Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Разработка моноклональных антител против белка ВИЧ-1 p24 и его применение в иммунохроматографическом анализе коллоидного золота при выявлении ВИЧ-1

Development of Monoclonal Antibodies against HIV-1 p24 Protein and Its Application in Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for HIV-1 Detection
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4812187/

Академический редактор: Базель-Хрейвеш

Белок вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) p24 является наиболее распространенным вирусным белком ВИЧ-1. Этот белок секретируется в сыворотке крови на высоких уровнях на ранних стадиях заражения ВИЧ-1, что делает его биомаркером для ранней диагностики. В этом исследовании был установлен иммунохроматографический анализ коллоидного золота (GICA) для обнаружения белка p24 с использованием мышиных моноклональных антител (mAb). Белок p24 HIV-1 экспрессировали в штамме BL21 E. coli, и очищенный белок использовали для иммунизации мышей. Стабильные гибридомные клеточные линии, секретирующие моноклональные антитела против p24, были получены после скрининга и субклонирования ELISA путем предельного разведения. 34 различных пассажа и мечения пар mAb были выбраны новым антисептическим сэндвич-ELISA-антителом, а затем применены в GICA для обнаружения белка p24. Метод GICA имеет предел обнаружения (LOD) 25 пг / мл и может обнаруживать белок p24 во всех 10 положительных образцах, полученных из Национального рецепта HIV-1 p24 антигена. Из 153 отрицательных образцов были получены 3 результата ложных срабатываний. Общая специфика этого теста составила 98,03%. Хорошая чувствительность и специфичность этого метода делают его подходящей альтернативой для обеспечения более удобного и эффективного инструмента ранней диагностики ВИЧ-инфекции.

Протеин P24 получен из белка Gag ВИЧ-1 и играет важную роль в сборке и созревании вирусного ядра [1, 2]. РНК ВИЧ-1, антитела против ВИЧ и антиген p24 представляют собой вирусные маркеры, которые использовались в качестве целевого антигена для раннего выявления инфекции ВИЧ-1 [3,4]. За последние два десятилетия иммуноанализы ВИЧ прошли первое поколение (с использованием вирусного лизата для обнаружения антител IgG), второго поколения (с использованием рекомбинантных антигенов для обнаружения антител IgG), обнаружения антител третьего поколения (IgM и IgG) и четвертого -генерация (детектирование антигена и p24-антигена) иммуноанализа. Эти наборы тестов помогли сократить «период окна» и обеспечить ранний диагноз для подозреваемых ВИЧ-инфицированных образцов по сравнению с иммуноанализами третьего поколения.

Иммуносорбентный анализ, связанный с ферментом (ELISA), является наиболее часто используемым иммуноанализом в наборах тестов третьего и четвертого поколения для диагностики ВИЧ в Китае. Предел обнаружения (LOD) для антигена p24 составляет от 11 пг / мл до 70 пг / мл [5]. Однако ELISA включает сложные процедуры и требует длительного времени реакции не менее 2 часов. Поэтому GICA была признана в качестве популярного диагностического инструмента для выявления антител к ВИЧ из-за его удобного для пользователя формата и легкой и быстрой скорости получения результатов без необходимости специального оборудования [6-8]. Нет всеобъемлющего исследования по обнаружению антигена p24 с использованием GICA, и поэтому развитие антигена HIV-p24 GICA, которое может использоваться одновременно с ВИЧ-антителом GICA для быстрого выявления ВИЧ, имеет большое значение. В этой работе mAb подвергали скринингу против рекомбинантного белка p24 и изучали его применение в GICA для выявления ВИЧ-1.

Компетентные клетки E. coli DH5α и BL21 (DE3) были приобретены у TIANGEN Biotech (Пекин, Китай). Рестрикционные эндонуклеазы NdeI и XhoI, Premix LA Taq и набор для лигирования ДНК были приобретены у TAKARA Biotechnology Co., Ltd. (Далянь, Китай). В нашей лаборатории были сохранены миеломные клетки SP2 / 0-Ag14 и плазмида pET-28a. Все химические вещества, используемые в этом исследовании, имели аналитический сорт.

Национальный сертификат антигена p24 HIV-1, содержащий 10 положительных образцов (от P1 до P10) и 10 образцов чувствительности (от L1 до L10), был приобретен в Национальном институте контроля фармацевтических и биологических продуктов (Пекин, Китай). Эти образцы чувствительности были протеинами p24 (стандарты ВОЗ) от Национального института биологических стандартов и контроля (Hertfordshire, UK) и разбавлены до концентраций L1 (20 МЕ / мл), L2 (10 МЕ / мл), L3 (5 МЕ / мл), L4 (2,5 МЕ / мл) и L10 (0 МЕ / мл). Образцы сыворотки (n = 153) собирались из Главного госпиталя Гуанчжоуского военного командования НОА. ВИЧ-антитело и отрицательные образцы p24 были подтверждены двумя различными коммерчески доступными тест-реагентами ELISA четвертого поколения.

Последовательность ДНК последовательности 149-354 аминокислот белка p55 Gag HIV в базе данных NCBI (NP_057850.1), кодирующей ген p24, была разработана с оптимизацией кодонов и синтезирована Shanghai Shenggong Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Очищенный p24-продукт ПЦР и плазмиду pET28a (+) оба дважды расщепляли рестрикционными ферментами NdeI и XhoI и лигировали с помощью ДНК-лигазы T4 для конструирования плазмиды pET28a-p24. E. coli BL21 (DE3) с рекомбинантной плазмидой культивировали в среде LB, дополненной канамицином 50 мкг / мл при 37 ° C, до тех пор, пока логарифмическая фаза (при OD600 0,6-0,8) до индукции с конечной концентрацией 1,0 мМ IPTG при 37 ° C, 25 ° C и 18 ° C до OD600 2,0, соответственно. Рекомбинантный белок очищали на колонке HiTrap Ni2 + с использованием AKTAPurifier 100 (GE Healthcare Life Sciences, PA, USA).

Шести-восьминедельным мышам BALB / c иммунизировали подкожно 100 мкг r-p24, смешанным с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, MN, USA). На 14-й и 28-й день мышей повышали с помощью 50 мкг r-p24, смешанного с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда (Sigma-Aldrich, MN, USA). На 38-й день конечная инъекция 50 мкг r-p24 в PBS вводилась внутрибрюшинно. Гибридома и mAb были получены, как описано ранее [9].

Новый метод ELISA с нечетным сэндвич-антителом, предназначенным для обнаружения антител, был предназначен для скрининга пар mAb, распознающих r-p24. Микротитровальные планшеты ELISA покрывали различными mAb (10 мкг / мл в PBS, pH 9,6) и инкубировали в течение ночи при 4 ° C с последующим блокированием 3% BSA в течение 2 часов. Для маркировки детекторного антитела 2 мкг / мл каждого mAb растворяли в буфере для разведения PBS (содержащем 0,05% (об. / Об.) Твин 20 и 1% (об. / Об.) BSA) и 0,1% (об. / Об.) HRP (GAM-HRP) в течение 30 минут перед использованием. Около 75 мкл r-p24 (1 мкг белка / мл в PBS), содержащей 4% здоровой мышиной сыворотки, инкубировали с 75 мкл детектора mAb в течение 5 минут реакции, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл смеси в двух повторностях и затем промывали через 30 минут. Последующую стадию реакции пероксидазы проводили, и все результаты анализа считывали с помощью микропланшетного считывателя Thermo Scientific MK3 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) на длинах волн 450 нм.

Пары моноклональных антител использовались в качестве захватных и детекторных антител на платформе GICA. Детекторное антитело было помечено конъюгацией с коллоидным золотом, смешанным с активным блокатором против гетерофильных антител и ревматоидным фактором. Смесь распыляли на стекловолокно при 40 мкл / см2. Захват mAb, козьим антимышиным IgG и активным блокатором распыляли на нитроцеллюлозной мембране в концентрации 2,0 мг / мл с толщиной линии 2 мкл / см для формирования контрольной, контрольной и блочной линий соответственно. Иммунохроматографические тест-полоски проводили, как описано ранее [10]. В образец для образца добавляли максимум 70 мкл образца, и развитие окраски наблюдалось через 20 минут.

Серийные разведения r-p24 (1000 пг / мл, 250 пг / мл, 100 пг / мл, 50 пг / мл, 25 пг / мл, 10 пг / мл и 0 пг / мл) наносили на тест-полоски GICA для проверки уровня чувствительности при различных концентрациях антигена. Полоски наблюдались в течение максимум 20 минут, а цветовое развитие сравнивалось со стандартной цветовой схемой. Затем интенсивность полосы была градуирована.

Было замечено, что более высокие температуры инкубации привели к образованию тел включения, тогда как более низкие температуры инкубации показали высокие уровни экспрессии растворимых белков r-p24. Экспрессию проводили при 18 ° С и белок r-p24 очищали на колонке HiTrap Ni2 + с общей чистотой> 95% (фиг. 1 (a), дорожка 7). Очищенный белок, представляющий интерес, был подтвержден ELISA-анализом белка с использованием коммерчески доступного моноклонального антитела против антигена p24 (фиг. 1 (b)).

28 стабильных анти-r-p24 гибридомных клонов выбирали с использованием косвенного ELISA. Комбинации захвата и детектора mAb были спарены и выбраны из этих 28 клонов для реактивности против иммуногена через косвенный сэндвич-ELISA. Из 784 (28 × 28) сэндвич-комбинаций mAb 34 пары могли реагировать с r-p24 на 1 мкг / мл, а 13 из них проявляли сильную чувствительность к белку r-p24. В общей сложности пара 15 mAbs могла реагировать с 1 мкг / мл r-p24, и только 2 пары mAb могли реагировать с 1 нг / мл r-p24. Пациент с антителом, состоящий из захвата (3-1D5) и детектора (4-8A10), показал относительно высокую чувствительность к p24 и был выбран для более поздних тестов GICA.

Чувствительность тест-полосок с использованием захвата (3-1D5) и детектора (4-8A10) определялась обработкой различными концентрациями антигена (1000 пг / мл, 200 пг / мл, 100 пг / мл, 50 пг / мл, 25 пг / мл, 10 пг / мл и 0 пг / мл), а интенсивность полосы оценивали через 20 минут по сравнению со стандартной диаграммой цвета. Желаемая чувствительность к GICA наблюдалась при 25 мкг / мл антигена (рисунок 2).

Боковые полосы GICA, изготовленные из 3-1D5 и 4-8A10, использовали для определения образцов антиген-положительной сыворотки HIV-1 p24 из Национального справочника (NR) ВИЧ-отрицательных образцов сыворотки ВИЧ и p24 (таблица 1). P1-P10 (положительные образцы p24 в NR), следовательно, были обнаружены методом GICA. Из образцов чувствительности p24 в NR (от L1 до L10) образцы L1, L2 и L3 с более высокими концентрациями белка p24 были положительно обнаружены GICA, тогда как образцы с более низкой концентрацией (L4-L10) были отрицательными. По сравнению с тест-реагентом четвертого поколения ELISA Vironostika HIV Uni-Form II Ag / Ab (Biomérieux, Boxtel, The Netherlands) три теста на положительную реакцию наблюдались при тестировании GICA, когда тестировали отрицательные образцы сыворотки p24 (n = 153), давая общая специфика — 98,03%.

Число новых случаев ВИЧ-инфекции растет, несмотря на многочисленные программы информирования и усилия по сокращению распространения инфекции. С внедрением тест-наборов для тестирования на наличие ВИЧ-инфекции скрининг на ВИЧ стал более децентрализованным с большим количеством тестов, выполненных на индивидуальной, а не на партии [21]. Следовательно, существует настоятельная необходимость в простых, недорогих, быстрых и точных форматах обнаружения, чтобы сократить период времени тестирования на ВИЧ и тем самым снизить риск передачи вируса от человека человеку во время переливания крови. Методы GICA были применены в реагентах быстрого обнаружения ВИЧ третьего поколения, но коммерчески доступных быстродействующих диагностических реагентов GICA, которые могут быстро обнаруживать антитела к ВИЧ и антиген ВИЧ-1 p24 в клинических образцах. Разработка быстрых реагентов для тестирования на ВИЧ для обнаружения антигена р24 может обеспечить легкий метод обнаружения и еще более повысить чувствительность имеющихся в настоящее время наборов для быстрого тестирования для раннего выявления ВИЧ-инфекции; следовательно, производство реагента для обнаружения быстрой ВИЧ-1 p24 быстрого GICA имеет большое значение.

Описанный здесь метод GICA может обеспечить гораздо более легкую, быструю и относительно недорогую альтернативу действующим протоколам ELISA для обнаружения антигена p24. LOD 25 пг / мл для p24 близок к тому, что наблюдается во многих коммерчески доступных антигенах / антителах, сочетающих ELISA. GICA также продемонстрировала хорошую способность обнаруживать низкие концентрации p24 в национальном рецепте антигена p24 ВИЧ-1. Этот анализ мог обнаружить все 10 образцов положительной сыворотки p24 ВИЧ-1, включая образцы генотипа ВИЧ-1 AE и B. Было подтверждено, что чувствительность GICA составляет 5 МЕ / мл, когда тестировались образцы стандартной чувствительности p24 ВОЗ в Национальном контроле антигена p24 ВИЧ-1.

В целях коммерческого использования также были разработаны химиолучевые иммуноанализы микрочастиц и анализы флуоресценции, связанные с ферментами, но для них требуются полные пакеты реагентов и носителей (таблица 2). В последнее десятилетие анализы антигена HIV-1 p24 значительно улучшились, а также введение новой методологии, такой как анализ амплификации биобаркода на основе наночастиц, анализы магнитной иммунохроматографии и иммуноферментные анализы (таблица 2). Сообщалось также, что ультрачувствительный емкостный иммуноферментный анализ может уменьшить обнаружение LOD детектора p24 до примерно 7,9 × 10-8 пг / мл (таблица 2). Однако для этих анализов обычно требуются сложные инструменты или хорошо обученные специалисты для их работы, которые в конечном счете ограничивают их использование в тесте на лечение, особенно в отдаленных районах большинства развивающихся стран.

В этом исследовании для быстрого скрининга пар антител использовали новый метод ELISA с использованием сэндвича антител-захвата. Выбранные пары антител показали хорошую эффективность при применении как в сэндвич-ELISA, так и в GICA. Для комбинированных экспериментов было получено 28 mAb для скрининга пар mAb, которые могли бы хорошо функционировать на платформе GICA. Среди этих пар только одна пара антител показала ожидаемую чувствительность для использования на платформе GICA. Тем не менее, предполагается, что более чувствительные пары антител могут быть получены путем оптимизации процесса иммунизации и подготовки антител, чтобы повысить чувствительность и специфичность наборов GICA. Большинство пар mAb GICA хорошо работают на платформе ELISA и некоторых других иммунологических анализах, таких как иммуноферментный анализ хемилюминесцентной микрочастицы и иммунохроматография с флуоресценцией. Полоски GICA могут применяться при качественном обнаружении или полуколичественном обнаружении антигенов. Эти результаты показали, что пара mAb может обнаруживать 20 pg / mL p24 антиген в методе ELISA с системой HRP (данные не показаны). Кроме того, можно использовать флуоресцентное вторичное антитело вместо коллоидного золота [22], а последующий сигнал можно точно определить машиной для количественной оценки p24.

Быстрый анализ одновременного обнаружения как антигена p24, так и антитела к ВИЧ-инфекциям обеспечит быстрый диагностический инструмент для скрининга ВИЧ-инфицированной крови или образца сыворотки и может служить лучшим заменителем в коммерчески доступных ELISA четвертого поколения. Дальнейшие исследования могут быть сосредоточены на повышении чувствительности и специфичности GICA при обнаружении антигена p24 и антител к ВИЧ в одном устройстве и, таким образом, ускорении их применения в иммуноанализах ВИЧ-инфекции четвертого поколения.

Эта работа была поддержана Проектом планирования науки и техники провинции Гуандун (грант № 2012A080800007), Национальным научным фондом Китая (грант № 21306055), Фондом естественных наук Гуандун (грант № 2014A030313261) и фундаментальными исследованиями Средства для центральных университетов (грант № 2015ZM161).

Авторы заявляют, что не существует конфликта интересов в отношении публикации этого документа.

Подготовка и идентификация рекомбинантного p24. (a) Выражение и очистка рекомбинантного p24. 1: цельный клеточный лизат без индукции IPTG, 2: цельный клеточный лизат с индукцией IPTG и 3: протекание через раствор; полосы 4-7 представляют собой четыре различных раствора, элюированных соответственно 50 мМ, 150 мМ, 300 мМ и 500 мМ имидазольного буфера. (b) Косвенный анализ ELISA рекомбинантного p24. A: антитело antip24 в качестве первичного антитела, B: заготовка без первичного антитела, C: заготовка без антигена покрытия и D: заготовка без первичного антитела и антигена покрытия.

Чувствительность GICA к антигену r-p24. Пробирки GICA обрабатывали в разных концентрациях (1000 пг / мл, 200 пг / мл, 100 пг / мл, 50 пг / мл, 25 пг / мл и 10 пг / мл) антигена r-p24. T и C представляют собой контрольные и контрольные линии, соответственно.

Результаты обнаружения Национального справочника по антигену ВИЧ-1 p24 антигенами GICA.

Уровень обнаружения: интенсивность полосы считывалась независимо двумя индивидами.

Сравнение GICA с некоторыми опубликованными анализами ВИЧ-1 p24 за последние годы.

Стандарт SFTS: французская национальная ссылка на ВИЧ-1 p24 Ag, полученная от Французского общества переливания крови.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *