нМ и 1,89 ± 0,66 нМ соответственно (таблица 1), и эти значения аналогичны предыдущим сообщенным Kd DOTA-cetuximab.26

Bmax:
общее количество сайтов связывания.

Из-за
агрегация 64Cu-CB-TE1A1P-click-cetuximab, в исследованиях биораспределения были оценены только 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab и 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab.
Биораспределение проводили у женщин-обнаженных мышей, несущих HCT116
опухоли. Как показано на рисунке 2, оба агента продемонстрировали
(до 8,2 ± 1,1% ID / г
через 24 ч до 8,3 ± 1,1% ID / г в течение 48 ч для 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба,
и 11,5 ± 2,5% ID / г в течение 24 ч до 11,9 ± 0,8% ID / г в течение 48 ч
для 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab).
радиоактивность в печени также показала либо отсутствие клиренса, либо слегка
увеличение поглощения, с 10,4 ± 0,8% ID / г в течение 24 ч до 9,5 ±
0,2% ID / г в течение 48 ч для 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаб,
и 8,7 ± 2,5% ID / г с 24 ч до 13,1 ± 2,6% ID / г в течение 48 ч
для 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab. Для
оба агента, количество активности, локализованное в почках, сердце,
и мышцы были ниже, чем в печени, и не показали значительных
от 24 до 48 ч.

Биораспределение 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab
(A) и 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаб (B)
в HCT116 опухолевых женских голых мышах. Отдельные исследования блокировки
были выполнены для подтверждения специфичности зондов для EGFR, соответственно.
Данные представлены в виде процентной дозы инъекции на грамм (n = 3-5 для каждой точки данных, баров ± SD).

64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab и 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab показали увеличение
поглощение опухоли от 24 до
48 ч. Поглощение опухоли 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab через 48 ч после инъекции (36,5 ± 1,9% ID / г) было
в три раза выше, чем поглощение опухоли при 24-часовой постинъекции (9,6
± 1,2% ID / г). Поглощение опухоли 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab
также увеличилось в 1,5 раза с 24 ч (14,1 ± 1,8% ID / г) до 48 ч
(20,2 ± 6,1% ID / г) после введения агентов. %
инъекционная доза в опухоли была наибольшей при 48 ч после инъекции для
как 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab, так и 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab (p <0,05 по сравнению со значениями в других временных точках). Специфика 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab и 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab для EGFR была подтвержденные отдельными исследованиями блокировки, выполненными в течение 24 ч после инъекции. Преинъекция 1,0 мг холодного цетуксимаба уменьшала поглощение опухоли 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба с 14,1 ± 1,78% ID / г до 8,68 ± 1,03% ID / г (р <0,05), и что 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab от 9,5 ± 1,2% ID / г до 4,9 ± 0,5% ID / г (р < 0,05).

Сравнение опухолей: нетопливные отношения при 48 ч постинъекции
среди 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab, 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab и 64Cu-DOTA-cetuximab27 показан на рисунке 3.
Колебания опухоли: мышцы и опухоли: печени 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab были значительно выше, чем у 64Cu-DOTA-цетуксимаба (p <0,001, p <0,01 соответственно), тогда как опухоль: кровь показала более высокая тенденция, но различия были незначительными (p = 0,09). С другой стороны, по сравнению с 64Cu-DOTA-цетуксимабом, 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаб показал сравнимую опухоль: кровь и опухоли: показатели печени, но значительно ниже опухоль: мышцы и опухоли: почки (p <0,05 для обоих), что можно отнести к низкой удельной активности (от 60 до 129 МБк / мг) 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба, что могло привести к снижению опухоли поглощение через 48 ч после инъекции по сравнению с 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab и 64Cu-DOTA-цетуксимабом.

Сравнения
опухоли: кровь, опухоль: мышцы, опухоль: печень и опухоль: почка
отношения 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab, 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab и 64Cu-DOTA-cetuximab
при 48-часовой постинъекции у HCT116 опухолевых женских обнаженных мышей (* p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 против 64Cu-DOTA-cetuximab27).

Малое животное ПЭТ / КТ-изображение
проводили через 24 и 48 ч после инъекции 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба
и 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab в HCT116
опухолевых мышей. Для обоих рентгеновских лучей опухолевые ксенотрансплантаты были явно
видимый через 24 и 48 ч после инъекции. Мыши, получающие блокирующую дозу
немеченого цетуксимаба показали значительное снижение поглощения
(рис. 4). Среднее стандартизованное
(SUVavg) и отношения опухоли к мышелу были
определяемые как для заблокированных, так и неблокированных опухолей через область интересов
(ROI). Внедорожники опухоли и мышц для 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба составляли 1,75 и 0,24 соответственно, тогда как
опухолевые и мышечные внедорожники для 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab составляли 1,5 и 0,18. В когорты, вводимые с блокировкой
дозу, отношение опухоли к мышцам 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба
была уменьшена с 7,72 ± 1,59 до 4,44 ± 0,11, а показатель 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab был снижен
с 8,07 ± 0,52 до 3,27 ± 0,17 (р < 0,05) (фиг. 4С), что дополнительно подтверждают Специфичность двух кросс-мостовых хелаторов прилагается cetuximab конъюгатов для EGFR в опухоли HCT116.

Максимальный ПЭТ / КТ животных
интенсивности проекционных изображений HCT116
опухолевых женских обнаженных мышей при 48 ч постинъекции 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab (A) и 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab (B). Одну группу мышей предварительно обрабатывали
с ~166-33 экв. немеченого цетуксимаба за 24 часа до
для зондирования инъекций (правые панели A и B), в то время как другая группа была
не предварительно обработанные (левые панели A и B). Калибровочные столбцы являются ориентировочными
Бк / мл. (C) Сравнение коэффициентов поглощения опухоли и мышечной ткани между
блокированных и разблокированных мышей, обработанных зондами цетуксимаба. Полосы ошибок
что указывает на стандартную ошибку среднего значения. N =
2 для каждой группы.

была выполнена первая попытка конъюгации CB-TE1A1P с цетуксимабом
в водной реакции с помощью сульфо-NHS. Карбоксилат
группа в CB-TE1A1P активировалась EDC для образования нестабильной реактивной
промежуточный. Поскольку гидролиз o-ацилиромочевины
сложный эфир был более распространен, чем реакция сочетания с сульфо-NHS,
Таким способом мы не смогли получить какой-либо конъюгированный цетуксимам.
Затем мы проверили реакции с использованием ДМФА в качестве растворителя, при содействии
NHS и инициируется EDC в качестве реагента связывания. Активированный CB-TE1A1P
подвергали взаимодействию с NHS с образованием полустабильного амин-реактивного сложного эфира, который
может затем образовывать стабильную амидную связь с антителом. ДМФА выпаривали
в вакууме перед добавлением водного раствора цетуксимаба к активированному
CB-TE1A1P. Хотя конъюгация имела место, только в среднем 1,5 хелатора
за cetuximab, полученный по этому синтетическому маршруту, из-за низкой эффективности
реакции сшивки, связанной с NHS, между CB-TE1A1P и
первичные амины антитела. Предыдущие исследования показали, что
может происходить реакция между группами фосфоновой кислоты и аминами,
но продукты быстро гидролизуются и стабильны только при сильных
основные условия 28,29. Мы постулируем, что гидролиз
фосфорамидов приводит к снижению эффективности конъюгации между CB-TE1A1P
и цетуксимабом, что приводит к низкой SA 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба.

Синтез радиофармацевтических препаратов часто требует быстрой кинетики
из-за короткого периода полураспада. Химия химии имеет привлекательные характеристики,
включая модульность, надежность, избирательность, быстроту и эффективность.
Cu (I) -катализированное азид-алкинное циклоприсоединение (CuAAC) было
широко используется для меченых 18F пептидов и малых молекул
и продемонстрировал преимущества по сравнению с обычными методами конъюгации.30 Однако CuAAC не идеальна для конъюгации
хелаторов, поскольку ионы Cu (I) могут препятствовать образованию радиометаллического хелата
сложный. Разработка безмасляного SPAAC расширила использование
химии щелчков для применений с радиометами.31-33 Чтобы улучшить эффективность конъюгации, мы применили SPAAC к нашей новой
разработанные хелаторы. Здесь мы демонстрируем синтез кросс-мостов
хелатор-цетуксимаб конъюгаты через SPAAC, что позволяет получать радиоактивную мечение
при физиологической температуре в высоком SA. CB-TE1A1P был впервые изменен
с коммерчески доступным DBCO-амином с образованием DBCO-CB-TE1A1P
с относительно низким выходом. Затем щелкнули DBCO-CB-TE1A1P с помощью
азид-модифицированный цетуксимаб. Полученный 64Cu-CB-TE1A1P-click-cetuximab
получали при 40 ° С в течение 60 мин в умеренном SA (от 206 до 321
МБк / мг). Анализ связывания показал сравнимую аффинность связывания и значения Bmax CB-TE1A1P-click-cetuximab
с CB-TE1A1P-цетуксимабом. Однако этот конъюгат показал разные
степени агрегации от партии до партии. Для решения этой проблемы,
другой кросс-мостиковый макроциклический хелатор CB-TE1K1P-PEG4-DBCO с дополнительным кронштейном карбоксилата и линкером PEG4 был разработан с целью обеспечения более мягких условий маркировки
и снижение агрегации. CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab
конъюгат был радиоактивно меченым при 37 ° С в течение 30 мин в более высокой SA (548
до 684 МБк / мг). После конъюгирования CB-TE1A1P с цетуксимабом, только
один фрагмент метанфосфоновой кислоты доступен для хелатирования Cu (II).
Из-за потери карбоксилатной группы и короткого линкера между
хелатор и антитело, CB-TE1A1P-cetuximab требует
40 ° C и относительно более длительное время радиоактивной метки (1-2 часа), 22,23, что также может объяснять некоторые проблемы агрегации.

DBCO-PEG4 присоединяли к первичному амину CB-TE1K1P
и затем конъюгировали с азидом-цетуксимабом через SPAAC.22. По методу химии без химии без примесей, мы
были в состоянии избежать гидролиза фосфорамидов, что привело к
значительно выше хелатор: отношение mAb. Соотношение эфира азида-NHS: цетуксимаба
составляла 20: 1, и ~ 45% эфиров NHS реагировали с первичными аминами
в цетуксимабе, тогда как другие 55% эфиры NHS гидролизуются. Соотношение
CB-TE1K1P-PEG4-DBCO: азид-цетуксимаб составлял 100: 1,
заставляя все азидные группы реагировать с CB-TE1K1P-PEG4-DBCO, в результате чего соотношение хелатор: антитело составляет 9, что увеличилось
SA в 6 раз по сравнению с SA, полученным из CB-TE1A1P-цетуксимаба
конъюгата, образованного с помощью реакции NHS.

Эффективность in vivo радиофармацевтических препаратов 64Cu
частично обусловлена ​​устойчивостью комплекса 64Cu-BFC
и SA радиатора. 64Cu-CB-TE1K1P и 64Cu-CB-TE1A1P продемонстрировали сопоставимую стабильность с 64Cu-CB-TE2A, как в качестве хелата металла, так и после конъюгации с пептидами.22,23,3464Cu-CB-TE1A1P-cetuximab
показал улучшение биораспределения по сравнению с 64Cu-DOTA-cetuximab,
о чем свидетельствует более быстрый клиренс крови и более низкий уровень потребления в
легких, печени, селезенки и почек. Трансхеляция in vivo
Cu (II) является одним из факторов неспецифического поглощения в нормальных тканях,
и формирование стабильных хелатов металлов улучшает биораспределение пептида
конъюгаты; однако нет никаких окончательных данных о том, что это верно
для конъюгатов хелатообразующих mAb. Фактически, опухоль: мышцы и
опухоль: отношение почек 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab
не были значительно лучше, чем у 64Cu-DOTA-cetuximab
(значения р> 0,05). Низкая удельная активность 64Cu-CB-TE1A1P-цетуксимаба, возможно, привела к насыщению рецепторов,
уменьшая поглощение опухоли ракетоносителя. Применение клика
химия позволила увеличить SA за счет повышения эффективности радиоактивной метки
с более длинной связью между хелатором и mAb и более высоким хелатором: антитело
соотношение. 64Cu-CB-TE1K1P-cetuximab продемонстрировал значительно
более высокая опухоль: мышца (р <0,001) и опухоль: печень (p <0,01) по сравнению с 64Cu-DOTA-цетуксимабом.

64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab получали с использованием обычных
NHS-сопряжение и 64Cu-CB-TE1A1P-click-cetuximab
и 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab были
полученных с использованием SPAAC, и получаемые в результате конъюгаты цетуксимаба были
оцениваются как агенты, ориентированные на рецепторы, для визуализации ПЭТ с будущим
приложения для радиоиммунотерапии (RIT) сверхэкспрессирующих опухолей
EGFR. Стратегия химии щелчка успешно увеличила число
хелаторов, которые были прикреплены к каждому антителу, и SA
соответствующий радиофармацевтический препарат. 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-cetuximab также продемонстрировал более высокую опухоль: отсутствие опухолей
чем 64Cu-CB-TE1A1P-cetuximab. Эти результаты
предоставляют возможности использования химии щелчков для стабильного конъюгирования 64Cu с широким спектром чувствительных к нагреванию биологических молекул. 64Cu-CB-TE1K1P-PEG4-click-cetuximab обладает потенциалом
для одновременной визуализации и лечения EGFR-положительных опухолей.

Информация о параметрах
для исследований изображений. Этот материал доступен бесплатно
через Интернет по адресу http://pubs.acs.org.

mp500004m_si_001.pdf

‡ Эти два автора внесли одинаковый вклад
к этой работе

Авторы не заявляют
конкурирующие финансовые интересы.

Авторы хотели бы поблагодарить Даниэля Сили
за его работу
оптимизация условий сопряжения для CB-TE1A1P для цетуксимаба и Кристофера
Шерман за техническую экспертизу. Это исследование было профинансировано NIH / NCI
Гранты 5R01CA064475 и 5R01CA093375, DOE DE-FG02-08ER64671 и NCI
Поддержка грантов Центра поддержки рака P30 CA91842 (WU) и P30 CA047904 (In
Vivo Imaging Facility, UPCI).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *