Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Исследование наличия антигенов Mycobacterium tuberculosis в циркулирующих иммунных комплексах, выделенных из сыворотки пациентов с туберкулезом

Research on the occurrence of Mycobacterium tuberculosis antigens in the circulating immune complexes, isolated from serum of patients with tuberculosis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3890399/

Дизайн исследования

Сбор данных

Статистический анализ

Интерпретация данных

Подготовка рукописи

Поиск литературы

Сбор средств

Туберкулез является одним из самых опасных инфекционных заболеваний и имеет самый высокий уровень смертности от всех инфекционных заболеваний. Ежегодно сообщается о 9 миллионах случаев активного туберкулеза; однако, по оценкам, одна треть населения мира инфицирована Mycobacterium tuberculosis и остается бессимптомной. Несмотря на большой прогресс в диагностике и лечении, туберкулез по-прежнему является серьезной проблемой для здоровья и общества. Контакт между иммунной системой и Mycobacterium tuberculosis инициирует специфичные для клетки (Th1) и гуморально-специфичные (Th2) ответы. Многие исследования о наличии противотуберкулезных антител в сыворотке дали противоречивые результаты из-за высокой доли ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Цель этого исследования состояла в том, чтобы подтвердить, что циркулирующие иммунные комплексы (CIC), выделенные из сыворотки пациентов с туберкулезом, сопровождаются антигенными белками, типичными для Mycobacterium tuberculosis.

Мы проанализировали образцы сыворотки у 42 пациентов с туберкулезом. Контрольная группа состояла из образцов сыворотки, взятых из 45 здоровых субъектов. Иммунохимический анализ диссоциированных иммунных комплексов методом точечного блоттинга показал положительную реакцию на присутствие антигенов Mycobacterium tuberculosis у всех пациентов с туберкулезом.

Все пациенты с туберкулезом продемонстрировали высокую концентрацию белка CIC в сыворотке. Средняя концентрация сыворотки белка CIC была значительно выше у пациентов, чем у контрольных: 0,081 г / л в контрольной группе и 0,211 г / л у пациентов с туберкулезом.

Анализ CIC предполагает, что это может быть полезным тестом для пациентов с туберкулезом из-за его быстроты, простоты идеи и ограниченной инвазивности.

Туберкулез является одним из самых опасных инфекционных заболеваний и имеет самый высокий уровень смертности от всех инфекционных заболеваний. Несмотря на большой прогресс в диагностике и лечении, туберкулез по-прежнему представляет собой серьезную проблему со здоровьем и социальной проблемой [1-4]. По оценкам ВОЗ, в 2011 году во всем мире было зарегистрировано 8,7 млн. Новых случаев заболевания туберкулезом, что соответствует 125 случаям на 100 000 населения, а 1,4 миллиона человек умерли от туберкулеза, из которых 0,5 миллиона были женщинами. Среди людей, живущих с ВИЧ, было 0,9 миллиона случаев. Также было зарегистрировано еще 0,43 миллиона случаев смерти от ВИЧ-инфекции. К концу 2011 года ШЛУ-ТБ были зарегистрированы 84 странами; в среднем 9,0% случаев МЛУ-ТБ имели ШЛУ-ТБ. Эти оценки предполагают, что в 2011 году среди зарегистрированных пациентов с туберкулезом легких было зарегистрировано около 310 000 случаев МЛУ-ТБ и ~ 25 000 случаев ШЛУ-ТБ [5]. Быстрый и надежный тест повысит вероятность эффективного лечения.

Контакт между иммунной системой и Mycobacterium tuberculosis инициирует специфичные для клетки (Th1) и гуморально-специфичные (Th2) ответы [4-10]. Многие авторы полагают, что доминирование гуморально-специфического ответа связано с прогрессированием заболевания [1,8]. Многие исследования наличия противотуберкулезных антител в сыворотке дали противоречивые результаты из-за высокой доли ложноположительных результатов [6,11-14]. Некоторые авторы отмечают высокие уровни циркулирующих иммунных комплексов (CIC) в сыворотке пациентов с туберкулезом [7,10,14,15]. Первоначальная работа над этим вопросом появилась в 1980-х годах [16]. Возможно, что часть фракции CIC содержит белковые антигены, секретируемые и эксфолированные Mycobacterium, и что присутствие этих антигенов связано с возникновением патогенного штамма бактерий. Цель этого исследования состояла в том, чтобы подтвердить, что иммунные комплексы, выделенные из сыворотки пациентов с туберкулезом, сопровождаются антигенными белками, типичными для Mycobacterium tuberculosis.

Мы проанализировали сыворотки у 42 пациентов с проверенными культурой пациентами с туберкулезом легких (ПТБ). Туберкулез можно диагностировать только в том случае, если бактерии Mycobacterium tuberculosis обнаружены в клиническом образце, взятом у пациента. Другие типы тестов могут сильно предполагать туберкулез как диагноз, но они не могут его подтвердить. Полная медицинская оценка туберкулеза (ТБ) должна включать историю болезни, физический осмотр, рентгенограмму грудной клетки и микробиологическое исследование (мокроты или другого подходящего образца). Он может также включать туберкулиновый кожный тест, другие исследования и рентгеновские снимки, а также хирургическую биопсию. Туберкулез диагностируется, если у пациента есть положительная культура для M. tuberculosis. Средний возраст пациентов составил 51,0 ± 12,2 года (диапазон — 21-85 лет). Характеристики исследуемой популяции представлены в таблицах 1 и 2. Сыворотки также получали от 45 здоровых субъектов, средний возраст которых составлял 44,1 ± 12,8 года (диапазон от 27 до 67 лет), который служил контрольной группой.

Каждый образец сыворотки (2 мл) разбавляли в 2 мл 7% ПЭГ-6000 в боратном буфере (0,1 М, рН 8,4). Образцы инкубировали при 4 ° С в течение 24 ч и центрифугировали при 15000 г в течение 30 мин при 4 ° С. Супернатант декантировали и осадок промывали 3,5% ПЭГ-6000 в боратном буфере, суспендировали в 2 мл 0,1 М NaOH и инкубировали при 25 ° С в течение 30 мин. Оптическая плотность оценивалась при 280 нм на спектрофотометре (0,1 единица оптической плотности считывалась как 0,07 г / л белка CIC). Результаты считались положительными, когда значение оптической плотности (OD) составляло> 0.130 на основе значения 0,122 ± 0,018 OD здоровых мужчин, о котором сообщалось в нашей предыдущей публикации [17].

Образец сыворотки (0,5 мл) от каждого пациента смешивали с 0,5 мл боратного буфера (0,1 М, рН 8,4) и 1 мл 7% ПЭГ в боратном буфере и инкубировали в течение 24 ч при 4 ° С. Осадок дважды промывали 3,5% ПЭГ в боратном буфере, центрифугировали при 15000 г в течение 20 мин при 4 ° С и ресуспендировали в 0,5 мл раствора для диссоциации [17].

Идентификация антигенов Mycobacterium tuberculosis предшествовала диссоциация иммунных комплексов. Чтобы выявить антигенные детерминанты, 2-меркаптоэтанол использовали для разрезания сульфидных мостиков в шарнирных областях иммуноглобулинов. Образцы CIC разбавляли в буфере для диссоциации (Tris-HCl, pH 6,8, 5% 2-меркаптоэтанола, 6% додецилсульфата натрия) и наносят на нитроцеллюлозные фильтры.

Антигены Mycobacterium tuberculosis идентифицировали методом точечного блоттинга на нитроцеллюлозных фильтрах. В качестве первого антитела использовали мышиное моноклональное антитело к Mycobacterium tuberculosis (Vector Laboratories, номер по каталогу VP-M660). Это антитело реагирует с наиболее распространенными формами микобактериальных видов, связанных с болезнью человека, включая Mycobacterium tuberculosis [18]. В качестве второго антитела использовали щелочной фосфатазо-конъюгированный поликлональный кролик-антимышиный иммуноглобулин (DakoCytomationDanmark A / S, номер каталога D0314). Для визуализации результатов был использован набор для щелочной фосфатазы субстрата BCIP / NBT IV (Vector Laboratories, номер каталога SK-5400) [18, 19].

Данные были отсортированы, начальные вычисления были выполнены, а цифры были сделаны с использованием Office 2010 (Microsoft Corp., Сиэтл, штат Вашингтон). Данные анализировали с помощью непараметрического теста Wilcoxon-Mann-Whitney и оценивались с использованием программного обеспечения STATISTICA для анализа данных (версия 10, StatSoft, Inc, www.statsoft.com). Выбранные результаты значимы от значения p <0,05.

Протокол исследования был принят Комитетом по этике Людвика Ридыгье, Медицинский университет в Быдгоще, в июне 2004 года (KB 385/2004), и каждому участнику было получено письменное информированное согласие.

Все пациенты с туберкулезом продемонстрировали высокую концентрацию белка CIC в сыворотке (рисунок 1). Средняя концентрация сыворотки белка CIC была значительно выше у пациентов, чем в контроле — 0,081 г / л в контрольной группе и 0,211 г / л у пациентов с туберкулезом (таблица 3).

Иммунохимический анализ диссоциированных иммунных комплексов из сыворотки здоровых людей не показал характер антигенных детерминант, типичных для тех, кто подвергся воздействию Mycobacterium (рисунок 2A). Однако в иммунных комплексах, выделенных из сывороток инфицированных людей, все образцы показали положительную реакцию на присутствие антигенов Mycobacterium tuberculosis (рисунок 2B).

Диагноз туберкулеза — постоянный вызов. Диагностический характер болезни постоянно меняется и может вести коварный и нехарактерный курс. Диагноз туберкулеза основан на микробиологических методах, дополненных генетическими и молекулярными методами. Культура Mycobacteria — надежный диагностический метод, хотя он занимает много времени [3,20]. Существует большая потребность в разработке простого, дешевого и надежного диагностического метода. Значение серологических тестов, подтверждающих диагноз туберкулеза, ограничено высокой долей как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов [6,13]. Была оценена полезность серологических тестов с использованием специфических антитуберкулезных антител в диагностике туберкулеза, но они дали разные результаты [6,13].

Микобактериальные антигены стимулируют иммунную систему к клеточным и гуморальным ответам на ранней стадии развития туберкулеза. Этот процесс связан с эксфолиацией поверхностных антигенов бактерий. Наличие эксфолированных антигенов может стимулировать иммунную систему к менее эффективному гуморальному ответу, что дает бактериям больше шансов выжить [1,3,7,10,14]. В настоящее время нет эффективного серологического метода идентификации Mycobacterium tuberculosis на ранней стадии заболевания [1-3,6], хотя эксфолиативные антигены Mycobacterium могут присутствовать в CIC на ранних стадиях заболевания [8].

Мы обнаружили характерную высокую концентрацию CIC в сыворотке пациентов с заболеванием по сравнению со здоровыми средствами контроля (табл. 3 и рис. 1). Иммунохимический анализ диссоциированных иммунных комплексов методом точечного блоттинга показал положительную реакцию на присутствие антигенов Mycobacterium tuberculosis в группе всех пациентов с туберкулезом. До сих пор никакие исследования не использовали этот метод для анализа состава CIC в сыворотке пациентов с туберкулезом.

Мы использовали диссоциативный буфер CIC, содержащий 2-меркаптоэтанол. Это соединение обладает способностью резать сульфидные мостики, которые объединяют тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов. В имеющейся литературе нет информации об использовании буфера для диссоциации CIC, содержащего 2-меркаптоэтанол. Присутствие этого соединения вызывает облучение блокированных антигенных детерминант путем удаления иммунных комплексов, связанных с иммуноглобулином. Этот процесс позволяет уточнить идентичность антигена, связанного специфическими моноклональными антителами.

Этот метод является быстрым и простым, и его следует учитывать при диагностике туберкулеза.

Способ, описанный для получения иммунохимической информации о присутствии Mycobacterium antigens в CIC, может быть полезен для разработки методов, относящихся к диагностике Tb.

Положительная реакция на антигены, типичные для Mycobacterium tuberculosis, показана в циркулирующих иммунных комплексах, выделенных из сыворотки пациентов с туберкулезом. Наши результаты показывают, что анализ CIC может быть полезным тестом для пациентов с туберкулезом из-за его быстроты, простоты идеи и ограниченной инвазивности.

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Источник поддержки: ведомственные источники

Концентрация CIC в сыворотке пациентов с туберкулезом (n = 42) и лиц, считающихся здоровыми (n = 45).

Анализ диссоциированных иммунных комплексов, выделенных из сыворотки здоровых людей (А) и пациентов с туберкулезом (В).

Демографические характеристики исследуемой популяции.

Клинические характеристики исследуемой популяции.

Таблица секций описательной статистики N = 87.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *