Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Собственная, простая и экономичная фаговая техника для быстрого выявления резистентности рифампицина, изониазида, этамбутола, стрептомицина и ципрофлоксацина с использованием изолятов Mycobacterium tuberculosis

In-house, simple & economical phage technique for rapid detection of rifampicin, isoniazid, ethambutol, streptomycin & ciprofloxacin drug resistance using Mycobacterium tuberculosis isolates
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3401714/

Множественная лекарственная устойчивость (MDR) среди Mycobacterium tuberculosis представляет серьезную терапевтическую проблему. Раннее выявление МЛУ может быть ценным, но обычные тесты на восприимчивость к препаратам занимают 4-6 недель после лабораторной изоляции M. tuberculosis. Сообщалось о бактериальном фаговом анализе как быстром инструменте для тестирования чувствительности рифампицина к туберкулезным бациллам с использованием суспензии изолированных культур. Настоящее исследование было направлено на создание фагового анализа для тестирования чувствительности препарата к изониазиду (INH), рифампицину, этамбутолу, стрептомицину и ципрофлоксацину в изолятах M. tuberculosis.

Бульон Мюллера-Хинтона вместо бульона Среднего Брукного 7H9 использовался, чтобы сделать его более экономичным. Анализ фага сравнивали с методом пропорции с использованием 100 M. tuberculosis изолятов из случаев туберкулеза легких. Результаты анализа фага были доступны в течение 48 ч для рифампицина и стрептомицина, в то время как для ННГ, этамбутола и ципрофлоксацина требовалось 72 часа. Анализ сравнивали с методом пропорции золота. Интерпретация результатов была простой и ясной.

В настоящем исследовании чувствительность и специфичность фагового анализа по сравнению с методом пропорций находились в диапазоне от 97 до 100% для всех лекарственных средств, за исключением ципрофлоксацина, для которого он составлял 93 и 96% соответственно.

Анализ фагов был экономичным, легким в использовании и быстрым для выявления резистентности к лекарственным средствам в изолятах M. tuberculosis без необходимости дорогого оборудования. Это находится в пределах досягаемости микробиологических лабораторий в развивающихся странах с высокими нагрузками туберкулеза.

Появление туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ) и, в последнее время, туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ) представляет собой серьезную угрозу для глобальных программ борьбы с туберкулезом12.

Множественный лекарственно-устойчивый туберкулез (МЛУ-ТБ), вызванный изолятами, устойчивыми по меньшей мере к изониазиду (INH) и рифампицину, создает тревожную проблему для успешного лечения туберкулеза3. Показатель распространенности МЛУ-ТБ в Индии составляет около 3% среди новых случаев, 12% среди случаев предварительной обработки4 и тревожных 17% среди пациентов, которые ранее лечились и развивали множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Сообщалось о MDR-TB4 почти во всех частях мира, прежде всего в результате плохого и нерегулярного лечения, что привело к увеличению затрат на лечение, а также к увеличению риска передачи этих резистентных штаммов бацилл.

Быстрое выявление МЛУ-ТБ может помочь в эффективном управлении такими случаями. Программа DOT plus разрабатывается в Индии и других странах с высоким уровнем ТБ5. Тем не менее, существующие фенотипические методы оценки восприимчивости препарата к туберкулезу Mycobacterium медленны и занимают 4-6 недель после лабораторной изоляции организмов. Быстрые методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), рассматриваются как альтернативный подход для выявления МЛУ, но обнаружение только резистентности к рифампицину через мутацию гена rpoB6-9 приобрело уверенность, тогда как в случае изменений INH в резистентном генах возникает проблема. Сообщалось также о методах на основе микобактериофагов для выявления жизнеспособных бактерий в клинических образцах1011, а также для тестирования антимикробной восприимчивости12-22.

Анализы на основе микобактериофага зависят от способности резистентных микобактерий поддерживать репликацию фага после воздействия на наркотики, тогда как чувствительные бактерии инактивируются и, следовательно, не способны поддерживать фаговую инфекцию. Внеклеточные фаги инактивируются вирулицидным агентом, тогда как внутриклеточные фаги защищены и реплицируются, вызывая их лизис и высвобождение нового потомства фага, обнаруженного при образовании бляшек на быстрорастущем газоне M. smegmatis (индикаторный штамм). Выпущенные фаги можно визуализировать на индикаторных пластинах в виде прозрачных областей (бляшек) на лужайке быстрорастущего M. smegmatis12. Этот изобретательный метод не требует специализированных лабораторных навыков или сложного оборудования.

Целью настоящего исследования было создание фагового анализа для чувствительности к лекарственным средствам к изониазиду, рифампицину, этамбутолу, стрептомицину и ципрофлоксацину с использованием суспензии изолятов M. tuberculosis и для сравнения его с долевым методом.

Изоляты Mycobacterium: В исследовании было включено в общей сложности 100 последовательных изолятов M. tuberculosis из респираторных образцов случаев туберкулеза легких, которые были переданы в отдел микробиологии больницы и исследовательского центра Choithram (CHRC), Индор, Индия, в период с января 2009 года по сентябрь 2010 года. Протокол исследования был одобрен Исследовательским и этическим комитетом CHRC, Индор. Для контроля качества каждой партии использовали стандартный штамм штаммов M. tuberculosis H37Rv и M. tuberculosis, устойчивых к лекарствам и поддерживаемых в лаборатории. M. tuberculosis был идентифицирован с использованием стандартных биохимических тестов23 и 3-4 старой культуры на среде Lowenstein-Jensen (LJ) использовали для изготовления суспензий для тестов восприимчивости к лекарственным средствам.

Стандартизация фагового анализа. Были проведены обширные работы по стандартизации для оптимизации следующих условий: жидкая среда для культивирования M. smegmatis; оценка различных твердых сред для анализа фагов; размер инокулята M. smegmatis для индикаторной пластины; плотность суспензии M. tuberculosis; отсечение для учета количества бляшек для чувствительных и устойчивых M. tuberculosis; оптимальная концентрация препаратов для воздействия M. tuberculosis; время воздействия препарата на M. tuberculosis; и концентрация и время воздействия сульфата аммония (FAS) для уничтожения внеклеточных фагов.

Реализованные адекватные средства управления были включены для работы по стандартизации для определения оптимальных условий.

Протокол анализа фага для тестирования чувствительности к лекарственным средствам: суспензию изолятов M. tuberculosis готовили в бульоне Muller-Hinton (M-H) в пластиковых пробирках, содержащих 8-10 стеклянных шариков. Инокулят был отрегулирован на трубку № 1 Макфарлэнд. INH, этамбутол и стрептомицин (Sigma-Aldrich Chemicals GmbH, Steinheim, Германия) в дистиллированной воде производили исходные растворы (10 мг / 10 мл) и фильтровали через мембрану размером пор 0,2 мкм. Рифампицин и исходные растворы ципрофлоксацина получали в диметилформамиде (Sigma, США). Все исходные растворы были аликвоты и сохранены при -70 ° C до использования.

Рабочий раствор готовят в бульоне MH (BD Difco, США). Используемые концентрации лекарств: INH (0,4 мкг / мл), рифампицин (2 мкг / мл), этамбутол (16 мкг / мл), стрептомицин (2 мкг / мл) , и ципрофлоксацина (4 мкг / мл). Обычный контроль M-H без лекарственного средства служил контролем.

Агар M-H с добавлением 0,4% глицерина и 1% глюкозы использовали для разливки пластин в фаговом анализе. M. smegmatis mc2155 использовали для распространения микобактериофагов на агаре M-H. Микобактериофаг (D29) размножался на M. smegmatis, как описано ранее [24]. Супернатант, содержащий фаги, пропускали через 0,22 мкм мембранную мембрану Millipore и хранили при -20 ° C. Титр фага определяли с использованием стандартного теста пятна24.

Изоляты M. tuberculosis подвергались воздействию рифампицина в течение 24 часов, в то время как время воздействия на другие препараты составляло 48 часов (на основе нашей предварительной работы и других исследований) 11-21. Концентрации препаратов, используемых для анализа фага, также основывались на нашем предварительном исследовании (неопубликованном). Анализ проводили в 10-миллилитровых пластиковых колпачках (Nunc, США). Пятьсот микролитров суспензии M. tuberculosis смешивали с 500 мкл лекарственного средства. Дикие лекарственно-устойчивые штаммы (лабораторные изоляты) и M. tuberculosis H37Rv были включены во все партии. Пробирки инкубировали в течение 24/48 ч при 37 ° С.

Микобактериофаг D29 (200 мкл, 108 БОЕ / мл) добавляли в соответствующие пробирки и инкубировали в течение 90 мин при 37 ° С. Внеклеточные фаги инактивировали 200 мкл фагицидного агента сульфата аммония железа (рабочая концентрация 30 мМ) (Merck, Индия) со временем контакта 10 мин. Содержимое пробирок переносили в 10 мл бульона M-H в пробирке 18 × 150 мм и вихревые. Один мл смеси бульона и 1 мл суспензии M. smegmatis дозировали в стерильной одноразовой чашке Петри (90 мм); и добавляли 10 мл расплавленного M-H-агара, дополненного глицерином и глюкозой, и перемешивали путем вращения по часовой стрелке и против часовой стрелки. Планшеты оставляли на 10 мин для отверждения и переносили в инкубатор при 37 ° С в течение ночи. Результаты анализировали путем подсчета бляшек. В контрольных пластинах количество бляшек варьировалось от 90-150 на планшете. Изоляты считались резистентными, если уменьшение количества бляшек составляло менее 80% по сравнению с контрольной пластинкой и было восприимчиво, если наблюдалось снижение более чем на 80%.

Тест на восприимчивость к лекарственным средствам по методу пропорций: метод пропорции 25 проводили с использованием среды L-J. Использовали рекомендуемые критические концентрации 25 INH 0,2 мкг / мл, рифампицин 40 мкг / мл, этамбутол 2 мкг / мл, стрептомицин 4 мкг / мл и ципрофлоксацин 2 мкг / мл. Первое чтение было сделано после 28 дней инкубации, а второе — на 42-й день. Процентное сопротивление (R) рассчитывали как отношение количества колоний в среде, содержащей лекарственное средство, к количеству, находящемуся на контрольной среде.

Статистический анализ: данные анализировались с использованием байесовской теоремы, 2 × 2 таблиц непредвиденных ситуаций для расчета чувствительности, специфичности, положительного прогностического значения (PPV) и отрицательного прогнозирующего значения (NPV) с использованием статистического программного обеспечения StatDirect версии 2.7.2, Великобритания. Тест McNemar был применен с использованием Graphpad software Inc., США (тест с двумя хвостами), где каждый изолят был сопоставлен для анализа фагов и пропорции.

Из тестируемых 100 штаммов туберкулеза M. 58 (58%) были устойчивы к INH, 43 к рифампицину, 55 изолятам стрептомицина, 32 к этамбутолу и 28 изолятам были устойчивы к ципрофлоксацину по долевому методу. Сорока изоляты были устойчивы как к рифампицину, так и к ИНГ (то есть МЛУ) по долевому методу.

Когда сравнивали фаговый анализ с методом пропорции, 57 из 58 устойчивых к ИНО изолятов и 41 из 42 чувствительных изолятов были правильно идентифицированы с помощью анализа фага (таблица). Разногласия для анализа фагов наблюдались среди двух изолятов. Чувствительность анализа микобактериофага при выявлении резистентности к ИЯН составила 98%; и достигнутая конкретность также составила 98 процентов. Как положительные, так и отрицательные предсказательные значения составляли 98 процентов.

Сравнение фаговых и пропорциональных методов определения чувствительности M. tuberculosis

В случае рифампицина, как устойчивые, так и чувствительные изоляты были правильно идентифицированы с помощью анализа фага. Чувствительность анализа микобактериофага при выявлении резистентности к рифампицину составляла 100%; и достигнутая конкретность также составляла 100 процентов. Положительные и отрицательные предсказательные значения также составляли 100% для обоих. Чувствительность и специфичность для этамбутола составляли 97% для обоих. Положительные и отрицательные прогностические значения составили соответственно 94 и 99 процентов. Чувствительность и специфичность для ципрофлоксацина были соответственно 93 и 96%. Положительные и отрицательные предсказательные значения составляли соответственно 90 и 97%. Каждый изолят проверяли на предмет чувствительности к лекарственному средству как по методу обычной пропорции, так и по фаговому анализу, и, таким образом, были сформированы согласованные пары, позволяющие проводить тест МакНемара.

Анализ на основе фага был разработан Уилсоном и его коллегами22 и применялся для тестирования чувствительности к рифампицину и изониазиду для клинических изолятов M. tuberculosis. Коммерческий анализ фагов доступен только для выявления резистентности к рифампицину2627. Следовательно, настоящее исследование было направлено на стандартизацию внутреннего фагового анализа для всех выявлений резистентности к противотуберкулезным препаратам первой линии. Фторхинолоны широко используются вместе с другими противотуберкулезными препаратами и, следовательно, также включены в настоящее исследование.

Средняя среда ручья 7H9 была заменена бульоном Мюллера Хинтона, чтобы сделать анализ экономичным. Стоимость коммерческого анализа фагов (FASTPlaque TB-RIF, Biotec Laboratories Ltd, Великобритания) для резистентности к рифампицину составляет более 500 на тест, в то время как стоимость расходных материалов для внутреннего анализа на основе фагов составляет менее 50 на один препарат на один изолят.

В настоящем исследовании чувствительность и специфичность фагового анализа по сравнению с методом пропорций находились в диапазоне от 97 до 100%, а для ципрофлоксацина — 93 и 96% соответственно. Данные о положительных и отрицательных прогностических значениях благоприятствовали использованию внутреннего анализа фагов.

Сокращение количества бляшек> 80% считалось восприимчивым к препарату в настоящем исследовании. Однако в случае чувствительных к рифампицину и стрептомицину изолятов наблюдалось более 99% снижения количества бляшек. Это, по-видимому, связано с высокой и быстрой бактерицидной активностью препаратов для Mycobacterium. Другой анализ на основе микобактериофага, анализ фагового репортера люциферазы (LRP) показал 99-процентное снижение светового сигнала после инкубации в течение ночи восприимчивых изолятов со стрептомицином28. Эти два препарата требовали более короткого времени воздействия (24 ч) по сравнению с другими препаратами, которые требовали 48-часового воздействия, как наблюдалось в другом исследовании19. Способ действия лекарственного средства также может быть фактором, способствующим, например, активность на уровне транскрипции / трансляции (стрептомицин, рифампицин) и уровень клеточной стенки (INH, этамбутол) 29.

Наши результаты были сопоставимы с другими исследованиями для рифампицина1415172030, INH и стрептомицина12161821. В случае фторхинолонов только два исследования сообщили об анализе фага1231, а информация для этамбутола 11 скудна.

Молекулярные методы имеют ограничения, поскольку ПЦР направлена ​​к конкретному мутанту. Такая сложность не возникает для анализа на основе фагов, поскольку они зависят от жизнеспособности после воздействия лекарственного средства.

Определение резистентности к лекарственным средствам на прямых клинических образцах, таких как мокрота, будет иметь огромную ценность, поскольку оно снизит время отчетности до 2-3 дней на прямых образцах.

В заключение, внутренний фаговый анализ, стандартизованный для определения резистентности к лекарственным средствам в суспензии культуры M. tuberculosis, показал высокую чувствительность и специфичность, и результаты были доступны в течение 2-3 дней. Анализ был экономичным и доступным для микробиологических лабораторий в развивающихся странах. Общее согласование с методом пропорций было хорошим.

Эта работа была поддержана грантом молодых ученых схемы SR / FT / L-116/2006 от DST (Департамент науки и техники), Нью-Дели, Индия.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *