Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Ориентация опухолей KRAS-мутантов на ингибиторы HSP90 включает деградацию STK33

Targeting of KRAS mutant tumors by HSP90 inhibitors involves degradation of STK33
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3328372/

C. Scholl и S. Fröhling внесли одинаковый вклад в эту работу.

Ингибирование HSP90 истощает STK33 в опухолях KRAS-мутанта.

Предыдущие усилия по разработке лекарств, которые непосредственно ингибируют активность мутанта KRAS, наиболее часто мутированного человеческого онкогена, не были успешными. Раковые клетки, приводимые в действие мутантом KRAS, требуют экспрессии серин / треонин киназы STK33 для их жизнеспособности и пролиферации, идентифицируя STK33 как контекстно-зависимую терапевтическую мишень. Однако конкретные стратегии вмешательства в критические функции STK33 пока недоступны. Здесь, используя экран на основе масс-спектрометрии для партнеров по взаимодействию белка STK33, сообщается, что шаперонный комплекс HSP90 / CDC37 связывается с STK33 и стабилизирует его в раковых клетках человека. Фармакологическое ингибирование HSP90 с использованием структурно расходящихся небольших молекул, находящихся в настоящее время в клиническом развитии, индуцирует протеасома-опосредованную деградацию STK33 в раковых клетках человека различного тканевого происхождения in vitro и in vivo и инициирует апоптоз преимущественно в мутантных клетках KRAS зависимым от STK33 образом , Кроме того, ингибирование ингибитора HSP90 нарушает формирование сферы и жизнеспособность первичных опухолевых клеток, инициирующих опухоль человека, укрывающих мутантный KRAS. Эти данные дают механистическое представление о активности ингибиторов HSP90 в раковых клетках мутанта KRAS, свидетельствуют о том, что повышенное требование для STK33 можно использовать для нацеливания на мутантные опухоли, основанные на KRAS, и идентифицировать истощение STK33 через ингибирование HSP90 в качестве терапевтической стратегии, основанной на биомаркерах, с непосредственный трансляционный потенциал.

В последние годы основное внимание в разработке лекарств от рака перешло от обычных цитотоксических препаратов к молекулярно-целевым терапевтическим средствам (de Bono и Ashworth, 2010). Для достижения цели индивидуальной, основанной на патогенезе терапии рака необходимы подробные знания о событиях, которые лежат в основе инициации и поддержания трансформированного фенотипа (Stratton et al., 2009), проницательность, которая подпитывает значительные усилия по каталогизации генетических изменения, которые приводят к наиболее распространенным раковым заболеваниям человека (Международный консорциум рака, 2010). Однако, хотя идентификация приобретенных генетических изменений, вызывающих определенные типы рака, привела к замечательным терапевтическим успехам (Hudis, 2007; Sharma et al., 2007; Druker, 2009), многие мутации, связанные с раком, трудно ингибировать напрямую. Таким образом, только ограниченное количество открытий, полученных в результате нынешних усилий в отношении генома рака, породило немедленно действующие целевые показатели наркотиков.

Дилемма «негибких» генетических повреждений иллюстрируется точечными мутациями в протоонкогене KRAS, которые встречаются в ~ 30% случаев рака человека и особенно распространены в аденокарцином поджелудочной железы, легкого и толстой кишки (Karnoub and Weinberg, 2008). Хотя онкогенные аллели KRAS были впервые идентифицированы> 20 лет назад, мутант KRAS уклонился от всех попыток терапевтического нацеливания до сих пор (Malumbres and Barbacid, 2003; Downward, 2003; Roberts and Der, 2007). Кроме того, мутации KRAS не только оказались нездоровыми, но теперь они понимаются как предиктора не реагирования на молекулярно-целевые методы лечения, такие как ингибиторы EGFR при раке легкого и толстой кишки (Roberts et al., 2010; Bardelli and Siena, 2010). Для решения проблемы избирательного нацеливания раковых клеток, несущих онкогенные КРАС, многие лабораторные исследования фокусируются на путях передачи сигналов ниже по потоку от KRAS, а несколько сигнальных молекул, которые регулируются RAS, такие как RAF, MEK и PI3K, нацелены на в ранних клинических испытаниях (Lim and Counter, 2005; Gupta et al., 2007; Engelman et al., 2008; Yu et al., 2008; Wee et al., 2009; Halilovic et al., 2010).

В дополнение к этим усилиям, которые основываются на предыдущих представлениях о линейных сигнальных путях, через которые RAS способствует клеточной жизнеспособности и пролиферации, в нескольких исследованиях использовались крупномасштабные функциональные геномные экраны для поиска генов, которые аберрантно требуются в результате адаптации к трансформируя мутацию KRAS и, следовательно, могут представлять новые терапевтические цели (Barbie et al., 2009; Luo et al., 2009; Scholl et al., 2009; Wang et al., 2010; Vicent et al., 2010). Используя высокопроизводительную РНК-интерференцию (RNAi), мы недавно описали, что экспрессия функционально нехарактеризованной серин / треонинкиназы STK33 требуется раковыми клетками человека, которые зависят от мутантных KRAS, но не нетрансформированных клеток или раковых клеток с другим онкогенное поражение (Scholl et al., 2009). Хотя роль STK33 в нормальной клеточной физиологии и в раковых клетках мутаций KRAS не совсем понятна, усиленная зависимость мутантных клеток KRAS от STK33 поддерживает STK33 как привлекательную мишень для терапии, которую можно было бы использовать с подходами обнаружения лекарств. Однако для информирования об этой стратегии необходимы дополнительные исследования, чтобы лучше понять функциональную связь между мутантным KRAS и STK33 и выяснить механизм, посредством которого STK33 способствует жизнеспособности раковых клеток.

Основная цель этого исследования состояла в том, чтобы получить представление о сигнальных путях, через которые STK33 функционирует в раковых клетках человека. Используя протеомику на основе масс-спектрометрии, мы обнаружили, что STK33 физически взаимодействует с компонентами шаперона-комплекса HSP90, который необходим для правильного складывания, стабилизации и активации многочисленных белков, участвующих в выживании и пролиферации клеток (Picard, 2002; Taipale et al. , 2010), включая онкопротеины, которые мутируют или сверхэкспрессируются в определенных типах рака (Gorre et al., 2002; George et al., 2004; Sawai et al., 2008; Cerchietti et al., 2009; Marubayashi et al., 2010 ). Генетическое или фармакологическое ингибирование HSP90 в линиях раковых клеток человека различного тканевого происхождения индуцировало протеасомную опосредованную деградацию STK33, что приводило к апоптозу как в in vitro, так и в опухолях ксенотрансплантата, преимущественно в клетках, несущих мутантный KRAS. Кроме того, клетки, полученные из KRAS-мутантных первичных карцином толстой кишки человека, были значительно более чувствительны к терапии ингибиторами HSP90. Эти данные идентифицируют STK33 как новый белок клиента HSP90 и обеспечивают механическое понимание активности ингибиторов HSP90 в раковых клетках мутанта KRAS, которые были отмечены ранее, но до сих пор остаются необъяснимыми (Wong et al., 2011; West et al., 2011; Sos et al., 2009). Кроме того, данные показывают, что потребность в STK33 может быть использована для нацеливания мутантных раковых заболеваний, основанных на KRAS, и предлагает терапевтическую стратегию, которая может быть оценена немедленно, поскольку ингибиторы HSP90 в настоящее время проходят клиническую оценку у пациентов с различными злокачественными новообразованиями. Наконец, эти результаты показывают, что оптимальное использование ингибиторов HSP90 будет зависеть от понимания функциональных зависимостей конкретных видов рака и поддержки статуса мутации KRAS в качестве маркера для прогнозирования реакции на эти агенты.

Мы использовали метод масс-спектрометрии для идентификации партнеров по взаимодействию белка STK33 в раковых клетках человека. Клеточные линии рака молочной железы MDA-MB-231 (содержащие мутацию KRASG13D) и BT-20 (поддерживающие WT KRAS) стабильно трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим маркировку STK33 с флагом или пустой вектор управления. Лизаты белков этих клеточных линий инкубировали с антигалактической агарозой и выделенные белки разделяли PAGE (фиг.1а). Каждую полосу вырезали и разделяли на 10 одинаковых размеров, а пептиды секвенировали с помощью микрокапиллярной масс-спектрометрии на основе ВЭЖХ с микрокапиллярной обратной фазой. Наиболее сильно обогащенные белки в образцах, экспрессирующих STK33, были двумя членами семейства шаперонов HSP90, HSP90AB1 (также известный как HSP90B) и HSP90AA1 (также известный как HSP90A). Кроме того, белок CDC37-адаптера HSP90 также был значительно избыточно представлен в образцах, экспрессирующих STK33 (фиг.1b). Эксперименты с коиммунопреципитацией (coIP) с клетками MDA-MB-231, стабильно экспрессирующими гемагглютинин (HA), были зарегистрированы STK33, подтвердили связывание STK33 с HSP90 и CDC37 (фиг.1c).

HSP90 связывает и стабилизирует STK33. (a) Анти-Flag IP были выполнены с использованием KRAS WT BT-20 и KRAS-мутантов MDA-MB-231 клеточных линий рака молочной железы, стабильно трансдуцированных пустым вектором (EV), N-концевого флакона STK33 (Flag-STK33) или C-терминальный флакон с маркировкой STK33 (STK33-Flag) и полученные белковые комплексы разделяли PAGE и окрашивали Coomassie. Пептиды, выделенные из каждой полосы, анализировали с помощью масс-спектрометрии. Полоса STK33 обозначается звездочкой. SM, маркер размера. (b) Количество пептидов, представляющих белки, высокообогащенные в STK33-содержащих IP-адресах. (c) IP-протоколы против HA выполнялись с клетками MDA-MB-231, стабильно трансдуцированными с пустым вектором (EV), N-концевым HA-маркированным STK33 (HA-STK33) или ST-33 с маркировкой HA с маркировкой HA (STK33-HA ), а иммуноблоты зондировали антителами против HSP90A / B, CDC37 и HA. Показан один из трех независимых экспериментов. (d) Экспрессия белков HSP90A, HSP90B, STK33 и расщепленных PARP в клетках легкого (NCI-H520, A549) и карциномы толстой кишки (Caco-2, HCT-116), трансдуцированных с помощью неправляющей контрольной shRNA или shRNA-нацеливающей HSP90A или HSP90B. Показан один из двух независимых экспериментов.

Известно, что HSP90 стабилизирует и активирует множественные белки (так называемые «клиенты», Picard, 2002; Taipale et al., 2010), некоторые из которых мутированы или сверхэкспрессируются при раке человека (Gorre et al., 2002; George et al. ., 2004; Sawai et al., 2008; Cerchietti et al., 2009; Marubayashi et al., 2010). В некоторых случаях HSP90 действует в комплексе с CDC37, который специально поддерживает правильную фальцовку и функцию протеинкиназ (Taipale et al., 2010). Чтобы исследовать, требуется ли HSP90 для стабильности STK33, мы использовали векторы коротких шпилевых лент (shRNA) лентивирусов для подавления экспрессии HSP90A и HSP90B в панели клеток клеточной линии легкого и толстой кишки, которые были зависимы от мутантных KRAS и STK33, как оценивали с помощью независимого от фиксации рост в мягком агаре и образование опухоли у мышей с ослабленным иммунитетом (A549, HCT-116, Scholl et al., 2009) или отсутствие мутанта KRAS (NCI-H520, Caco-2). Мы определили уровни белка STK33 с помощью Вестерн-блот-анализа. Нокдаун HSP90A и HSP90B истощал белок STK33 во всех клеточных линиях, независимо от состояния мутации KRAS (рис.1d). Однако деградация STK33 сопровождалась индукцией апоптоза, о чем свидетельствует увеличение расщепления PARP, в мутантных KRAS- и STK33-зависимых клеточных линиях, но не в клеточных линиях, несущих WT KRAS (фиг.1d). В совокупности эти наблюдения идентифицировали STK33 как нового клиента-шаперона HSP90 и предложили истощение STK33 посредством ингибирования HSP90 в качестве потенциальной стратегии нацеливания на мутантные KRAS-зависимые раковые клетки.

Из-за своей функции в стабилизации различных онкобелков HSP90 стал многообещающей мишенью для лечения рака, и в настоящее время в клинических исследованиях изучаются несколько конкурирующих с АТФ ингибиторов HSP90 (Taldone et al., 2008; Trepel et al., 2010). Чтобы рассмотреть возможность того, что функциональная связь между STK33 и HSP90 может быть использована в терапевтическом отношении, мы исследовали, будет ли фармакологическое ингибирование HSP90 оказывать такое же влияние на стабильность STK33, как нокдаун HSP90, опосредованный с помощью SHRNA, и может ли истощение ингибирования STK33 через HSP90 индуцировать апоптоз в раковых клетках, которые полагаются на мутантные KRAS для их выживания.

Мы обработали 12 человеческих раковых клеточных линий (KRAS-мутант, n = 6, KRAS WT, n = 6), представляющих четыре разных типа рака (рак легких, рак толстой кишки, рак молочной железы и острый миелоидный лейкоз [AML]), с увеличением концентрации двух разных соединений; бензохинон ансамицин 17-ААГ, первый ингибитор HSP90, который вошел в клинические испытания (Kim et al., 2009); и PU-H71, оптимизированный, водорастворимый элемент пуринового класса ингибиторов HSP90 (Taldone and Chiosis, 2009). Мы наблюдали, что оба ингибитора вызывали дозозависимую деградацию STK33 во всех клеточных линиях, независимо от происхождения ткани или статуса мутации KRAS (фиг.2а и не показаны). Анализ расщепления PARP показал, что все шесть клеточных линий с мутантным KRAS подверглись апоптозу в ответ на лечение ингибиторами HSP90, тогда как клеточные линии KRAS WT не подвергались воздействию. Введение 17-AAG или PU-H71 также приводило к увеличению расщепления и активности каспазы 9 у мутанта KRAS, но не к клеточным линиям KRAS WT (фиг.2, a и b), в соответствии с предыдущими данными, показывающими, что апоптоз, индуцированный подавлением STK33 в мутантных KRAS-зависимых клетках опосредуется через митохондриальный путь (Scholl et al., 2009). Мониторинг жизнеспособности клеток в присутствии низких концентраций PU-H71 также продемонстрировал более высокую чувствительность мутантных KRAS-зависимых клеточных линий к этому соединению (рис.2, c). Эти данные показали, что из-за их способности эффективно деградировать STK33 ингибиторы HSP90 могут представлять собой подход к нацеливанию на рак человека, связанный с существенностью мутантного KRAS, и подтвердили предыдущие наблюдения, что подавление STK33 убивает мутантные KRAS-зависимые раковые клетки различного тканевого происхождения ( Scholl и др., 2009).

Фармакологическое ингибирование истощения HSP90 STK33 и предпочтительно индуцирует апоптоз в мутантных KRAS-зависимых раковых клетках. (а) иммуноблоты рака легких (NCI-H520, A549), рак толстой кишки (Caco-2, HCT-116), рак молочной железы (BT-20, MDA-MB-231) и AML (HL-60, SKM- 1) клеточные линии, инкубированные с увеличением концентрации PU-H71 или 17-AAG в течение 24 часов. (b) Активность каспазы 9 в клеточных линиях мутантов KRAS (mut) и KRAS WT, инкубированных с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 24 часов. Эксперименты проводились в трех экземплярах. Полосы ошибок представляют среднее значение ± SEM. Показан один из двух независимых экспериментов. (c) Жизнеспособность и пролиферация мутантных KRAS-зависимых (mut) и KRAS WT раковых клеточных линий, инкубированных с низкими концентрациями PU-H71 в течение 48 часов. Эксперименты проводились в трех экземплярах. Полосы ошибок представляют среднее значение ± SEM. Показан один из двух независимых экспериментов.

HSP90 участвует в стабилизации нескольких белков, которые способствуют выживанию раковых клеток, включая известные эффекторы RAS, такие как компоненты сигнальных путей PI3K-AKT и MAPK (Picard, 2002; Taipale et al., 2010). Поэтому мы искали дополнительные доказательства того, что индукция апоптоза в мутантных KRAS-зависимых раковых клетках при ингибировании HSP90 может быть объяснена истощением STK33.

Сначала мы провели эксперименты с временным курсом, чтобы определить, предшествует ли down-модуляция STK33 индукции апоптоза. Мы обработали мутантные KRAS- и STK33-зависимые клетки MDA-MB-231 и A549 с 5 мкМ 17-AAG или 1 мкМ PU-H71 в течение 4, 8, 12, 16, 20 и 24 ч и обнаружили, что уровни STK33 начали уменьшаются на 4 часа, с максимальным истощением, возникающим через 12 часов. После деградации STK33 последовало расщепление PARP через 12-16 ч, что согласуется с причинностью между уменьшением экспрессии белка STK33 и индукцией апоптоза, а не с неспецифическим изменением, связанным с гибелью клеток (фиг.3а и не изображено). Напротив, клеточные уровни KRAS не уменьшались путем лечения PU-H71 (неопубликованные данные), подтверждая предыдущие наблюдения, что KRAS не является клиентом HSP90 (Sos et al., 2009).

Причинная связь между деградацией STK33 и убийством мутантных KRAS-зависимых раковых клеток ингибиторами HSP90. (a) Иммуноблоты мутанта KRAS-зависимого рака молочной железы (MDA-MB-231) и клеточных линий рака легких (A549), инкубированные с 1 мкМ PU-H71 в указанные моменты времени. (b) Иммуноблот клеток MDA-MB-231, A549 и Calu-1, стабильно трансдуцированных пустым вектором (EV) или STK33, и инкубировали с различными концентрациями PU-H71 в течение 24 часов. Клинированные полосы PARP определяли количественно путем денситометрического анализа с использованием программы ImageJ. Показаны результаты двух-трех независимых экспериментов. RU, относительная единица. (c) Активность каспазы 9 в KRAS-мутантном раке молочной железы (MDA-MB-231) и клеточных линиях рака легких (Calu-1), трансдуцированных пустым вектором (EV) или STK33, и инкубировали с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 24 часов. Эксперименты проводились в трех экземплярах. Полосы ошибок представляют среднее значение ± SEM. (d) Иммуноблот KRAS WT MDA-MB-453 рака молочной железы (амплифицированный ERBB2) и MOLM-14 AML (FLT3-мутированные) клетки, стабильно трансдуцированные пустым вектором (EV) или STK33 и инкубированные с различными концентрациями PU-H71 для 24 ч. (e) Иммуноблот клеток MDA-MB-231, который уклонялся от апоптоза, индуцированного shKNA-опосредованным нокаутом STK33 после инкубации с увеличением концентрации PU-H71 в течение 24 часов. Все результаты были подтверждены, по крайней мере, в одном дополнительном независимом эксперименте.

Во-вторых, мы исследовали, является ли принудительная экспрессия STK33 защищенных мутантных KRAS-зависимых клеток апоптотическим эффектом ингибирования HSP90, поскольку это подтверждает STK33 как белок, истощение которого опосредует чувствительность мутантных KRAS-клеток к ингибированию HSP90. Мы обработали клетки MDA-MB-231, A549 и Calu-1, сверхэкспрессирующие STK33, с увеличением концентрации 17-AAG или PU-H71 и определили обилие STK33 и расщепленного PARP методом Вестерн-блот-анализа. Как и ожидалось, экзогенный STK33 также подвергался деградации; однако более высокие уровни STK33 частично спасли жизнеспособность клеток после лечения ингибитором HSP90 дозозависимым образом (фиг.3b и не изображены). Сверхэкспрессия STK33 также уменьшала активность каспазы 9 и приводила к сдвигу кривой доза-реакция в мутантных KRAS-зависимых клетках после обработки PU-H71 (фиг.3c и не изображалась). Напротив, экзогенный STK33 не предотвращал апоптоз в клетках рака молочной железы MDA-MB-453 и клетках MOLM-14 AML, которые, как известно, сильно зависят от разных клиентов HSP90 (ERBB2 [также известный как HER2] и FLT3 соответственно), что указывает что частичное спасение, наблюдаемое в мутантных клетках KRAS, не является неспецифическим эффектом, вызванным супрафизиологической экспрессией STK33 (фиг.3d).

В-третьих, мы культивировали клетки MDA-MB-231, стабильно экспрессирующие shRNA, нацеливающие STK33 в течение 3 недель, и изолировали клетки, которые избегали апоптоза, несмотря на достаточный нокдаун STK33. В соответствии с гипотезой о том, что эти клетки «эскоператора» также уменьшали чувствительность к истощению STK33 с помощью ингибирования HSP90, обработка 17-AAG или PU-H71 приводила к уменьшению расщепления PARP по сравнению с клетками, трансдуцированными с помощью неправляющей контрольной shRNA (фиг.3 e и не изображены).

Наконец, мы рассмотрели, может ли генотип-селективный эффект ингибирования HSP90 быть вызван истощением других белков, вовлеченных в опосредованный KRAS онкогенез, которые, как сообщается, являются клиентами HSP90. В частности, мы сосредоточились на сериновых / треонин-киназах RAF1 и AKT1, которые являются непосредственными нисходящими эффекторами KRAS. Обработка клеток MDA-MB-231 1 мкМ PU-H71 в течение 24 часов приводила к эффективному истощению RAF1 и AKT1 в зависимости от времени, сравнимом с STK33 (фиг.4а). Это показало, что истощение RAF1 или AKT1 может способствовать индукции апоптоза в клетках-мутантах KRAS после ингибирования HSP90. Чтобы исследовать эту возможность, мы оценивали зависимость RAF1 и AKT1 в трех клеточных линиях мутантных раковых клеток KRAS с использованием RNAi, опосредованной shRNA. Подавление RAF1 и AKT1 увеличивало апоптоз в клетках рака толстой кишки HCT-116, но не в клетках рака легких A549 и клетках рака молочной железы MDA-MB-231, спорящих против RAF1 и AKT1 в качестве клиентов HSP90, ответственных за селективный эффект генотипа HSP90 ингибиторы в разных тканях (фиг.4, b и c). В соответствии с этим выводом избыточная экспрессия RAF1 и AKT1 в этих клеточных линиях не спасла жизнеспособность клеток после лечения PU-H71 (фиг.4d).

Связь между деградацией AKT1 или RAF1 и убийством мутантных KRAS-зависимых раковых клеток ингибиторами HSP90. (a) Иммуноблоты клеток MDA-MB-231, инкубированные с 1 мкМ PU-H71 в указанные моменты времени, показывающие обеднение AKT1 и RAF1. (b и c) расщепление PARP в мутантном KRAS-зависимом раке легкого (A549), раке молочной железы (MDA-MB-231) и клеточных линиях рака толстой кишки (HCT-116), трансдуцированных с помощью РРНК, нацеленных на AKT1 (c) и RAF1 (b ) соответственно, или безрисковой управляющей shRNA. (d) Иммуноблоты клеток A549, MDA-MB-231 и HCT-116 стабильно трансдуцируют пустым вектором (EV), AKT1 или RAF1 и инкубируют с 1 мкМ PU-H71 в течение 24 часов. Все результаты были подтверждены, по крайней мере, в одном дополнительном независимом эксперименте.

Вместе эти данные подтвердили концепцию о том, что деградация STK33 требуется для уничтожения раковых клеток мутанта KRAS из разнообразного тканевого происхождения 17-AAG или PU-H71 и указывает, что степень зависимости от STK33 диктует чувствительность раковых клеток человека к HSP90 ингибирование. Истощение других клиентов, таких как RAF1 и AKT1, вероятно, способствует апоптозу ингибиторов HSP90 в клетках, которые полагаются на экспрессию этих белков.

Затем мы оценили механизм истощения STK33, вызванного ингибированием HSP90. Чтобы исследовать, разрушен ли STK33 по лизосомальному пути, мы инкубировали клетки рака легкого KRAS A549 с ингибитором лизосомы NH4Cl с последующей обработкой PU-H71 и определяли обилие белка STK33 в растворимых в растворителе и нерастворимых фракциях с помощью Вестерн-блот-анализа , Предварительная обработка NH4Cl не увеличивала уровни белка STK33 по сравнению с инкубацией только с PU-H71, что указывает на то, что STK33 не деградирует по лизосомальному пути (фиг.5а). Напротив, лечение клеток A549 с помощью двух ингибиторов протеасом, MG-132 и бортезомиба с последующей инкубацией с PU-H71 спасло уровни белка STK33 и привело к перераспределению STK33 до нерастворимой в детергенте фракции; этот результат был подтвержден в клетках MDA-MB-231 и HCT-116 (фиг.5b и не показан). В соответствии с его деградацией через протеосомный путь STK33 экстенсивно убиквитировали в клетках 293T после обработки PU-H71 в комбинации с MG-132, в результате чего молекулярная масса составляла более 250 кДа (фиг.5с).

PU-H71 индуцирует убиквитинирование и протеасомную деградацию STK33. (a) Иммуноблот из клеток A549, обработанных 20 мМ NH4Cl в течение 2 ч, с последующей инкубацией с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 16 часов. Показан один из двух независимых экспериментов. (b) Иммуноблот из клеток A549, обработанных 10 мкМ MG-132 в течение 2 часов, с последующей инкубацией с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 16 часов. (c) IP HK-маркированного STK33 из клеток 293T, обработанных или не содержащих 1 мкМ PU-H71 в течение 7 ч и 10 мкМ MG-132 в течение последних 3 часов. Ubiquitinated STK33 проявляется как мазок с высокой молекулярной массой. Показан один из трех независимых экспериментов. (d) Анти-Flag IP были выполнены с KRAS WT BT-20 и мутантными KRAS-зависимыми клетками MDA-MB-231, стабильно трансдуцированными с пустым вектором (EV), с N-концевым флаконом STK33 (Flag-STK33) или C -терминально с маркировкой STK33 (STK33-Flag) с флагом и полученные белковые комплексы анализировали с помощью масс-спектрометрии. Показано обогащение пептидов, представляющих белки, участвующие в системе ubiquitin / proteasome. (e) Иммуноблот клеток MDA-MB-231 и A549, трансдуцированных пустым вектором (EV) или BAG2, и обрабатывали 0,5 мкМ PU-H71 в течение 24 часов. (f) Иммуноблот HCT-116 и A549 клеток, трансдуцированных с помощью неконтролируемой контрольной shRNA или shRNAs, нацеленной на BAG2. (g) Анти-Flag IP были выполнены с клетками MDA-MB-231, стабильно трансдуцированными с пустым вектором (EV) или с маркировкой Flag STK33, и иммуноблоты были зондированы антителами против BAG2 и Flag. Показан один из двух независимых экспериментов. (h) Иммуноблот из клеток 293Т, трансфецированных HA-мечеными STK33 или Xpress-помеченными USP15 и USP5 соответственно, и обрабатывали с использованием или без 0,5 мкМ PU-H71 в течение 24 часов. Показан один из двух независимых экспериментов. (i) клетки MDA-MB-231 трансфицировали с помощью безрисковой контрольной shRNA или shRNA, нацеленной на HERC2. Через 3 дня клетки инкубировали с 1 мкМ PU-H71 в течение 18 ч, как указано. Уровни белка анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием указанных антител. Показан один из двух независимых экспериментов.

Для поиска белков, которые могли бы регулировать стабильность STK33, мы опросили список потенциальных партнеров-партнеров STK33, идентифицированных в эксперименте масс-спектрометрии, показанном на рисунке 1a. Среди белков, обогащенных STK33-содержащими IP, был BAG2, содержащий BAG-содержащий белок, который ингибирует деградацию связанных с шапероном цитоплазматических белков через систему ubiquitin / proteasome (Dai et al., 2005); USP5 и USP15, две убиквитинспецифические пептидазы; и HERC2, E3-убиквитин-лигазу (фиг.5d). Чтобы оценить, участвует ли BAG2 в контроле стабильности STK33, мы трансдуцировали клетки MDA-MB-231 и A459 с лентивирусным вектором, кодирующим BAG2, и определяли количество белка STK33 после обработки PU-H71. В соответствии с гипотезой о том, что BAG2 ингибирует деградацию STK33, избыточная экспрессия BAG2 спасла уровни белка STK33 в присутствии PU-H71 в обеих клеточных линиях, и это было связано с уменьшением апоптоза, что подтверждается уменьшенным расщеплением PARP (фиг.5 e). Напротив, нокдаун SHRNA BAG2 в клетках HCT-116 и A549 уменьшал экспрессию STK33 (фиг.5f). Связывание BAG2 с STK33 было подтверждено в экспериментах coIP с клетками MDA-MB-231, стабильно экспрессирующими Flag-tagged STK33 (фиг.5 g). Чтобы проверить, могут ли USP5 и USP15 дебиквитинировать STK33, мы проанализировали клетки 293T, ко-трансфицированные с помощью STK33 с индексом HA и USP5 или USP15. Ни одна из USP5 и избыточная экспрессия USP15 не защищала STK33 от деградации, вызванной ингибитором HSP90, что указывает на то, что другие чувствительные к ubiquitin пептидазы участвуют в регуляции стабильности STK33 (рис. 5 ч). Чтобы исследовать, прикрепляет ли HERC2 ubiquitin к STK33 после ингибирования HSP90, мы определяли уровни белка STK33 в контексте нокдауна HERC2 в клетках MDA-MB-231 после лечения PU-H71. Истощение HERC2 не улучшало стабильность STK33, утверждая, что HERC2 является специфичной для STK33 ubiquitin ligase (фиг.5 i). Вместе эти данные показали, что деградация STK33 при ингибировании HSP90 происходит через протеосомный путь и отрицательно регулируется BAG2.

Чтобы проверить генотип-зависимый апоптотический эффект ингибиторов HSP90 in vivo, мы впервые провели эксперименты по ксенотрансплантации, используя анализ куриной хориоаллантоической мембраны (CAM), который смягчает фармакокинетические обязательства некоторых ингибиторов HSP90 в моделях ксенотрансплантатов грызунов. Мутантные KRAS-зависимые клетки рака толстой кишки HCT-116 и KRAS WT Caco-2 осаждались на поверхности куриного CAM 8d после оплодотворения, а образование опухоли наблюдалось через 24 часа. 17-ААГ (5 мкМ) и PU-H71 (1 мкМ) вводили через 24 и 48 ч после имплантации, а опухоли ксенотрансплантата измеряли и анализировали с помощью иммуногистохимии (IHC) через 72 часа. Обработка клеток HCT-116 либо ингибитором приводила к значительному уменьшению размера опухоли, тогда как клетки Caco-2 не подвергались воздействию (фиг.6а). Анализ IHC показал, что STK33 был эффективно деградирован во всех опухолях после инкубации с ингибиторами HSP90 (фиг.6b). Однако усиленный апоптоз, оцененный с помощью концевой маркировки концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL), наблюдался только в клетках КТР-мутантов HCT-116, но не в клетках KRAS WT Caco-2 (фиг.6с). Влияние ингибирования HSP90 на рост опухоли и жизнеспособность клеток в контексте зависимости мутанта KRAS можно было бы повторить в клетках рака молочной железы MDA-MB-231 (фиг.7, а и b). Цитотоксичность 17-AAG и PU-H71 была отменена экзогенной сверхэкспрессией STK33, что подтверждается восстановленным образованием опухолей и уменьшенным апоптозом, снова поддерживая причинную связь между истощением STK33 и убийством мутантных KRAS-зависимых раковых клеток посредством ингибирования HSP90 (рис. 7, а и б). Специфичность антитела STK33, используемого для IHC, была подтверждена окрашиванием опухолей ксенотрансплантата, полученных из линий раковых клеток, которые были стабильно трансдуцированы тремя различными shRNAs, нацеленными на STK33, и выращены на CAM или голыми мышами (неопубликованные данные).

Ингибирование HSP90 снижает рост мутантных KRAS-зависимых опухолей толстой кишки на куриной CAM. (а) формирование опухоли на куриной КАМ клеток KRAS WT (Caco-2) и мутантных KRAS-зависимых (HCT-116) раковых клеток, обработанных 5 мкМ 17-AAG или 1 мкМ PU-H71 или носителем в течение 48 часов. Репрезентативные фотографии опухолей (клетки осаждались в 5-миллиметровом кремниевом кольце для введения лекарственного средства) и области опухолей (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM от четырех до шести опухолей). Бар, 1,5 мм. (b и c) анализ IHC опухолей CAM, показанных в a. Экспрессию белка STK33 (b) и окрашивание TUNEL (c) опухолей Caco-2 и HCT-116. Показаны репрезентативные фотографии участков ткани и доля TUNEL-положительных клеток (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM из четырех микроскопических полей с 600 ячейками). NS, не имеет значения. Вставки в c показывают детали соответствующих фотографий. Бар: 125 мкм; вставка, 25 мкм.

Сверхэкспрессия STK33 восстанавливает рост мутантных KRAS-зависимых опухолей молочной железы, обработанных ингибиторами HSP90. (a) Опухоль на куриной CAM мутантных KRAS-зависимых клеток рака молочной железы MDA-MB-231, стабильно трансдуцированных с Flag-tagged STK33 или пустым вектором (EV) и обработанных 5 мкМ 17-AAG или 1 мкМ PU-H71 для 48 час Показаны репрезентативные фотографии опухолей и областей опухолей (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM от четырех до шести опухолей). NS, не имеет значения. Бар, 1,5 мм. (b) Анализ IHC опухолей CAM, показанных в a. Показаны репрезентативные фотографии участков ткани и доля TUNEL-положительных клеток (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM из четырех микроскопических полей с 600 ячейками). EV, пустой вектор. Вставки показывают детали соответствующих фотографий. Бар: 125 мкм; вставка, 25 мкм.

Основываясь на этих наблюдениях в системе ксенотрансплантации куриного CAM, мы искали подтверждение у иммунодефицитных мышей. Сначала мы оценили кинетику деградации STK33 in vivo путем трансплантации клеток HCT-116 s.c. в голых мышей и после образования опухоли мы вводили либо 75 мг на кг массы тела PU-H71, либо PBS, i.p. Мышей умерщвляли через 12, 24, 48 и 72 ч позже, а уровни белка STK33 в опухолях определяли с помощью Вестерн-блот-анализа. Деградация STK33 проявлялась через 12 ч после обработки и поддерживалась через 72 часа (фиг.8а). Для оценки влияния обработки PU-H71 на рост опухоли мы вводили мутантные KRAS-зависимые (SW-480, HCT-116) и KRAS WT (Caco-2, Colo-320HSR) клеточные линии рака толстой кишки s.c. в обе стороны голых мышей. После образования опухолей мышей получали либо 75 мг на кг массы тела PU-H71, либо носитель (PBS), и т.п .; 3 раза в неделю. Наблюдали рост опухоли, а мышей умерщвляли, когда опухоли достигали максимального размера, разрешенного в соответствии с институционально утвержденным протоколом (Colo-320HSR), или после 3 недель (SW-480, HCT-116, Caco-2). В соответствии с анализом in vitro и CAM рост опухолей KRAS-мутантов был существенно ингибирован PU-H71, тогда как опухоли KRAS WT не подвергались воздействию (фиг.8b). Кроме того, апоптоз, оцененный TUNEL, избирательно увеличивался в опухолях KRAS-мутанта (рис.8 с). Деградация белка STK33 в опухолях была подтверждена вестерн-блот-анализом (фиг.8d). Эти данные показали, что ингибирование HSP90 эффективно истощает STK33 in vivo и ухудшает образование опухолей раковых клеток мутанта KRAS зависимым от STK33 образом.

Ингибирование HSP90 снижает рост мутантных KRAS-зависимых опухолей у голых мышей. (a) Иммуноблот опухолей HCT-116. После образования опухоли мышей вводили один раз 75 мг на кг массы тела PU-H71 или PBS, и опухоли собирали после указанного времени. Была проанализирована одна мышь на состояние и время. (b) Воздействие PU-H71 на опухолеобразование мутантных KRAS-зависимых (SW-480, HCT-116) и KRAS WT (Caco-2, Colo-320HSR) линий рака толстой кишки у обнаженных мышей. Показаны снимки репрезентативных опухолей и объемов опухолей (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM 7-14 опухолей от 4-7 мышей). (c) Анализ IHC опухолей, показанный в b. Показаны репрезентативные фотографии участков ткани и доля TUNEL-положительных клеток (полосы ошибок представляют собой среднее ± SEM из четырех микроскопических полей с 600-800 клетками). NS, не имеет значения. Бар, 125 мкм. (d) Иммуноблот опухолей, показанный в b, демонстрирующий экспрессию STK33 у обработанных мышей. Опухоли собирали через 24 часа после последней инъекции.

Чтобы оценить, могут ли данные в клеточных линиях быть экстраполированы на первичные раковые клетки человека, мы создали сферические культуры, которые позволяют обогащать и расширять клетки опухолеобразующими свойствами из пяти хирургических резекций карциномы толстой кишки. Анализ последовательности ДНК идентифицировал мутацию KRAS в трех из пяти образцов (фиг.9а). Чтобы исследовать реакцию на ингибирование HSP90, отдельные клетки высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 48 часов. Сфера образования мутантных клеток KRAS была аннулирована PU-H71, тогда как клетки KRAS WT демонстрировали остаточную сферообразующую способность (фиг.9b). Кроме того, PU-H71 оказывает значительно более сильное ингибирующее действие на жизнеспособность и пролиферацию клеток в культурах KRAS-мутанта по сравнению с культурами KRAS WT (фиг.9, c и d). Вместе эти результаты показали, что ингибиторы HSP90 нацеливают на клетки KRAS-мутантов первичные человеческие клетки рака толстой кишки с опухолеобразующей способностью, что также подтверждает идею о том, что ингибиторы HSP90 могут быть эффективными при лечении раковых опухолей KRAS.

Ингибирование HSP90 снижает выживаемость первичных опухолевых клеток-предшественников KRAS-мутантов. (а) Характеристики первичных образцов рака толстой кишки человека, используемые для образования сферных культур. (б) Фотографии культур сферы рака толстой кишки, обработанных 0,5 мкМ PU-H71 или PBS в течение 48 часов. Бар, 200 мкм. (c) Жизнеспособность и пролиферация культур сферы рака толстой кишки, инкубированных с 0,5 мкМ PU-H71 в течение 48 часов. Было проведено 6-12 независимых экспериментов. Шкалы ошибок представляют среднее значение ± SD. (d) Кумулятивный анализ реакции на PU-H71 различных культур сферы, полученных от пациента, согласно статусу KRAS. *, Р <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,0001.

Ингибирование конститутивно активных KRAS уже давно рассматривается как потенциальная стратегия лечения рака. Тем не менее, попытки нацеливать мутантов KRAS напрямую не успели (Downward, 2003; Malumbres and Barbacid, 2003; Roberts and Der, 2007). Чтобы преодолеть эту проблему, в нескольких исследованиях были выявлены со-зависимости, которые KRAS-мутантные раковые клетки оказывают на взаимодействующие неонкогены, которые кодируют широкий спектр белков, таких как киназы, регуляторы транскрипции и молекулы адгезии (Singh et al., 2009; Scholl et al., 2009; Luo et al., 2009; Barbie et al., 2009; Puyol et al., 2010; Wang et al., 2010; Vicent et al., 2010). Хотя эти молекулы представляют собой перспективные терапевтические цели, в принципе, для большинства из них особых ингибиторов не существует. Кроме того, механические основы требования к определенным неонкогенам в раковых клетках мутанта KRAS неизвестны, что еще более усложняет усилия по разработке небольших молекул, нацеленных на такие зависимости.

Для работы над генотипированным обращением с раковыми заболеваниями, вызванными мутантом KRAS, мы сосредоточились на STK33, сериновой / треонин-киназе неизвестной функции, которая избирательно требуется мутантными КРАС-зависимыми клеточными линиями человека (Scholl et al., 2009). Используя экран количественного белкового взаимодействия, мы обнаружили, что STK33 является новым клиентом хаперонного комплекса HSP90. Фармакологическое ингибирование HSP90 с структурно расходящимися небольшими молекулами приводило к дестабилизации и протеасомальной деградации STK33, независимо от типа клеток и статуса мутации KRAS. Однако на функциональном уровне ингибиторы HSP90 были преимущественно токсичны для мутантных клеток, основанных на KRAS, из различных тканей, как in vitro, так и in vivo, поддерживая мнение о том, что STK33 представляет собой соответствующую цель в данном конкретном контексте. Корреляция между мутантным KRAS и чувствительностью к лечению ингибиторами HSP90 семейства ансамицина недавно наблюдалась в клеточных линиях рака легких человека и мышиной модели аденокарциномы легких (Sos et al., 2009), а также в клеточных линиях рака толстой кишки человека (West et al., 2011). Кроме того, клиническая активность ингибитора HSP90 второго поколения ganetespib была отмечена у пациентов с KRAS-мутантным немелкоклеточным раком легкого (Wong et al., 2011). Наши данные теперь дают молекулярное объяснение этой ассоциации и показывают, что она может быть экстраполирована на другие виды рака с мутациями KRAS.

Обильные доклинические данные свидетельствуют о том, что ингибиторы HSP90 являются мощными противораковыми агентами из-за их способности нарушать стабильность ключевых онкогенных белков, таких как BCR-ABL1, EGFR, ERBB2, FLT3, JAK2 и BCL6, которые приводят к злокачественному превращению посредством мутационной активации или сверхэкспрессии (Mimnaugh et al., 1996; Gorre et al., 2002; George et al., 2004; Sawai et al., 2008; Cerchietti et al., 2009; Marubayashi et al., 2010). В этом контексте цитотоксический эффект ингибирования HSP90 можно отнести к онкогенной зависимости, зависимости опухоли от конкретного онкогена, которая изменяется в этой опухоли. Данные, представленные здесь, иллюстрируют, что в раковых клетках HSP90 также важен для поддержания функции генных продуктов, которые не имеют структурных нарушений или дерегулированной экспрессии, но тем не менее проявляют существенность в конкретных контекстах и ​​тем самым расширяют репертуар показаний для ингибиторов HSP90 к вторичным, неонкогенные зависимости. Это может быть особенно актуально в контексте трудноразрешимых онкобелков, которые не могут быть напрямую заблокированы и не являются клиентами HSP90, такими как мутантный KRAS.

Учитывая, что HSP90 стабилизирует различные регуляторы жизнеспособности и пролиферации клеток (Taipale et al., 2010), часто остается неуловимым, является ли клеточное убийство при ингибировании HSP90 опосредованным истощением одного клиента или одновременной деградацией нескольких белков, необходимых для трансформированного фенотипа. Кроме того, было высказано предположение, что ингибиторы HSP90 могут воздействовать на более общий эффект на белковый гомеостаз. Наши результаты показывают, что изысканная чувствительность мутантных KRAS-зависимых раковых клеток к этим агентам в основном связана с истощением STK33. Во-первых, деградация STK33, индуцированная обработкой ингибитором HSP90, предшествовала апоптозу и, таким образом, не представляла собой неспецифическое изменение, связанное с гибелью клеток. Во-вторых, принудительная экспрессия жизнеспособности клеток STK33 после лечения ингибитором HSP90 в клетках мутанта KRAS, но не в раковых клетках KRAS WT, которые зависят от другого клиента HSP90. В-третьих, раковые клетки мутанта KRAS, которые избежали апоптотического эффекта нокдауна STK33, опосредуемого RNAi, были частично устойчивы к 17-AAG и PU-H71. В отличие от этих наблюдений, истощение RAF1 и AKT1, которые являются установленными эффекторами KRAS, которые также известны как клиенты HSP90, привели к апоптозу только в подмножестве клеточных линий KRAS-мутанта. Таким образом, хотя ясно, что различные субстраты HSP90 вносят вклад в противораковые эффекты ингибиторов HSP90 в разных контекстах, зависимость STK33 проявляется как важная детерминанта ответа мутантных клеток KRAS на эти агенты. Эти данные не только обеспечивают механическое понимание активности ингибиторов HSP90 в опухолях KRAS-мутанта, но также дают дополнительные убедительные доказательства предпочтительного требования к STK33 в мутантных KRAS-зависимых раковых клетках. Подобно опосредуемому shRNA нокдауну, ингибиторы HSP90 нацеливают мутантные раковые клетки, управляемые KRAS, через истощение всего белка STK33. Это свойство может иметь особое значение с учетом недавних наблюдений, согласно которому селективное ингибирование ферментативной активности STK33 не убивает некоторые клеточные линии мутантных раковых клеток KRAS (Babij et al., 2011; Luo et al., 2012), что указывает на то, что активность некиназы STK33 может быть ответственным за его наблюдаемую существенность в исследованиях на основе RNAi, что является важным несоответствием, которое также было сообщено для киназ Aurora B и PI3 (Weiss et al., 2007).

В более общем плане наши результаты подчеркивают необходимость использования прогностических маркеров в преимуществах ингибиторов HSP90. Ранние клинические испытания показали, что ингибиторы HSP90 недостаточно эффективны во многих случаях рака (Barginear et al., 2008; Mahalingam et al., 2009; Trepel et al., 2010). Однако, хотя существует несколько установленных фармакодинамических биомаркеров модуляции HSP90 (Banerji et al., 2005; Zhang et al., 2006; Maloney et al., 2007), в нескольких исследованиях были отобраны пациенты на основе генетических факторов или функциональных характеристик, которые может предсказать чувствительность к ингибиторам HSP90. Наши данные свидетельствуют о том, что в некоторых раковых опухолях, например, вызванных мутантами KRAS, реакция на ингибирование HSP90 определяется их зависимостью от одного или небольшого числа клиентских белков, таких как STK33, деградация которых не может быть компенсирована. Основываясь на этом наблюдении, мы выдвигаем гипотезу о том, что подмножество пациентов, которые получают пользу от ингибиторов HSP90, может быть обогащено для случаев, связанных с мутантными KRAS и STK33. Поэтому будет интересно исследовать ткань опухоли у пациентов, включенных в клинические испытания этих агентов, для присутствия мутаций KRAS. Другие примеры генетически определенных видов рака, которые, по-видимому, являются гиперчувствительными к ингибированию HSP90, включают ERBB2-амплифицированный рак молочной железы (Modi et al., 2007, 2011) и аденокарциномы легких, обусловленные слитым геном EML4-ALK (Sequist et al., 2010; Normant et al., 2011). Таким образом, максимизация клинической пользы ингибиторов HSP90 в качестве противоопухолевых агентов потребует подробного изучения генотипов опухолей и связанных с ними фенотипических зависимостей, что иллюстрирует важность сочетания структурных и функциональных геномных генов (Boehm and Hahn, 2011).

Несмотря на многообещающие доклинические данные, несколько ингибиторов HSP90 показали ограниченную эффективность в качестве монотерапии в исследованиях фазы 2 у пациентов с эпителиальными и гемопоэзными злокачественными новообразованиями (Barginear et al., 2008; Mahalingam et al., 2009; Trepel et al., 2010). Это выявляет ряд проблем, помимо выбора правильного указания, которое может усложнить рациональное клиническое развитие ингибиторов HSP90, включая избыточность между сигнальными путями, влияние микроокружения опухоли и неэффективное ингибирование внутриутробной активности HSP90 (Workman et al., 2007) Trepel et al., 2010). Тем не менее, наши данные показывают, что ингибиторы HSP90 способны индуцировать апоптоз в мутантных раковых клетках, подверженных КРАС, путем ориентации их внутренней зависимости от STK33. Мы полагаем, что это специфическое для контекста свойство агентов, нацеленных на HSP90, может быть наилучшим образом использовано в сочетании с традиционными цитотоксическими лекарственными средствами или новейшими терапевтическими средствами для молекулярного рака, стратегия, которая была успешно использована у пациентов с множественной миеломой и ERBB2-положительным раком молочной железы (Modi et al., 2007, 2011; Richardson et al., 2011).

В заключение, идентификация STK33 как нового клиента HSP90 обеспечивает обоснование нацеленности на мутантные раковые заболевания, основанные на KRAS, которые, как известно, трудно поддаются лечению, генетически информированным способом. Следует отметить, что потенциальную ценность такого персонализированного терапевтического подхода у пациентов можно было бы сразу оценить, учитывая, что в настоящее время в клиническом развитии находятся несколько ингибиторов HSP90. Наконец, в то самое время, когда усилия по разработке ингибиторов STK33 осложняются неполным пониманием специфических свойств STK33, которые имеют отношение к опосредованному KRAS онкогенезом, ингибирование HSP90 является альтернативным средством для вызова полной потери функции STK33 для терапевтического эффекта.

Клеточные линии поддерживались в стандартных условиях. PU-H71, 17-AAG и MG-132 для исследований in vitro были получены от Sigma-Aldrich. PU-H71 для инъекций мышам синтезировали, как сообщалось (Caldas-Lopes et al., 2009). Бортезомиб был получен от LC Laboratories.

КДНК STK33 и BAG2 были получены из Open Biosystems. RAF1 и AKT1 были получены от W. Hahn и D. Root через Addgene (ID 23752 и 23832). Эпитопные метки были прикреплены с помощью ПЦР-амплификации. кДНК клонировали в лентивирусный экспрессирующий вектор pLenti6.2 / V5-DEST с использованием технологии Gateway (Invitrogen). XDS-метки USP5 и USP15 кДНК в векторе pcDNA4c были получены из P. Howley через Addgene (ID 24744 и 23216). Эксперименты с RNAi проводили с использованием векторов pLKO.1 lentiviral shRNA, полученных из библиотеки shRNA TRC-Hs 1.0 (Human) через Open Biosystems (shSTK33-1, TRCN0000002077; shSTK33-2, TRCN0000002079; shSTK33-3, TRCN0000002081; shHSP90A, TRCN0000001025; shHSP90B , TRCN0000008748; shBAG2-1, TRCN0000033590; shBAG-2, TRCN0000033591; shHERC2, TRCN0000118376; shRAF1, TRCN0000001067; shAKT1-1, TRCN0000039794; shAKT1-2, TRCN0000039797). Для временной экспрессии кДНК трансфицировали в клетки 293Т. Генерация вирусных супернатантов и вирусная трансдукция выполнялись, как описано ранее (Scholl et al., 2009).

Цельноклеточные белковые экстракты получали с использованием лизисного буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10% глицерина и 0,5% НП-40, дополненного коктейлями-ингибиторами протеазы (G-Biosciences) и фосфатазой 2 (Сигма-Олдрич). Экстракты белков (9 мг БТ-20, 17 мг МДА-МБ-231) преклировали с 150 мкл упакованной мышиной IgG-агарозы (Sigma-Aldrich) в течение 1 часа и супернатанты инкубировали в течение ночи с 150 мкл упакованного анти-FLAG M2 Affinity Бусины геля (Sigma-Aldrich). Бусины промывали пять раз в буфере для лизиса, и связанные белки элюировали с использованием 3 × FLAG-пептида (Sigma-Aldrich). Элюированные белки концентрировали центрифужными колонками Microcon YM-10 (Millipore) и разделяли SDS-PAGE на 4-12% геле. После окрашивания геля коллоидным синим (Invitrogen) каждую полосу вырезали и разрезали на 10 одинаковых размеров, которые промывали водой ВЭЖХ с последующим промыванием в 50% ацетонитриле. Пептиды в каждом гелевом фрагменте секвенировали в Гарвардской микрохимии и анализе методом протеомики методом микрокапиллярной масс-спектрометрии с микрокапиллярной обратной фазовой жидкостной жидкостной хроматографией (μLC / MS / MS) на масс-спектрометре LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific).

Цельноклеточные белковые экстракты для IP и прямого вестерн-блоттинга получали с использованием буфера IP-лизиса, содержащего 10 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 50 мМ NaF и 1% Triton-X100, дополненного коктейльными таблетками с полной протеазой (Roche). Нерастворимые фракции получали с буфером, содержащим 2% SDS, и подвергали 16 циклам ультразвуковой обработки (30 с). Растворимые фракции готовили, используя буфер IP-лизиса. Протеиновые экстракты (50-100 мкг) подвергали SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Whatman). Мембраны блокировали с использованием 5% сухого молока в PBS, содержащем 0,2% Tween-20, с последующей инкубацией с первичными и HRP-связанными вторичными антителами (GE Healthcare). Для coIP белковые экстракты (1-2 мг) инкубировали с 2 мкг антитела и белком G-сефарозой (GE Healthcare) при 4 ° C. Иммобилизованные белки промывали три раза, ресуспендировали в буфере Лаэмми и подвергали SDS-PAGE и вестерн-блоттингу. Диапазоны определяли количественно денситометрическим анализом с использованием программного обеспечения ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij). Использовали следующие антитела: анти-FLAG M2 аффинный гель, анти-β-актин (Sigma-Aldrich); анти-PARP, анти-каспаза 9 (специфическая для человека), анти-RAF1 и анти-AKT1 (технология Cell Signaling); анти-STK33 (клон 4F7; Abnova); анти-HA (клон Y-11), анти-CDC37 (клон H-271), анти-HSP90α / β (клон H-114), анти-HSP90β (клон D-19), анти-K-Ras-2B ( клон C-19), анти-Neu (клон H-200) и анти-FLT3 (клон C-20; Santa Cruz Biotechnology); анти-BAG2 (клон EPR3567; Эпитомика); анти-HERC2 (клон 17; BD); анти-убиквитин (EMD); анти-Xpress (Invitrogen); и анти-HSP90α (AB3466; Millipore).

Жизнеспособность и пролиферацию клеточных линий, инкубированных с PU-H71, определяли с использованием анализа пролиферации CellTiter 96AQouous One Solution (Promega). Активность Caspase 9 измеряли с использованием анализа Caspase-Glo 9 (Promega).

HCT-116, Caco-2 и MDA-MB-231 (по 1,3 × 106 каждый) осаждались в пределах 5-миллиметровых кремниевых колец на поверхности куриного CAM 8d после оплодотворения. 17-AAG (5 мкМ) и PU-H71 (1 мкМ) вводили через 24 и 48 ч после имплантации, а опухоли ксенотрансплантата собирали через 72 часа. Опухолевые области измерялись с использованием программного обеспечения ImageJ. Формано-фиксированные опухоли внедряли в парафин, а IHC проводили с использованием следующих антител: анти-STK33 (1: 100, клон 4F7, Abnova) и анти-FLAG M2 (1: 1000; Sigma-Aldrich). Апоптотические клетки были обнаружены TUNEL с использованием набора для определения смертности клеток in situ, POD (Roche) и количественно подсчитаны с помощью> 600 клеток по меньшей мере из четырех микроскопических полей.

Впрыскивали клетки рака толстой кишки HCT-116, SW-480, Caco-2 и Colo-320HSR (по 8 × 106). во флангах голых мышей (NMRI-nu [nu / nu]; Janvier) и контролировали образование опухоли. Для каждой клеточной линии мышей разделяли на группу лечения и контрольную группу (от четырех до семи мышей каждый) со сравнимыми средними размерами опухоли. Мыши в группе лечения получали 75 мг на кг массы тела PU-H71, i.p. три раза в неделю, а мыши в контрольной группе получали PBS. Размер опухоли измеряли еженедельно, а мышей умерщвляли, когда опухоли достигали максимального размера, разрешенного в соответствии с принятым в институте протоколом или после 3 недель. IHC опухолей выполняли, как описано для экспериментов CAM в предыдущем разделе. Для Вестерн-блот-анализа опухоли замораживали в жидком азоте и дезинтегрировали, а белковые экстракты получали с использованием буфера IP-лизиса. Утверждение об использовании животных в этом исследовании было предоставлено Комитетом по уходу и использованию животных в Regierungspräsidium Tübingen по протоколу номер 1030.

Образцы тканей от первичной карциномы толстой кишки человека были получены в соответствии с утвержденным протоколом, утвержденным Институтом обзора, после письменного информированного согласия. Сферные культуры были установлены, как описано ранее (Kreso and O’Brien, 2008) и поддерживались в DME / F-12 с добавлением 0,6% глюкозы, 1% пенициллина / стрептомицина, 2 мМ l-глутамина, 4 мкг / мл гепарина, 5 мМ Hepes, 4 мг / мл BSA, 10 нг / мл FGF basic (R & D Systems) и 20 нг / мл EGF (R & D Systems). Для функциональных исследований опухолевые сферы механически диссоциировали и клетки высевали в 96-луночные планшеты в соответствии с базальным уровнем АТФ различных культур пациентов (SC-01 и SC-02, 400 клеток, SC-03 и SC-04, 1500 клеток, SC-05, 3000 клеток). PU-H71 или PBS добавляли через 24 часа, и жизнеспособность клеток определяли с использованием анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega) через 48 часов.

Все результаты были подтверждены, по крайней мере, в одном независимом эксперименте, хотя обычно больше (как указано в легендах фигур). Статистическую значимость оценивали с помощью t-теста непарного Student с использованием GraphPad Prism Version 5.0a (GraphPad Software).

Авторы благодарят Мартину Шнайдер за техническую помощь, а Гэри Джиллиланд, Стивен Лейн, Стивен Сайкс и Торстен Зенц за их советы и критический обзор рукописи.

Это исследование было поддержано Немецкой помощи против рака и стипендией Эмми Нётер из Немецкого исследовательского фонда (до С. Шолла). Дж. Эллегаст был поддержан стипендией молодого следователя с медицинского факультета Университета Ульма. G. Chiosis частично поддерживается Национальным институтом здравоохранения 1R01-CA-155226-01. H. Glimm частично поддерживается грантами Немецкого исследовательского фонда (KFO 227) и Баден-Вюртембергского Stiftung.

Авторы не имеют противоречивые финансовые интересы.

Используемые сокращения:
            
              AML
              
                острый миелоидный лейкоз

хориоаллантоидная мембрана

гемагглютинин

иммуногистохимия

иммунопреципитация

РНК-помеха

короткая шпилька РНК

концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP ник-концевая маркировка

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *