Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Иммуноцитохимическое обнаружение специфического антигена Mycobacterium Tuberculosiscomplex, MPT64, улучшает диагностику туберкулезного лимфаденита и туберкулезного плеврита

Immunocytochemical detection of Mycobacterium Tuberculosiscomplex specific antigen, MPT64, improves diagnosis of tuberculous lymphadenitis and tuberculous pleuritis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4262190/

Быстрая, чувствительная и точная лабораторная диагностика имеет первостепенное значение в случаях подозрения на внелегочный туберкулез (EPTB). Однако традиционные методы обнаружения кислотоустойчивых бацилл имеют ограничения. Целью исследования было оценить диагностическую ценность иммуноцитохимического окрашивания для выявления специфического антигена комплекса Mycobacterium tuberculosis, MPT64, в аспиратах от плевральных выпотов и лимфатических узлов, наиболее распространенных представлений EPTB.

Исследование в поперечном разрезе было проведено путем включения пациентов в специализированную больницу Тикура Анбесса и медицинских медицинских услуг United Vision с декабря 2011 года по июнь 2012 года. У пациентов с аспирацией и образцами плевральной жидкости были собраны и проанализированы из 51 случая (26 туберкулезных (туберкулез) ) плеврита и 25 ТБ лимфаденита) и 67 не-TB контроля. Каждый образец подвергали окрашиванию Ziehl-Neelsen (ZN), культуре на среде Lowenstein-Jensen (LJ), цитологическому исследованию, полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием последовательности IS1081gene в качестве праймера и иммуноцитохимии (ICC) с поликлональным антителом против MPT64. Все пациенты были подвергнуты скринингу на ВИЧ.

ICC был положительным в 38 из 51 случая, а в 7 из 67 контролей, дающих общую чувствительность и специфичность 74,5% и 89,5% соответственно. Используя IS1081-PCR в качестве эталонного метода, чувствительность и специфичность, положительная и отрицательная прогностическая ценность ICC составили 88,1%, 89,5%, 82,2% и 93,2% соответственно. Показатель выявления случаев заболевания увеличился с 13,7% по сравнению с ZN до 19,6% по культуре ЖЖ, до 66,7% по цитологии и 74,5% по МТП.

Иммуноцитохимия с анти-MPT64-антигеном улучшала выявление ТБ в плевральном выпоте и аспиратах лимфатических узлов. Дальнейшие исследования с использованием моноклональных антител на образцах из других сайтов EPTB рекомендуются для проверки этого относительно простого диагностического метода для EPTB.

Онлайн-версия этой статьи (doi: 10.1186 / s12879-014-0585-1) содержит дополнительный материал, доступный для авторизованных пользователей.

Туберкулез (ТБ) является важной проблемой общественного здравоохранения в Эфиопии. Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2011 год, оценочная распространенность случаев ТБ в Эфиопии в 2010 году составила 394 на 100 000 человек, а Эфиопия занимает восьмое место среди 22 стран с высоким уровнем туберкулеза [1].

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) обладает способностью колонизировать почти любое место в организме и может влиять на органы, отличные от легких, такие как; плевры, лимфатических узлов, брюшной полости, мочеполового тракта, кожи, суставов, костей и менингов [2], [3].

В соответствии с программой борьбы с туберкулезом и проказами в Эфиопии в 2010-2011 годах туберкулез легких составляет 67,5%, а внелегочный туберкулез (ЕРТБ) — 32,5% от всех новых случаев ТБ [4]. Наиболее распространенным типом EPTB является туберкулезный лимфаденит (TBLN) [5], [6] с туберкулезным плевритом (TBP), являющимся вторым наиболее частым внелегочным проявлением [7], [8]. Несмотря на эти высокие показатели, диагноз EPTB остается проблемой как для клиницистов, так и для микробиологов [9], [10], поскольку заболевание представлено по-разному, а недостаток диагностических ресурсов в развивающихся странах добавляет к этой проблеме. Диагностика EPTB затруднена из-за его paucibacillary природы и нерегулярного распределения бацилл, которые имеют тенденцию к скоплению вместе, что приводит к очень низкой чувствительности к обычным мазкам и культуре обычных бактерий с быстрой бациллой (AFB) [11], [12].

Недавнее исследование изучало эффективность иммуноцитохимического (ICC) метода окрашивания для выявления специфического антигена комплекса M. tuberculosis; MPT64 в диагностике EPTB. В этом исследовании ICC показал общую чувствительность 67,4% и специфичность 95% [13]. MPT64 представляет собой секретируемый белок с 26 kd, продуцируемый организмами комплекса M. tuberculosis, и этот антиген не был обнаружен в некуберкулезных микобактериях. Но этот антиген отсутствует в штаммах BCG с делецией RD2 [14].

Целью нашего исследования было оценить диагностическую способность окрашивания ICC для диагностики TBLN и TBP путем обнаружения специфического антигена комплекса M. tuberculosis, MPT64 в популяции пациентов из Эфиопии и сравнить результаты с обычными методами, т.е. Ziehl-Neelsen (ZN ) и окрашивание Ловенштейна-Йенсена (LJ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Пациенты были включены в исследование из специализированной больницы Tikur Anbessa и United Vision Medical Services, Аддис-Абеба, Эфиопия, с декабря 2011 года по июнь 2012 года, используя дизайн поперечного исследования. Образцы плевральной жидкости собирались последовательно из стационарных пациентов с клиническим диагнозом ТБП (n = 26), парапневмонический выпот (n = 14), плевральный выпот, вторичный по отношению к злокачественности (n = 7), сердечная недостаточность (n = 6), цирроз (n = 5), хроническое заболевание почек (n = 5). В то время как аспираты лимфатических узлов были собраны у амбулаторных пациентов, которые последовательно связывались с United Vision Medical Services для тонкоигольной аспирационной цитологии (FNAC) с диагнозом TBLN (n = 25), лимфаденопатия, вторичная по отношению к реактивному состоянию, отличному от TB (n = 19) и лимфомой Ходжкина (n = 11). Пациенты с активным легочным туберкулезом на рентгенограмме грудной клетки, пациенты, получавшие противотуберкулезное лечение до тонкой игла аспирации (FNA) или торакоцентез, и пациенты с противопоказаниями к торакоцентезу, не были включены в исследование.

Для каждого участника исследования была проведена подробная клиническая история (включая признаки и симптомы, такие как кашель, лихорадка и потеря веса), физический осмотр, гемограмма, тесты на ВИЧ и рентгенография грудной клетки. Собранные образцы обрабатывали для окрашивания ZN, культурой на среде LJ и цитологическим исследованием. Дезокси-рибонуклеиновую кислоту (ДНК) экстрагировали из аспирата плевральной жидкости и лимфатического узла, и ПЦР проводили с использованием праймеров, специфичных для IS1081. Иммуноцитохимическое окрашивание проводили с использованием поликлонального антитела против MPT64 на мазках из отложений плевральной жидкости и тонкого игольчатого аспирата увеличенного лимфатического узла.

Пациенты рассматривались как случаи, когда имелось клиническое подозрение на TBLN или TBP и с лабораторным подтверждением с любым из следующих тестов: кислотоустойчивые бациллы на окрашивание ZN и / или положительная культура микобактерий на среде LJ и / или положительные на основе IS1081 ПЦР и / или наводящий на размышления цитологический находкой туберкулеза на окрашенном мазке Райт. Контроль за текущим исследованием был у пациентов с клиническим диагнозом, отличным от ТБ, и отсутствие туберкулеза подтверждено вышеупомянутыми лабораторными тестами.

Информированное согласие было получено от каждого участника исследования, и была обеспечена конфиденциальность. Решение сделать торакоцентез или тонкую иглоукалывание было сделано на клинической почве, а не ради участия в этом исследовании. Этическое одобрение было получено от комитета по этическим обзорам отдела отдела медицинских лабораторных наук, Университета Аддис-Абебы, Института исследований им. Армауэра Хансена (AHRI) и All Africa Leprosy, Tuberculosis and Rehabilitation Training Centre (ALERT) и Национального исследования Комитет по этике Эфиопии.

Последовательные образцы плевральной жидкости (5-8 мл), асептически аспирированные, собирали в соломенных трубах, содержащих гепарин (2 мг / мл), и отправляли в микробиологический отдел Специализированной больницы Тикура Анбесса для микробиологического анализа. Тонкая игла аспирации была выполнена из пальпируемых лимфатических узлов подозреваемых случаев опытным патологоанатом в качестве амбулаторной процедуры с использованием иглы 21 калибра, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл, следуя стандартной процедуре. Одна половина жидкого и аспирационного образцов использовалась для культивирования и экстракции ДНК. Другая половина была использована для подготовки трех мазков; один был установлен для цитологического обследования, вторая половина для окрашивания ZN и остального мазка для окрашивания ICC. Слайд для ICC фиксировали абсолютным спиртом, покрывали алюминиевой фольгой и хранили при -20 ° C до обработки.

Стандартную процедуру окрашивания ZN применяли с помощью набора методов окрашивания Clin-Tech Ziehl-Neelsen (Clin-Tech Ltd, Unit G Perram Woks, Соединенное Королевство). Для инокуляции использовали три трубки среды LJ (Fluka Analytical, Sigma-Aldrich, Switzerland) (две трубки с глицерином и одна с пируватом натрия), образцы инкубировали при 35 ± 2 ° C. Инокулированные пробирки исследовали до 8 недель, а колонии, выращенные на среде ЖЖ, были подтверждены окрашиванием ZN.

Для обеспечения качества окрашивания ZN были приняты следующие меры контроля качества. Положительный (M. tuberculosis) и отрицательный (смешанные некислотные быстрые организмы) контролирующие мазки мокроты окрашивали каждый раз, когда проводили кислотное быстрое окрашивание, если контрольные образцы не показали правильной реакции, пациент и контрольный образец повторно окрашивали. Кроме того, все положительные и 10% негативных слайдов были перечитаны опытными лаборантами.

В качестве меры контроля качества для культуры ЖЖ было проведено бесплодие и тестирование производительности. Испытание на стерильность проводили путем приема 3-5% каждой партии и инкубировали при 35 ° С в течение 2 дней, остальное хранили в холодильнике. Если видны более двух колоний на пробирку, вся партия среды ЖЖ была отброшена. Эксплуатационные испытания для среды LJ проводили путем полоскания штаммов Mycobacterium gordonae (микобактерии быстрого роста) на трубке LJ. Затем инкубацию в течение ночи проводили при 37 ° С и хорошее качество среды LJ обеспечивали рост, наблюдаемый после инкубации в течение ночи.

Цитологическое исследование аспирата и плевральных жидкостей лимфатических узлов проводили путем окрашивания раствором Райт, и обследование проводили опытные патологоанатомы. Аспираты из лимфатических узлов были диагностированы как TBLN на основе присутствия гранулем, состоящих из эпителиоидных клеток / гигантских клеток без казеозного некроза (группа I), некротизирующих гранулем с переменной степенью некроза с рассеянными хорошо сформированными гранулемами (группа II) и в основном некротическим материалом с нейтрофилами, лимфоцитами и несколькими рассеянными эпителиоидными клетками (группа III).

TBP был диагностирован цитологическими данными лимфоцитарного плеврального выпота на белковом или флюидном фоне, лишенном неопластических клеток.

Выделение геномной ДНК осуществляли, как описано ранее Arora et al. и Pahwa et al. [15], [16]. Вкратце, 400 мкл материала FNA инкубировали в водяной бане при 80 ° C в течение 30 минут и затем разбавляли 500 мкл буфера Tris-EDTA (TE) (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Аналогично, 400 мкл осадка из образца центрифугированной плевральной жидкости ресуспендировали в 500 мкл ТЕ-буфера. Затем бактерии лизировали 50 мкл лизоцима (10 мг / мл) (Sigma-Aldrich, Chemie Gmbh, Steinheim, Germany) и инкубировали в течение 1 часа при 37 ° C для аспирации лимфатических узлов и 2 часа для плевральной жидкости.

Образцы, обработанные лизоцимом, инкубировали при 65 ° C в течение 10 минут и 1 часа в присутствии 5 и 6 мкл 10 мг / мл протеиназы K (BDH Biochemical, VWR International LTD, Англия) для образца лимфатических узлов и плевральной жидкости соответственно в присутствии 70 мкл 10% додецилсульфата натрия (SDS). Добавляли 100 мкл 5 М раствора хлорида натрия и затем 100 мкл предварительно нагретого раствора цетилтриметиламмонийбромида (CTAB) / хлорида натрия перед инкубацией на водяной бане при 65 ° С в течение 10 минут. Затем проводили экстракцию фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (25: 24: 1). Осадок ДНК получали добавлением абсолютного спирта после инкубации в течение ночи при -20 o C и ДНК осаждали путем центрифугирования при 12000 об / мин в течение 15 минут, затем промывали холодным 70% этанолом и ресуспендировали в 30 мкл ТЕ-буфера. Концентрация экстрагированной ДНК была аппроксимирована проведением ее на электрофорезе на 1% агарозном геле. Наконец, образцы ДНК хранили при -20 ° С до использования для ПЦР.

Качество протокола извлечения ДНК было сначала обеспечено запуском известных образцов плевральной жидкости и аспирата лимфатических узлов, которые содержат микобактериальную ДНК. В каждую партию экстракции ДНК проводили положительный образец и отрицательный контроль, то есть ТЕ-буфер вместо образца.

ПЦР проводили с использованием IS-1081 (элемент последовательности вставки, который был обнаружен в нескольких экземплярах от пяти до семи) в пределах хромосомы всех штаммов, принадлежащих комплексу M. tuberculosis) праймеры (вперед и назад), Hot StartTaq Master Mix (Qiagen, Germantown, MD, USA) и QiagenRNase-Free Water (Germantown, MD, USA). Для амплификации ПЦР использовали в общей сложности 25 мкл реакционной смеси ПЦР, содержащей 4 мкл экстрагированной ДНК, 10 мкл основной смеси HotStarTaq, 0,5 мкл каждого прямого и обратного праймеров и 5 мкл свободной от РНКазы воды. ПЦР-амплификацию проводили в течение 35 циклов, где каждый цикл составлял 95 ° С в течение 1 минуты, 55 ° С в течение 30 секунд и 72 ° С в течение 30 секунд с начальной стадией активации нагревания 95 ° С в течение 15 минут и конечное удлинение 72 ° С в течение 10 минут с использованием TC 512 Thermocycler (Barworld Scientific, Англия). Амплифицированный продукт анализировали в 2% -ном агарозном геле, содержащем бромид этидия (Fisher Bioreagents, Fair Lawn, USA). Положительные образцы показали полосу на 136 базовых парах, и снимки гелей были взяты после воздействия на УФ-свет для документации.

ПЦР-положительные и ПЦР-отрицательные контрольные образцы были обработаны во всех ПЦР-анализах. Были включены три типа ПЦР-положительных контролей: (i) ДНК штамма H37Rv штамма M. tuberculosis, (ii) известный ZN-положительный и культурально-положительный тестовый образец и (iii) положительный образец из предыдущего цикла ПЦР. Аналогично, в каждом наборе анализов также обрабатывались три типа ПЦР-отрицательных контролей: (i) контроль экстракции (со всеми стадиями, но без какого-либо экстрагированного материала), (ii) реакционная трубка с замещением свободной воды Qiagen RNase для тестового шаблона (iii) отрицательный образец из предыдущего анализа ПЦР. Чтобы проверить перекрестное загрязнение, случайные образцы были повторно протестированы. Использовались отдельные лабораторные пространства, посвященные процессу экстракции ДНК, приготовлению смеси ПЦР, циклированию и электрофорезу.

Иммуноцитохимическое окрашивание проводили в соответствии с Purohit et al. [13]. Вкратце, окрашивание ICC проводили с помощью набора DakoCytomation (EnVision + System-HRP; DakoCytomation Denmark A / S, Glostrup, Дания) на всех смазанных жидкостях и аспирационных образцах, чтобы продемонстрировать наличие специфического антигена комплекса MPT64 M. tuberculosis. Спирто-фиксированные мазки гидратировали путем снижения содержания алкоголя, промывали в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в течение 10 мин и обрабатывали 3% H2O2 в течение 15 минут, а затем инкубировали с внутренним поглощенным поликлональным анти-MPT64 антителом (полученным из Бергенский университет, Норвегия) при разведении 1/250. Последующие инкубации затем проводили с антикровным декстрановым полимером, конъюгированным с пероксидазой хрена, и с субстратом, состоящим из 3-амино-9-этилкарбазола (AEC) и пероксида водорода для визуализации связанных антител. Наконец, фон был противоположен гематоксилину Майера, а слайды были смоделированы в водном иммунометре Дако Фамамонт для микроскопии. Все инкубации проводили при комнатной температуре, и слайды три раза промывали 3 мкл трис-буферным солевым раствором 20 между инкубациями. Микобактерий-антиген окрашивался красновато-коричневым цветом в цитоплазму макрофагов или внеклеточно в некротических материалах. Структура внутриклеточного окрашивания может быть зернистой или диффузной (рисунок 1). Рисунок 1
Иммуноцитохимическое окрашивание аспиратов лимфатических узлов (A), плевральной жидкости (B) и образца аспирата отрицательного лимфатического узла (C). Положительное окрашивание считается красновато-коричневым в клетках и внеклеточным в некротических областях, как указано стрелкой в ​​А и В. Образец окрашенных положительных клеток может быть зернистым или диффузным.

В каждую окрашивающую партию были включены один положительный контроль и два отрицательных контроля. Положительный контроль содержит известный образец, содержащий M. tuberculosis. В одном отрицательном контроле первичное антитело было замещено разбавителем антитела, а в другом отрицательном контроле для оценки специфичности реакции использовали нерелевантное кроличье поликлональное антитело (хориононадотропинфин человека).

Двойной ввод данных выполнялся с использованием Microsoft Excel 2007, и анализ проводился с использованием SPSS версии 20. GraphPad Prism 5 также использовался для построения фигур. Индексы производительности (чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные прогностические значения, ложноположительные и ложноотрицательные показатели) всех модальностей были рассчитаны и сопоставлены между случаями и контролем. Индексы производительности рассчитываются с использованием комбинации тестов, а также IS1081-PCR в качестве эталонного метода. Тест PiSons Chi-square и точные тесты Фишера были использованы для сравнения различий в категориальных переменных, и значение было установлено при значении P <0,05.

В общей сложности 118 образцов (63 плевральной жидкости и 55 аспирации лимфатических узлов) были собраны у пациентов, посещавших специализированную больницу Тикура Анбеса и медицинскую службу United Vision Medical с декабря 2011 по июнь 2012 года. Из всех участников исследования 51 были случаи ТБ (26 случаев TBP и 25 случаев TBLN) и 67 были контрольными (37 были плевральной жидкостью, а 30 — аспиратами лимфатических узлов).

В нашем исследовании участники из всех возрастных групп были от 3 до 85 лет со средним возрастом 35 лет. Большинство [52/118; (44,1%)] участников исследования составляли от 25 до 44 лет. Доля мужчин-исследователей составляет 53,4% (63/118) от общей выборки, а женщины составляют 46,6%. Двадцать семь пунктов — пять процентов (14/51) случаев ТБ и 19,4% (13/67) не туберкулезных контролей были ВИЧ-инфицированными.

Все пациенты имеют признаки и симптомы в зависимости от места заболевания. Преобладающим местным симптомом для случаев ТБП был кашель, боль в груди, потеря веса и ночное потоотделение. В то время как преобладающим местным симптомом у участников исследования с TBLN была масса шеи, ночная потливость, потеря аппетита и головная боль (таблица 1). Из 55 пациентов с лимфаденопатией у большинства из 43 (78,2%) из них были опухоли шейного лимфатического узла, а затем подмышечные 7 (12,7%) и подчелюстные 5 (9,1%) лимфатические узлы. Таблица 1
Признаки и симптомы участников исследования по типу внелегочного туберкулеза легких

Как показано в таблице 2, окрашивание ZN было положительным в 7/51 (13,7%) случаях ТБ, а 10/51 (19,6%) образцов демонстрировали рост на средах ЖЖ. Нагрузка бацилл положительного образца плевральной жидкости составляла 3 бациллы / 100 полей. В отличие от образцов плевральной жидкости, AFB наблюдался у 6/26 (24%) аспиратов лимфатических узлов из случаев TBLN. Из 6 ZN-окрашивающих положительных аспиратов лимфатических узлов, 1+, 2+ и 4 бациллы / 100 полей были замечены у 3 (50%), 2 (33,3%) и 1 (16,7%) аспиратов лимфатических узлов соответственно, которые оценивались ВОЗ / Международный союз борьбы с туберкулезом и болезнями легких (WHO / IUATLD). Из 10 положительных образцов культуры 5 (50%) росли на глицериносодержащих средах, 3 (30%) на глицерине и пирувате натрия, а остальные 2 (20%) выросли на пирувате натрия. Таблица 2
Результаты лабораторных исследований различных диагностических процедур при туберкулезном плеврите и случаях туберкулезного лимфаденита и контроле не-туберкулеза

Цитологическое исследование плевральных жидкостей и аспирата лимфатических узлов показало, что 16/26 (61,5%) и 18/25 (72,0%) случаев TBP и TBLN были диагностированы как предполагающие ТБ соответственно (таблица 2). Сорок четыре процента (11/25) мазков TBLN показали цитоморфологическое изменение I группы, тогда как цитоморфологическое изменение группы II и III наблюдалось в 8/25 (32%) и 6/25 (24%) аспиратах лимфатических узлов. Как описано в таблице 3, более высокий процент положительности AFB, LJ-культуры, ПЦР и ICC наблюдался в цитоморфологической структуре II группы (гранулема с некрозом) по сравнению с другими. Таблица 3
Позитивность различных лабораторных тестов среди различных цитоморфологических моделей от аспирата лимфатических узлов случаев туберкулезного лимфаденита

Из 51 случаев туберкулеза 42 (82,4%) участников исследования были положительными по IS1081-PCR. Среди случаев с TBP и TBLN 21 (80,8%) и 21 (84,0%) были положительными по показателю IS1081-PCR (Таблица 2). На фиг. 2 изображен репрезентативный гель, показывающий положительную (136 п.н.) и отрицательную плевральную жидкость и аспират лимфатических узлов. Фиг. 2
IS1081-ПЦР ДНК, экстрагированной непосредственно из аспирации плевральной жидкости и лимфатического узла дорожки 1, представляет собой ДНК-лестницу 100 п.о. (молекулярный маркер), полоса 2 через дорожку 4 представляют собой ДНК, выделенную из плевральной жидкости, дорожка 5 и полоса 6 являются ДНК, извлеченными из образцов аспират лимфатических узлов, Lane 7, полный 9, представляет собой продукт амплификации положительных контролей, т.е.
M. tuberculosis
ДНК штамма H37Rv, известный ZN-положительный и культурально-положительный испытуемый образец и положительный образец из предыдущего цикла ПЦР, который показал положительный результат, полоса 10-12, то есть контроль экстракции, реакцию с замещением свободной воды Qiagen RNase для теста шаблон и отрицательный образец из предыдущего анализа ПЦР дали отрицательный результат.

Из 51 случая туберкулезного плеврита и туберкулезного лимфаденита окраска ICC анти-MPT64 была положительной у 38 мазков и 7 контролей, что давало общую чувствительность, специфичность, положительную прогностическую ценность и отрицательную прогностическую ценность 74,5, 89,5, 84,4 и 82,2% соответственно. Все ZN и культуральные положительные туберкулезные мазки были положительными при использовании ICC с использованием антител против MPT64.

Сравнивали положительность культуры ZN, LJ, цитологическое исследование, окрашивание IS1081-PCR и ICC антителом против MPT64 среди 51 случая TBP и TBLN, как определено комбинацией тестов. Как показано на рисунке 3, диагноз туберкулеза увеличился с 7 (13,7%) образцов по ZN-окраске до 10 (19,6%) по культуре ЖЖ. Обнаружение случая дополнительно увеличилось до 34 (66,7%) путем цитологического исследования и до 42 (82,4%) с помощью IS1081-PCR. Только ICC обнаружил 38 (74,5%) случаев. Из рисунка 3 видно, что ICC может обнаруживать значительно больше случаев ТБ по сравнению с обычным АФБ, культурой и цитологическим исследованием. Рисунок 3
Положительность лабораторных тестов среди случаев.

МТП был положительным среди 38 случаев туберкулеза и 7 контрольных пунктов, что дает общую чувствительность и специфичность 74,5% и 89,5% соответственно. Диагностическая достоверность ICC была выполнена с использованием ПЦР в качестве эталонного метода. Чувствительность, специфичность, положительная и отрицательная прогностическая ценность МТП среди случаев составили 88,1%, 89,5%, 82,2% и 93,2% соответственно. Диагностические параметры выше среди случаев с TBLN, чем TBP (таблица 4). Таблица 4
Диагностическая оценка иммуноцитохимии для аспирации плевральной жидкости и лимфатических узлов

Не было статистически значимой разницы с позитивностью окрашивания ZN, культурой LJ, цитологией и испытаниями IS1081-PCR среди участников с реактивным и нереакционноспособным серостатитом ВИЧ (таблица 5). Но статистически значимое большее число ВИЧ-отрицательных случаев было положительным с иммуноцитохимическим окрашиванием по сравнению с ВИЧ-положительными (p-значение = 0,013). Таблица 5
Положительность лабораторных тестов среди участников реагирования на ВИЧ и нереактивных участников

В настоящем исследовании было проведено исследование диагностической ценности ICC для выявления специфического антигена M. tuberculosis, MPT64, для диагностики наиболее распространенных представлений EPTB, TBLN и TBP в образцах аспирации плевральной жидкости и лимфатических узлов из специализированной больницы Tikur Anbessa и United Vision Medical Services, Аддис-Абеба, Эфиопия. Результаты показали, что ICC с использованием антигена MPT64 является чувствительным и специфическим тестом для диагностики TBLN и TBP. Это исследование подтверждает предыдущее исследование, проведенное на пациентах из Индии, показывающее, что ICC, использующий поликлональное антитело против MPT64, может быть использовано для быстрой и ранней диагностики Менингита TBLN, TBP и TB [13].

Результаты этого исследования показали, что только 1/2 (3,8%) образца плевральной жидкости у участников исследования с TBP были положительными для AFB, а бациллярная нагрузка положительного мазка составляла 3 бациллы / 100 микроскопических полей. Это открытие согласуется с другими исследованиями, в которых не было обнаружено бацилл [13], [17] — [19] или были обнаружены более низкие скорости обнаружения, такие как 0,9% -ная положительная скорость AFB в Мьянме [20] и 3,8% -ная положительность AFB наблюдалось в другом исследовании [21]. Низкая положительность плевральной жидкости для окрашивания ZN объясняется патофизиологией туберкулезного плеврального выпота, поскольку основной механизм TBP является иммунологическим, то есть жидкость собирается в результате реакции замедленной гиперчувствительности на туберкулезные белки [22].

В отличие от образца плевральной жидкости, 24% случаев TBLN были положительными для AFB, и аналогичный процент положительности AFB наблюдался в исследовании Aljafari et al. [23]. Положительность плевральной жидкости на культуре ЖЖ составляла 11,5%, и это открытие согласуется с другими исследованиями, 15,4% [19], 19% [13]. Это может отражать paucibacillary статус плевральной жидкости, которая, по крайней мере, частично от иммунологического механизма. Другая возможная причина низкой чувствительности культуры ЖЖ на плевральной жидкости может быть связана с небольшим объемом образца. Помимо своей низкой чувствительности, культура микобактерий требует лабораторий 3 уровня биобезопасности, которые бросают вызов реализации в условиях нехватки ресурсов. Тем не менее, возможность тестирования чувствительности к лекарственным средствам по культуре делает его важным и незаменимым диагностическим инструментом. Недостатком этой возможности МУС является слабость этого метода.

Показатель положительности культуры среди случаев TBLN в нашем исследовании составил 28% и сопоставим с другими исследованиями, которые показали 24,4% [24] LJ культуральную положительность аспирации лимфатических узлов. Но это было ниже, чем чувствительность LJ-культуры аспиратов лимфатических узлов в другом исследовании, в котором сообщается о положительности культуры 38,8% [25]. Низкая чувствительность в нашем исследовании может быть объяснена стадией лимфаденита, где в центральном абсцессе / некротическом материале присутствует большое количество туберкулезных бацилл [26].

Среди случаев с TBLN более высокая положительность AFB, LJ-культуры, IS1081-PCR наблюдалась в цитоморфологической картине II группы (некротизирующие гранулемы), и этот вывод соответствовал другим исследованиям, показывающим более высокую (75,6%) положительность AFB [27] , культура (26%) среди случаев с цитоморфологическим рисунком некротизирующих гранулем [13]. Но с ICC в случаях с некротизирующим цитоморфологическим рисунком (табл. 3) наблюдалась несколько более высокая положительность, что согласуется с предыдущим исследованием Purohit et al. Это означает, что МУС играет большую роль в диагностике наиболее сложной цитоморфологической картины.

IS1081-ПЦР была положительной среди 42/51 (82,4%) случаев TBP и TBLN, и она была положительной в 21/26 (80,8%) случаев TBP, и этот результат согласуется с исследованием, проведенным для оценки эффективности IS1081 в TBP, которое показало чувствительность 84,6% [21]. IS1081-ПЦР повысила чувствительность выявления случаев ТБ как в TBP, так и в TBLN. Как было показано на рисунке 3, IS1081-PCR увеличил выявление случаев туберкулеза в TBP и TBLN по сравнению с культурой LJ. ПЦР-положительность нескольких случаев, которые были негативными в культуре, указывает на то, что ПЦР очень чувствительна и полезна при сборе случаев, которые могут содержать мертвые бациллы [16].

Использование ПЦР в качестве золотого стандарта и чувствительности, специфичности, положительной прогностической ценности и отрицательной прогностической ценности было 88,1, 89,5, 82,2 и 93,2% соответственно. Этот вывод был ниже по сравнению с аналогичным исследованием, которое было проведено в Индии в 2006 году, где сообщаемая чувствительность и специфичность, положительная прогностическая ценность и отрицательная прогностическая ценность составляли 96, 96, 95 и 97% соответственно. Разница в характеристиках эффективности может быть объяснена изменением критериев отбора случая, типа внелегочных образцов, цитоморфологической картины аспирата лимфатических узлов и праймера, используемого для амплификации ПЦР. Как показано в таблице 4, чувствительность, специфичность, положительное прогностическое значение и отрицательная прогностическая ценность образца плевральной жидкости ниже, чем аспираты лимфатических узлов. Это может быть связано с paucibacillary статус плевральной жидкости, которая является результатом иммунологического механизма. В этом исследовании предварительная обработка образца плевральной жидкости для нарушения иммунных комплексов, с точки зрения извлечения антигена, не проводилась. Это было основано на опыте предыдущего исследования, когда предварительная обработка (например, микроволновая обработка) не улучшала чувствительность [13]. Это может быть связано с фиксацией спиртом этих образцов, что не приводит к сшиванию таким образом, что происходит с фиксацией формалином биопсий, что делает необходимым получение антигена.

Среди МТК среди групп, не являющихся ТБ, было 7 положительных образцов. Возможной причиной наличия ложноположительного результата может быть неспецифическое окрашивание из-за поликлонального характера используемого антитела, в то время как ложный негатив может быть обусловлен объемом образца [28], к деградации антигенов с продолжительностью времени в хранения [29] и отсутствия MPT64 от некоторых штаммов TB. Поэтому решение лечить пациента всегда должно проводиться после общей оценки, основанной на клиническом подозрении, и результатов других диагностических тестов. Кроме того, рекомендуется использовать моноклональное антитело против MPT64. Увеличение выявления случаев ТБ с использованием ICC, наблюдаемое в этом исследовании, можно объяснить способностью ICC обнаруживать фрагменты антигена, а не присутствие интактных бацилл, что является предпосылкой для окрашивания ZN [30], [31]. Более низкие урожаи ICC-окрашивания в плевральной жидкости по сравнению с аспиратом лимфатических узлов могут быть вызваны наличием на этом сайте меньшего количества бацилл, что подтверждается более низкой позитивностью с культурой. Этот более низкий выход обычного и ICC-метода также может быть объяснен отсутствием адекватных объемов образцов из-за распределения образца для различных диагностических тестов [28].

Метод иммуноцитохимического окрашивания показал повышенную чувствительность при диагностике TBP и TBLN по сравнению с другими традиционными методами, такими как окрашивание ZN, культуральное и цитологическое исследование. Использование ICC для обнаружения микобактериального комплексного специфического антигена для клинического управления всегда должно интерпретироваться вместе с клинической историей, анализом и другими диагностическими тестами, поскольку оно имеет ложноположительные результаты. Кроме того, ICC необходимо оценивать с помощью моноклонального антитела против MPT64 с большим количеством образцов из других типов EPTB. В противном случае это простой метод, который не требует сложного инструментария, то есть требует обычного светового микроскопа для изучения окрашенных препаратов. Это занимает 3 с половиной часа, когда пациенты могут получить результат в тот же день сбора. Благодаря своей простоте ICC может быть проведена в обычной лаборатории патологии.

AT: разработал исследование, выполнил сбор данных, лабораторный анализ, статистический анализ, интерпретировал данные и подготовил первый проект рукописи, БД: участвовал в разработке исследования, выборе места исследования, оптимизации и тщательном наблюдении за лабораторным анализом, анализом данных , интерпретированные данные и рукопись, JH: участвовал в разработке исследования, цитологическом исследовании образцов; рукопись написать, TG: участвовал в наборе пациентов и сборе образцов, помогал в подготовке рукописи, AB: помогал в разработке исследования и подготовке рукописи, ТМ: помогал в разработке исследования и статистического анализа, интерпретации данных, подготовке рукопись, АСТ: помогала в разработке исследования, участвовала в анализе данных, интерпретации данных и рукописи, А.А.: участвовала в разработке исследования, выборе учебного места, облегчила логистику, анализ данных, интерпретацию данных и участвовала в подготовке рукопись, Л.С .: участвовал в разработке исследования, облегчал логистику, анализ данных, интерпретацию данных и подготовку рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

AT: магистра, лектор, Университет Гондара, Гондар, Эфиопия.

БД: кандидат наук, докторант Ученые, исследовательский институт им. Армауэра Хансена, Аддис-Абеба, Эфиопия JH: MD +, патолог, исследовательский институт им. Армауэра Хансена, Аддис-Абеба, Эфиопия.

TG: MD +, патологоанатом, специализированная больница TikurAnbessa, Аддис-Абеба, Эфиопия AB: магистра, лектор, Аддис-Абебский университет, Аддис-Абеба, Эфиопия.

ТМ: PhD, профессор, Центр международного здравоохранения, Бергенский университет, Берген, Норвегия. AsT: PhD, лектор, Аддис-Абебский университет, Аддис-Абеба, Эфиопия.

AA: PhD, научный директор, исследовательский институт Armauer Hansen, Аддис-Абеба, Эфиопия.

ЛС: кандидат медицинских наук, профессор кафедры патологии Гаукандской университетской больницы Гаде Лаборатория патологии, отделение клинической медицины, Бергенский университет, Берген, Норвегия.

Ниже приведены ссылки на исходные файлы авторов для изображений. Исходный файл автора. Рисунок 1

Исходный файл авторов для рисунка 2

Исходный файл авторов для рисунка 3

Иммуноцитохимическая

Туберкулезный лимфаденит

Туберкулезный плевральный выпот

туберкулез

Полимеразной цепной реакции

Кислотные быстрые бациллы

Циля-Нильсен

Левенштейна-Йенсена

Внелегочный туберкулез

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Ни один из авторов не имеет финансовых отношений с коммерческим субъектом, который заинтересован в предмете этой рукописи. Только авторы отвечают за содержание и письмо газеты.

Авторы хотели бы поблагодарить профессора Харальда Г. Викера и профессора Якоба Шинидера за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана главным образом исследовательским институтом им. Армауэра Хансена и частично финансировалась Университетом Аддис-Абебы.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *