Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Экспрессия и прогностическое значение ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту, в колоректальном раке

The Expression and Prognostic Significance of Retinoic Acid Metabolising Enzymes in Colorectal Cancer
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3946526/

Конкурирующие интересы: Грэм Мюррей является научным консультантом по антителам позвоночных, которые внесли свой вклад в это исследование. Никакое финансовое вознаграждение не было или получено для этой позиции, и он не владеет акциями этой компании. Beatriz Cash и Ayham Alnabulsi являются сотрудниками антител позвоночных. Это не изменяет приверженность авторов политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: GTB BGC AA GIM. Провели эксперименты: GTB BGC DB PJ AA GIM. Проанализированы данные: GTB BGC AA GIM. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: GTB BGC DB PJ AA GIM. Написал документ: GTB BGC AA GIM.

Колоректальный рак является одним из наиболее распространенных видов рака с более чем пятьюдесятью процентами пациентов, представляющих на продвинутой стадии. Ретиноевая кислота является метаболитом витамина А и имеет важное значение для нормального роста клеток, а аберрантный метаболизм ретиноевой кислоты связан с опухолеобразованием. Это исследование профилировало экспрессию ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту, с использованием хорошо охарактеризованного колоректального ракового тканевого микрочипа, содержащего 650 первичных колоректальных раков, 285 метастазов лимфатических узлов и 50 образцов слизистой оболочки нормальной толстой кишки. Иммуногистохимию проводили на тканевом микрочипе с использованием моноклональных антител, которые мы разработали для ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и лецитиновой ретинолацилтрансферазы (LRAT), используя полуколичественную схему оценки для оценки экспрессии. Умеренная или сильная экспрессия CYP26A1 наблюдалась у 32,5% случаев рака по сравнению с 10% образцов обычного эпителия толстой кишки (р <0,001). CYP26B1 умеренно или сильно экспрессировался в 25,2% опухолей и был значительно менее выражен в нормальном кишечном эпителии (р <0,001). CYP26C1 не был выражен ни в одном образце. LRAT также показал значительно повышенную экспрессию при первичных колоректальных раках по сравнению с обычным кишечным эпителием (p <0,001). Сильная экспрессия CYP26B1 достоверно ассоциировалась с плохим прогнозом (HR = 1.239, 95% CI = 1.104-1.390, χ2 = 15.063, p = 0.002). Сильный LRAT также ассоциировался с более слабым результатом (HR = 1,321, 95% CI = 1,034-1,688, χ2 = 5,039, p = 0,025). При несовпадении репарации опытных опухолей сильный CYP26B1 (HR = 1,330, 95% CI = 1,173-1,509, χ2 = 21,493, p <0,001) и сильный LRAT (HR = 1,464, 95% CI = 1,110-1,930, χ2 = 7,425, p = 0,006) также были связаны с более низким прогнозом. Это исследование показало, что ферменты, метаболизирующие ретиноевую кислоту CYP26A1, CYP26B1 и LRAT, значительно избыточно экспрессируются при колоректальном раке и что CYP26B1 и LRAT достоверно связаны с прогнозом как в общей когорте, так и в тех опухолях, которые являются специалистами по ремонту несоответствия. CYP26B1 был независимо прогностическим в многомерной модели как во всей группе пациентов (HR = 1,177, 95% CI = 1,020-1,216, p = 0,026), так и в опухолях с несоответствующим восстановлением (HR = 1,255, 95% CI = 1,073-1,467, р = 0,004).

Колоректальный рак является одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований, пятилетняя выживаемость которых остается на уровне примерно пятидесяти процентов, несмотря на введение программ скрининга рака кишечника [1]. В то время как молекулярный патогенез этого типа опухоли все чаще понимается и определяется прежде всего на ранних стадиях развития рака толстой кишки, где молекулярные изменения были очерчены с высокой степенью детализации [2] — [4]. Однако по-прежнему существует явная потребность в идентификации биомаркеров колоректального рака, включая прогностические, прогностические и диагностические маркеры [5] — [15].

Ретиноиновая кислота (РА) является метаболитом витамина А (ретинола), который выполняет важные функции при нормальном росте клеток и дифференцировке, а дисменованный метаболизм ретиноевой кислоты участвует в опухолегенезе [16], [17]. Ретиноиды, термин, используемый для описания природных или синтетических соединений, демонстрирующих структурное или функциональное сходство с ретинолом, играют важную роль в клеточном росте, дифференцировке и апоптозе [16]. Наиболее активная форма RA, all-trans retinoic acid (atRA), обладает регуляторной функцией гена и играет решающую роль в развитии нескольких органов. 4-оксо-9-цис-ретиноевая кислота (9-цис-РА) и 4-оксо-13-цис-ретиноевая кислота (13-цис-РА) являются стереоизомерами atRA, а также играют важную роль в передаче сигналов RA , Некоторые ретиноиды обладают противораковыми свойствами, которые уже использовались для лечения нескольких видов рака, включая рак шейки матки и промиелоцитарный лейкоз.

Внутриклеточная обработка ретинола включает лецитиновую ретинолацилтрансферазу (LRAT), которая отвечает за этерификацию ретинола [18], [19], в то время как гидроксилирование ретинола осуществляют гидроксилазами ретиноевой кислоты (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1), которые являются всеми членами семейства ферментов цитохрома P450 (P450) [20], [21].

Три члена семейства CYP26 способны метаболизировать atRA менее биологически активными 4-гидрокси-, 4-оксо- и 18-гидрокси-RA-интермедиатами [22] — [24], из которых 4-оксо-RA является наиболее распространенным метаболитом [16]. Хотя в предыдущих исследованиях была изучена экспрессия P450 в опухолях и показана экспрессия опухоли с отдельными P450, особенно с CYP1B1 [25], CYP26-семейство P450s уделяет мало внимания в связи с их экспрессией в опухолях.

Это исследование профилировало экспрессию ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и LRAT, с использованием хорошо охарактеризованного колоректального ракового тканевого микрочипа с моноклональными антителами к CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и LRAT соответственно, которые были разработаны и охарактеризованы для их использования посредством иммуногистохимия на фиксированной восках фиксированной ткани.

Моноклональные антитела к CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и LRAT были разработаны в сотрудничестве с Vertebrate Antibodies Ltd (Aberdeen, UK) с использованием синтетических пептидов. Были идентифицированы пептиды внутри предполагаемых белковых последовательностей, которые были антигенными, экспонированными на поверхности и уникальными для целевого белка. Аминокислотные последовательности и расположение на белках указаны в таблице 1. Пептиды были получены от Almac Sciences Ltd (Эдинбург, Великобритания) и конъюгированы индивидуально с овальбумином для иммунизации и альбумина бычьей сыворотки для тестов ELISA [26]. Иммунизация мышей, продуцирование гибридомных клеток и скрининг ELISA проводились в основном так, как описано ранее [26], за исключением того, что антиген был назначен подкожным путем. Гибридомы клонировали путем предельного разведения до тех пор, пока в 96-луночный планшет не выращивали одну положительную колонию ELISA. Затем отдельные клеточные линии выращивали при высокой плотности клеток для получения содержимого антитела, которое впоследствии использовалось для их характеристики путем иммуноблоттинга и иммуногистохимии.

Целевые клеточные лизаты из клеток (человеческие эмбриональные клетки почек), сверхэкспрессирующие CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и LRAT, использовали в качестве положительного контроля иммуноблоттинга, тогда как лизаты из клеток, содержащих вектор, использовали только в качестве отрицательных контролей. Лизат клеток CYP26A1 и его контроль были приобретены у Abnova (Тайбэй, Тайвань), в то время как CYP26B1, CYP26C1 и LRAT, содержащие клеточные лизаты, и их соответствующие контрольные образцы были получены из (Novus Biologicals, Cambridge, UK). Клеточные лизаты (5 мкг белка / полоса) разрешались электрофорезом на NuPAGE 4-12% бис-трис-гелях (Fisher Scientific, Loughborough, UK). После переноса белка мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре в забуференном фосфатом физиологическом растворе — Tween-20 (PBST), содержащем 1% (мас. / Об.) Обезжиренного сухого молока. Мембраны инкубировали в течение ночи при 4 ° С с использованием CYP26A1 (разбавление 1/5), разведения CYP26B1 (1/2), разведения CYP26C1 (1/2) или моноклональных антител LRAT (1/2), разведенных в PBST. Мембраны промывали (6 раз) в течение 1 часа в 1% обезжиренного молока. Затем мембраны исследовали в течение 1 часа с конъюгированным с конъюгированным конъюгированным с хрена пероксидазой антителом против мышиного IgG (1/2000, Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Мембраны затем промывали (6 раз) в течение 1 часа в 1% обезжиренного молока, а белковые полосы визуализировали с использованием усовершенствованной системы детектирования хемилюминесценции (Fisher Scientific).

Все случаи колоректального рака, включенные в это исследование, были ретроспективно выбраны из банка опухолей колоректального рака Aberdeen (теперь он включен и управляется NHS Grampian Biorepository, Абердин, Великобритания). В общей сложности в этом исследовании участвовали образцы опухолей из 650 пациентов, в каждом случае был поставлен диагноз первичного колоректального рака, а пациенты прошли факультативную хирургию для первичного колоректального рака в Абердине в период с 1994 по 2009 год. пациенты получали любую форму дооперационной химиотерапии или лучевой терапии. В частности, были исключены пациенты с ректальным раком, получившие неоадъювантную терапию, включая лучевую терапию коротким курсом. Данные для пациентов и их опухолей, включенные в это исследование, подробно описаны в таблице S1. Информация о выживании (смертность от всех причин) была доступна для всех пациентов, и во время оценки данных о результатах лечения было 309 (47,5%) смертей. Средняя выживаемость пациентов составила 115 месяцев (95% ДИ 108-123 месяца).

Опухоли были зарегистрированы в соответствии с инструкциями Королевского колледжа патологов Великобритании по гистопатологической отчетности о случаях резекции колоректального рака и которые включают руководство от версии 5 системы промежуточного TNM [27]. Гистопатологическая обработка образцов для иссечения колоректального рака подробно описана в материалах и методах S1.

Был сконструирован микрочип колоректальной раковой ткани, содержащий образцы проб слизистой оболочки толстой кишки (n = 50), первичные (n = 650) и образцы метастатического колоректального рака (n = 285), как описано ранее [28] — [30]. Подробная информация о конструкции тканевого микрочипа приведена в материалах и методах S1.

Иммуногистохимия для каждого антитела проводилась с помощью системы Dako Envision, свободной от биотина (Dako, Ely, UK) с использованием автонайнера Дако (Dako), как описано ранее [28] — [30]. Детали иммуногистохимии приведены в материалах и методах S1. Секции оценивали методом световой микроскопии, а интенсивность иммуноокрашивания в каждом сердечнике оценивалась независимо двумя исследователями (БРГ и ГИМ) с использованием системы скоринга, ранее описанной для оценки экспрессии белка в опухолевых микрочипах [28] — [30]. Интенсивность иммуноокрашивания в каждом ядре оценивалась как отрицательная, слабая, умеренная или сильная. Также регистрировали субклеточную локализацию (ядерную, цитоплазматическую или мембранную) иммуноокрашивания. Изменение иммуностима в сердцевинах каждого случая не выявлено. Любые расхождения в иммуногистохимической оценке тканевых сердечников между двумя наблюдателями были разрешены путем одновременной микроскопической повторной оценки.

Состояние восстановления несоответствия (MMR) оценивали с помощью иммуногистохимии с использованием антител к MLH1 и MSH2, как описано ранее [28], [30]. Статус MMR был зарегистрирован как квалифицированный, так и дефектный.

Статистический анализ данных, включая тест Манна-Уитни U, критерий ранга Вилкоксона, критерий хи-квадрат, анализ выживаемости Каплана-Мейера, логарифмический тест и многовариантный анализ Кокса (переменные, введенные как категориальные переменные), включая расчет коэффициенты риска и 95% CI были выполнены с использованием IBM SPSS версии 21 для Windows 7 ™ (IBM, Портсмут, Великобритания). Тест ранга журнала использовался для определения различий в выживаемости между отдельными группами. Значение вероятности p≤0.05 считалось значительным. Влияние различных точек отсечения относительно выживаемости исследовали путем дихотомизации показателя интенсивности для каждого маркера. Группы, которые были проанализированы, были отрицательным окрашиванием в сравнении с любым положительным окрашиванием, отрицательным и слабым окрашиванием по сравнению с умеренным и сильным окрашиванием и отрицательным, слабым и умеренным окрашиванием и сильным окрашиванием.

Проект был одобрен Комитетом по этике научных исследований Севера Шотландии (ссылки № 08 / S0801 / 81 и 11 / NS / 0015). Комитет по этике исследований не требовал письменного согласия пациента на ретроспективные образцы тканей, которые были включены в микрочип ткани колоректального рака.

Специфичность моноклональных антител к CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 и LRAT определяли с помощью ELISA с использованием иммуногенных пептидов, а также путем иммуноблоттинга (рисунок 1) с использованием лизатов целых клеток из клеток, сверхэкспрессирующих каждый белок. Полоса, мигрирующая с ожидаемой молекулярной массой, наблюдалась для каждого антитела в лизате, полученном из клеток, сверхэкспрессирующих соответствующий белок, в то время как полосы не были обнаружены с соответствующим контрольным лизатом.

Левая полоса на каждой панели содержит лизат контрольной клетки, а правая полоса полосы каждой панели содержит лизат, полученный из клеток, экспрессирующий соответствующий белок. 5 мкг белка загружали на лунку.

CYP26A1, CYP26B1 и LRAT показали иммунореактивность как в нормальном кишечном эпителии, так и в первичном и метастатическом колоректальном раке, и в каждом случае иммуноокрашивание локализовалось в цитоплазме клеток (рисунок 2). Не было никакой иммунореактивности ядерной или клеточной поверхности. В нормальном кишечном эпителии иммуноокрашивание было преимущественно локализованными поверхностными эпителиальными клетками, и не было обнаружено никакой гетерогенности внутрипальцевых или первичных или метастатических колоректальных опухолей. CYP26C1 не обнаружил никакого иммуноокрашивания в любом из исследованных образцов ткани.

Интенсивность иммуноокрашивания была значительно выше при первичном колоректальном раке по сравнению с нормальной слизистой оболочкой толстой кишки для CYP26A1 (p = 0,002), CYP26B1 (p <0,001) и LRAT (p <0,001) (рисунок 3, таблица 2). Не было различий в интенсивности экспрессии CYP26A1 или CYP26B1 между колоректальным раком Dukes C и их соответствующим метастазированием лимфатических узлов, тогда как для LRAT наблюдалось значительное снижение иммунореактивности в метастазировании лимфатических узлов по сравнению с соответствующими первичными опухолями (p <0,001 ) (рисунок 3 и таблица 2).

Оценка нормального эпителия толстой кишки по сравнению с первичными образцами опухоли для иммунореактивности (тест Манн-Уитни U, ↑ = увеличение опухоли, ↓ = уменьшение опухоли, — отсутствие изменений между опухолью и нормой) и оценка первичных образцов колоректальной опухоли Dukes C и их соответствующие образцы метастази для иммунореактивности (суммарный критерий оценки ранга Wilcoxon, ↑ = увеличен при метастазе в лимфатические узлы, ↓ = уменьшен при метастазе в лимфатические узлы, ↔ = нет изменений между первичной и метастатической опухолью). Значимые значения выделены жирным шрифтом.

Экспрессия CYP26A1 была сильно коррелирована с экспрессией CYP26B1 (χ2 = 192,2, p <0,001) и экспрессией LRAT (χ2 = 89,54, p <0,001), тогда как экспрессия CYP26B1 также коррелировала с экспрессией LRAT (χ2 = 144,88, p <0,001 ).

Сравнения экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT и клинико-патологических параметров обобщены в таблице 3. CYP26B1 и LRAT показали значительные ассоциации с опухолевым участком, стадией опухоли (Т), зародышевой венозной инвазией и общей стадией. Напротив, CYP26A1 показал только связь с участком опухоли и не обнаруживал связи с какими-либо из других исследованных клинико-патологических параметров.

Значимые значения выделены жирным шрифтом.

Отношение экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT с общей выживаемостью было исследовано с использованием разных точек отсечения (отрицательный v слабый v умеренный v сильный, отрицательный v положительный, отрицательный / слабый положительный v умеренный / сильный и отрицательный / слабый / умеренный v сильный) иммуногистохимического скоринга и суммируется в таблице 4 и рисунке 4.

A-D целая пациентка. A. общая выживаемость, показывающая отдельные категории CYP26B1. В B-D показано влияние различной точки. E-H Несоответствие ремонта квалифицированной когорты. E. общая выживаемость, показывающая отдельные категории CYP26B1. В F-H показано влияние различных точек отсечения.

Значимые значения выделены жирным шрифтом.

Между экспрессией CYP26B1 и результатом была достигнута последовательная и значительная связь (рис. 4). Рассматривая каждую группу интенсивности CYP26B1 отдельно, увеличение интенсивности иммунореактивности CYP26B1 было связано с более низким прогнозом (HR = 1.239, 95% CI = 1.104-1.390, χ2 = 15.063, p = 0.002). Для отрицательных опухолей CYP26B1 (n = 242) средняя выживаемость составляла 133 месяца (95% CI = 118-148 месяцев), для слабо выраженных опухолей CYP26B1 (n = 216) средняя выживаемость составляла 106 месяцев (95% CI = 95-116 месяцев), для умеренных экспрессирующих опухолей CYP26B1 (n = 106) средняя выживаемость составляла 103 месяца (95% ДИ = 85-120 месяцев), а для сильного экспрессии опухолей CYP26B1 (n = 58) средняя выживаемость составляла 81 месяц (95% ДИ = 60-101 месяцев).

Сравнивая отрицательные опухоли CYP26B1 с опухолями, которые показали любую иммунореактивность CYP26B1, более низкая выживаемость была связана с экспрессией CYP26B1 (HR = 1,352, 95% CI = 1,054-1,735, χ2 = 5,707, p = 0,017). Для отрицательных опухолей CYP26B1 (n = 242) средняя выживаемость составляла 133 месяца (95% ДИ = 118-148 месяцев), тогда как для положительных опухолей CYP26B1 (n = 380) средняя выживаемость составляла 107 месяцев (95% ДИ = 98-116 месяцев ). Сравнение отрицательных и слабоположительных опухолей CYP26B1 с умеренными и сильными экспрессирующими опухолями CYP26B1 показало, что существует высокая связь с выживаемостью (HR = 1.465, 95% CI = 1.151-1.865, χ2 = 9.832, p = 0.002). Средняя выживаемость для негативных / слабых опухолей (n = 458) составила 125 месяцев (95% ДИ = 115-135 месяцев), а средняя выживаемость для умеренной / сильной группы опухолей (n = 164) составила 96 месяцев (95% ДИ = 108-124 месяца). CYP26B1 отрицательные / слабые / умеренные экспрессирующие опухоли по сравнению с сильно выраженными опухолями CYP26B1 также показали очень значительную связь с выживаемостью (HR = 1,737, 95% CI = 1,288-2,418, χ2 = 11,092, p = 0,001). Средняя выживаемость для группы CYP26B1 с отрицательной / слабой / умеренной (n = 564) составляла 119 месяцев (95% CI = 111-128 месяцев), тогда как средняя выживаемость сильных опухолей CYP26B1 (n = 58) составляла 80 месяцев (95% ДИ = 60-101 месяцев).

Для LRAT была значительная связь с выживаемостью (HR = 1,321, 95% CI = 1,034-1,688, χ2 = 5,039, p = 0,025), когда показатель интенсивности иммуногистохимии был дихотомизирован в отрицательные и слабые случаи LRAT (n = 239) по сравнению с LRAT умеренные и сильные случаи (n = 383) (рисунок 5). Для LRAT отрицательные и слабые случаи средняя выживаемость составила 132 месяца (95% ДИ = 119-146 месяцев), тогда как для LRAT умеренные и сильные случаи средняя выживаемость составила 106 месяцев (95% ДИ = 96-116 месяцев). Связь между CYP26A1 и выживаемостью во всей группе пациентов не наблюдалась.

A. Связь LRAT и выживаемости во всех колоректальных раковых опухолях и B. Связь LRAT и выживаемости при несоответствии восстановлению опытных опухолей.

Подробное соотношение между экспрессией CYP26A1, CYP26B1 и LRAT, патологическими параметрами и общей выживаемостью показано в таблицах S2, S3, S4 и S5.

В многомерном анализе CYP26B1 оставался независимо прогностическим (p = 0,026), в то время как независимого прогностического значения экспрессии LRAT (таблица 5) не было. Если модель многомерного анализа содержит только переменные, которые могут быть доступны из биопсии колоректального рака (то есть нет информации о стадии pT, стадии pN и EMVI), то CYP26B1 является значимым независимым прогностическим маркером (p = 0,017, таблица S6)

В опытных опухолях MMR наблюдалась последовательная связь между интенсивностью экспрессии CYP26B1 и общей выживаемостью (таблица 6, рисунок 4). Увеличение интенсивности иммунореактивности CYP26B1 было связано с более низким прогнозом (HR = 1,330, 95% CI = 1,173-1,509, χ2 = 21,493, p <0,001). Для отрицательных опухолей CYP26B1 (n = 200) средняя выживаемость составляла 143 месяца (95% CI = 127-158 месяцев), для слабых опухолей CYP26B1 (n = 186) средняя выживаемость составляла 106 месяцев (95% ДИ = 94-116 месяцев ), для умеренных опухолей CYP26B1 (n = 87) средняя выживаемость составила 96 месяцев (95% ДИ = 82-112 месяцев), а для сильного экспрессии опухолей CYP26B1 (n = 49) средняя выживаемость составляла 77 месяцев (95% CI 56- 98 месяцев).

Значимые значения выделены жирным шрифтом.

Сравнивая отрицательные опухоли CYP26B1 с опухолями, которые показали любую иммунореактивность CYP26B1, более низкая выживаемость была связана с экспрессией CYP26B1 (HR = 1,604, 95% CI = 1,207-2,322, χ2 = 10,796, p = 0,001). Для отрицательных опухолей CYP26B1 (n = 200) средняя выживаемость составляла 143 месяца (95% CI = 127-158 месяцев), тогда как для положительных опухолей CYP26B1 (n = 322) средняя выживаемость составляла 104 месяца (95% ДИ = 94-114 месяцев ). Сравнение отрицательных и слабоположительных опухолей CYP26B1 с умеренными и сильными экспрессирующими опухолями CYP26B1 показало очень значительную связь с выживаемостью (HR = 1,617, 95% CI = 1,222-2,105, χ2 = 12,962, p <0,001). Средняя выживаемость для негативных / слабых опухолей (n = 386) составила 130 месяцев (95% ДИ = 120-141 месяцев), а средняя выживаемость для умеренной / сильной группы опухолей составила 92 месяца (95% ДИ = 79-106 месяцев ). CYP26B1 отрицательные / слабые / умеренно выраженные опухоли по сравнению с сильно выраженными опухолями CYP26B1 также показали очень значительную связь с выживаемостью (HR = 1,948, 95% CI = 1,366-2,777, χ2 = 14,149, p <0,001). Средняя выживаемость для CYP26B1 отрицательная / слабая / умеренная группа (n = 473) составила 123 месяца (95% ДИ = 113-132 месяца), а средняя выживаемость для сильно выраженных опухолей CYP26B1 составила 77 месяцев (95% CI = 56-98 месяцы).

Для LRAT была значительная связь с выживаемостью (HR = 1.464, 95% CI = 1,110-1,930, χ2 = 7,425, p = 0,006), когда показатели интенсивности иммуногистохимии были дихотомизированы в отрицательные и слабые случаи LRAT (n = 198) по сравнению с LRAT умеренные и сильные случаи (n = 326) (рисунок 5). Для LRAT отрицательных и слабых случаев средняя выживаемость составила 139 месяцев (95% ДИ = 124-156 месяцев), тогда как для LRAT умеренные и сильные случаи средняя выживаемость составила 106 месяцев (95% ДИ = 96-116 месяцев). Связь между CYP26A1 и выживаемостью в когорте пациентов, обладающих навыками MMR, отсутствовала.

При многомерном анализе CYP26B1 оставался независимо прогностическим (p = 0,026), в то время как независимого прогностического значения экспрессии LRAT не было (таблица 7). Если модель многомерного анализа содержит только переменные, которые можно было бы получить при биопсии колоректального рака (т. Е. Информации о стадии опухоли, узловой стадии и внеротовой венозной инвазии), то CYP26B1 является очень значимым независимым прогностическим маркером (p = 0,001, Таблица S6)

Значимые значения выделены жирным шрифтом.

Не было обнаружено связи дефектных опухолей MMR с экспрессией CYP26A1, CYP26B1 или LRAT и общей выживаемостью.

Колоректальный рак является одним из самых распространенных видов рака, заболеваемость которого продолжает расти, и в то время как молекулярные события, характеризующие раннюю стадию развития рака толстой кишки, были описаны подробно, все еще существует четкое требование идентифицировать, характеризовать и проверять биомаркеры рака толстой кишки [ 4] — [6], [12].

Это исследование определило профиль экспрессии ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту CYP26A1, CYP26B1 и CYP26C1, которые являются членами семейства ферментов P450 и LRAT в большой когорте хорошо охарактеризованных колоректальных раков. Установлено также прогностическое значение экспрессии этих ферментов, метаболизирующих ретиноевую кислоту.

P450 представляют собой большую группу зависимых от NADP гидроксилаз, классифицированных по семействам, подгруппам и отдельным членам [31] — [34]. Существуют две различные функциональные группы P450s, основанные на их субстратной специфичности как для ксенобиотиков, так и для эндогенных соединений. CYP1, CYP2 и CYP3 являются преобладающими семействами, участвующими в метаболизме ксенобиотиков, тогда как другие семейства из CYP4 вверх участвуют в метаболизме конкретных групп биологически активных эндогенных соединений, включая эйкозаноиды, стероидные гормоны, желчные кислоты и витамины, включая витамины А и D [ 35] — [42]. Они имеют множественные транскрипционные и посттранскрипционные регулятивные механизмы [43]. Метаболизирующие формы ксенобиотиков P450 широко изучались в опухолях, и было показано, что многие индивидуумы были сверхэкспрессированы в определенных типах опухолей, особенно CYP1B1, у которых, как было показано, повышенная экспрессия в широком диапазоне опухолей [25], [44] ] — [52]. Экспрессия опухоли P450 была предложена в качестве терапевтической мишени, особенно для опосредованной P450 пролекарственной активации [51] — [57]. P450s, участвующие в метаболизме эндогенных соединений, как правило, получали гораздо меньше исследований в опухолях, за исключением тех P450, которые участвуют в метаболизме полового гормона (эстроген и тестостерон) в отношении мишеней в отношении рака молочной железы и предстательной железы соответственно [58] — [60].

Структурно P450s показывают наибольшее разнообразие аминокислот на своих C-концах, который является гидрофильным компонентом белка в отличие от N-конца, который является наиболее липофильным компонентом белка. Учитывая выраженную C-терминальную аминокислотную вариацию и ее гидрофильность, использование пептидов на C-конце отдельного P450 в качестве иммуногенов для получения моноклональных антител к отдельным формам P450 доказало, что многие исследовательские группы, включая нашу собственную, являются высокоэффективной стратегией для разработки индивидуальных форм-специфических моноклональных и поликлональных антител P450 [30], [61], [62].

В этом исследовании мы создали антитела, которые специфичны для отдельных форм семейства CYP26, а именно CYP26A1, CYP26B1 и CYP26C1. Все три фермента CYP26-гидроксилата ретиноевой кислоты и наиболее полно характеризуются CYP26A1, который является преобладающей формой, связанной с гидроксилированием ретиноевой кислоты. CYP26B1 и CYP26C1 являются недавно идентифицированными членами семейства CYP26 и менее хорошо охарактеризованы по сравнению с CYP26A1. CYP26C1, по-видимому, имеет преобладающую, но не обязательно исключительную экспрессию в определенных областях мозга [22], [23].

Колоректальные раковые заболевания можно классифицировать в соответствии с их микросателлитной нестабильностью / MMR-статусом, и это является основным путем развития колоректального рака [63], [64]. В этом исследовании мы обнаружили прогностическое значение для CYP26B1 как у всей когорты пациентов, так и у тех опухолей, которые были определены как микросателлитные интактные или стабильные. Напротив, те опухоли, которые были дефектными по MMR, не показали какого-либо прогностического значения, указывающего на то, что могут быть созданы различные регуляторные механизмы в опыте MMR и дефектных опухолях MMR.

Ферменты CYP26 были предложены в качестве противораковых лекарственных препаратов [65], а повышенная экспрессия CYP26A1 и CYP26B1 при колоректальном раке предположила бы, что эти ферменты могут быть подходящими терапевтическими мишенями в опухолях этого типа. Было синтезировано несколько соединений, основанных на различных структурных свойствах, которые ингибируют CYP26 [66] — [69]. Эти соединения являются высокоселективными для CYP26 и проявляют высокую ингибирующую активность (наномолярную активность) в отношении CYP26A1. Однако ингибирующая активность этих соединений в отношении CYP26B1 и CYP26C1 еще не была оценена. Эпидемиологические данные также предполагали нацеливание на ретиноиды и пути ретиноевой кислоты для химиопрофилактики колоректального рака, а увеличение экспрессии CYP26A1 и CYP26B1 при колоректальном раке указывало бы на то, что нацеливание на эти ферменты может быть полезным методом [70] — [72].

Это исследование также выявило повышенную экспрессию LRAT при первичном колоректальном раке по сравнению с обычным кишечным эпителием. Это открытие, похоже, отличается от предыдущих исследований других типов опухолей, включая рак мочевого пузыря [73], рака молочной железы [74] и рака предстательной железы [75], которые предположили снижение экспрессии LRAT в раковых клетках, хотя в этих исследованиях относительно небольшое количество образцов опухолей было были проанализированы и в основном биохимические анализы целых опухолевых экстрактов, что привело к оценке «среднего уровня», так как была включена строма опухоли и некротическая ткань. Существовали значительные ассоциации между экспрессией LRAT как у всей когорты пациентов, так и у опухолей MMR, когда показатели LRAT были дихотомизированы в отрицательные / слабые / умеренные и сильные. Эта ассоциация не была отмечена для других точек отсечения и была менее надежной, чем наблюдалась для CYP26B1 с точки зрения прогностических значений.

Основная проблема большинства видов рака, включая колоректальный рак, — это метастатическое заболевание, и лечение обычно направлено на метастазы, хотя фенотипическая оценка, на которую часто принимаются решения о лечении, путем анализа первичных опухолевых образцов. В отличие от хорошо определенных молекулярных событий, ведущих к развитию колоректального рака, пути метастаза получили гораздо меньше внимания [76]. Это исследование предназначалось для оценки фенотипической экспрессии как в первичных опухолях, так и при их метастазировании в лимфатических узлах. Было обнаружено, что не было различий в экспрессии в CYP26A1 или CYP26B1 между первичными опухолями и соответствующими метастазами в лимфатические узлы. Однако LRAT показал значительное снижение экспрессии в метастазировании лимфатических узлов по сравнению с соответствующими первичными опухолями. Это говорит о том, что как первичные опухолевые факторы, так и микроэкологические факторы участвуют в регуляции экспрессии этих ферментов при метастазировании колоректального рака. Потенциальные последствия измененной экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT в метастатических колоректальных раковых клетках и их вклад в прометастатический фенотип показаны на рисунке 6.

Экспрессия A. CYP26A1, CYP26B1 и LRAT низка в нормальных клетках, что приводит к «правильному» количеству ретиноевой кислоты и экспрессии генов-мишеней ретиноевой кислоты для поддержания и продвижения нормального роста и дифференцировки клеток. B. CYP26A1, CYP26B1 и LRAT показывают значительную избыточную экспрессию в метастатических клетках колоректального рака, потенциально снижающих уровни ретиноевой кислоты и транскрипцию гена-ретиноевой кислоты, что, в свою очередь, значительно изменяет рост, дифференцировку и способствует прометастатическому фенотипу. Stra6, стимулированный рецептором гена ретиноевой кислоты 6, этот рецептор клеточной поверхности способствует внутриклеточному поглощению ретинола; RDH, ретинолдегидрогеназа; RALDH, ретинальдегиддегидрогеназа.

В заключение были разработаны моноклональные антитела к ферментативным ферментам для ретиноевой кислоты, которые эффективны на фиксированных восках, закрепленных во фторане, и показали, что ферменты, метаболизирующие ретиноевую кислоту CYP26A1, CYP26B1 и LRAT, значительно избыточно экспрессируются при колоректальном раке и что CYP26B1 и LRAT значительно связаны с прогноз как в общей популяции пациентов, так и в той опухоли, которые являются специалистами MMR. CYP26B1, который был независимо прогностическим в многомерной модели как во всей группе пациентов, так и в опытных опухолях MMR, представляет собой новый биомаркер колоректального рака, а CYP26B1 может представлять собой новую лекарственную мишень для этого типа опухоли.

Клинико-патологические характеристики пациентов и их опухолей, включенных в микрочип ткани колоректального рака.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Отношения экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT и выживаемости на стадии индивидуального герпеса колоректального рака.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Связь экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT и выживаемость при раке толстой кишки и раке прямой кишки.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Соотношение экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT и выживаемость в проксимальном и дистальном раках толстой кишки.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Соотношение экспрессии CYP26A1, CYP26B1 и LRAT и выживаемость при колоректальных раках с и без EMVI.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Многовариантный анализ всей когорты пациентов и компетентной когорты MMR.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(PDF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Разработка микрочипа колоректальной ткани была поддержана биорегуляцией NHS Grampian.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *