Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Подход CRISPR / Cas9 показывает, что полимеразная активность ДНК-полимеразы β может быть пригодна для инфицирования ВИЧ-1 в делящихся и неразделенных клетках

A CRISPR/Cas9 approach reveals that the polymerase activity of DNA polymerase β is dispensable for HIV-1 infection in dividing and nondividing cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5572920/

Под редакцией Чарльза Э. Самуэля

Интеграция ретровирусов в геном хозяина основана на нескольких ферментах-хозяевах, которые потенциально включают ДНК-полимеразу β (Pol β). Однако неясно, является ли человеческий Pol β существенным для репликации лентивируса в клетках человека. Здесь мы отменили экспрессию ДНК-полимеразы β (Pol β) путем нацеливания ее ДНК-полимеразной области на CRISPR / Cas9 в человеческих моноцитарных клетках THP-1 для исследования роли Pol β в трансдукции ВИЧ-1 как на делящихся, так и на недеформирующих стадиях макрофагов THP -1. Pol β-нокаут был подтвержден повышенной чувствительностью к повреждению ДНК, вызванному метилметансульфонатом. Следует отметить, что ядерные экстракты из выщелачивающих TNP-1 клеток Pol β, полученных как на делящихся, так и на недефицированных стадиях, демонстрировали значительно уменьшенную способность восстанавливать промежуточный ДНК-субстрат, инфицированный ВИЧ-1, в биохимическом моделировании. Однако ядерный экстракт как на делящихся, так и на недефицирующих стадиях клеток Pol β-KO обнаруживал активность восстановления разрывов, что указывает на то, что другие ДНК-полимеразы хозяина также восстанавливают ДНК с генотипом ВИЧ-1, особенно в делящихся клетках. Затем, когда мы сравнивали трансдукцию с использованием вируса ВИЧ-1 и вируса иммунодефицита обезьян в контрольных клетках Pol β-KO, потеря экспрессии Pol β не влияла на эффективность трансдукции этих лентивирусов как на делящихся, так и на делящихся стадиях. Наконец, анализ восстановления пробела показал, что ограниченные клеточные dNTP-пулы, но не экспрессия Pol β, являются первичным фактором для восстановления разрыва ДНК ВИЧ-1, особенно в незараздельных клетках. Эти данные подтверждают идею о том, что активность Pol β-полимеразы применима для заражения ВИЧ-1 как на делящихся, так и на недефицированных стадиях клеток человека, нацеленных на вирус.

Одним из отличительных признаков репликации ретровирусов является интеграция вирусной ДНК в хромосому хозяина инфицированных клеток. Интеграция лентивирусов, таких как вирус иммунодефицита человека Тип 1 (ВИЧ-1) и вирус иммунодефицита обезьян (SIV) 2 требует высококоординированных действий как вирусных, так и принимающих игроков. После того, как вирусная двухцепочечная (ds) ДНК синтезируется из вирусной геномной РНК с помощью обратной транскриптазы (RT), ряд вирусов и белков-хозяев координируют для сборки комплекса предварительной интеграции, который переносит вирусную dsDNA в ядро, где он вставляется в хромосому хозяина (1). Процесс интеграции состоит из трех различных и последовательных этапов: 1) 2-3 нуклеотида удаляются из обоих 3′-концов вирусной dsDNA с помощью вирусной интегразы (IN); 2) 3′-концы вирусной dsDNA ковалентно связаны с хромосомной ДНК хозяина путем переэтерификации, катализируемой IN (2); и 3) 4-6 нуклеотидный одноцепочечный (ss) разрыв ДНК между 5′-концом вирусной ДНК и 3′-конца хромосомной ДНК хозяина заполняют и лигируют после удаления несоответствий на 5′-концах вирусной ДНК (3), что приводит к полностью интегрированному провирусу. Хотя вирусная IN катализирует первые два этапа, считается, что третья стадия в основном выполняется механизмом восстановления ДНК хозяина (4).

Среди белков-хозяев, участвующих в процессе восстановления ДНК, ДНК-полимераза β (Pol β) считается ферментом, ответственным за заполнение пробега ссДНК, возникающего в результате вирусной интеграции (4). Известно, что Pol β действует в восстановительном ремонте основания (BER), который восстанавливает повреждение ДНК в результате таких источников, как алкилирующие агенты и реакционноспособные виды кислорода (5). Сообщалось об аберрациях в экспрессии и активности Pol β при различных раковых заболеваниях (6-8). Недавно в исследовании сообщалось, что нокдаун Pol β с помощью RNAi в клетках HeLa снижает трансмиссию ВИЧ-1 в целевом экране репарационных ферментов ДНК (9). Кроме того, снижение инфицированности ВИЧ-1 и FIV сообщалось в эмбриональных фибробластах мыши у животных POLB — / — (10). Результаты этих исследований подтверждают роль Pol β и других ферментов BER в интеграции лентивирусов. Наша лаборатория также сообщила, что иммунодеплекс Pol β из первичного CD4 + Т-клетка и макрофагальный ядерный экстракт снижает биоремическую активность в восстановлении активности ссДНК ВИЧ-1 (11). Тем не менее, генетические данные, разъясняющие роль человеческого Pol β в репликации лентивируса в клетках человека, еще не сообщаются.

Еще одной уникальной особенностью лентивирусов по сравнению с другими членами семейства Retroviridae является способность реплицироваться как в делящихся, так и в неразделенных клетках (12). В случае ВИЧ-1 и SIV активированные CD4 + Т-клетки и макрофаги, соответственно, представляют собой важные мишени инфекции в рамках этой классификации. Поскольку в недеяющих клетках отсутствует синтез хромосомной ДНК, вполне вероятно, что механизмы репарации ДНК, используемые лентивирусами во время интеграции, могут регулироваться по-разному между этими двумя типами клеток. Фактически, для решения вопросов, связанных с делящими и не делящимися клетками-мишенями, широко использовалась модель клеток THP-1, линия клеток моноцитарной лейкемии, поскольку разделение клеток THP-1 можно дифференцировать с неделяющим макрофагоподобным фенотипом путем обработки форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA) (13, 14).

В настоящем исследовании мы создали новые линии клеток POLB KO THP-1 с использованием системы CRISPR / Cas9 (15). Эти клеточные линии KO были проверены и показаны как демонстрируют повышенную чувствительность к алкилирующим агентам, так и отсутствие эффективной восстановительной активности зазора ssDNA in vitro. В отличие от предыдущих отчетов, которые показали более выраженное снижение эффективности вирусной трансдукции в клетках человека с нокаутом Pol β и мышечных нокаутирующих клетках (9, 10), мы наблюдали лишь незначительные, но статистически значимые эффекты потери Pol β на ВИЧ- 1 и эффективности трансдукции SIV как в делящихся, так и безразмерных клетках POLB KO THP-1. Кроме того, мы показываем, что скорость восстановления разрыва ssDNA ограничена в физиологических концентрациях dNTP, которые далее ограничены в неразделенных клетках. Наши результаты показывают, что Pol β не является существенным для восстановления разрыва ssDNA во время трансляции lentiviral как в делящихся, так и в неразделенных клетках. Кроме того, этот процесс восстановления кинетически ограничен концентрациями клеточного dNTP, в частности, в незараздельных клетках.

Ранее сообщаемые (10) клеточные модели POLB KO, используемые для изучения репликации ВИЧ-1, были получены от мышей, которые не могут точно воспроизвести нормальную среду хозяина приматов-лентивирусов. Кроме того, для изучения роли человеческого поля β в интеграции ВИЧ использовались только тесты на основе RNAi (9). Чтобы создать новую и соответствующую клеточную модель человека, мы использовали LentiCRISPRv2 (15), лентивирусную векторную систему доставки CRISPR / Cas9, экспрессирующую целевую sgRNA, нуклеазу Cas9 и маркер выбора пуромицина, чтобы индуцировать делецию POLB. Мы выбрали последовательности однонаправленной РНК (sgRNA) (фиг.1A) из базы данных CRISPR KO (GeCKO) генома масштаба, нацеленной на две разные области вблизи активного участка полимеразы субдомена Pol β palm (фиг.1B). Более конкретно, sgRNA1 нацеливает экзон 10 гена POLB, область в высокоструктурированной области пальмы, которая кодирует триаду связывания металла, сайт связывания dNTP, сайт связывания праймера и активный сайт. sgRNA2 нацеливает экзон 9 и соответствует структурированному участку в области пальмы, близкому к активному сайту, но не кодирует непосредственно каталитические остатки.

Генерация клеточных линий POLB KO THP-1 CRISPR / Cas9.
A, sgRNA, используемые в этом исследовании. Нуклеотидные числа в экзоне 10 (sgRNA1) или экзоне 9 (sgRNA2) гена POLB указаны как индекс. B, отображение белка Pol β и гена POLB. sgRNA1 и sgRNA2 в пределах экзонов 10 и 9 соответственно. Обе цели находятся в пределах области кодирования, которая соответствует пальмовому субдомену ДНК-полимеразной области. Показаны аминокислотная нумерация и субдомены белка Pol β. Номера экзонов указаны для гена POLB. C, ядерные экстракты были выделены из делящихся (-PMA) или недифференцирующих макрофагов (+ PMA) стадий ТНР-1 клеток. Ядерные экстракты (10 мкг / л) из THP-1 дикого типа (WT), пустого векторного контроля (CTRL) и клеток POLB KO THP-1 (KO1 и KO2) зондировали моноклональным антиполевым антителом, нацеленным на С-концевой области. Блоты были удалены и повторно исследованы для β-актина в качестве контроля загрузки. Позиции маркеров молекулярной массы указаны на левой стороне пятна. Результаты представляют собой два независимых эксперимента. Были выделены геномные ДНК из клеток WT THP-1, CTRL, KO1 и KO2 и секвенированы ПЦР-ампликоны, фланкирующие области, подвергнутые CRISPR / Cas9. Показаны выравнивания последовательностей оснований 18898-18957 (экзон 9) (D) и 22845-22904 (экзон 10) (E) гена POLB. Нумерация основана на всей последовательности гена POLB с использованием эталонного гена RefSeq NM_002690.2.

Затем мы выбрали человеческую моноцитарную линию клеток THP-1 для POLB KO, поскольку эта клеточная линия может быть эффективно инфицирована ВИЧ-1 и может быть дифференцирована на стадию безразличного макрофага путем обработки PMA. Клетки THP-1 трансдуцировали с каждым из сконструированных лентивирусных векторов, включая пустой вектор, в качестве контроля. После трансдукции, селекции пуромицина и одноячеистой сортировки клональные клетки были расширены и оценены для успешного ПОЛБ KO с помощью Вестерн-блот-анализа как на делящихся (-PMA), так и на неразделенных, дифференцированных стадиях (+ PMA) (рис.1C). Мы выделили геномные ДНК из клонов с кунт-блоттингом, секвенированные экзоны 9 (фиг.1D) и 10 (фиг.1E) POLB, а затем выбрали один клон, соответствующий каждой sgRNA для дальнейшей характеристики. Мы обнаружили, что клон, отредактированный с помощью sgRNA1 (KO1), имел несколько точечных мутаций вблизи целевого сайта, которые индуцируют изменения аминокислот и делецию отмены каркасной пары с 7 основами, которая вводит преждевременный стоп-кодон ниже ~50 пар оснований удаления. Клон, отредактированный с помощью sgRNA2 (KO2), также имел несколько точечных мутаций вблизи целевой последовательности и 20-базовую парную отмену сдвига кадров, которая вводит преждевременный стоп-кодон ~100 базовых пар вниз по течению. Кроме того, клональные клетки ТНР-1, трансдуцированные вектором переноса LentiCRISPRv2, не содержащим вставку sgRNA (пустой вектор), были выбраны для использования в качестве контроля, который экспрессирует Pol β как на делящихся, так и на недефицирующих стадиях, в соответствии с тем, что мы наблюдали в родительском THP-1 клеток (фиг.1С). Эти данные обеспечивают достаточные молекулярные и генетические доказательства того, что выбранные клоны были нулевыми по POLB, чтобы продолжить дальнейший функциональный анализ.

POLB KO подтвержден в предыдущих сотовых системах с использованием чувствительности к MMS (5, 17), что вызывает повреждение ДНК, восстановленное по пути BER. Мы обработали наши клоны THP-1, а также поликлональные родительские клетки THP-1 с диапазоном концентраций MMS и оценили чувствительность клеток к MMS с использованием анализа пролиферации клеток на основе XTT. Клеточные линии POLB KO, но не пустые клетки управления вектором, показали повышенную восприимчивость к MMS (фиг.2A), что согласуется с ранее опубликованными значениями с использованием методов ингибирования роста (5, 17).

Клетки POLB KO THP-1 чувствительны к повреждению ДНК, вызванному MMS. 2,5 × 104 ТНР-1 клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты на стадии разделения (А) или безразделения (В). Клетки WT THP-1, CTRL, KO1 и KO2 обрабатывали различными концентрациями ДНК-алкилирующего агента MMS в течение 2 часов. Клетки промывали три раза 1 × PBS и культивировали в течение 72 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с использованием анализа XTT, и значения были нормированы на необработанный контроль для каждой группы. Результаты двух независимых экспериментов, выполненных в трех повторениях, показаны как среднее ± S.D.

Кроме того, мы стимулировали клетки THP-1 с помощью PMA, чтобы индуцировать макрофагоподобный фенотип, как описано ранее (13). В этом состоянии клетки THP-1 уменьшали концентрации dNTP (18) и не отличались небольшим синтезом клеточной ДНК (см. Рис. S1). Затем мы проверили, были ли чувствительные к повреждению ДНК MMS-клетки не разделяющие клетки THP-1. Неизлучающие клетки KO1 и KO2 проявляли чувствительность к повреждению ДНК, вызванному MMS, по сравнению с родительскими клетками THP-1 и CTRL (фиг.2B), сходными с результатами, наблюдаемыми при делении клеток THP-1. Основываясь на этих функциональных результатах, мы пришли к выводу, что клеточный фенотип, представленный нашими клетками POLB KO, согласуется с ранее сообщенными результатами и подтверждает обоснованность нашего молекулярного анализа.

Ранее мы сообщали о анализе in vitro, который имитирует механизм восстановления однонитевой ДНК-щели, который возникает во время стадии интеграции ВИЧ-1 с использованием ядерных экстрактов (11). Эта система требует трех ферментативных шагов для получения продукта восстановления зазора на 50 мл, как показано на фиг.3А: 1) синтез ДНК из 5′-конца 5′-конца праймера ДНК через четырехнуклеотидный промежуток, генерируемый из отжиг 3′-ДНК-праймера; 2) смещение и удаление несогласованного однонуклеотидного клапана; и 3) лигирование расширенных 5 ‘и 3’-праймеров, генерирующих 50-мерный отремонтированный продукт.

Влияние POLB KO на активность восстановления биохимической активности ссДНК с субстратом ДНК с разрывом ВИЧ-1. Заполнение лентивирусного промежутка смоделировали in vitro с использованием ранее сообщенного анализа (13). A, схематическое описание шагов, необходимых для полного ремонта модельного субстрата на основе LTR ВИЧ-1. 5′-концевой 32P-меченый 20-мерный олигонуклеотидный праймер (красные звезды) и немеченый 27-мерный олигонуклеотидный праймер с единственным несоответствием 5′-конца отжигают до 50-мерного олигонуклеотидного шаблона. Расширение меченого праймера ДНК-полимеразами дает продукты 21-24-mer (обозначенные синей стрелкой), которые требуют удаления рассогласования и лигирования с немеченой 27-меркой для образования меченого продукта восстановления на 50 меринов. B, 20 нм промежуточный ремонтный субстрат инкубировали с 4 мкг ядерного экстракта из клеток WT THP-1, CTRL, KO1 и KO2 в присутствии 250 мкМ dNTP и 2 мм ATP. Реакции инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин, затем гасили 40 мм ЭДТА и инактивировали при 95 ° С в течение 1 мин. Субстрат также инкубировали с ядерным экстрактом WT THP-1 в отсутствие dNTP (NC) при 37 ° C в течение 30 минут (NC). Продукты разрешали мочевиной-ПААГ на 20% акриламидном геле и визуализировали фосфоримацией. Показаны нерасширенный субстрат 20-Мер, 24-мерный промежуточный продукт (включая частично расширенные продукты, обозначенные скобкой) и 50-мерный полностью отремонтированный продукт. Результаты были количественно оценены с помощью денситометрии в ImageLab 5.2 (Bio-Rad). Количество восстановительного продукта рассчитывали как отношение плотности полос 50-мера к общей плотности на полосу и в зависимости от концентрации субстрата в каждой реакции. Результаты трех независимых экспериментов показаны как среднее ± S.D. Был выполнен двухсторонний анализ дисперсии, и для сравнения различий между линиями клеток и эффектом обработки PMA использовался множественный сравнительный тест Dunnett. ***, р <0,001. NS, не имеет значения.

Для проверки того, был ли рестрикционный разрыв ограничен в клетках POLB KO, мы приготовили ядерные экстракты из родительских THP-1, пустых векторных контролей, KO1 и KO2-клеток как на делящихся (-PMA), так и на неразделенных (+ PMA) стадиях, как описано ранее (11 ). Ядерные экстракты были нормализованы до 1 мг / мл общего белка с помощью анализа Брэдфорда и инкубированы с подложкой для восстановления радиоактивной метки, описанной в легенде на фиг.3А, с насыщающими dNTP (250 мкм) в течение 30 мин при 37 ° С. Как показано на фиг.3В, ядерные экстракты POLB KO1 и KO2 генерируют значительно уменьшенный 50-мерный отремонтированный продукт по сравнению с родительскими и контрольными клетками THP-1, экспрессирующими Pol β. Удивительно, однако, что ядерные экстракты POLB KO все еще отображали некоторые уровни частично расширенного 5′-праймера (см. «Скобка» на фиг.3B), поддерживая, что другие ДНК-полимеразы могут распознавать щелевой субстрат ВИЧ-1, тогда как Pol β быть первичной полимеразой, которая распознает субстрат. Кроме того, когда восстановленный продукт в каждой реакции количественно определяли (фиг.3C), существенной разницы в активности восстановления щели ДНК между делящими (-PMA) и незаразделяющимися (+ PMA) стадиями всех типов клеток, что указывает на то, что Pol β также основной полимеразой для восстановления разрыва ssDNA на стадии деления. Кроме того, это наблюдение подтверждается повышенной чувствительностью к MMS, наблюдаемой нами в клетках POLB KO, обработанных PMA (фиг.2B). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что генетическая потеря экспрессии Pol β значительно снижает, но не полностью отменяет активность восстановления разрывов в ссДНК ВИЧ-1 в модели THP-1.

В предыдущем докладе было показано, что эмбриональные фибробласты, полученные из мышей POLB — / -, проявили снижение трансдукции лентивируса по сравнению с клетками дикого типа (10). Однако эта модель не совсем уместна, поскольку мыши не переносят лентивирусы. Поэтому мы использовали наши человеческие клетки POLB KO THP-1 для проверки того, участвует ли человек Pol β в трансдукции ВИЧ-1. Для этого теста клетки пустого вектора THP-1, KO1 и KO2 были инфицированы на этапах деления и безразличия с псевдотипом GFP-репортера HIV-1 (DHIV3-GFP) VSV-G, который кодирует все гены NL4-3, за исключением env и nef, которые заменены на GFP (19). Как показано на фиг.4А, только незначительные различия в эффективности векторной трансдукции ВИЧ-1 относительно пустых векторных контрольных клеток наблюдались как на делящихся, так и на недефицированных стадиях клеток ТНР-1. Мы обнаружили, что эффективность трансдукции снижалась на ~ 20% как при делении KO2-клеток, так и на незащищенных клетках KO1. Мы также заметили, что POLB KO не равномерно снижает эффективность трансдукции другого лентивируса SIV (фиг.4B). Отсутствие однородного эффекта в этих данных свидетельствует о том, что человеческий Pol β не является абсолютно необходимым для трансдукции ВИЧ-1. Этот результат далее подтверждается биохимическими данными, представленными на фиг.3, что другие ДНК-полимеразы также могут распознавать разрывы ssDNA ВИЧ-1, хотя их способность восстанавливать зазор ВИЧ-1 менее эффективна, чем Pol β.

Влияние POLB KO на трансдукцию ВИЧ-1 в делящихся и неразделенных клетках THP-1. Клетки CTRL, KO1 и KO2 выращивали в суспензионной культуре для стадии разделения (-PMA) или обрабатывали 150 нм PMA (+ PMA) в течение 7 дней, чтобы дифференцироваться на стадию безразмерного макрофага. Клетки трансдуцировали с помощью VSV-G-псевдотипированного вектора ВИЧ-1 (A) или SIVmac239 (B), экспрессирующего GFP при множественности заражения 0,4 и анализируемого с помощью проточной цитометрии для измерения GFP, экспрессирующей популяцию, через 24 (деление) или 120 ч ( неразделение) пост-трансдукции. Данные сообщаются как среднее ± S.D. из трех независимых экспериментов, выполненных в трех повторениях. Данные анализировали путем одностороннего анализа дисперсии, и различия между KO и клетками CTRL определялись с помощью множественного сравнительного теста Dunnett. *, р <0,05. **, p <0,01. ***, р <0,001.

Ранее мы сообщали, что уровень клеточного dNTP в незараздельных клетках, таких как макрофаги, полученные из человеческих моноцитов, чрезвычайно низок (20-40 нм) по сравнению с делящимися клетками, такими как активированные CD4 + Т-клетки (1-4 мкм) (20). Крайне ограниченный пул dNTP в макрофагах кинетически подавляет обратную транскрипцию ВИЧ-1, которая потребляет клеточные dNTP-субстраты для синтеза вирусной dsDNA (21). Однако также ясно, что для устранения разрыва ДНК ВИЧ-1 во время вирусной интеграции требуются клеточные dNTP. Действительно, наш предыдущий анализ восстановления ДНК-пробела HIV-1 in vitro продемонстрировал, что концентрация клеточного dNTP влияет на восстановление разрыва ДНК ВИЧ-1 (11). Здесь мы проверили влияние концентрации dNTP на активность восстановления ДНК-разрывов ВИЧ-1 ядерного экстракта, полученного из нашей модели линии клеток THP-1. Для этого теста мы провели анализ восстановления разрывов ДНК в пробирке in vitro с использованием ядерных экстрактов из делящихся (-PMA) и незараздельных (+ PMA) стадий родительского THP-1 при концентрациях dNTP, обнаруженных в делящихся / активированных CD4 + Т-клетках (2,5 мкм) , не делящихся макрофагов (40 нм), а также насыщающей концентрации (250 мкм) (фиг.5). Мы измерили две популяции продукта: 1) полностью отремонтированный продукт (50-мерный продукт на фиг.5А и красные части в В и С) и 2) частично расширенный продукт (кронштейн на фиг.5А и синий в В и С ). Во-первых, уровни полностью восстановленного 50-мерного продукта были значительно снижены при концентрации внутриклеточного dNTP (2,5 мкм и 40 нм) по сравнению с насыщающими dNTP (250 мкм), хотя восстановительный продукт все еще обнаруживался в более поздние моменты времени на разделяющая концентрация dNTP ячейки (2,5 мкм). Однако полностью не восстановленный продукт не был обнаружен в концентрации dNTP без делительной ячейки (40 нм) даже в более поздние моменты времени. Во-вторых, эта восстановительная активность, зависящая от концентрации в dNTP, наблюдалась как в обработанных PMA, так и в необработанных клетках THP-1 (фиг.5A). В-третьих, когда мы количественно оценивали общий уровень расширения праймера, включающий как частично расширенные продукты, так и полностью отремонтированные продукты с 50 мерами, концентрация dNTP делящихся клеток (2,5 мкм) давала более высокие уровни (~ 48%) от общего расширенного продукта, чем концентрация макрофагов dNTP (~ 14%) в реакциях с экстрактом клеток, не обработанным PMA (фиг.5B), и аналогичная разница в полных расширенных продуктах также наблюдалась в реакциях с обработанными PMA клетками (фиг.5C). Эти данные моделирования подтверждают, что доступность внутриклеточных dNTP значительно влияет на восстановление разрыва ДНК ВИЧ-1 и что ограниченные пулы dNTP, а не экспрессия Pol β, являются первичным лимитирующим фактором для контроля восстановления разрыва ВИЧ-1 в незараздельных клетках, что по меньшей мере частично объясняет отсутствие эффекта POLB KO на инфекционность ВИЧ-1 на стадии деления клеток THP-1 (фиг.4).

Влияние концентрации dNTP на активность восстановления проксимальной активности ssDNA in vitro in vitro. Выделены ядерные экстракты из делящихся (-PMA) и неразделенных (+ PMA) стадий CTP-клеток THP-1, экспрессирующих Pol β. A, 20-нм промежуточный ремонтный субстрат инкубировали с 4 мкг ядерного экстракта из клеток CTRL в присутствии насыщающих (250 мкм), делящихся клеток (5 мкм) или концентрации неразделенных клеток (40 нм) dNTP и 2 мм АТФ ( необходимое для лигирования). Реакции инкубировали в течение 30, 60 или 120 мин. Данные трех независимых экспериментов были проанализированы с помощью денситометрии для количественного определения количеств полностью отремонтированных, частично расширенных (синяя скобка) и нерасширенных радиоактивно меченых праймеров, которые представлены как среднее ± S.D. для деления (B) и неразделенных (C) стадий пустых векторных контрольных клеток THP-1. Процент, составляемый каждым продуктом (отремонтированный, частично расширенный и нерасширенный), представлен красным, синим и серым полоскам соответственно. Средний процент, рассчитанный для каждого продукта, обозначается номером внутри соответствующего бара.

Интеграция генетической информации с помощью лентивирусов, таких как ВИЧ-1, представляет собой значительный барьер для искоренения вируса in vivo. Хотя все ретровирусы кодируют вирусную IN (1), ни один не кодирует ферменты, которые обрабатывают 5′-концы частично интегрированной вирусной dsDNA, субстрат, который требует относительно сложного удаления несогласованных пар оснований и восстановления разрыва ssDNA. Это включает в себя множество ферментативных функций, включая удаление несоответствующих оснований эндонуклеазой лоскута, полимеризацию ДНК и лигирование вновь синтезированной ДНК на хромосому хозяина (3). Провирус считается стабильно интегрированным только после того, как эти шаги были завершены. Поскольку, как известно, рестрикционная полимераза ДНК-хозяина ДНК β заполняет короткие разрывы ssDNA во время рутинной репарации клеточной ДНК, было высказано предположение, что Pol β участвует в восстановлении зазора лентивирусного 5′-конца ДНК. Это подтверждается результатами целевого экрана siRNA, который показал умеренное снижение трансдукции ВИЧ-1 в клетках HeLa, когда некоторые ферменты BER, включая Pol β, были сбиты (9). Эта работа была также подтверждена результатами, демонстрирующими умеренное снижение инфицированности ВИЧ-1 в эмбриональных фибробластах, полученных из мышей POLB — / — (10). Однако эти результаты не были подтверждены генетическими доказательствами в моделях клеток человека. Важно, что, насколько нам известно, настоящее исследование является первым, кто сообщает о клетках POLB KO человека и, следовательно, предоставляет наиболее полную систему моделирования восстановления пробела ВИЧ-1 в клетках человека на сегодняшний день.

Лентивирусы, такие как ВИЧ-1 и SIV, инфицируют окончательно дифференцированные, не разделяющие миелоидные клетки, такие как макрофаги (22, 23). Этим клеткам не хватает репликации хромосомной ДНК, деления клеток и имеют дополнительные механизмы, которые создают барьеры для репликации лентивирусов. Два таких механизма связаны с жестким контролем биосинтеза dNTP путем ингибирования рибонуклеотидредуктазы (24) и активации гидролиза dNTP стерильным мотивом и белком, содержащим HD-домен 1 (SAMHD1) (25, 26). Ранее мы показали, что, ограничивая концентрацию dNTP, неразделимые клетки ограничивают репликацию лентивируса как на этапах обратной транскрипции, так и на интеграцию (11). Поскольку большинство исследований, изучающих восстановление ДНК, сосредоточено на разделении клеток, последствия этих уникальных правил недостаточно понятны. На самом деле остается неясным, обладают ли такие терминально дифференцированные, неразделенные клетки полностью функциональной способностью репарации ДНК в отсутствие репликации хромосомной ДНК и в какой степени это контролируется клеточным типом. Репарация ДНК, связанная с транскрипцией, как представляется, функционирует в неразделенных клетках, но не была полностью охарактеризована (27). Интересно, что из-за жесткой регуляции dNTP, которая возникает в незараздельных клетках, клеточные ДНК-полимеразы, которые действуют на пути восстановления ДНК, могут работать неэффективно. Ранее сообщалось, что макрофаги поддерживают концентрации dNTP в диапазоне 20-50 нм (20), что намного ниже, чем указано в значениях Km любой известной клеточной ДНК-полимеразы (1-100 мкм) (28-30). Таким образом, неясно, что механизм восстановления ДНК в не делящихся линтивирусных клетках-мишенях способен эффективно выполнять ремонт на 5′-концевых промежутках в таких ограничительных условиях. Свидетельства, которые мы приводим здесь, являются первыми, кто сравнивает восстановление пробелов как в делящихся, так и в незаразделенных клетках, которые полностью не обладают экспрессией Pol β. Наши предыдущие результаты показали, что скорость восстановления пробела контролировалась концентрацией dNTP, но эти эксперименты проводились в клетках, которые выражали Pol β (11). Эти новые данные подтверждают значимость регуляции клеточного dNTP в определении скорости восстановления зашита лентивирусной ДНК.

В настоящем исследовании мы демонстрируем, что ВИЧ-1 и SIV реплицируются с небольшим ухудшением в клетках POLB KO как в делящихся, так и безразмерных условиях. Это открытие удивило нас, учитывая, что другие наблюдали снижение эффективности трансдукции в других системах с использованием мышиного POLB KO или человеческого POLB KD. Это привело нас к рассмотрению двух возможных сценариев: 1) другие ДНК-полимеразы, кроме Pol β, выполняют 5′-концевой ремонт дефекта частично интегрированной вирусной dsDNA, особенно в делящихся клетках, или 2) лентивирусы могут не требовать завершения 5-дюймового ремонта зазора транскрипция провирусной ДНК.

По первому сценарию мы рассмотрели другие нерепликативные ДНК-полимеразы. Pol β, Pol λ и Pol μ являются членами семейства ДНК-полимераз X и участвуют в восстановлении ДНК (31). Хотя Pol μ, по-видимому, функционирует в основном в созревании B-клеток в лимфоидной ткани, Pol λ, как известно, выступает в качестве резерва в реакциях BER с использованием клеточных экстрактов (32). Однако степень, в которой Pol λ может заполнить эту роль в незараздельных клетках, неизвестна. Напротив, Pol β конститутивно экспрессируется с увеличением экспрессии мРНК до и во время репликации хромосомной ДНК (33, 34) и после повреждения ДНК (35). Эти данные подтверждают роль Pol β в качестве первичной восстановительной полимеразы в незараздельных клетках, но не исключают возможности того, что другие ДНК-полимеразы могут выполнять ту же функцию в ее отсутствие. Действительно, наш анализ биохимического моделирования (фиг.3А) показал, что ядерные экстракты клеток POLB KO, в частности, полученные на стадии деления, отображают обнаруживаемую активность восстановления щели ДНК ВИЧ-1, что подтверждает возможность того, что другие ДНК-полимеразы могли распознавать и восстанавливать ДНК разрыва ВИЧ-1. Примечательно, что в условиях с насыщающими dNTPs скорость восстановления зазора снижалась более чем на 90% в клетках POLB KO (рис.3). Это указывает на то, что, хотя другие ДНК-полимеразы способны заполнять щель в отсутствие Pol β, процесс восстановления намного менее эффективен. Однако, когда этот эксперимент был повторен с использованием клеток POLB KO и различных концентраций dNTP, размер эффекта на скорость восстановления между клетками WT и POLB KO снижался в 10 раз с насыщающими dNTP до менее чем в 2 раза при физиологических концентрациях dNTP (см. S2). Эти данные помогают объяснить, почему мы наблюдали лишь небольшие различия в эффективности трансдукции между клетками WT и POLB KO (рис.4), тогда как анализ на разрыв в пробирке показал такой сильный эффект (рис.3). Поскольку восстановление ДНК-разрывов ВИЧ-1 абсолютно зависит от концентрации dNTP (фиг.5 и дополнительного рисунка S2), чрезвычайно ограниченные пулы dNTP, наблюдаемые в незараздельных клетках, а не экспрессия Pol β, могут быть основным фактором для контроля ВИЧ -1 Восстановление щели ДНК во время вирусной интеграции в незараздельных клетках. Примечательно, что концентрация dNTP умеренно повышается в незаразных клетках в ответ на повреждение ДНК с помощью р53-зависимой индукции гена p53R2, которая кодирует альтернативную небольшую субъединицу R2 из рибонуклеотидредуктазы (24, 36). Однако индукция р53R2 требует длительного воздействия повреждения ДНК и не вызвана инфекцией ВИЧ-1 (18, 36).

В дополнение к клеточной ДНК-полимеразе, RT способен заполнять промежуточный ДНК-промежуток посредством активности его вытеснения нити (4, 37, 38). Заполнение зазоров RT напрямую также объясняет отсутствие сильного влияния на эффективность трансдукции в клетках POLB KO, особенно в незараздельных клетках, где потенциальная роль RT в низких концентрациях dNTP может играть важную роль. Кроме того, имеются данные о том, что RT и IN непосредственно взаимодействуют (39), что может поддерживать локализацию RT до места интеграции, тем самым минуя потребность в клеточной ДНК-полимеразе. Однако неясно, сохраняется ли активность RT после того, как комплекс предварительной интеграции центрирует ядро, потому что обратная транскрипция происходит в основном в цитоплазме (1). Кроме того, заполнение зазоров RT не обойти необходимость в активности клеточной эндонуклеазы и лигазы, которая затем может действовать как этап ограничения скорости при ремонте, если заполнение зазором RT действительно эффективно.

По второму сценарию мы предположили, что немедленный ремонт 5′-конца LTR-разрыва может не понадобиться для репликации ВИЧ, особенно в незараздельных клетках. Ущерб от ДНК, обнаруженный при хромосомной репликации, приводит к активации механизмов ответа на повреждение ДНК, которые, в случае необходимости, вызывают остановку клеточного цикла и, в случае необходимости, апоптоз (40). Однако активированные CD4 + Т-клетки, инфицированные ВИЧ-1, подвергаются остановке клеточного цикла, индуцированной вирусным белком R (41), и, в конечном счете, к гибели клеток без возобновления клеточного деления. В некоторых инфицированных CD4 + Т-клетках, которые становятся спокойными, немедленная потребность в восстановлении ДНК также может быть обойдена, поскольку эти клетки больше не действуют на велосипеде. Такая же логика следует и для макрофагов, которые также не делятся. Наконец, неизвестно, влияет ли и как невосстановленный 5′-концевой промежуток на LTR влияет на транскрипцию ВИЧ-1. Кроме того, транскрипционные механизмы собираются в структурах, расположенных внутри LTR (1), что позволило бы избежать потенциально заторможенной процессинговости через 5′-концевой зазор. Хотя этот сценарий является чисто умозрительным, его можно протестировать с использованием методов для обнаружения невосстановленного 5′-конца разрыва ДНК ВИЧ-1. Однако в настоящее время нет надежного количественного анализа для измерения частично интегрированной ДНК ВИЧ-1, и мы не смогли адаптировать существующий анализ, используемый для выявления разрыва вируса лейкоза молочной железы (42).

В дополнение к активности ДНК-полимеразы как Pol, так и Pol λ имеют отчетливую активность 5′-2-дезоксирибоза-5-фосфатлиазы (43-45). Недавно сообщалось, что для эффективной трансдукции ВИЧ в эмбриональных фибробластах мыши (46) требуется активность Pol β 5′-2-дезоксирибоза-5-фосфатлиазы, но не полимеразная активность. В нашем исследовании мы рассмотрели, что, поскольку индуцированные CRISPR делеции были ниже по течению домена Pol β lyase, возможно, что фрагмент, сохраняющий эту активность, все еще может быть экспрессирован в наших клетках POLB KO. Мы исследовали ядерные экстракты из клеток WT и POLB KO THP-1 с использованием поликлонального антитела, выращенного против цельного белка Pol β, и не смогли обнаружить какую-либо конкретную полосу, которая могла бы представлять усеченную форму Pol β (данные не показаны). Хотя это предостережение, которое может объяснить нашу неспособность воспроизвести снижение инфекционности, важно отметить, что эти ранее сообщенные результаты основывались на экспрессии полноразмерной конструкции Pol β с точечными мутациями в активных участках полимеразы или лиазы. Поскольку наши клетки POLB KO не имеют почти всех пальмовых доменов и всего большого пальца, маловероятно, чтобы такой усеченный белок даже сохранял способность взаимодействовать с ДНК, даже если была выражена функциональная лиганда субдомена. Будущие эксперименты могут нацеливаться на лиазный домен Pol β, чтобы генерировать полное делецию, чтобы окончательно определить, является ли Pol β лиаза также доступной для репликации лентивирусов.

В заключение наши генетические биохимические исследования показали, что полимеразная активность Pol β, по-видимому, не пригодна для трансдукции ВИЧ-1 как в делящихся, так и в неразделенных клетках THP-1. Это исследование открывает новые возможности для рассмотрения в ремонте концевого промежутка ВИЧ-1: «рестрикция концевого пробела лентивирусной ДНК» может беспорядочно использовать клеточные ДНК-полимеразы и / или вирусную РТ во время интеграции или что немедленный ремонт 5′-концевого промежутка может не быть необходимо для репликации вируса.

Клетки THP-1 (ATCC TIB-202) культивировали в среде RPMI 1640 (Corning), дополненной 10% FBS и 1% пенициллином / стрептомицином в соответствии с рекомендованным поставщиком методом субкультивирования. Клетки THP-1 дифференцировали путем непрерывной стимуляции 150 нм PMA (Sigma) в течение 7 дней с заменой среды каждые 2 дня. Все клетки выращивали при 37 ° С, 5% СО2. Ячейки 293FT (Invitrogen) культивировали в DMEM (Gibco) с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина в соответствии с рекомендованным поставщиком способом субкультивирования. 293FT трансформировали для получения лентивирусного вектора, как описано ранее (21). Вкратце, клетки выращивали до 70% слияния и трансфецировали с использованием (Sigma) полиэтиленимином-комплексной плазмидной ДНК. Трансфекционную среду удаляли через 8 ч и супернатант собирали через 24 ч и через 48 ч после трансфекции. Супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр и концентрировали с использованием ультрацентрифуги Beckman Coulter Optima XE90. Концентрированные вирусные гранулы ресуспендировали в 1 × сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Gibco), аликвотировали и хранили при -80 ° C. Псевдовирусы продуцировали в клетках 293FT, ко-трансфицированных GFP-экспрессирующей лентивирусной плазмидой и pCMV-VSV-G (протеин вируса везикулярного стоматита под контролем быстрого и раннего энхансера и промотора цитомегаловируса) (47). Псевдовирус HIV-1 был получен с использованием pDHIV3-GFP (Nv4-3 на основе Δenv, Δnef) (19). SIV-псевдовирус был получен с использованием pSIV-GFP и pSIVΔvpx-GFP (на основе SIVmac239 Δenv) (48). Ядерный антиген измеряли с использованием p24 и p27 ELISA (Advanced BioScience Laboratories Inc.) и активность RT измеряли, как описано ранее (49).

Вход вектора псевдовируса нормализуется с помощью активности RT, затем клетки THP-1 инфицируют в присутствии 30 мкг / мл DEAE-декстрана (Sigma) в течение 2 ч, 3 раза промывают 1 × PBS (Gibco) и анализируют на экспрессию GFP 24 или 120 ч после трансдукции для деления и деления клеток соответственно. Измерение GFP проводили с использованием проточного цитометра MACSQuantVYB (Miltenyi Biotec), и данные анализировали с использованием программного обеспечения MACSQuantify (Miltenyi Biotec).

Плазмиды LentiCRISPRv2, нацеленные на POLB, были сконструированы с использованием ранее описанных способов (15, 16). Вкратце, бесплатные олигонуклеотиды, содержащие специфическую последовательность sgRNA и выступы, дополняющие выступы, продуцированные BsmBI перевариванием LentiCRISPRv2, были отожжены в BsmBI-расщепленную плазмиду LentiCRISPRv2 для генерации функционального вектора переноса. Непереваренная плазмида LentiCRISPRv2, не имеющая последовательности sgRNA, использовалась для получения псевдовируса в качестве контроля. Вектор LentiCRISPRv2 генерировали, как описано для псевдовирусов ВИЧ-1 и SIV, за исключением того, что плазмида psPAX2 (Addgene) была совместно трансфицирована плазмидами LentiCRISPRv2 (15) и pCMV-VSV-G. Клетки ТНР-1 инфицировали концентрированным псевдовирусом LentiCRISPRv2. Через 48 ч после трансдукции среду заменяли полным RPMI, содержащим 1 мкг / мл пуромицина (Gibco) и поддерживали в селективной среде в течение 14 дней. Выбранные клетки были одноячеистыми, отсортированными в 96-луночные планшеты с использованием BD FACS Aria II Cell Sorter (BD Biosciences). Отдельные клетки разлагали и анализировали на экспрессию Pol β методом Вестерн-блот-анализа. Клещи, отрицательные для Pol β с помощью вестерн-блот-анализа, дополнительно анализировали с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК, фланкирующей область, ориентированную на CRISPR. Прямые праймеры 5′-CTTGCCTTGTCAGTAGACAGCA-3 ‘и 5′-CTCTGTGTTGACTGGGTTGGTC-3′ и обратные праймеры 5’-AACTTGGGCAGTTGGGCACAGT-3 ‘и 5′-CCCGGCCATCTCTATGTTTTCT-3′ использовали для усиления экзонов 9 и 10 соответственно. Эксон 9 секвенировали с использованием прямого праймера 5’-GCTGTTGTCATCTCAGTGAATTC-3 ‘и обратного праймера 5′-CCACAACTTCACTATCATCCAG-3’. Эксон 10 секвенировали с использованием прямого праймера 5′-CCAATTACTGTTGTCATCACAG-3 ‘и обратного праймера 5′-TAGACTGTCCTCCCAGCAACTC-3’. Множественные последовательности были выполнены с использованием Clustal Omega (50).

Синтез ДНК оценивали в клетках THP-1 с использованием ранее описанных способов. Вкратце, клетки THP-1 стимулировали PMA в течение 7 дней или выращивали в суспензионной культуре. Среда заменялась полным RPMI, содержащим 10 мкм 5-бром-2′-дезоксиуридина (Sigma). Клетки выращивали в присутствии BrdU в течение 1 или 8 ч, собирали и фиксировали добавлением 70% ледяного этанола. Клетки пермеабилизировали добавлением 0,5% Triton X-100 и ДНК денатурировали 2 н. HCl, нейтрализовали, промывали и окрашивали анти-BrdU-антителом (Cell Signaling Technology, Bu20a), разбавленным 1:50 в растворе 1 × PBS, 1% BSA и 0,1% Tween 20. Клетки промывали, затем окрашивали антителом против мышиного антитела Alexa Fluor 488 (Invitrogen), разбавленным 1:50. Клетки промывали и анализировали с использованием проточного цитометра MACSQuantVYB (Miltenyi Biotec), и данные анализировали с использованием программного обеспечения MACSQuantify (Miltenyi Biotec).

Для Вестерн-блоттинга применяли анти-β-актин (Abcam; ab6276) и анти-Pol β (Abcam; ab175197) антитела. Анти-Pol β-антитела были впервые подтверждены для Вестерн-блоттинга с использованием ядерных и цельных клеточных экстрактов из клеток THP-1, Jurkat, HeLa и 293FT. Лизаты разрешали SDS-PAGE на 4-15% геле (Bio-Rad) и белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad). Первичные антитела разбавляли 1: 5000 в TBS-T 5% сухим молоком. Антивидовые вторичные антитела разбавляли 1: 10000 в TBS-T 5% сухим молоком. Блоты были отображены хемилюминесценцией (суперчувствительный субстрат SuperSignal West Femto, Thermo Scientific) с использованием системы обработки изображений ChemiDoc Touch (Bio-Rad) и проанализированы в программном обеспечении ImageLab 5.2 (Bio-Rad). Определенная полоса при ~ 38 кДа, соответствующая предсказанной молекулярной массе для Pol β, была обнаружена во всех образцах, испытываемых с слегка меняющимися уровнями экспрессии в зависимости от типа клетки.

Чувствительность к повреждающему ДНК агенту MMS (17) определяли путем измерения ингибирования роста с использованием анализа XTT на основе соли на основе тетразолия (АТСС) (51). Линейность анализа была предопределена изменением плотности посева клеток, инкубацией клеток при 37 ° С, 5% СО2 в течение 72 ч и измерением удельной абсорбции (475 нм — 660 нм) с использованием спектрофотометра с микропланшетом Epoch (BioTek) после 4-часовой инкубации с XTT реагент. Для оценки цитотоксичности MMS клетки инкубировали с различными концентрациями MMS (Sigma) в течение 2 ч, три раза промывали 1 × PBS и инкубировали при 37 o C, 5% CO2 в течение 72 часов перед анализом, как описано выше.

Ядерные экстракты готовили, как описано ранее (52). Вкратце, клетки промывали в 1 × PBS, ресуспендировали в гипотоническом буфере и Dounce гомогенизировали. Лизированные клетки центрифугировали при 3300 × g в течение 15 мин. Ядерный осадок ресуспендировали в буфере для экстракции с низкой солью и перемешивали по каплям с высоким солевым буфером (1,6 м KCl). Экстрагированные ядра центрифугировали при 22,065 × g в течение 30 мин. Супернатант собирали и центрифугировали еще 15 мин при 22655 г. Экстракты диализовали в буфер хранения в течение 2 ч, аликвотировали и хранили при -80 ° С. Общая концентрация белка определялась с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad).

Тесты на разрыв в пробирке проводили, как описано ранее (11), используя ранее опубликованные олигонуклеотиды (4). Праймеры KEY35 (5′-ATTCGAGCTATCCTTGCGCG-3 ‘) и KEY31 (5′-ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTA-3′) и шаблон KEY36 (5’-TAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGGCCCCGCGCAAGGATAGCTCGAAT-3 ‘) были получены из Integrated DNA Technologies. KEY35 был 5’-концевой меченной γ-32P с использованием полинуклеотид-киназы T4 (New England Biolabs). Основание для ремонта разрывов было изготовлено путем отжига 800 нм KEY35, 2,4 мкм KEY31 и 1,6 мкм KEY36.

Реакции восстановления разрывов проводили в 20 мкл объемах, содержащих 20 нм подложку, 2 мм АТФ, dNTP (60 нм, 2,5 мкм или 250 мкм) и реакционный буфер. Реакции начинались добавлением 4 мкл 1 мг / мл ядерного экстракта, инкубировали при 37 ° С в течение 30, 60 или 120 мин, затем останавливали добавлением 10 мкл 40 мм ЭДТА, 99% формамида и нагревали в течение 1 мин при 95 ° С. Аликвоту по 4 мкл каждой реакции разрешали на 20% мочевину-ПААГ (American Bio). Гели визуализировали путем фосфорирования на молекулярном тепловизоре PharoxFX (Bio-Rad) и количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageLab 5.2 (Bio-Rad).

Р. У. Г. разработал и провел эксперименты, проанализировал данные и написал статью. Р. Ф. и Д. Х. задумали исследование. Б. К. задумал исследование, разработал эксперименты и написал статью. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Эта работа была полностью или частично поддержана Национальными институтами здравоохранения Грантов GM104198 (до Б. К.), AI049781 (от B. K.), MH100999 (до Р. Ф. S) и T32-GM008602 (до Р. W. G.). Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием этой статьи. Контент принадлежит исключительно авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здоровья.

Эта статья содержит дополнительные рис. S1 и S2.

Используемые сокращения:
Сивисимский иммунодефицитный вирус

интеграза

ремонт базового иссечения

однонаправленная РНК

форбол 12-миристат 13-ацетат

метилметансульфонат

вирус везикулярного стоматита

2,3-бис- (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил) -2H-тетразолия-5-Carboxanilide.

Мы благодарим Детское Здравоохранение Калифорнийского проточного цитометрического сердечника в Атланте и Эмори для оказания помощи при одноярусной сортировке.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *