Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Анализ GeneXpert MTB / RIF для диагностики туберкулезного лимфаденита на концентрированных точных иглообразных аспиратах при высоких нагрузках на туберкулез

GeneXpert MTB/RIF Assay for the Diagnosis of Tuberculous Lymphadenitis on Concentrated Fine Needle Aspirates in High Tuberculosis Burden Settings
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4569183/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: М. Т. К. Абдисса. Провели эксперименты: М. Т. Д. А. Абделье А. Б. МБ. Проанализированы данные: MT GA. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: GA KA. Написал статью: MT LA BJ LR.

Диагноз туберкулезного лимфаденита (ТБЛ) остается сложным. Обычно используемые методы (цитология и микроскопия мазка) имеют субоптимальную чувствительность. Недавно ВОЗ рекомендует использовать GeneXpert в качестве первоначального диагностического теста у пациентов, подозреваемых в наличии внелегочного туберкулеза (EPTB). Тем не менее, это была условная рекомендация из-за очень низкого качества доказательств, и необходимы дополнительные исследования. В этом исследовании мы оценили эффективность Xpert для диагностики TBL на концентрированных тонких иглах (FNA) в Юго-Западной Эфиопии.

FNA собирали из предполагаемых случаев TBL. Два мазка готовили из каждого аспирата и обрабатывали для цитологии и обычной микроскопии. Оставшийся аспират обрабатывали N-ацетил-L-цистеин-NaOH и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 g. Концентрированный осадок использовали для культивирования и теста Xpert. Тест Capilia TB-Neo использовался для дифференциации комплекса M. tuberculosis (MTBC) от некуберкулезных микобактерий (NTM). В качестве эталонного стандарта были рассмотрены композиционные бактериологические методы (культура и / или мазка микроскопии).

Из 143 зарегистрированных подозреваемых 64,3% (92/143) были подтверждены TBL-случаями по составному эталонному стандарту (CRS). Xpert обнаружил M. tuberculosis complex (MTBC) в 60,1% (86/143) презумптивных случаев TBL. Чувствительность Xpert по сравнению с CRS составила 87,8% [95% ДИ: 81,0-94,5] и специфичность 91,1% [95% ДИ: 82,8-99,4]. Чувствительность составила 27,8% для микроскопии мазка и 80% для цитологии по сравнению с CRS. Цитология показала самую низкую специфичность (57,8%). Xpert был положительным в 4 из 45 случаев, связанных с культурой и мазком. Среди 47 цитоморфологически не-TBL-случаев 15 были положительными на Xpert. Более половины Xpert-положительных случаев находились в диапазоне очень низких пороговых значений отсечки (28

Тест Xpert показал высокую чувствительность и специфичность для диагностики TBL на образцах концентрированной FNA. Кроме того, Xpert предлагал быстрое обнаружение резистентных к рифампицину штаммов M. tuberculosis из аспирата лимфатических узлов.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Туберкулез (ТБ) остается одной из основных проблем общественного здравоохранения в Эфиопии. Эфиопия занимает восьмое место в списке 22 стран с тяжелым бременем туберкулеза и 3-е место по количеству внелегочного туберкулеза (EPTB); из которых 80% локализованы в лимфатических узлах [1,2]. Точный диагноз и раннее лечение ТБ могут снизить заболеваемость и смертность, связанные с лимфаденитом ТБ (TBL). Однако дифференциальная диагностика TBL является широкой и лабораторное подтверждение имеет первостепенное значение для руководства соответствующей терапией [3,4].

Цитология и обычная микроскопия мазка были использованы в качестве исходных диагностических инструментов для TBL в условиях плохого использования ресурсов [4,5]. Тонкая иглоукалывающая цитология — это простой и быстрый метод диагностики, но с низкой специфичностью из-за наличия подобных цитологических показателей при поражениях, отличных от тех, которые связаны с ТБ [6,7]. Обычная микроскопия мазка испытывает недостаток в чувствительности из-за paucibacillary природы тонких игл аспирата (FNA) [8]. Микобактериологическая культура и тестирование на чувствительность к лекарственным средствам не всегда доступны в условиях плохой работы, таких как Эфиопия [1,9]. В соответствии с этими ограничениями необходимы более быстрые и надежные методы. В декабре 2010 года ВОЗ одобрила GeneXpert MTB / RIF® (Цефеид, США) для использования в лабораториях ТБ. Анализ Xpert состоит из замкнутой системы, основанной на полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР). Он может использоваться операторами с минимальными техническими знаниями, позволяющими диагностировать ТБ и одновременное обнаружение резистентности к рифампицину в течение 2 часов [10].

Анализ Xpert был проверен и оптимизирован для образцов мокроты для диагностики ВИЧ-ассоциированного туберкулеза и туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью. ВОЗ настоятельно рекомендует широко использовать Xpert для этих групп пациентов [11,12]. Совсем недавно был проведен ряд исследований для оценки этого анализа с использованием невоспалительных клинических образцов у пациентов, подозреваемых в наличии EPTB [9,13,14]. В 2014 году ВОЗ рекомендовала Xpert по сравнению с обычными испытаниями (включая обычную микроскопию, культуру или гистопатологию) для тестирования конкретных невоспалительных образцов (лимфатических узлов и других тканей) у пациентов, подозреваемых в наличии EPTB [15]. Однако это была условная рекомендация из-за очень низкого качества имеющихся доказательств. Поэтому необходимы дополнительные исследования, особенно в условиях высокой распространенности EPTB. Таким образом, мы оценили эффективность Xpert для диагностики TBL с использованием регулярно собранных образцов FNA и сравнили его с цитологией, микроскопией мазка и культурой.

Этический клиренс был впервые получен от этического совета директоров Джиммы. Письмо с разрешения на проведение исследования было получено в офисе клинического директора Института специализированной клинической больницы Джиммы. Все пациенты или опекуны в случае детей были запрошены за письменное согласие до поступления в исследование. Любая информация о пациентах оставалась конфиденциальной. Результаты лабораторных исследований были возвращены врачам для начала лечения или принятия решения как можно раньше.

Это исследование было проведено в специализированной больнице Университета Джимма, государственной больнице третичной помощи, на юго-западе Эфиопии. В этом исследовании было зарегистрировано 143 последовательных амбулаторных больных, клинически подозреваемых в TBL и упомянутых клиницистами для тестирования на туберкулез. Демографическая и клиническая информация участников была собрана с использованием опробованного опросного листа. Образец FNA, по меньшей мере 1 мл, был собран патологом в диагностической группе патологии. Во время сбора образцов был зарегистрирован внешний вид образца (казеозный, гнойный и / или окрашенный в кровь). Первые несколько капель аспирата использовались для цитоморфологического диагноза. Высушенные на воздухе мазки окрашивали пятно Райта и осматривали патологоанатом. Цитологические критерии для диагностики TBL основаны на наличии следующих цитоморфологических проявлений: агрегата эпителиоидных клеток с или без гигантских клеток Лангерганса и некроза, агрегата эпителиоидных клеток без некроза, некроза без агрегата эпителиоидных клеток или полиморфонуклеоцитов с некрозом [16]. Лечение туберкулеза было начато на основе цитоморфологического диагноза.

Оставшийся образец обрабатывали для микроскопии мазков, культуры и Xpert в Исследовательском центре микобактериологии в Университете Джимма. Две капли из каждого образца использовали для нанесения мазков для стандартного окрашивания Ziehl-Neelsen (ZN). Окрашенные мазки анализировали на присутствие AFB под масляным погружением (100x) с использованием светового микроскопа. Все положительные слайды AFB были оценены на основе шкалы IUATLD [17].

Микобактериальную культуру проводили на среде Löwenstein-Jensen (LJ) в течение 2 дней после сбора образцов. Все образцы FNA обрабатывали стандартным методом N-ацетил-L-цистеина и гидроксида натрия (NALC / NaOH) с конечной концентрацией NaOH 1% [17]. К образцу добавляли равный объем стандартного раствора NALC-NALC / NaOH и инкубировали в течение 15 минут. После нейтрализации забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) и центрифугированием (15 минут при 3000 g) осадок повторно суспендировали в 1 мл стерильного PBS. Наконец, 200 мкл осадка использовали для инокуляции на двух наклонах LJ. В качестве положительного контроля использовали лабораторный штамм M. tuberculosis H37Rv (АТСС 27294). Случайные уклоны среды LJ инокулировали стерильной дистиллированной водой в каждом прогоне в качестве отрицательного контроля. Культурные положительные результаты были подтверждены для MTBC по тесту Capilia TB-Neo (TAUNS, Izunokuni, Япония).

Из-за задержки в транспортировке картриджей Xpert оставшиеся осадки хранили при -20 ° C. Задержка медианной (IQR) до тестирования Xpert составляла 41 (30-45) дней. Испытание Xpert проводилось с использованием замороженного и оттаиваемого осадка, как описано ранее [18]. Образец реагента (1,5 мл), поставляемого с тестом, добавляли в соотношении 3: 1 к осадку образца (0,5 мл). Смесь встряхивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Два мл смеси образцов реагентов затем переносили в картридж Xpert с использованием пастеровой пипетки, и картридж загружали на машину Xpert (Cepheid, Dx System версии 4.0c). Результаты были сообщены как положительные или отрицательные для M. tuberculosis, включая полуколичественный масштаб, основанный на значении количественного порога цикла (Ct) для зонда A. Результаты резистентности к рифампицину были зарегистрированы как восприимчивые, устойчивые или неопределенные.

Данные были дважды введены и проанализированы с использованием программного пакета SPSS (версия 16). Чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные предсказательные значения с их соответствующими 95% ДИ были рассчитаны с использованием композиционных бактериологических методов (культура для M. tuberculosis на среде LJ и / или мазка микроскопии с использованием метода ZN) в качестве эталонного стандарта. Отчетность и анализ исследований соответствовали стандартам для отчета о контрольном списке исследований точности (STARD), который прилагается в качестве файла дополнительной информации (таблица S1).

В период с мая по сентябрь 2013 года было зарегистрировано 143 пациента с клиническим презумптивным туберкулезом с лимфаденопатией. Из них 18,9% (27/143) были положительными для TBL при микроскопии мазка, 60,1% (86/143) на Xpert и 61,5 % (88/143) по культуре. При цитологическом исследовании 67,1% (96/143) имели цитоморфологические признаки, указывающие на TBL. В целом, 64,3% (92/143) испытуемых случаев были положительными для TBL с помощью микроскопии культуры и / или мазков (23 мазков / культуральных положительных, 65 положительных на культуру / отрицательных мазков, 3 положительных на наличие мазков / отрицательных культур и 1 мазок-положительный / зараженный культурой) (рис. 1). Результат Xpert недействителен для 1,4% (2/143) проведенных тестов. Показатели демографических и лимфатических узлов пациентов показаны в таблице 1.

TBL = туберкулезный лимфаденит, FNA = тонкая игла аспирации, + = положительная, — = отрицательная.

Микроскопия мазка обнаружила AFB в 26% (23/88) культурально-положительных и 6% (3/49) случаев, отрицательных к культуре. Из пяти загрязненных образцов культуры, одна была положительной на микроскопию мазка. Культура была положительной в 74% (71/96) случаев с наводящей цитоморфологией туберкулезом и 36,2% (17/47) случаев, не вызывающих TBL. По сравнению с CRS микроскопия мазка имела чувствительность 27,8% и 100% специфичность, тогда как цитология показала чувствительность 80,0% и специфичность 57,8%. Xpert был положительным для M. tuberculosis в 86,4% (76/88) культурально-положительных и 14,3% (7/49) культурально-негативных случаев. M. tuberculosis ДНК была обнаружена Xpert в 3 из 5 образцов с зараженными культурами (рис. 1). Только один изолят был идентифицирован как NTM с помощью теста Capilia, а результат Xpert был отрицательным. Изоляты MTBC, устойчивые к рифампицину, были идентифицированы в 4,7% (4/86) Xpert положительных случаев. Статус резистентности к рифампицину для одного положительного образца MTBC (очень низкий класс) был неопределенным.

Xpert показал общую чувствительность 87,8% и специфичность 91%. Xpert дала положительный результат в 56 из 65 случаев с отрицательным мазком / культурой. Только два образца, которые были зарегистрированы как «скудные AFB» в мазке микроскопии, были отрицательными Xpert. Когда положительные результаты культивирования стратифицируются результатами мазка AFB, чувствительность Xpert составляла 91% (20/22) при положительном мазке и 86,2% (56/65) в случаях с отрицательным мазком. Резюме диагностической точности цитологии и теста Xpert по сравнению с CRS представлено в таблице 2.

PPV = положительное прогностическое значение, NPV = отрицательное прогностическое значение, CI = доверительный интервал, LR + = коэффициент правдоподобия положительный, LR- = отношение правдоподобия отрицательное. Контрольным стандартом была культура для M. tuberculosis и / или мазка микроскопии для кислой быстрой бациллы (AFB).

Тест Xpert присваивает полуколичественный сорт (очень низкий, низкий, средний и высокий) на основе значения Ct для каждого теста, положительного для M. tuberculosis, и эти категории, по-видимому, предсказывают бактериальную нагрузку [19]. Среди 86 положительных образцов Xpert 53,5% (46/86) были очень низкими (28

AFB = кислотоустойчивые бациллы; Ct = порог цикла

Цитоморфологические признаки, соответствующие туберкулезу, наблюдались у 67% (96/143) пациентов с лимфаденитом. Другими диагнозами, данными о цитологии, были хроническое воспаление в 11,2% (16/143), гнойный абсцесс у 10,5% (15/143), реактивный лимфаденит у 7,7% (11/143) и злокачественность в 3,5% (5/143). Xpert обнаружил M. tuberculosis у 74% (71/96) случаев с вызывающей цитоморфологией туберкулеза. Кроме того, Xpert также был положительным в 15 случаях с отрицательной цитологией: 10 из гнойных абсцессов. Во всех этих последних случаях TBL подтверждается CRS (таблица 4).

TBL = туберкулезный лимфаденит, FNA = аспират с тонкой иглой, CRS = составной эталонный стандарт, ZN = Ziehl-Neelsen.

Общий аспират лимфатических узлов был описан как гнойный у 51% (73/143), казеозный в 40,6% (58/143) и крови, окрашенных в 8,4% (12/143) случаев. Показатель положительности Хпперта был самым высоким в аспиратах с казеозным появлением (69% (40/58)), и самый низкий в крови окрашенных аспиратов (41,7% (5/12)), хотя эти различия статистически не значимы (табл. 4).

ВОЗ и Эфиопское национальное руководство по внедрению GeneXpert настоятельно рекомендуют использовать Xpert для первоначального диагноза лиц, подозреваемых в туберкулезе с МЛУ-ТБ или ВИЧ [12]. Основываясь на данных очень низкого качества, ВОЗ также условно рекомендует использовать Xpert вместо традиционных методов в качестве первоначального диагностического теста у пациентов, подозреваемых в наличии EPTB [12,15]. В Юго-Западной Эфиопии, где ТБ и МЛУ-ТБ широко распространены, эффективность Xpert для диагностики TBL и / или обнаружения лекарственной устойчивости не была окончательно продемонстрирована.

В настоящем исследовании чувствительность Xpert составляла 87,8%. Систематический обзор и метаанализы, проведенные Denkinger et al, показали, что тест Xpert имеет чувствительность в пределах от 50% до 100% с объединенной чувствительностью 83% [20]. Недавно Пенз и др. Проанализировали 36 исследований в своих метаанализах и подтвержденная чувствительность Xpert на 87%, что аналогично нашему исследованию [21]. Однако чувствительность Xpert в текущем исследовании ниже, чем в аналогичном исследовании Ligthelm et al (чувствительность, 96,7%) [22]. Было 11 положительных к культуре случаев, которые были отрицательными на Xpert. Причина ложноотрицательных результатов теста Xpert может быть вызвана ограниченным количеством бацилл в образце FNA или длительным хранением (средняя (IQR) задержка 41 (30-45) дней) образца перед тестированием Xpert.

Было установлено, что специфичность (91%) Xpert в текущем исследовании согласуется с предыдущими исследованиями, полученными другими (специфичность, 89-99%) [20,21,22], но выше, чем исследование, проведенное Biadigilegn et al. (специфичность, 69,2%) [13]. Семь отрицательных по культуре случаев были Xpert-положительными. Пять из них были положительными для TBL по цитологии и 3 — для микроскопии мазков, что свидетельствует о наличии нежизнеспособных бактерий из-за сурового процесса дезактивации или характера казеозного поражения в ткани лимфатического узла, который, возможно, содержал мертвые туберкулезные бациллы. Такие случаи (Xpert-положительные, но отрицательные по отношению к культуре), вероятно, будут истинными положительными результатами туберкулеза, подтвержденными высокой специфичностью [14,18], и тем, что эта процедура менее подвержена загрязнению из-за замкнутой реакционной камеры (реал- временная технология ПЦР) Xpert.

Несмотря на то, что обычная микроскопия ZN сыграла важную роль в диагностике TBL в условиях плохой ресурса, Xpert обнаружил MTB в 86% случаев (56/65) случаев, пропущенных мазкой микроскопии. Только 2 образца с положительным мазком и культурой положительно отрицательны Xpert. В соответствии с другими исследованиями [9,18,22], Xpert обладает более высокой чувствительностью, чем микроскопия мазка. Не было мало различий в чувствительности Xpert в случаях положительного и отрицательного мазка TBL. Xpert обнаружил значительную долю негативных и культурально-положительных случаев с мазком и значительно увеличил относительную долю диагностированных случаев TBL.

В развивающихся странах мазка микроскопии является единственным широко применяемым методом количественной оценки бактериальной нагрузки во время первоначальной диагностики [23]. Xpert дает полуколичественное измерение количества бацилл MTBC, присутствующих в клиническом образце. В этом исследовании более 90% Xpert-положительных образцов были оценены как «низкие» и «очень низкие», что указывает на ограниченное количество бацилл в образце FNA.

Цитология FNA как недорогой и надежный инструмент для TBL была изучена рядом исследователей [4,24,25]. Это один из наиболее часто используемых методов в условиях плохого использования ресурсов. В текущем исследовании чувствительность цитологии была сопоставима с чувствительностью Xpert, но специфичность была ниже (57,8%), что давало много ложных срабатываний. Это может быть связано с неспецифическими цитоморфологическими особенностями, наблюдаемыми в цитологии. С другой стороны, цитоморфологические признаки, связанные с гнойным абсцессом, достоверно не исключали TBL в нашем исследовании, что можно объяснить отсутствием характерных признаков, таких как рассеянные эпителиоидные клетки среди полиморфной популяции лимфоидных клеток. Действительно, наши результаты показывают, что » гнойные функции следует рассматривать как наводящие на размышления о ТБ как причину развития лимфаденита.

Насколько нам известно, информация о структуре лекарственной устойчивости микобактериальных штаммов, выделенных из пациентов с TBL в Юго-Западной Эфиопии, отсутствует. Тест Xpert предлагает быстрое обнаружение штаммов MTBC, устойчивых к рифампицину, непосредственно из клинического образца, что является важным преимуществом по сравнению с цитологией и мазкой микроскопии. Предыдущие исследования сообщили о 98-100% -ном согласии в выявлении штаммов резистентности к рифампицину с использованием теста Xpert и теста на чувствительность к фенотипическим препаратам [13,14,18,26]. В текущем исследовании устойчивость к рифампицину была идентифицирована в 4,7% (4/86) Xpert-положительных случаях. Два из них — случаи повторного лечения.

У нашего исследования есть некоторые ограничения. Микобактериальную культуру на среде LJ и / или мазковую микроскопию использовали в качестве эталонного стандарта, хотя оба этих метода недостаточны для обнаружения всех случаев TBL. Среди случаев, связанных с культурой и / или мазками, могут быть ложные негативы, которые начали лечение от туберкулеза по клиническим причинам и улучшили случаи, которые, скорее всего, были истинными ТБ. К сожалению, мы не включили клинические результаты в наш набор данных. Таким образом, необходимы дальнейшие проспективные исследования для оценки эффективности Xpert на необработанных образцах свежей FNA с использованием более чувствительной жидкой культуры и / или гистологии в качестве эталонного стандарта или путем добавления клинического диагноза (с ответом на лечение) к стандартам. Более того, хотя мы идентифицировали только один НТМ в культуре, мы не указали его, и наше исследование неспособно задуматься о вкладе в Эфиопию НТМ, которые, как известно, вызывают лимфаденит, такие как M. scrofulaceum, M. avium complex и M. kansasii.

В заключение наши результаты показывают, что тест Xpert MTB / RIF является полезным инструментом для обнаружения MTBC с высокой чувствительностью и специфичностью на концентрированном тонком иглах с превосходной производительностью по сравнению с цитологией и мазкой микроскопии. Помимо улучшенной чувствительности, Xpert смог идентифицировать пациентов с TBL из-за резистентного к рифампицину туберкулеза. Тест Xpert — это простой и подходящий метод для использования в эндемических условиях туберкулеза, и его реализация может значительно улучшить быструю диагностику TBL.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

(DOCX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарны всем учащимся, участвовавшим в этом исследовании.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *