Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Генетическая изменчивость комплекса Mycobacterium tuberculosis у пациентов без известных факторов риска развития МЛУ-ТБ в северо-восточной части Лимы, Перу

Genetic variability of Mycobacterium tuberculosis complex in patients with no known risk factors for MDR-TB in the North-eastern part of Lima, Peru
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3765759/

Целью этого исследования было исследование генетического разнообразия комплекса Mycobacterium tuberculosis, циркулирующего у пациентов с неизвестными факторами риска туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), живущего в высокой области бремени MDR, и анализа взаимосвязи между генотипами, первичной лекарственной устойчивости и возраста.

Образцы были собраны в течение января-июля 2009 года. Изоляты испытывали на восприимчивость к лекарственным средствам для препаратов первой линии и были генотипированы с помощью сполиготипирования и 15-локулярной микобактериальной перекрестной повторной единицы (MIRU15).

Из проанализированных 199 изолятов 169 (84,9%) были идентифицированы в SpolDB4.0, а 30 (15,1%) не могли быть сопоставлены ни с одной линией. Наиболее распространенной линией была Харлем (29,6%), за ней следуют Т (15,6%), Пекин (14,1%), Латинская Америка Средиземноморье (12,6%) и U (8,5%). Несколько изолятов принадлежали кланам X и S (4,5%). Анализ Spoligotype выявил кластеризацию среди 148 из 169 изолятов, тогда как с MIRU15 все изоляты были уникальными. Из 197 штаммов; 31,5% были резистентны по меньшей мере к одному препарату, 7,5% — МЛУ и 22,3% — к резистентности к изониазиду.

В отличие от других латиноамериканских стран, где преобладает линия ЛАМ, мы нашли наиболее распространенным сполиготип 50 из линии Харлема. Ни одна из преобладающих линий не показала значительную связь с возрастом или резистентностью к изониазиду и / или рифампицину.

Туберкулез (ТБ) в настоящее время занимает седьмое место в глобальном ранжировании причин смерти [1]. В 2010 году было зарегистрировано 8,8 миллиона случаев заболевания туберкулезом или более 24 000 в день [2]. Хотя в Перу приходится только 3% населения Северной и Южной Америки, в Перу проживают 12% пациентов с туберкулезом в регионе и 32% пациентов с множественным лекарственным устойчивостью (МЛУ) [3]. Согласно Перуанской национальной программе борьбы с туберкулезом, в Перу в 2010 году было зарегистрировано 17 264 новых случая туберкулеза легких [4]. Большинство (58%) случаев уведомляются в столице; в частности в полугородских районах на севере Лимы, что составляет 86% зарегистрированных случаев в столице [5]. Сан-Хуан-де-Луриганчо является самым крупным и самым густонаселенным районом в Лиме, ​​где проживает более одного миллиона жителей, заболеваемость туберкулезом — 213/100 000 жителей [6], а первичная распространенность МЛУ составляет 7% среди всех случаев ТБ [7]. Otero et al. обнаружили высокий уровень первичного МЛУ-ТБ (6,3%) [8] у населения, не имеющего идентифицируемых факторов риска для МЛУ-ТБ, но живущего в этой области с высоким бременем. Неясно, в какой степени возникновение резистентного ТБ в этой группе с низким уровнем риска связано с клональным распространением ограниченного числа изолятов или, скорее, после случайного распределения. Кроме того, преобладание конкретных генотипов среди молодых жителей может указывать на недавнее введение этого генотипа в популяцию [9]. Молекулярно-эпидемиологические методы могли бы помочь нам лучше понять динамику популяции туберкулеза в Северной Лиме, ​​где в последние годы наблюдалось увеличение резистентности к антибиотикам [10,11]. Однако данные о молекулярной эпидемиологии туберкулеза в этой стране ограничены; база данных spoligotyping SpolDB4.0 содержит только 96 перуанских штаммов из 39 609 опубликованных записей [12].

Целью этого исследования было выявление преобладающих циркулирующих линий туберкулеза в этой популяции без каких-либо известных факторов риска развития МЛУ-ТБ, живущих в гиперэндемичном районе Лимы, а также для изучения взаимосвязи между генотипами, основными типами резистентности к лекарственным средствам и возрастом.

Это исследование было включено в перспективную когорту новых случаев туберкулеза легких с положительным мазком мокроты, проведенного в северо-восточном районе провинции Лима в Перу [12]. В округе действуют 33 медицинских центра и одна больница общего профиля, которой управляет Министерство здравоохранения. Все эти медицинские учреждения обеспечивают лечение туберкулеза и располагают лабораторными средствами для выявления подозрительных лиц с туберкулезом, таких как микроскопия мазка. Для этого исследования образцы мокроты были собраны у пациентов с туберкулезом легких с положительным мазком мокроты, ранее не получавших лечение, более 18 лет и без известных факторов риска для МЛУ-ТБ в 34 медицинских учреждениях [13], включая больницу района, между Январь и июль 2009 года.

Алкоголь и злоупотребление наркотиками считались факторами высокого риска для МЛУ-ТБ, в дополнение к факторам риска, рассмотренным в национальных руководящих принципах: лица, сообщающие о случаях заболевания МЛУ-ТБ или в случае ТБ, который не прошел курс лечения или который умер во время лечения; пациенты с иммуносупрессивными сопутствующими заболеваниями, такими как ВИЧ и диабет; лица, работающие или допущенные в тюрьму; медицинских работников и лиц с недавним и продолжительным поступлением в больницу. Пациенты с по меньшей мере одним из этих факторов были исключены. Все больные туберкулезом проходили лечение в соответствии с Национальным руководством по борьбе с туберкулезом [14] в соответствии с рекомендациями ВОЗ по лечению [15].

Район географически расположен на склоне холма и неформально разделен на верхнюю и нижнюю территорию. Верхняя часть беднее, со светлыми строительными домами, где обычно не хватает предметов первой необходимости (свет, вода и / или санитария). Нижний район более урбанизирован; дома больше и сделаны из цемента.

Образцы мокроты были доставлены в лабораторию микробиологии в Институте тропической медицины (IMTAvH, Лима, Перу) в течение 6 часов после производства. Образцы культивировали в тот же день или выдерживали при 4 ° C, когда они прибыли днем ​​или в выходные дни. Проводили мазковую микроскопию по методу Зиля Нельсена, а затем образцы культивировали на двух склонах среды Лёвенштейна-Йенсена (LJ) после дезактивации с использованием метода NalC-NaOH. Изоляты Mycobacterium tuberculosis (MTB) тестировали на чувствительность к лекарственным средствам (DST) с использованием метода агара 7H10 со следующими концентрациями препарата: 0,2 мкг / мл и 1 мкг / мл изониазида (H), 1 мкг / мл рифампицина (R), 2 мкг / мл стрептомицина (S) и 6 мкг / мл этамбутола (E).

Данные были собраны в медицинских учреждениях. Исследователи не мешали рутинному управлению пациентами. Обученные и опытные полевые работники опросили пациента для получения социально-демографических данных (имя, пол, возраст) и определения факторов риска МЛУ-ТБ, чтобы исключить пациентов из этого исследования.

Для получения геномной ДНК для spoligotyping и набора MIRU-VNTR, микобактериальные колонии, выращенные на среде LJ, ресуспендировали в 100 мкл 1X буфера Tris-EDTA (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ динатрия этилендиаминтетрауксусной кислоты [рН 8,0]) и затем кипятили в течение 30 минут. Суспензию центрифугировали при 14 000 об / мин в течение 10-15 минут для осаждения клеток гранул. Супернатант, содержащий ДНК, хранили при -20 ° С и использовали в реакциях ПЦР.

Сполиготипирование проводили с использованием праймеров (DRa и DRb), соответствующих прямой области повторения (DR) генома Mycobacterium tuberculosis в соответствии с процедурой, описанной Kamerbeek et al. Амплификацию и гибридизацию проводили с использованием встроенной в дом мембраны [16]. Гибридизованная мембрана подвергалась рентгеновской пленке для обнаружения сигнала гибридизации. Рентгеновскую пленку (Hyperfilm ECL, Amersham Bioscience UK Ltd.) читали вручную, чтобы получить полную картину наличия или отсутствия прокладок между прямыми повторами, укрытыми определенным штаммом. Чтобы определить семейство сполиготипов, образцы сравнивались с образцами в международной базе данных моделей Spoligo (SpolDB4).

MIRU-VNTR представляет собой метод ввода на основе ПЦР, который назначает количество тандемных повторов для независимых локусов (MIRU), которые были найдены полиморфными в MTB. Стандартизованный набор MIRU-VNTR на основе 15 локусов выполнялся с использованием ручного метода. Каждый локус амплифицировали отдельно с помощью симплексной ПЦР с набором Qiagen Hotstart Taq Polymerase, включающим Q-решение, в соответствии с Генотипированием Технического руководства MTB [17]. Продукты анализировали электрофорезом с использованием гелей 2% агарозы (Promega, Fitchburg, США). Контрольный штамм H37Rv включали в каждую партию ПЦР и гелей.

Демографическая информация (пол и возраст), сполиготипирование и модели MIRU-VNTR были сопоставлены с международной базой данных SpolDB4.0 с использованием бесплатного веб-программного обеспечения MIRU-VNTRplus [18]. Полученные шаблоны получили международный тип сполиго (SIT) в соответствии с назначением кластера. Профили MIRU-VNTR с двойными аллелями в одном локусе считались клональными вариантами того же штамма, тогда как с двойными аллелями в 2 или более локусах считались смешанными инфекциями или результатом перекрестного заражения [19,20] , Идентичные сполиготипы и образцы MIRU-VNTR считались находящимися в кластере.

Данные пациента, мазка, культура и результаты DST были введены в специальную базу данных Access. Контроль качества проводился на 20% месторождений; 100% из тех, у кого более 5% ошибок и для всех DST и молекулярных (Spoligotyping и MIRU15 анализ) контроль качества был выполнен для двойной записи данных в базу данных.

Шаблоны сполиготипов в двоичном формате были введены в лист Excel и сравнивались с базой данных spoligotype SpolDB4 с использованием MIRU-VNTR plus. Дискриминационный указатель Hunter Gaston (HGDI) использовался для расчета дискриминационной способности метода сполиготипирования [21]. Для оценки различий по возрасту и показателям резистентности резистентности к линиям применяли критерий Чи квадрат или точный тест Фишера при необходимости. (Epi Info v7, Грузия, США). Значения p менее 0,05 считались значимыми.

Исследование было одобрено в Институциональном совете по обзору в Университете Перуаны Каэтано Эредиа. Все зарегистрированные пациенты подписали информированное согласие. Данные управлялись анонимно. Результаты мазков, культуры и DST были предоставлены врачу в службе здравоохранения, как только они были доступны.

В медицинских учреждениях зарегистрировано 376 пациентов с первым эпизодом туберкулеза легких с положительным мазком. Для 62 пациентов не было получено никакого информированного согласия и 50 исключены, поскольку они сообщили о по меньшей мере одном из факторов риска развития МЛУ-ТБ. Среди 264 подходящих пациентов 65 (24,6%) не были включены, потому что они не оставили образец (n = 6), первичная культура была отрицательной (n = 22), субкультура была отрицательной (n = 36) или загрязнена ( п = 1). Таким образом, общее количество культур разных субъектов, доступных для генотипирования ДНК, составило 199, что составляет 75,4% пациентов, имеющих право на это исследование. Соотношение между мужчинами и женщинами составляло 1,2; и средний возраст составил 31 год (диапазон от 18 до 78).

Результаты испытаний на чувствительность к лекарственным средствам (DST) были доступны для 197 (99%) изолятов. В общей сложности 62 (31,5%) были устойчивы по меньшей мере к одному препарату и 135 (68,5%) были полностью восприимчивыми (таблица 1). Пятнадцать случаев (7,5%) были MDR, 17 (8,6%) были монорезистентны к H, 17 (8,6%) до S и 1 (0,5%) были устойчивы к E (таблица 1).

Сопротивление штаммов 197 M. tuberculosis complex изолятов

H-изониазид, R-рифампицин, S-стрептомицин, E этамбутол.

MDR с множественной лекарственной устойчивостью, n число.

Среди 199 типизированных изолятов образцы из 169 (84,9%) изолятов принадлежали семи линиям в SpolDB4.0, тогда как 30 (15,1%) изолятов не могли быть сопоставлены ни с одной линией, и поэтому называются «сиротами». Из них 59 (34,9%) изолятов принадлежали линии Haarlem, в то время как 110 (65,1%) не были штаммами Гарлема. Штаммы, классифицированные по линии неаарлема, включали штаммы из линии Т (15,6%), линии Пекина (14,1%), латиноамериканского Средиземноморья (12,6%) и линии U (8,5%). Несколько изолятов (4,5%) принадлежали X и S-кладам (рис. 1).

Распространенность линий и сполиготипов среди 199 изолятов
              
                Микобактерий туберкулез
              
              (n = количество изолятов).

Всего из проанализированных 199 изолятов было получено 44 различных сполиготипа (ST) (рисунок 1). Среди них наиболее часто встречался член ST50 линии Haarlem (29,5%), за ней следуют ST1 из родословной в Пекине (16,5%), ST33 от латиноамериканской средиземноморской линии (7,1%) и ST53 от линии T (5,9 %). Несмотря на относительно высокий HGDI, равный 91,8% [21], spoligotyping показал явно более низкое разрешение по сравнению с типизацией MIRU-VNTR.

Не было обнаружено корреляции между идентифицированными линиями в отношении первичной лекарственной устойчивости при сравнении МЛУ-ТБ по сравнению с не-MDRTB, не-MDR H-резистентным против H-восприимчивых изолятов и любых H-резистентных против H-восприимчивых изолятов. (см. таблицу 2 для наиболее распространенной линии). Точно так же ни одна из линий не показала связи с определенной возрастной группой, хотя линии Haarlem и Beijing были немного более распространены среди молодых пациентов (p-значение 0,09 для Пекина и 0,07 для Гарлема, таблица 2).

Распределение штаммов Гарлема и Неарлема в зависимости от возрастной и возрастной группы

* Результаты DST были доступны для 197 изолятов.

В отличие от анализа spoligotype, у всех изолятов был уникальный шаблон MIRU-VNTR, и мы не наблюдали ни одного случая бактериальной субпопуляции или смешанной инфекции M. tuberculosis среди наших изолятов.

Наше исследование дает представление о штаммах M. tuberculosis, циркулирующих среди пациентов, не имеющих известных факторов риска для МЛУ-ТБ, живущих в области с высоким уровнем ТБ. Мы обнаружили, что линия Харлема присутствовала в одной трети образцов, которая отличается от других латиноамериканских стран, где наиболее распространена линия ЛАМ.

В настоящее время существует шесть филогеографических линий, которые составляют глобальное население M. tuberculosis [22]. Одним из них является евро-американская линия, в которую входят все сполиготипы, преобладающие в западном мире (Гарлем, ЛАМ и неопределенная группа Т) [11]. В частности, линия Харлема вездесущна [23] и представляет собой около 25% изолятов в Европе, Центральной Америке и Карибском бассейне, что указывает на связь с европейской колонизацией после Колумба [24]. Haarlem штаммы были ответственны за длительную вспышку туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) в Аргентине [23,25] и активно передаются в городских условиях в Колумбии, что вызывает серьезные проблемы общественного здравоохранения [26].

В отличие от предыдущих сообщений [11,22,27-30], где линия LAM была наиболее распространенной в Латинской Америке, наши результаты показали, что линия Haarlem и, в меньшей степени, линия T, были основными циркулирующими генотипами TB у пациентов с неизвестными факторами риска. Линия Харлема была описана в Нидерландах в 1999 году [31]. Три основных символа сполиготипа определяют варианты H1, H2 и H3 [32]. В нашем исследовании большая часть штаммов Гарлема принадлежала к H3-сублиации (84,7%), и лишь немногие из них принадлежали к H1-сублинажу (13,6%). Линия Харлема широко распространена в Северной Европе, а также в Центральной Африке, где, как считается, она была введена во время европейской колонизации, но она присутствует в Карибском бассейне в меньшей степени [33].

Очень мало исследований, касающихся текущей генетической эпидемиологии штаммов МТБ, циркулирующих в Перу. Cohen et al. [34] основное внимание уделялось домашним хозяйствам в Лиме, ​​в которых> 1 пациент с МЛУ-ТБ получал лечение в период с 1996 по 2004 год; среди 391 изолятов MDR-TB у 236 человек наиболее распространенными линиями были LAM (n = 40,6%), T (n = 33,7%), Haarlem (n = 14,0%) и Пекин (n = 6,0%). Позднее Taype et al. [35] проанализировали 323 образца с положительным мазком мокроты, собранных в период между 2004 и 2006 годами из 3 районов на севере Лимы (Римак, Сан-Мартин-де-Поррес и Лос-Оливос) и обнаружили, что наиболее распространенными линиями были ЛАМ (23,8%), Харлем (23,8%) и Т (22,3%). Хотя основное внимание в этих исследованиях было отличным от нашего (МЛУ-ТБ в одном исследовании и разных районах в другом), а размер выборки в каждом изученном районе оставался небольшим, эти данные указывают на тенденцию к увеличению распространенности генотипа Харлема в Северо-Восточный район Лимы. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на появлении линии Харлема и ее возможных причин.

Поскольку spoligotyping имеет ограниченное разрешение, мы набрали образцы 15-локусом MIRU-VNTR. Интересно, что, несмотря на то, что штаммы были получены у пациентов, живущих в области высокой передачи, не было доказательств преобладающего клона. Это может быть связано с выбором пациентов с низкими факторами риска МЛУ-ТБ и относительно коротким временным интервалом выборки (7 месяцев) для анализа недавней передачи [36,37].

Когда мы стратифицировали генотипы по возрасту, мы заметили, что 62,3% соответствует самой молодой и самой продуктивной возрастной группе (≤30 лет). Наши результаты показывают, что линии Пекина и Харлема несколько более часты среди молодых людей, которые могут указывать на их недавнее появление в нашей популяции. Для Пекина это согласуется с предыдущими исследованиями [38]. Наблюдаемые различия не были статистически значимыми, но мы не можем исключить, что они могли бы быть значительными, если бы размер выборки был бы больше.

Преобладание генотипа Haarlem в нашем населении приобретает особое значение в свете предыдущих исследований, демонстрирующих способность этого генотипа вызывать вспышки МЛУ-ТБ, как сообщается в Аргентине [23], Чешской Республике [39], Тунисе [40] и Польши [41]. По сравнению с перуанскими данными по всей стране был обнаружен высокий показатель MDR среди новых пациентов с туберкулезом легких с положительным мазком с неизвестными факторами риска для MDR, проживающих в Северной Лиме (5,3% против 7,5% соответственно) [4]. Мы также наблюдали высокую частоту H-монорезистентности (8,6%) и общую высокую H-резистентность (22,3%) среди изолятов, но ни одна из линий не обнаруживала значительную связь с первичной резистентностью MDR или H.

У нашего исследования есть некоторые ограничения. Во-первых, поскольку это было исследование пассивного наблюдения, были включены только пациенты, посещающие медицинские учреждения в государственном секторе. Во-вторых, выбор пациентов без известных факторов риска основывался на самоотчете пациента, который мог бы замаскировать некоторые факторы риска, и, следовательно, переоценивать показатели МЛУ-ТБ среди пациентов с низким риском. В-третьих, отсутствие кластеров может быть связано с относительно коротким периодом исследования и исключением пациентов с факторами риска.

Таким образом, популяционная структура комплекса M. tuberculosis среди пациентов с неизвестными факторами риска для МЛУ-ТБ была разнообразной, в том числе 44 разных сполиготипа, но ни один из них не был связан с возрастом или с какой-либо моделью резистентности. Будущие перспективные исследования на уровне сообществ должны быть направлены на то, чтобы точно оценить генетическую изменчивость M. tuberculosis в районах повышенного бремени и проанализировать их взаимосвязь с МЛУ-ТБ.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Задуманные и разработанные эксперименты: FB, LO, CS, LR. Выполняли эксперименты: FB, JC, BA, LR. Анализировали данные: FB, LO, JC, BA, BCJ, LR. Написал документ: FB, LO, BCJ, CS, LR. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Доступ к этой публикации можно получить здесь:

хттп://ввв.биомедцентраль.ком/1471-2334/13/397/препуб

Мы благодарим наших полевых работников за сбор данных и образцов и сотрудников медицинских учреждений за их постоянную поддержку в проведении исследования. Это исследование было профинансировано Бельгийским Генеральным директоратом по сотрудничеству в целях развития (DGDC) посредством институционального сотрудничества между Институтом тропической медицины в Антверпене, Бельгия и Институтом Медицины Тропического Александра фон Гумбольдта в Лиме, ​​Перу.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *