Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Идентификация новых молекулярных образований (NME) в качестве потенциальных источников против туберкулеза из хранилища с открытым исходным кодом

Identification of New Molecular Entities (NMEs) as Potential Leads against Tuberculosis from Open Source Compound Repository
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4671662/

Конкурирующие интересы: Tanmay Banerjee работает в Syngene International Ltd. Syngene International Ltd. не имеет финансовых и профессиональных конкурирующих интересов, связанных с переданными данными. Патентов, продуктов в разработке или продаваемых продуктов не существует. Это не изменяет приверженность авторов ко всем политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами, как подробно описано в руководстве для авторов.

Задуманные и разработанные эксперименты: PM RU. Выполнены эксперименты: SK SN LN RU. Проанализированы данные: SK SN TB RU. Добавленные реагенты / материалы / инструменты анализа: SK SN LN PM RU. Написал документ: HR PM RU.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы предоставить ряд разнообразных и перспективных ранних соединений свинца, которые будут поступать в трубопровод обнаружения лекарств для разработки новых противотуберкулезных агентов. Результаты фенотипического скрининга библиотеки соединений с открытым исходным кодом против Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium bovis (БЦЖ) с подтверждением ударов против M. tuberculosis (H37Rv) выявили новые сильнодействующие соединения. Для определения их лекарственной чувствительности был проведен системный анализ физико-химических свойств соединений-хитов с использованием инструментов чеминформатики. Отобранные молекулы анализировали путем кластеризации на основе их химических отпечатков пальцев и структурного сходства, определяющего их химическое разнообразие. Библиотеку хитовых соединений также фильтруют для лекарственной чувствительности на основе физико-химических описателей, следующих за фильтрами Липински. Прочная фильтрация хитов с последующим вторичным скринингом против BCG, H37Rv и оценки цитотоксичности выявила 12 соединений с потенциалом против H37Rv (диапазон MIC от 0,4 до 12,5 мкМ). Кроме того, в анализах цитотоксичности 12 соединений проявляли низкую цитотоксичность в отношении клеток печени и легких, обеспечивая высокий терапевтический показатель> 50. Чтобы избежать любых изменений в активности из-за пути химического синтеза, удаленные соединения были синтезированы независимо и подтверждены для их потенциала против H37Rv , Взятые вместе, приведенные здесь обращения показывают, что многочисленные потенциальные отправные точки для производства новых потенциальных клиентов в конечном итоге добавляют к линии обнаружения наркотиков против туберкулеза.

Все соответствующие данные представлены в документе.

Во всем мире туберкулез составляет больше смертей среди людей, чем все другие инфекционные заболевания [1]. Туберкулез является высокоинфекционным заболеванием, вызванным Mycobacterium tuberculosis (M. tb). Его целевым органом являются в основном легкие, особенно альвеолярные макрофаги. Было зафиксировано, что туберкулез является вторым по величине инфекционным заболеванием, ответственным за смертность в мире [2]. Несмотря на то, что для лечения туберкулеза (ТБ) существуют разные схемы лечения, более двух миллионов человек умирают от туберкулеза каждый год [3]. Тем не менее, эффективное лечение туберкулеза является актуальным до настоящего времени. Лечение первой линией со стандартными препаратами, такими как рифампицин, изониазид, этамбутол и пиразинамид в течение 6-8 месяцев, связано с несоблюдением между больными туберкулезом, что приводит к эволюции множественного (MDR) и широко резистентного к лекарственным средствам ( XDR). Среди пациентов с XDR смертность достигает 100% [4,5]. Некоторые из недавно возникших штаммов бактерий не реагируют на препараты первой линии, такие как изониазид и рифампицин, два самых мощных (или стандартных) противотуберкулезных препарата. В некоторых странах штаммы MDR / XDR могут составлять до 22% инфекции [6]. Эти лекарственно-устойчивые штаммы представляют большую угрозу здоровью людей из-за отсутствия эффективных методов лечения до настоящего времени [5]. Доступная линия лечения туберкулеза полностью неэффективна против этих штаммов. Еще одна серьезная проблема заключается в борьбе с бактериями от латентно инфицированных людей, которые рискуют перейти к активному туберкулезу. Только в течение последних нескольких лет появилось несколько перспективных кандидатов на лекарства [7-9]. Поэтому существует острая необходимость в разработке новых лекарств для сокращения продолжительности лечения ТБ, включая лекарственно-устойчивые и латентные туберкулезные инфекции; а также уменьшает возникновение любого из возможных побочных эффектов, известных для существующих лекарств.

В недавнем прошлом комбинаторная химия стала ключевой платформой для разработки разнообразных химических веществ для открытия лекарств. Однако необходимо исследовать химическое пространство соединений для различных биологических применений с использованием различных методов скрининга. Хотя случайный скрининг соединений менее эффективен, он привел к идентификации новых лесов как потенциальных потенциальных клиентов. Методы скрининга на основе целевой или цельной клетки — это общие подходы, используемые при раннем открытии лекарств. Преимущество целевого подхода заключается в том, что выбранная мишень, присутствующая только в бактериях, а не у людей, уменьшит проблемы токсичности на дальнейших стадиях развития лекарственного средства. Однако эти соединения, идентифицированные в целевом подходе, должны достичь своей цели в бактериях, которые часто являются узким местом из-за уникальной и сложной клеточной стенки M. tb. Кроме того, бактерии оснащены отходящими насосами, которые удаляют лекарства из клеток, снижающие эффективную концентрацию этих препаратов против мишени.

Поэтому для обнаружения новых противотуберкулезных агентов, использующих подход на основе «цельной клетки», получило более привлекательный подход, чем подход, основанный на целевых показателях. В этом подходе на основе всей клетки соединения выбираются исходя из их способности убивать бактерии. Соединения, идентифицированные при скрининге на целых клетках, уже выполняют некоторые важные критерии, такие как клеточная проницаемость лекарств и мощное ингибирование Mycobacterium. Заболевания о возможной токсичности также сопровождаются параллельной оценкой соединений свинца в батарее анализов, связанных с профилированием безопасности. Дальнейшее выяснение механизма действия соединения может способствовать дальнейшему развитию новых противотуберкулезных агентов. Таким образом, эти соединения обеспечивают подходящие химические и биологические исходные точки для дальнейшего развития лекарственных форм, таких как леса, с помощью принципов медицинской химии. Поэтому в текущем исследовании мы изучили библиотеку соединений (как аналогов природного продукта, так и различных новых химических объектов), заархивированных на объекте National Mol Bank, чтобы идентифицировать новые хиты с противотуберкулезными свойствами. Выявленные удары были протестированы на цитотоксический потенциал и проанализированы на физико-химические свойства. До настоящего времени многие сложные библиотеки были отобраны для идентификации отправных точек для различных программ обнаружения лекарств [10-12]. Плохая скорость успеха при открытии антибактериальных препаратов объясняется главным образом отсутствием химически разнообразных соединений. Составная библиотека, скринированная против Mycobacterium в настоящем исследовании, состоит из химически разнообразных соединений, содержащих сложные классы, такие как флавоноиды, углеводы, различные гетероциклы, стероиды, пептиды и, самое главное, соединения природного происхождения с химически разнообразными каркасами.

Бактериальные штаммы, используемые в текущем исследовании, были получены из аутентифицированных источников (АТСС, США). Лиофилизированные штаммы восстанавливали в бульоне Middlebrook 7H9 с добавлением глицерина, 0,05% об. / Об. Tween 80 и 10% ADS (альбумин-декстроза-солевый) (Sigma) для Mycobacterium smegmatis (mc2155) и 0,05% Tween 80 (Sigma) и 10 % OADC (0,06% олеиновой кислоты, 5% БСА, 2% декстрозы, 0,85% NaCl), глицерин (0,2% об. / Об.) (Himedia) для Mycobacterium bovis (BCG) и M. tb (H37Rv). Морфологию восстановленных бактерий проверяется путем образования небольших циклов культур на агаре Middlebrook 7H10 наряду с необходимыми добавками. Культуры окрашивали стандартным пятном Зиль-Нильсена на регулярной основе для подтверждения Mycobacterium. Все бактериальные штаммы выращивали при 37 ° С при встряхивании со скоростью 200 об / мин.

Клеточные линии HepG2 (клетки гепатомы человека) и A549 (человеческие эпителиальные клетки человека), используемые в текущем исследовании, были получены из АТСС (Manassas, США) и культивировались в DMEM (Sigma) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллин и стрептомицин. Клетки регулярно тестировали на заражение микоплазмой с использованием набора MycoAlert Kit (Cambrex Bio Science Rockland, Inc., Rockland, ME, США).

CSIR-Индийский институт химической технологии (IICT) в качестве лаборатории исследований научных и промышленных исследований (CSIR) предоставлен National Mol Bank (NMB) для хранения новых молекулярных объектов (NME). Объект хранит синтетические / изолированные леса из различных исследовательских групп и коммерческих источников для выявления новых химических компонентов для различных заболеваний. В настоящее время на объекте расположено более 10000 соединений с огромным химическим разнообразием из разных источников и хранится в пробирках с штриховым кодированием (50 мМ в ДМСО) в форматах 96-луночных планшетов. Дозированные планшеты (10 мМ) готовили из запасов для скрининга в разных биоанализах. Леса выбираются исходя из их химической классификации и источника. Природные продукты, изолированные, получают предпочтение по сравнению с коммерчески доступными общими лесами. Выбор натурального продукта, такого как скелет, был главным критерием даже в коммерческих библиотеках. Классы соединений варьируются от флавоноидов, терпеноидов, на основе углеводов, пептидов и пептидомиметических, гетероциклических соединений, липидов и алкалоидов и их производных. Поскольку первичный скрининг включает большое количество соединений, все соединения подвергают скринингу при фиксированной концентрации 30 мкМ. Выбор концентрации связан с тем, что соединения требуют более высокой концентрации для ингибирования роста M. smegmatis по сравнению с M. tuberculosis.

M. smegmatis и M. bovis (BCG) Pasteur являются суррогатными моделями для крупномасштабного скрининга химических веществ для идентификации новых антимикобактериальных агентов [7,13-15]. Первичный скрининг при одной концентрации (30 мкМ) проводили против M. smegmatis в 96-луночных планшетах из полистирола с плоским дном (Nunc). Для первичного скрининга испытуемые соединения, полученные в ДМСО или ДМСО в качестве контроля, распределяли на испытательные пластины (в обозначенных трех лунках) перед добавлением компонентов анализа. Используя ручную пипетку, 98 мкл инокулята (над ночной культурой с 0,6 OD, разведенной при 1: 1000 в бульоне 7H9) распределяли на стерильные пластины микротитра. Это разведение тестируемых соединений с инокулятами дает 30 мкМ конечной концентрации соединений в скринирующей среде. Для лучшего определения активности соединений в качестве положительного контроля для ингибирования роста M. smegmatis в каждой пластинке добавляли контрольные вещества, такие как ДМСО в качестве контроля растворителя, контроль над средой (Бланк), а также рифампицин и изониазид. Периферийные лунки аналитических пластин заполняли стерильной дистиллированной водой, чтобы избежать испарения в лунках для анализа. Инокулированные пластины укладывали в группы из 7-8 пластинок. Плиты тщательно обертывали алюминиевой фольгой для предотвращения испарения и позволяли инкубировать при 37 ° С при относительной влажности 80%. Время инкубации составляло четыре дня в случае БЦЖ и 32 часа для M. smegmatis. После инкубационного периода рост бактерий изучали с помощью турбидометрии, измеряющей поглощение при 600 нм с использованием Multi Mode Reader (Perkin Elmer). Ингибирование роста в процентах определяли против контроля ДМСО (разведение соединений готовили в ДМСО). Эффект ингибирования роста соединений был рассчитан как:
% Ингибирования = 100 × [ОП с соединением -od отрицательного контроля]% [ОП положительного контроля -od отрицательного контроля]
Те соединения, которые показали 40% ингибирования или более, были дополнительно проанализированы для определения их значений MIC по отношению к M. bovis и M. smegmatis. Из результатов, полученных при первичном скрининге, соединения, демонстрирующие ингибирование роста более 40%, были подтверждены аналогично свежеприготовленным запасам из исходных соединений, сохраненных при подаче образцов в NMB. Чтобы определить значение MIC для тестируемых соединений, реакцию полной дозы проводили путем взятия от 0 до 100 мкМ конечной концентрации соединений в клетках в аналитических планшетах. После периода инкубации, от поглощения инокулята, наблюдаемого при 600 нм, значения MIC рассчитывали как самую низкую концентрацию лекарственного средства, которая показала 90% -ное ингибирование роста бактерий. В каждой аналитической пластине отрицательный контроль ДМСО добавляли в одну колонку, что соответствует 100% -ному росту, и положительные контрольные образцы (рифампицин и изониазид) добавляли в одну колонку. Эти средства контроля использовались для контроля качества анализа, а также для нормализации данных на основе каждой пластины.

Для определения эффективности ударов, выявленных при первичном скрининге (соединения, ингибирующие рост M. smegmatis и M. bovis), отобранные соединения были протестированы против M. tuberculosis. Измерение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для каждого испытуемого соединения проводили в 96-луночных планшетах из полистирола с плоским дном. Из 10 мМ исходных растворов было проведено девять раз в два раза разведенных растворов в чистом ДМСО, начиная с 10 мМ (линии B-F, ряды 2-10 пластин, формат пластины сохраняется между основной и дочерней пластинами). Были приготовлены девять раз в два раза (64 — 0,25 мкг / мл) изониазида в качестве положительного контроля (линии G, строки 2-10). Эти составные растворы (4 мкл) добавляли к дочерним планшетам в виде дубликатов. В строку 11 добавляли аккуратный ДМСО (4 мкл) (рост и пустые контрольные образцы). Инокулум стандартизировали до ~ 1 × 10 КОЕ / мл и разбавляли 1: 1000 в бульоне Middlebrook 7H9 с необходимыми добавками для получения конечного инокулята H37Rv. Этот инокулят (200 мкл) добавляли ко всем планшетам, загруженным соединениями, и контролировали всю пластину, за исключением А и Н-рядов, а также 1-ю колонку (пустые контрольные образцы заполнены H2O). Инокулированные пластины герметизировали парафилом и укладывали в группы из 7-8 пластинок. Плиты тщательно обертывали алюминиевой фольгой для предотвращения испарения и позволяли инкубировать при 37 ° C без встряхивания в течение шести дней. После инкубации в каждую лунку добавляли 5 мкл свежеприготовленного реагента Alamar Blue в стерильном фосфатном буферном растворе (PBS). Планшеты для анализа дополнительно инкубировали в течение 24 ч при 37 ° С. В Alamar Blue Assay синий цвет в колодцах означает отсутствие роста, а появление розового цвета проявляет рост бактерий. MIC определяли путем сопоставления роста в составных лунках с контролем в колонке 11 в каждой аналитической пластине.

Цитотоксичность соединения тестировали с помощью анализа Sulforhodamine B (SRB) с использованием клеточных линий A549 и HepG2. Для анализов пролиферации клеток интересующую клеточную линию высевали в 96-луночный планшет с плоским дном (5000 клеток / 100 мкл) в среде, содержащей 10% сыворотки. Планшеты инкубировали в течение 18-20 ч в инкубаторе с непрерывной подачей 5% СО2, чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток к поверхности дна колодцев. Через 18 ч клетки обрабатывали соединением. Соединения готовили в 50 раз более высоких концентрациях для получения требуемой конечной концентрации в клетках. Из исходных пластинок в каждую лунку добавляли 2 мкл аликвоты, получая конечную концентрацию соединения от 0 до 100 мкМ. Каждое соединение испытывали в трех повторностях, и цитотоксичность определяли как среднее значение этого трех повторов. ДМСО и доксорубицин (в качестве стандартного противоопухолевого лекарственного средства) принимали в качестве носителя и положительных контролей соответственно. Кроме того, планшеты инкубировали еще 48 ч в инкубаторе, поддерживаемом при 37 ° С, с постоянной подачей 5% СО2. Через 48 ч клетки фиксировали с использованием 10% раствора ТСА и инкубировали в течение 1 ч при 4 ° С. Затем планшет тщательно промывали водой MQ и сушили на воздухе при комнатной температуре. После добавления 0,057% растворного раствора SRB инкубировали в течение приблизительно 30 мин до того, как его промыли, используя 1% уксусную кислоту. Планшеты затем сушат на воздухе и к каждой лунке добавляют 100 мкл 10 мМ трис-основания для солюбилизации SRB для измерения поглощения с использованием многомодового считывателя Perkin-Elmer при 510 нм. Измерение поглощения прямо пропорционально росту клеток и используется для расчета значений IC50. Кроме того, значения терапевтического индекса (TI) рассчитывают для тестируемых соединений. TI представляет собой отношение концентрации соединения, которое вызывает 50% -ную токсичность для клеток, деленное на концентрацию, что приводит к 50% -ному эффективному ингибированию роста целевого организма. Таким образом, терапевтический индекс рассчитывали по формуле IC50 / GI50 (концентрация, которая вызывала 50% -ное ингибирование роста Mycobacterium tuberculosis (H37Rv) [16,17].

Как упоминалось в предыдущем разделе, результаты первичного скрининга библиотеки соединений с результатами М. smegmatis были собраны в виде процентного ингибирования роста соединениями по сравнению с контрольным ДМСО (100% -ный рост). При первичном скрининге каждое соединение подвергали скринингу в двух экземплярах, а составные значения z рассчитывали, используя процент ингибирования роста и значения стандартного отклонения, используя контрольные образцы ДМСО и Rifampicin в качестве ссылок. Оценка Z рассчитывалась как
г оценка =% ингибирования — Среднее Среднее Стандартное отклонение ÷
Среднее значение z-балла данных обрезания выбирают для отбора соединений, показывающих ингибирование 50% в первичных анализах. Хиты из экрана M. smegmatis были определены как соединения с составным z-счетом более 1,5. Кроме того, чтобы определить способность к химическому воздействию химических веществ, выявленных на первичном экране, систематический анализ был проведен с использованием инструментов чеминформатики. В настоящем исследовании мы определили физико-химические свойства, такие как растворимость, проницаемость и правило Липински, включая молекулярную массу, количество акцепторов и доноров водородной связи, logP и полярную площадь поверхности (PSA) с использованием инструментов Cytoscape и ChemMine, доступных в качестве открытого источника. Исходя из вычисленных параметров соединений, идентифицированный список хитов был отфильтрован, чтобы исключить соединения, которые не удовлетворяют критериям в пределах заранее установленных лекарственно-подобных параметров [11].

Иерархическая кластеризация первичных обращений была выполнена для понимания их уникальности и анализа шаблонов для идентификации структуры сигнатур, показывающей хорошую антимикобактериальную активность. Структурно похожие молекулы, сгруппированные вместе, обычно имеют сходные физико-химические и биологические свойства. У нас есть кластерные молекулы с использованием отпечатков пальцев, как это реализовано в наборе для разработки химии (CDK) [18]. Для кластеризации молекул мы разработали два сценария TD_calculator и Taylor_Butina, написанные в PERL 1.0. TD_calculator был разработан для считывания отпечатков pubchem, выводимых из калькулятора дескриптора CDK (v1.3.2). TD_calculator использовался для изучения сходства каждой молекулы в совокупности молекул, которые должны быть сгруппированы. Сходство между молекулами измеряли с использованием расстояния Танимото. Мы пробовали разные расстояния Танимото, чтобы определить сходство между двумя молекулами, используя молекулы из банка молекул. Отсечение 0,15 дало нам химически значимые кластеры. Метаданные, содержащие информацию о сходстве каждой молекулы, найденной против других молекул, использовались в качестве вклада в наш следующий сценарий Taylor_butina. Эта реализация подобна той, которая описана Бутинайте. и др. [19]. Молекулы упорядочены по убыванию, согласно числу соседей. Молекула с наибольшим числом соседей образует самый большой кластер. Если молекула появляется в более чем одном кластере, то она присоединена к кластеру, у которого больше молекул. Кластерные составные семейства были представлены с использованием инструмента визуализации Cytoscape 3.1. 2D-изображения соединений отображаются, предоставляя строки InCHI или SMILES в chemViz.

Тест MBC определяет минимальную концентрацию антимикробного агента, необходимую для предотвращения роста организма после субкультуры в среду без антибиотиков. Тест MBC позволяет определить, проявляют ли противомикробные агенты бактерицидное или бактериостатическое действие на рост определенного микроорганизма [20]. Таким образом, поскольку мы уже определили значения MIC для отобранных соединений, те же самые соединения были подвергнуты определению MBC. Для выполнения теста MBC, как сообщалось ранее, обычный подход КОЕ был адаптирован для всех тестируемых организмов в настоящем исследовании с незначительными модификациями [21]. Чистую бактериальную культуру, выращенную в течение ночи, разбавленную в полной ростовой среде до концентрации между 1 × 105 и 1 × 106 КОЕ / мл. Ряд растворов тестируемых соединений (максимум 100 раз MIC, наблюдаемых для соответствующих соединений) готовят в 96-луночных планшетах для микротитрования. Бактерии сначала подвергались воздействию соединений путем инокуляции бактерий соответствующими соединениями в различных концентрациях, включая концентрации MIC. Все разведения тестируемых соединений инокулируют одинаковыми объемами указанных микроорганизмов независимо и культивируют в течение еще 24 часов. Затем 100 мкл этих инокулюмов из каждого разведения затем распределяли на твердой агаровой среде M7H10 без антибиотиков, дополненной OADC и глицерином. Планшеты инкубировали в течение 7 дней, в течение которых наблюдался рост Mycobacterium ежедневно. Для тестовых микроорганизмов положительная контрольная лунка демонстрирует удовлетворительный микробный рост в течение периода инкубации и отрицательный контроль, чтобы обеспечить стерильность среды в течение длительного периода инкубации. По завершении инкубационного периода рост в тестовых планшетах сравнивали с контрольными планшетами с инокулятами, обработанными ДМСО. Различия в возникновении колониеобразующих единиц (КОЕ) в тесте, а также контроле использовались для измерения MBC соединений. MBC является самой низкой концентрацией, которая демонстрирует предопределенное снижение (например, 99,9%) в КОЕ / мл по сравнению с разбавлением MIC. Основываясь на определенных значениях MIC и MBC для соответствующего соединения, он может быть помечен как бактерицидный или бактериостатический против конкретного микроорганизма.

Чтобы оценить сбор соединений в National Mol Bank (10 000 единиц химического вещества) CSIR-IICT против микобактерий, избегая больших объемов культивирования инфекционных материалов в среде биологической безопасности (BSL) 3, мы решили использовать M. smegmatis (MC2155) в качестве M.tuberculosis суррогат для раннего назначения скрининга наркотиков. M. smegmatis — это аэробная, быстрорастущая, непатогенная микобактерия и может безопасно работать в среде BSL1. M. smegmatis имеет много общих черт с патогенными микобактериями H37Rv [22]. Этот вид разделяет гены 2 000 генов с M. tuberculosis и имеет такую ​​же необычную структуру клеточной стенки, как M. tuberculosis и другие виды микобактерий [23]. Существует несколько сообщений об использовании Mycobacterium smegmatis в качестве основного экрана для отбора соединений, которые могут быть активными против M. tuberculosis [7,24,25]. Следует отметить, что новый противотуберкулезный препарат диарилхинолин, известный как TMC207 (Bedaquiline), одобренный в 2013 году, был идентифицирован с помощью высокопроизводительного скрининга с использованием M. smegmatis [7]. Поэтому мы полагали, что скрининг редкой библиотеки небольших молекул, заархивированных на нашем объекте, выявит потенциальные соединения, интересные для разработки новых противотуберкулезных агентов.

M.smegmatis выращивали в идентичных условиях культивирования для различной партии скрининговых анализов и полной библиотеки соединений, скринированных в три раза. Для определения надежности экранов был рассчитан z-балл. Был рассчитан средний z-показатель по результатам скрининга для определения соединений, ингибирующих рост бактерий. Средний z-показатель первичных данных скрининга составляет 7,34, а стандартное отклонение — 21,47. Средний z-показатель для рифампицина и изониазида составил 4,4 и 4,9 соответственно. После получения стандартного отклонения и среднего значения, оценка z была рассчитана для всего набора данных. Для описания соединений в качестве антимикобактерий применяли минимальное обрезание составного г-показателя более 1,5 (минимальное ингибирование роста 50%) библиотечных соединений при 30 мкМ [12]. Используя эти критерии, было обнаружено 150 ударов против M. smegmatis от первичного скрининга (рис. 1). Первоначальный список первичных хищников M. smegmatis был сужен после применения ряда строгих фильтров в соответствии с благоприятными принципами отбора химикатов с лекарственным сходством. Основной каскад каскада первичного скрининга и удара представлен на рис. 2.

Используя обрезание z-score 1,5, 150 соединений были идентифицированы активами против микобактерий. Здесь показано распределение z-балла для основного экрана.

Малая молекулярная библиотека скрининга на антимикобактериальный потенциал, физико-химические свойства в соответствии с принципами лекарственной химии и цитотоксичность выявили потенциальные хит-леса.

Анализ данных скрининга малых молекул является важным компонентом трубопровода для обнаружения лекарств [26-28]. Инструменты Cheminformatics позволяют исследовать структурные сходства, физико-химические свойства и биодоступность хитов от первичного скрининга, прежде чем приступать к дальнейшим исследованиям в области обнаружения лекарств. Выполнена кластеризация малых молекул на основе показателей структурного сходства. Поражения, полученные при первичном скрининге, привели к образованию 6 основных кластерных семейств, 9 двухтонов (фиг. 3А и 3В) и оставшихся 109 однолетних (т.е. некластеризованных соединений, которые остаются одиночными). Существует несколько подходов к кластеризации малых молекул. Среди широко используемых методов широко используются структурные подходы с использованием классических дескрипторов, таких как химические отпечатки пальцев. Эти параметры кластеризации помогут в скачкообразной перестройке сравнить и определить приоритетность структурно связанных новых молекул свинца от случайных подходов к скринингу. Из наблюдаемой картины кластеризации ясно, что только незначительная часть ударов (23 молекулы) имеет структурное сходство, когда 109 соединений показаны как уникальные леса (рис. 3А и 3В). Поскольку кластеризация соединений на основе структуры является наилучшим подходом для определения структурных избыточности и анализа разнообразия, наш анализ ясно показывает, что первичные образы являются гетерогенными. Поэтому, чтобы не потерять никаких хороших лесов в трубопроводе обнаружения, мы рассмотрели все эти соединения для дальнейшего скрининга для выявления потенциальных молекул, активных против патогенных бактерий с минимальной токсичностью в клеточных моделях.

Все идентифицированные удаленные соединения были химически сгруппированы с использованием отпечатков пальцев. (A) Здесь показан основной кластер с пятью соединениями с максимальным до меньшего кластера с тремя соединениями и (B) удваивается.

В трубопроводе обнаружения лекарств многие из новых лекарств, таких как молекулы (хиты / пробы), часто выходят из строя на стадии расширенного обнаружения. Поэтому важно оценить «лекарственную привлекательность» и «свинцовость» потенциальных ударов, полученных в результате комплексного подхода к скринингу. Они также полезны для обогащения коллекции библиотек с полезными свойствами для оптимизации хитов для получения потенциальных / новых лекарств [29,30]. Правило Липински пять — это эмпирическое правило, чтобы определить лекарственное сходство химического соединения со свойствами, которые, вероятно, сделают его перорально активным лекарственным средством. Эти параметры были установлены на основании наблюдения, что большинство перорально вводимых препаратов являются малыми и умеренно липофильными молекулами [31]. В цепочке обнаружения лекарств кандидатские препараты, которые аутентифицируют эти правила, имеют тенденцию к меньшему количеству истощения для отказа в клинических испытаниях и, следовательно, имеют повышенный шанс выйти на рынок [31,32]. Поэтому, чтобы сузить список хитов от первичного скрининга, мы применили несколько строгих фильтров для получения потенциальных хитов для продвижения новых противотуберкулезных агентов.

В качестве первого фильтра правило Липински 5 применяется ко всем полученным ударам. 150 соединений фильтруют для разрешенной молекулярной массы (≥ 180 и ≤ 500 Да), aLogP (≤ 5), количества доноров водородной связи (≤ 5) и акцепторов (≤ 10). Из выбранных хитов 32 соединения не соответствовали установленным критериям молекулярной массы ≥ 180 и ≤ 500 Да, и они были исключены из вспомогательного анализа (рис. 4А). Увеличение молекулярной массы соединения может приводить к уменьшению растворимости и последующей биодоступности соединения [33]. Для оставшихся 121 соединений мы вычислили aLogP с использованием Cytoscape [34]. Это показатель растворимости с использованием коэффициента распределения, который определяет растворимость соединения в двух несмешивающихся фазах, то есть октаноле и воде. Из полученных значений было ясно, что все 115 соединений, кроме 6, попадают в диапазон с logP ≤5 (фиг. 4B), тем самым делая эти соединения наиболее вероятными растворимыми в водных растворах. Полученные 115 соединений затем подвергали дополнительному анализу для расчета доноров H-связи (сумма N-H и O-H) и акцепторов (сумма атомов N и O). Для расчета описанных параметров использовался инструмент онлайн-приложения ChemMine [35]. Для лекарственного сходства любой молекулы общее число доноров водородной связи, а также акцепторов является императивным химическим свойством. Увеличение числа водородных связей снижает разделение от водной фазы на липид-бислойную мембрану, влияя на ее проницаемость через клеточные мембраны [29]. Поэтому важно сохранить минимальное число доноров H-связи в NME для их наркотического сходства. Таким образом, значение отсечки для доноров H-связи было взято за ≤5, а значение отсечки ≤10 было принято для акцепторов H-связи. Как видно из графического представления (рис. 4C и 4D), 4 соединения не соответствовали заданным критериям срезанных значений. Следовательно, как было предложено правилом Липински 5, вместе взятые 111 соединений отвечали строгим критериям, которые следует рассматривать для дальнейшей проверки.

Фильтрация соединений на основе принципа Липински с пятью лекарственными способностями (A) Обрыв среза, (B) alogP (C) Доноры водородной связи и (D) Акцепторы водородной связи.

Чтобы улучшить предсказания сходства наркотиков, правила Липинского были уточнены [36], включая вращающиеся связи и полярную площадь поверхности (ПСА). PSA представляет собой сумму полярных атомов, которая определяет проницаемость лекарств. Сообщалось, что ПСА и количество вращающихся связей оказались ценными параметрами для выделения орально активных соединений из большого набора соединений [37]. В частности, предполагается, что соединения с ≤10 вращающимися связями и PSA ≤140 Å2 имеют хорошую биодоступность [37]. Молекулы свинцового лекарственного средства с пределом отсечения PSA ≤140Å2 имеют тенденцию быть более проницаемыми через клеточные мембраны. Однако для проницаемости молекул через гематоэнцефалический барьер ПСА должен быть ≤90Å2 [38]. Чтобы исключить любые химические вещества, которые не показывают хорошую расчетную проницаемость, ПСА рассчитывали для кратковременных химических веществ, применяющих ChemMine. Исходя из допустимых значений ПСА и вращающихся связей, 8 соединений, которые не показали хороших расчетных свойств проницаемости, были уволены. Таким образом, набор из 103 соединений был выбран для дальнейших биоанализов (фиг. 5).

Список идентифицированных удаленных соединений был отфильтрован на основе правил Veber (A) PSA и (B) Число вращающихся облигаций.

Вышеуказанные критерии отбора идентифицировали 103 соединения с физико-химическими свойствами лекарственной молекулы. Таким образом, эти соединения подвергали скринингу цитотоксичности против выбранной клеточной линии A549 (клетки эпителиального рака легкого) и HEPG2 (гепатоцеллюлярная карцинома печени). Из результатов жизнеспособности клеток, использующих оба типа клеток, ясно, что 40 соединений показали показатель селективности> 50 к антимикобактериальной активности, чем цитотоксичность. Поскольку существует дискуссия о суррогатных штаммах микобактерий, наиболее подходящих для скрининга новых составных библиотек, 40 ударов, отфильтрованных от первичного скрининга, были скринированы против M.bovis (BCG) перед тестированием против H37Rv. Сообщалось, что БЦЖ является более чувствительной моделью для скрининга библиотек малых молекул, которые могут быть активными против M. tuberculosis [7,13-15]. Из вторичного скрининга 35 соединений показали сильные значения MIC <25 мкМ. Очевидно, что 78% соединений, идентифицированных на экране M. smegmatis, показали активность против M. bovis. Однако активные соединения, идентифицированные на предыдущих экранах, должны проявлять активность против M. tuberculosis, чтобы получить каталогизацию в качестве новых соединений, обладающих противотуберкулезным потенциалом. Таким образом, значения MIC для результирующих 35 соединений, идентифицированных на текущем экране, были определены против H37Rv в установке BSL3. Полученные значения MIC подтверждают, что 28 соединений показали MIC в диапазоне от> 12,5 мкм до 25 мкм, тогда как 12 соединений показали значения MIC в диапазоне от 0,4 до 12,5 мкм против H37Rv (таблица 1). Эти 12 соединений были включены в короткий список для дальнейшего анализа.

Рифампицин и изониазид были взяты за контроль. Величины MIC для контролей против M. smegmatis составляют Rif-2.43 ± 0.02μM и Inh-11.03 ± 0.05 мкМ и H37Rv — Rif-0,08 ± 0,01 мкМ и Inh-0,22 ± 0,3 мкМ.

После того, как хиты будут идентифицированы на ранней стадии обнаружения, когда сложные библиотеки были отобраны в режиме HTS, необходимо систематически пересматривать систему генерации свинца. Соединения свинца могут подвергаться дальнейшим шагам оптимизации для оптимизации свинца. Во-первых, мы оценили химическую аменабельность 12 ударов с помощью химиков для определения возможности повторного синтеза этих соединений в безаварийных химических путях. Интересно, что контролируемый анализ хитовых соединений на основе их химических особенностей показал, что они не очень тесно связаны друг с другом (данные не показаны). Значения MIC для отдельных соединений также не показывают никакой положительной корреляции, возможно, из-за разнообразия химической природы идентифицированных соединений. Этот факт также вдохновил нас на то, что это наблюдение наглядно доказывает, что библиотека соединений, архивированных, разнообразна и не так много подобных соединений присутствуют в любой идентифицированной группе. Если бы они присутствовали, то они имели бы сопоставимую активность на биологических экранах. С другой стороны, из-за разнообразного характера трудно сделать SAR, так как сходства найти нелегко. Из 12 HIT два соединения были мочевинами (H15 и H94), а три были пиримидинонами (H137, H26 и H27). Все остальные были очень разнообразны, чтобы развить любую корреляцию. Вероятно, все они действуют по разному способу действия, направленному на различные биологические пути для наблюдаемой противотуберкулезной активности. Это упражнение помогло выявить новые строительные леса, которые могут служить основой для разработки новых препаратов против туберкулеза.

Кроме того, чтобы не игнорировать периодические изменения партии с биологической активностью соединений, хитовые соединения были синтезированы с использованием классического синтеза органической химии (Методология повторного синтеза будет сообщена в другом месте). Новая партия соединений была протестирована непосредственно на штамме M. tb H37Rv для определения их антимикобактериального потенциала. Как показано в таблице 1, соединения показали, что значения MIC сравнимы с MIC, определенными при первом скрининге. В совокупности серия фильтров, систематически применяемых к данным, полученным в результате первичного скрининга, привела нас к выявлению новых лесов с антимикобактериальными свойствами и обеспечивает путь для фазы оптимизации свинца для противотуберкулезных препаратов.

После идентификации потенциальных противотуберкулезных соединений от скрининга крупных и химически разнообразных библиотек важно подтвердить бактерицидную активность лучших кандидатов, чтобы оценить, могут ли выбранные молекулы или леса создавать новые противомикробные агенты в будущем. Тест MBC позволяет определить, проявляют ли противомикробные агенты бактерицидное или бактериостатическое действие на рост определенного микроорганизма [20]. MBC представляет собой концентрацию антимикробного агента, при которой 99,99% бактерий убивают тестируемыми агентами [39]. Чтобы лучше понять эффективность соединения, учитываются значения MIC и MBC [21]. На основании сравнения MIC и MBC соединения классифицируются как Bactericidal или Bacteriostatic. Определения «бактериостатические» и «бактерицидные» кажутся простыми: «бактериостатический» означает, что агент предотвращает рост бактерий (останавливает их в стационарной фазе роста), а «бактерицидный» означает, что он убивает бактерии [40]. Когда значения MIC и MBC соединения эквивалентны, соединение считается бактериоцидным [21]. Существенное различие в значениях MIC и MBC соединения свидетельствует о том, что соединение является бактериостатическим, причем значение MBC значительно выше, чем значение MIC [41].

В настоящем исследовании тест MBC на 12 соединений химии (таблица 1) выполняли, как описано ранее, против тестируемых организмов, выбранных в текущем исследовании. Из результатов анализа видно, что соединения H26 и H136 показывают значения MBC, эквивалентные их значениям MIC, где, когда другие соединения имеют значительно более высокий MBC, чем их значения MIC, ингибирующие рост бактерий. Следовательно, H26 и H136 проявляют бактерицидную активность против тестируемых микроорганизмов. В результате H26 и H136, демонстрирующие бактерицидную активность с мощными значениями MIC (0,4 и 1,6 мкМ соответственно) с хорошей селективностью по сравнению с цитотоксичностью, дают основание для химического развития новых противотуберкулезных агентов. Ранее сообщалось, что, когда значение MBC выше, чем значение MIC, соединение не проявляет бактерицидную активность, справедливо выступает в качестве бактериостатического остановки бактериального роста в стационарной фазе [42]. Антибиотики, такие как котримоксазол, сульфонамидный антибиотик, который показал значения MIC и MBC как 31,2 мкг / мл и 125 мкг / мл соответственно, были классифицированы как бактериостатический антибиотик [41]. Аналогичным образом, в настоящем исследовании 10 из отобранных соединений показали сходные различия в значениях MBC и MIC. Таким образом, наблюдаемые значения MBC для остальных 10 соединений предполагают, что они являются бактериостатическими (таблица 2). В настоящее время многие бактериостатические ингибиторы используются для эффективного лечения инфекций [43]. Показано, что линезолид является антибиотиком, классифицированным как бактериостатическое, демонстрирующим многообещающую противотуберкулезную активность [43,44]. Кроме того, среди противотуберкулезных препаратов, таких как этамбутол, бактериостатический, где изониазид и пиразинамид являются бактерицидами для быстрого деления бактерий и бактериостатиков на медленно делящиеся бактерии [45,46]. В текущем исследовании, несмотря на то, что хиты с бактериостатическим потенциалом, показывающие ВПК от 6,25 до 12,5 мкМ, они дают отправные точки химии для дальнейшего развития этих лесов для новых противотуберкулезных агентов.

Доксорубицин принимался за контроль. TI обозначает терапевтический индекс, рассчитанный по значению IC50 / GI50 против H37Rv.

Выявленные 12 химически разнообразных ударов можно разделить на 10 лесов, как показано на рис. 6. Хит H15 представляет собой производное 2-метоксидибензофурана и химически приемлемо, обеспечивая широкие возможности для дальнейших химических манипуляций для выявления более сильных аналогов. На основе триптамина хиты H26, H27 и H136 являются близкими аналогами Phaitanthrin A, который был выделен из Phailusmismensis [47]. Также следует отметить, что соединение H26 показало IC50 более 50 мкМ против MCF-7, NCI-H460, SF-264, характеризующих его хороший показатель селективности при уничтожении бактерий [47]. В нашей руке MIC для H26 против H37Rv составляет 0,4 мкМ с меньшей цитотоксичностью против клеток A549 и HepG2 (таблица 2). Следует отметить, что все аналоги триптантрорина показали ингибирование M. tb, указывающее на устойчивость триптантриновых лесов как противотуберкулезного агента и прокладывающие путь для дальнейших химических модификаций. H43 имеет оксадиазольный каркас, в то время как тиадиазол, его близкий эшафот, как сообщается, проявляет противогрибковую активность [48]. H85 представляет собой производное тиазолкарбоксамида. H94 представляет собой замещенный фенил-1,2,4-тиадиазолилмочевинный каркас. Сообщалось, что некоторые тиадиазолы обладают антибактериальной активностью против устойчивых к метицилину стафилококтов (MRSA) и P. auregenosa [49]. Эта справочная информация поддерживает возможность дальнейшего изучения этого леса для противотуберкулезной активности. H117 относится к классу бензотиазола и является единственным фрагментом в идентифицированных хитах. Этот фрагмент имеет потенциал для дальнейших исследований с использованием подхода обнаружения наркотиков на основе фрагментов. H126 имеет триазолопиримидиновый каркас и имеет восемь акцепторов водородной связи и один донор водородной связи. У эшафота больше гибкости, так как он имеет пять вращающихся связей. Эти физико-химические свойства должны позволить создавать лучшие аналоги серии. H127 представляет собой конденсированный тиазолотриазол, тогда как H134 имеет 1,2,4-бензотриазиновый каркас. H137 представляет собой 1,3-дизамещенный хиназолин-2,4 (1H, 3H) -дионный каркас и ранее не изучался для противотуберкулезной активности. Немногие антитуберкулезные молекулы находятся в различных клинических испытаниях. TBA-354 (нитроимидазол) находится в клинических испытаниях фазы I, тогда как AZD5847 (оксазолидинон) и сутезолид (оксазолидинон) находятся в клиническом исследовании фазы IIa. Delamanid (нитроимидазол), Pretomanid (нитроимидазол) и Bedaquiline (диарилхинолин) находятся в фазе II клинических исследований. Отобранные леса из нашего исследования химически отличаются по сравнению с вышеуказанными молекулами / каркасами, которые находятся в различных клинических исследованиях, указывающих на потенциал этих молекул для дальнейшей модификации для идентификации новых противотуберкулезных агентов.

В заключение, из нашего фенотипического скрининга с последующей фильтрацией хитов на основе свойств для подобных лекарственным средствам мы идентифицировали 103 соединения из библиотеки небольших молекул, состоящей из химически разнообразных соединений. Всего было идентифицировано 12 соединений на основе значений отсечки MIC <12,5 мкМ против H37Rv и TI> 50. Кроме того, подтвержденные хиты ранжируются на основе химического разнообразия лесов и ударяют экспансию вокруг выявленных лесов в нашей лаборатории. Мы надеемся на то, что в результате этого расширения появятся новые соединения, имеющие хорошее лекарственное сходство с M. tuberculosis и позволяющие нам разрабатывать новые идеи для вступления в доклинические разработки лекарств.

Мы благодарим доктора Гиту Вани Раайасама и доктора Бема Рао Угаркара за полезные обсуждения. Мы благодарим д-ра С. Чандрасекара, директора CSIR-IICT и National Mol Bank за доступ к сложной библиотеке.

Национальный МолБанк

Микобактерий туберкулез

Новые молекулярные сущности

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *