Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Предэкспозиция зараженных микобактерией туберкулеза макрофагов до воздействия кристаллических кремнеземов Контроль роста бактерий путем дерегулирования баланса между апоптозом и некрозом

Pre-Exposure of Mycobacterium tuberculosis-Infected Macrophages to Crystalline Silica Impairs Control of Bacterial Growth by Deregulating the Balance between Apoptosis and Necrosis
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3838437/

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: LCHG ISO. Выполнены эксперименты: LCHG LARL ISO. Проанализированы данные: LCHG ISO LARL LTB RPP. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: LTB RPP. Написал рукопись: LCHG ISO LTB RPP.

Вдыхание частиц кристаллического кремнезема (КС) увеличивает риск возникновения туберкулеза легких; однако точный механизм, благодаря которому воздействие CS облегчает заражение Mycobacterium tuberculosis (Mtb), неясен. Мы предполагаем, что воздействие макрофагов на КС приводит к дерегулированию путей гибели клеток, которые могли бы объяснить, по крайней мере частично, связь, наблюдаемую между воздействием КС и туберкулезом легких. Поэтому мы установили модель in vitro, в которой макрофаги были подвергнуты воздействию CS, а затем инфицированы Mtb. Экспрессию поверхностных маркеров анализировали с помощью проточной цитометрии, JNK1 / 2, ASK1, каспазы 9, P-p38, Bcl-2 и Mcl-1, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга и цитокинов с помощью ELISA. Наши результаты показывают, что воздействие CS ограничивает способность макрофагов контролировать рост Mtb. Более того, эта экспозиция уменьшала экспрессию TLR2, Bcl-2 и Mcl-1, но увеличивала экспрессию молекул JNK1 и ASK1 в макрофагах. Наконец, когда предварительно обнаженные макрофаги были инфицированы Mtb, концентрации экспрессии TNFα, IL-1β и каспазы-9 увеличивались. Этот провоспалительный профиль макрофага несбалансирован по пути апоптоза / некроза. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, сенсибилизированы к гибели клеток с помощью MAPK-киназного зависимого сигнального пути. Секреция TNF-α и IL-1β с помощью Mtb-инфицированных макрофагов способствует некрозу, и это дерегулирование путей клеточной гибели может способствовать освобождению жизнеспособных бактерий, что приводит к прогрессированию туберкулеза.

Туберкулез — инфекционное заболевание, вызванное Mycobacterium tuberculosis (Mtb). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2011 году было зарегистрировано 8,7 миллиона случаев заболевания туберкулезом, а 1,4 миллиона человек умерли от этой болезни [1,2]. Воздействие значительных количеств CS при вдыхании приводит к воспалению легких и развитию силикоза и / или силикобактерий [3-5]; однако механизмы, с помощью которых воздействие КС изменяет функцию макрофагов, не были полностью выяснены.

Альвеолярные макрофаги (АМ) являются критическими компонентами врожденной и адаптивной иммунной системы и прототипической клеткой-хозяином для различных патогенов, в том числе Mtb и многих бортовых частиц [6,7]. Взаимодействие AM с CS-частицами давно изучено с использованием моделей токсичности in vitro и in vivo [8-10]. Макрофаги и клетки альвеолярного типа II, подвергшиеся воздействию CS, усиливают клеточный стресс, секрецию активных форм кислорода (ROS) и провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, клетками, подвергающимися апоптозу [11-15]. За клеточным стрессом следует фосфорилирование членов семейства митоген-активированных протеинкиназ (MAPK), включая апоптоз-регуляторную киназу 1 (ASK1), c-Jun N-концевую киназу (JNK) и p38 белки [16-18]. Кроме того, активная секреция IL-1β, которая частично зависит от активности каспазы-1, которая, в свою очередь, требует сборки и активации воспалительного процесса Nalp3, представляет собой новый, врожденный иммунный механизм, который способствует микобактериальному клиренсу путем стимулирования фаголизосомального созревания и пироптоза Mtb-инфицированных макрофагов [19-21].

Mtb разработала множество стратегий для защиты защитной защиты хозяина [22]. Манипуляция созреванием фагосом и дерегулирование путей клеточной гибели являются хорошо известными механизмами, которые облегчают выживание бацилл в их нише [23, 24]. Например, вирулентные штаммы Mtb стимулируют гибель клеток некрозом, позволяя жизнеспособным бациллам выходить из соседних клеток. Однако именно то, как изменена иммуно-физиологическая функция макрофага при воздействии частиц CS, а потенциальные последствия для бактериального иммунитета к внутриклеточным патогенам, таким как Mtb, являются критическими вопросами, которые еще не были четко определены. Мы предполагаем, что дерегулирование путей смерти клеток может объяснить, по крайней мере частично, связь, наблюдаемую между воздействием КС и туберкулезом легких.

В этом исследовании мы протестировали гипотезу о том, что воздействие макрофагов на CS-частицы вызывает внутриклеточные клеточные пути смерти таким образом, что эти макрофаги становятся более склонными к некрозу, чем апоптоз при заражении Mtb.

Образцы крови были приобретены у окулистых покрытий персоналом банка крови в Национальном институте респираторных домов, Мехико. Исследование было одобрено Советом по институциональному обзору (IRB # B03-12) Национального института респираторных заболеваний и проводилось в соответствии с принципами, закрепленными в Хельсинкской декларации.

CS со срединным диаметром 5 мкм сначала нагревали при 180 ° С в течение 2 ч для удаления всех следов липополисахаридов (ЛПС).

Линию клеток моноцитов человека THP-1 (American Tissue Type Collection, Rockville, MD, USA) выращивали в увлажненной атмосфере при 37 ° C и 5% CO2 в среде RPMI 1640 с l-глутамином (2 мМ, GIBCO, Grand Island, NY, USA), дополненную 10% инактивированной энергией эмбриональной бычьей сывороткой (FIB) (GIBCO, Grand Island, NY, США), 10 мМ HEPES, 1 мМ пировиноградной кислоты (Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия) и пенициллин / стрептомицин (Сигма-Олдрич, Штайнхайм, Германия). Моноциты человека THP-1 дифференцировали в макрофаги, добавляя 13-ацетат форбол-12-миристат (PMA) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) (100 нМ / мл) в течение 3 ч при 37 ° C.

Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из буферизованных покрытий стандартным центрифугированием градиента LymphopreTT (Accurate Chemical-Scientific, Westbury, NY, USA). Моноциты обогащались с использованием положительного отбора с помощью магнитных микрошариков, покрытых антителами к CD14 (Miltenyi Biotech). Фракцию CD14 + анализировали с помощью проточной цитометрии для определения чистоты клеток. Очищенные клетки обычно составляли 90-95% от предполагаемого типа клеток. CD14 + обогащенные моноциты высевали на 1 × 105 клеток на лунку в 96-луночных планшетах (Костар, Онтарио, Канада) с средой RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, США), дополненной l-глутамином (2 мМ, GIBCO, Grand Island, NY, USA), стрептомицин, пенициллин и 10% инактивированной энергией эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (GIBCO, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). После 7-дневного периода инкубации жизнеспособные клетки считались макрофагами, полученными из моноцитов (МДМ), в зависимости от их профиля экспрессии CD14, CD68 и маннозного рецептора (данные не показаны). Эти зрелые МДМ затем использовались в разных экспериментах.

Для измерения экспрессии маркеров клеточной поверхности 106 ТНР-1 макрофагов окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии. Вкратце, клетки окрашивали в течение 20 мин при 4 ° С с помощью флуорохромового конъюгированного mAb на CD68, CD80, CD86, TLR2, TLR4, HLA-DR и MMR (CD206) (BioLegend, San Diego, CA). После инкубации клетки промывали и повторно суспендировали в буфере для окрашивания перед проточной цитометрией. Данные собирали с использованием проточного цитометра FACS Aria (Becton Dickinson, San Jose, CA) и программного обеспечения FACS Diva (V.6.1), а затем анализировали FlowJo (Tree Star, Inc. Ashland, OR). Как правило, было приобретено 100 000 событий.

В этих экспериментах использовали штамм Mtb H37Rv (Mtb-H37Rv). Mtb-H37Rv выращивали до логарифмической фазы в бульоне Middlebrook 7H9 (Difco, Detroit, MI) и дополняли 1% глицерином и 10% -ным обогащением каталазы альдегином альдегида Middlebrook (Difco, Detroit, MI). Затем бактерии собирали и замораживали при -80 ° С в RPMI 1640, 10% фетальной бычьей сыворотки и 6% глицерина. Покрытие серийных 10-кратных разведений на агаре 7H10 и подсчете колоний после инкубации в течение 3 недель определяли бактериальный КОЕ.

МДМ и ТНР-1 макрофаги выращивали в 24-луночных планшетах (5х105 клеток / лунку). Суспензию CS (1 мкг / мкл) была изготовлена ​​в RPMI-1640 и вихректирована до разбавления соответствующей средой для достижения конечных концентраций. Клеточные культуры подвергали воздействию CS в течение 24 ч при следующих концентрациях: 1, 5 и 10 мкг / мл. Через 24 ч клетки дважды промывали средой RPMI, а затем инфицировали Mtb-H37Rv при множественности заражения (MOI) = 1, как описано ранее [25]. Вкратце, Mtb-H37Rv опсонизировали в течение 5 мин, используя среду RPMI 1640, дополненную 2% человеческой сывороткой, 10% FBS, 0,05% Твин 80 и дважды промывали в полной среде без антибиотиков. Затем бактерии пропускали через 5 мкм шприцевой фильтр (Millipore, Carrigtwohill, Ireland), который подсчитывали в камере Петрова-Хауссера и добавляли к МДМ при указанном МВД. Продолжительность заражения составляла 2 часа для всех экспериментов. На 4-й день после инфицирования клетки лизировали 0,1% -ным раствором сапонина в течение 5 мин, и бактерии перечисляли путем серийного разведения клеточных лизатов на чашках Agar Middlebrook 7H10. Колонии были подсчитаны через 21 день.

Супернатанты культуры из Mtb-инфицированных макрофагов ТНР-1 или МДМ пропускали через фильтр 0,2 мкМ для удаления любых бактерий. Супернатанты анализировали на цитокины с помощью сэндвич-ELISA, который проводили в соответствии с инструкциями изготовителя с абсорбцией, зарегистрированной на 405 нм, на программном обеспечении SoftMax Pro ELISA (Molecular Devices). IL-1β и TNF-α в супернатантах культуры количественно оценивали по сравнению с соответствующим рекомбинантным стандартом (приобретаемым в R & D Systems).

Макрофаги ТНР-1 (106 клеток) выращивали на 4-луночных планшетах (Millicell EZ slide, Millipore) и экспонировали в течение 24 ч при следующих концентрациях CS: 1, 5 и 10 мкг / мл. После инкубации клетки дважды промывали средой RPMI и заражали Mtb-H37Rv, как описано ранее. Макрофаги ТНР-1 промывали один раз в PBS перед фиксацией в 4% параформальдегиде в течение 1 ч при комнатной температуре. После дополнительной промывки клетки пермеабилизировали добавлением пермеабилизирующего раствора (0,1% Triton X-100, 0,1% цитрата натрия в H2O) в течение 5 мин на льду и промывали PBS. Разрывы нитей ДНК были помечены добавлением терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, опосредуемой реакционной смесью нитевидных концевых нитей (TUNEL), согласно инструкциям изготовителя (набор для определения смертности в клетке Cell, Applied Science Roche). Реакционная смесь содержала концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу, которая добавляет меченые флуоресцеином нуклеотидные полимеры к свободным концам ДНК 3′-ОН фрагментированной ДНК. Образцы инкубировали в течение 1 ч при 37 ° С. Ядра окрашивали 4′-6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), а интенсивности флуоресценции измеряли под микроскопом OLYMPUS IX81 Evolution ™ (Bethesda, MD, USA) при длинах волн возбуждения и излучения 500 и 535 нм для красной флуоресценции и 550 и 700 нм для зеленой флуоресценции, соответственно.

Макрофаги ТНР-1 (1X106) подвергали воздействию CS в течение 24 ч (1, 5 и 10 мкг / мл). После инкубации клетки дважды промывали средой RPMI и заражали Mtb-H37Rv (MOI = 1) в течение 24 часов при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. После инфицирования клетки промывали PBS и лизировали в лаэмми-буфере. Равные количества белка подвергали Mini-Protean TGK 4-15% гелям (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) и переносили в мембрану Trans-Blot TurboTM PVDF с размером пор 0,2 мкм (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Вестерн-блот проводили с использованием следующих антител: каспазы 9, цитохрома c, ASK1 и p-38 (разведение: 1: 1000), JKN1 / 2 (разведение 1: 2000) (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA), Mcl -1 и Bcl-2 (разведение 1: 1000) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA). Полосы протеина были обнаружены путем инкубации с мечеными мечеными пероксидазой хрена и визуализированы с помощью усовершенствованного реагента хемилюминесценции (Thermo Scientific, Pierce Biotech., Rockford, IL) с использованием системы визуализации от Bio-Rad (ChemiDocTM XRS + System). Плотность полос анализировали с помощью денситометрии с использованием онлайн-программного обеспечения IMAGEJ 1.39c, предоставленного NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html), как описано Люком Миллером (http: //www.lukemiller. или / журнал / 2007/08 / количественно-westernblots-without.html). Каждый образец был нормализован с использованием глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в качестве контроля загрузки.

Макрофаги THP-1 (5X105) подвергали воздействию CS в течение 24 часов. Через 24 ч некоторые из клеток инфицировали Mtb-H37Rv (MOI = 1) в течение 24 часов при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. После инфицирования гибель клеток измеряли с использованием иммуноферментной аналитической клетки с ферментной связью (Cell Detection Detection ELISA PLUS, Roche) для количественного определения цитоплазматических (апоптоза) и внеклеточных (некрозов) гистонов связанных фрагментов ДНК в соответствии с протоколом производителя. В моменты, указанные после заражения, относительные количества некроза или апоптоза были рассчитаны как отношение оптической плотности инфицированных макрофагов к числу неинфицированных контрольных макрофагов.

Результаты выражаются как средства ± SEM. Сравнение данных выполнялось с использованием однонаправленного ANOVA с последующим пост-hoc-тестом Dunnett для множественных сравнений. Для оценки различий между контрольными и обработанными группами использовали двухсторонние непарные тесты для ученика. (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния).

Хроническое воздействие КС связано с легочной и внелегочной туберкулезной инфекцией [3,26-28]. Влияние экспозиции макрофагов на КС при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч на рост бактерий живого Mtb показано на рисунках 1A и B. По сравнению с неэкспонированными макрофагами обработка in vitro CS снижалась в дозе зависимой способностью макрофагов контролировать внутриклеточную бактериальную репликацию Mtb как в макрофагах THP-1, так и в MDM (фиг. 1A и B).

Макрофаги ТНР-1 (А) и МДМ (В) подвергали воздействию КС при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, а затем инфицировали Mtb-H37Rv (MOI 1). На 4-й день после инфицирования CFU были перечислены. Бары показывают среднее ± SD из пяти независимых экспериментов. * P <0,05, ** P <0,01. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Было показано, что макрофаги ТНР-1 экспрессируют множество рецепторов, участвующих в активации клеток [29]. Здесь экспрессия CD68, CD80, CD86, HLA-DR, MMR, TLR2 и TLR4 анализировали в разных экспериментальных условиях (плюс или минус воздействие CS и с или без Mtb-инфекции). Воздействие CS в течение 24 часов не изменяло выражения CD68, CD80, CD86, HLA-DR или MMR (данные не показаны); однако, когда неэкспонированные макрофаги ТНР-1 были инфицированы Mtb, частота и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) изменились, что указывает на то, что в этих экспериментальных условиях CS не отвечал за наблюдаемые фенотипические изменения.

Активация макрофагов Toll-подобных рецепторов (TLR) 2 и 4-зависимого пути была описана ранее после стимуляции крупными частицами и после воздействия лигандов TLR, таких как липоарабиноманнан, фосфатидилинозитол-маннозиды и липопротеин 19-кДа [30-34]. Мы выяснили, что воздействие макрофагов на КС снижало регуляцию МФО TLR2 дозозависимым образом (фиг. S1-A и -B, вспомогательная информация); однако выражение TLR4 не изменилось в ответ на воздействие CS (данные не показаны). Эти результаты показывают, что сигнальный путь TLR2 может быть изменен после воздействия макрофагов на CS.

TNF-α и IL-1β являются двумя провоспалительными цитокинами, которые участвуют в активации макрофагов и регуляции путей клеточной гибели при туберкулезной инфекции [35,36]. Для анализа специфичности CS-индуцированной секреции провоспалительных цитокинов мы измерили продукцию TNF-α и IL-1β в супернатанте культуры макрофагов THP-1 и MDM. Наши результаты показывают, что макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, имели незначительное увеличение в производстве цитокинов; однако Mtb-H37Rv-инфицированные макрофаги имели заметное увеличение секреции обоих цитокинов и делали это зависимым от дозы образом (фиг. 2A-D).

Концентрации TNF-α и IL-1β измеряли с помощью ELISA в супернатанте культуры из CS-экспонированных и неэкспонированных макрофагов THP-1 (A и B) и MDM (C и D), инфицированных Mtb. Бары показывают среднее ± SD из восьми независимых экспериментов. **** P≤0,0001, ** P <0,01, * P <0,05 ANOVA и пост-hoc-тест Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Зацепление TLR-рецепторов с микобактериальными лигандами на поверхности макрофагов часто приводит не только к секреции цитокинов, но также к гибели клеток [37]. Поскольку экспрессия TLR2 была уменьшена после воздействия макрофагов на CS, мы решили оценить гибель клеток на макрофагах, подвергнутых воздействию CS и инфицированных Mtb. Мы определили, что воздействие макрофагов на возрастающие концентрации CS индуцирует накопление положительных макрофагов TUNEL (рисунок S2, вспомогательная информация). Окрашивание TUNEL Mtb-инфицированных макрофагов ТНР-1 показало, что только инфекция увеличивала фрагментацию ДНК по сравнению с неинфицированными макрофагами; однако мы обнаружили, что CS-праймирование Mtb-инфицированных макрофагов напрямую не увеличивало клеточную гибель.

Активность митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) играет центральную роль в активации различных иммунологических механизмов в макрофагах. Апоптоз-регуляторная киназа1 (ASK1) является членом этого семейства киназ MAPK, который активируется в ответ на сигналы опасности [38,39] и, в свою очередь, активирует две разные подгруппы киназ MAP-киназ (MAPKK): JNK (c- Jun-амино-терминальная киназа) и p38 [40]. Активация р38 приводит к продуцированию и секреции TNF-α [41], тогда как JNK относится к многочисленным клеточным механизмам, включая развитие апоптотической гибели клеток [42, 43]. Учитывая, что как цитокиновая секреция, так и клеточная смерть увеличились в макрофагах, подвергнутых CS, мы предположили, что путь MAPK может быть задействован. Чтобы рассмотреть эту возможность, выражения ASK1, P-p38, JNK1 и JNK2 были исследованы Western Blot. CS индуцировала экспрессию ASK1 и JNK1, но не P-p38 (рисунок 3A-C). Этот фенотип не был модифицирован после инфицирования Mtb. JNK2 не обнаружил значительных изменений после воздействия CS или Mtb-инфекции (рис. 3D-F). Эти результаты согласуются с нашими предыдущими результатами (фиг. 2 и S2), поскольку P-p38 увеличился в ответ как на воздействие CS, так и на Mtb-инфекцию, аналогичную секреции цитокинов; в то время как JNK1 увеличивался в ответ на воздействие КС, подобно смерти клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что активация пути MAPK и JNK1 происходила в ответ на CS и могла быть ответственна как один из потенциальных механизмов, опосредующих гибель клеток.

Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч и инфицировали Mtb. Показаны относительные единицы ASK-1 (A), P-p38 (B), JNK1 (D) и JNK2 (D); плотности полос в Вестерн-блотах были нормализованы против GAPDH. Показана одна из пяти независимых вестерн-блотов для ASK1, P-p38, JNK1 и JNK2 (C, F). Общий белок определяли с использованием GAPDH в качестве контроля загрузки. Бары показывают среднее ± SD. * P <0,05, ** P <0,01. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Хорошо известно, что активация JNK может привести к гибели клеток с помощью двух разных механизмов: повреждения митохондрий или деградации / инактивации анти-апоптотических молекул Bcl-2 [44-46]. Для оценки того, подвергаются ли макрофаги, подвергающиеся воздействию CS, регулировать экспрессию антиапоптотических молекул, лейкоз миелоидной клетки-1 (Mcl-1) и В-клеточную лимфому-2 (Bcl-2) измеряли с помощью Western Blot. Мы наблюдали, что при концентрациях 1 и 5 мкг / мл CS уменьшал экспрессию Bcl-2, а при 10 мкг / мл экспрессия Mcl-1 была значительно снижена (фиг. 4A и B). Это заставляет нас думать, что уменьшение антиапоптотических молекул является следствием активации JNK и что это особое микроокружение приводит к относительному увеличению проапоптотических молекул и гибели клеток.

Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, затем макрофаги были инфицированы Mtb. Показаны относительные единицы Bcl-2 (A) и Mcl-1 (B); плотности полос в Вестерн-блотах были нормализованы против GAPDH. Представлен один из четырех независимых вестерн-блотов для Bcl-2 и Mcl-1 (C). Бары показывают среднее ± SD. * Р <0,05. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Основываясь на наших предыдущих результатах, показывающих, что воздействие CS увеличивает экспрессию ASK1 и JNK и уменьшает молекулы Bcl-2 и Mcl-1, мы предположили, что этот фенотип макрофага является вторичным по отношению к митохондриальному повреждению. Чтобы проверить эту гипотезу, каспазу 9 измеряли в неинфицированных и Mtb-инфицированных макрофагах Western Blot после воздействия CS. Мы наблюдали, что макрофаги, подвергнутые воздействию 5 мкг / мл CS, увеличивают экспрессию прокаспазы и каспазы 9 (фиг. 5A и B), предполагая, что сигнальный путь, ведущий к гибели клеток, может быть следствием активации каспазы 9 и повреждения митохондрий.

Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, затем макрофаги были инфицированы Mtb. Показаны относительные единицы прокаспазы 9 (А) и каспазы 9 (В); плотности полос в Вестерн-блотах были нормализованы против GAPDH. Представлен один из пяти независимых Вестерн-блотов для прокаспазы 9 и каспазы 9 (С). Бары показывают среднее ± SD. * Р <0,05. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Ранее мы продемонстрировали, что CS-облучение сенсибилизированных макрофагов приводит к гибели клеток вследствие повышенной экспрессии ASK1, JNK1 и каспазы 9, а также к деградации антиапоптотических молекул. Чтобы проанализировать вероятность того, что воздействие макрофагов на КС изменяет баланс между апоптозом и некрозом, мы измеряли внутриклеточные и внеклеточные ДНК-гистоновые комплексы, которые указывают на апоптоз и некроз соответственно [47]. Мы определили, что только CS повышает частоту как апоптоза, так и некроза в макрофагах ТНР-1 (фиг. 6A и B). Когда макрофаги ТНР-1 были предварительно подвергнуты воздействию CS и позже были инфицированы Mtb-H37Rv, частота некротических клеток увеличивалась дозозависимым образом по сравнению с неэкспонированными инфицированными ТНР-1 макрофагами. Эти результаты показали, что, когда макрофаги ТНР-1 предварительно подвергаются воздействию CS, их профиль устойчивого состояния изменяется на профиль про-смерти и что в этих модифицированных условиях заражение Mtb увеличивает скорость некроза.

Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, затем макрофаги были инфицированы Mtb. Апоптоз (A) или некроз (B) оценивали через 24 часа после Mtb-инфекции. Стауроспорин (3 мкМ) использовали в качестве положительного контроля. Данные re_’¡. Бары показывают среднее ± SD. * Р <0,05. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

Наиболее важные результаты нашего исследования заключаются в следующем: 1) CS снижает способность макрофагов контролировать внутриклеточный бактериальный рост Mtb; 2) CS индуцирует секрецию TNF- и IL-1β; 3) CS повышала внутриклеточную экспрессию ASK1, JNK1 и каспазы 9, но уменьшала антиапоптотические молекулы Mcl-1 и Bcl-2; и 4) предварительное облучение CS увеличило некроз Mtb-инфицированных макрофагов.

При воздействии макрофагов МДМ и ТНР-1 на МС in vitro увеличение внутриклеточного бактериального роста дозозависимым образом (рис. 1А и 1В) приводило к ухудшению некоторых микобактерицидных механизмов макрофага. Эти результаты согласуются с данными из Yin, XJ и др., Которые показали, что воздействие AM на частичные частицы дизельного топлива (DEP) подавило убийство моноцитогенов Listeria [48]. Сообщаемый клеточный ответ макрофагов, подвергнутых воздействию DEP и CS в нашем исследовании, аналогичен, несмотря на разницу в химическом составе, включая отсутствие нескольких органических соединений в пыли CS.

Хотя ранее было продемонстрировано, что CS снижает регуляцию экспрессии аксессуарных молекул на дендритных клетках [49], мы исследовали, может ли CS-облучение оказывать такое же влияние на неинфицированные и Mtb-инфицированные макрофаги ТНР-1. Мы не наблюдали изменений в экспрессии клеток со стимулирующих молекул после воздействия макрофагов на CS. Дискретное изменение экспрессии CD86, HLA-DR и MMR наблюдалось, как только клетки были инфицированы Mtb (данные не показаны); что 24-часовое воздействие CS не привело к активации макрофагов.

TLR представляют собой рецепторы распознавания патогенов, экспрессируемые несколькими клетками-хозяевами, включая моноциты и макрофаги. Из них TLR 2 и 4 были изучены в экспериментальных моделях мышиных и человеческих in vitro, показывающих их участие в врожденном иммунном ответе против Mtb, распознавая связанные с патогенами молекулярные структуры, чтобы индуцировать активацию клеток и ограничение роста внутриклеточного бактерий [31,33,34 ]. Цитометрический анализ макрофагов, экспрессирующих THP-1, показал, что уровень экспрессии TLR4 не изменился после CS (данные не показаны); однако TLR2 MFI уменьшался дозозависимым образом (фиг. S1-A и -B). Эти результаты позволяют предположить, что сигнальный путь TLR2, который приводит к секреции провоспалительных цитокинов и гибели клеток, может быть затронут после воздействия макрофагов на CS.

Nalp3-зависимая секреция IL-1β была описана в мышиных макрофагах, обработанных с увеличением концентрации CS [12]. В наших экспериментальных условиях наблюдалась небольшая концентрация IL-1β в разных концентрациях CS, но когда инфицированные макрофаги (MDM или THP-1) были инфицированы Mtb, мы идентифицировали дозозависимое увеличение секреции IL-1β ( Рисунки 2B и 3D). Аналогичный результат был отмечен при анализе TNF-α (фиг. 2А и 3С). Секреция этих двух провоспалительных цитокинов может участвовать в активации различных путей внутриклеточной гибели клеток, которые необходимы для иммунного ответа против Mtb [1,50,51]. Из-за связанных с этим понятий, что TLR2-зависимый путь ведет к гибели клеток и что некроз считается механизмом уклонения, индуцированным Mtb [52,53], мы установили, что воздействие макрофагов THP-1 на 5 мкг / мл CS увеличилось процент ячейки TUNEL + (рисунок S2). Наши данные показали, что воздействие CS даже при низких концентрациях влияет на путь активации TLR2, поскольку он увеличивает как секрецию цитокинов, так и гибель клеток (фиг. 2 и S2). Мы выбрали низкую концентрацию CS из-за предыдущих наблюдений в нашей лаборатории, показав, что более 50% макрофагов, подвергшихся воздействию 20 мкг / мл или более CS, приводило к гибели клеток (данные не показаны). Этот высокий уровень клеточной смерти может привести к смещению наших результатов и интерпретации, которую мы рассматриваем.

Активность MAPK-киназы индуцируется после взаимодействия Mtb с макрофагами или выражением сигналов опасности [40, 54]. В нашей экспериментальной модели мы определили, что воздействие CS повышало экспрессию уровней ASK1 и JNK1 дозозависимым образом (фиг. 3A и 5D). Экспрессия p38 возрастала только после Mtb-инфекции (рисунок 5B): результат, который согласуется с профилем экспрессии цитокинов, который мы обнаружили ранее (рис. 2). Как и в предыдущих выводах, мы обнаружили, что воздействие макрофагов на CS приводит к внутриклеточной активации по меньшей мере двух молекул пути MAPK, ASK1 и JNK1 [55]. Мы наблюдали, что воздействие CS увеличивало экспрессию JNK1 и уменьшало молекулы Bcl-2 и Mcl-1 (фиг. 4A и 6B). Путь передачи JNK1 отвечает за многопозиционное фосфорилирование / инактивацию Bcl-2, а Bcl-2 наиболее изучен как антиапоптотическая молекула [56]. Ранняя, переходная активация JNK1 способствует выживанию клеток, тогда как длительная активация JNK1 может опосредовать апоптоз [57].

Таким образом, мы предположили, что макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, более подвержены клеточной смерти, чем неэкспонированные макрофаги. Чтобы выяснить, приводит ли этот проапоптотический профиль к повреждению митохондрий и активирует сигнальные пути, связанные с гибелью клеток, мы измерили прокаспазу и каспазу 9 (рис. 5А и 7В). Наши данные подтвердили, что макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, более склонны к гибели клеток, чем контрольные, потому что они увеличили каспазу 9, возможно, из-за повреждения митохондрий.

В нормальных условиях активация TLR2 дозозависимым образом приводит к образованию цитокинов в макрофагах. 2) Макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, увеличили уровни ASK1 и JNK1 (возможно, как сигналы клеточного стресса), но уменьшили экспрессию TLR2 и уровни антиапоптотических молекул Bcl-2 и Mcl-1; в этих условиях макрофаг более восприимчив к гибели клеток. 3) Если макрофаги, предварительно подвергнутые воздействию CS, инфицированы Mtb-H37Rv, наблюдается повышенная секреция проапоптотических цитокинов (TNF- и IL-1β). Когда макрофаги подвергаются воздействию CS, они становятся более восприимчивыми к гибели клеток, если они также инфицированы M.tb, провоспалительные цитокины секретируются и некроз устанавливается, что способствует высвобождению жизнеспособных внутриклеточных бацилл.

Наконец, чтобы продемонстрировать, что CS дерегулирует критический баланс апоптоза и некроза в клеточных путях, которые участвуют в иммунном ответе против Mtb, мы измеряли внутриклеточные и внеклеточные ДНК-гистоновые комплексы в открытых макрофагах, обнаружив, что CS увеличивал апоптоз в неинфицированных макрофагах, но увеличение некроза дозозависимым образом у лиц, инфицированных Mtb (рис. 6B). Это представляет собой пагубное воздействие на защиту хозяев, поскольку оно способствует освобождению жизнеспособных внутриклеточных бацилл и, следовательно, прогрессированию туберкулеза. Это изменение вызвано дисбалансом в пути активации MAPK, который завершается образованием цитокинов и апоптозом макрофагов.

Мы предлагаем в первый раз механизм (рис. 7), посредством которого воздействие КС влияет на способность макрофагов контролировать внутриклеточную бактериальную репликацию Mtb. TLR2-зависимая сигнализация приводит к активации пути MAPK-киназы, тем самым индуцируя главным образом секрецию цитокинов или гибель клеток. Когда макрофаги подвергаются воздействию CS, снижается экспрессия TLR2 и увеличивается уровень ASK1. Активация ASK1 вызывает увеличение уровней JNK1, и активируются антиапоптотические молекулы Caspase 9. Этот дисбаланс в пути MKK-киназы делает макрофаги более восприимчивыми к гибели клеток. Когда предварительно обнаженные макрофаги инфицированы Mtb, секреция проапоптотических цитокинов (TNF- и IL-1β) увеличивается. Вместе дисбаланс антиапоптотических молекул плюс повреждение митохондрий приводит к высокой скорости некроза макрофагов.

Макрофаги, подвергшиеся воздействию CS, уменьшали экспрессию TLR2. Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, а затем инфицировали Mtb-H37Rv. Макрофаги собирали и окрашивали mAb против TLR2. Проанализированы частота и MFI экспрессии TLR2 (A и B) между неинфицированными и инфицированными макрофагами. Бары показывают среднее ± SD из пяти независимых экспериментов. * Р <0,05. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

(TIFF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

CS индуцирует гибель клеток неинфицированных макрофагов. Макрофаги ТНР-1 подвергали воздействию CS при концентрациях 1, 5 и 10 мкг / мл в течение 24 ч, а затем инфицировали Mtb. На графике показан процент макрофагов ТНР-1, которые были положительными для окрашивания TUNEL. Бары показывают среднее ± SD из пяти независимых экспериментов. * Р <0,05. ANOVA и Dunnett по сравнению с неэкспонированными макрофагами.

(TIFF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим д-ра Хосе Сиснероса за помощь в анализе микроскопии. CS был щедрым подарком от доктора Игнасио Парамо (Национального института респираторных заболеваний, Мехико).

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *