Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Устранение геномов ВИЧ-1 из Т-лимфоидных клеток человека с помощью CRISPR / Cas9 Gene Editing

Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4778041/

Мы использовали РНК-систему CRISPR / Cas9 для редактирования ДНК, чтобы точно удалить весь геном ВИЧ-1, охватывающий 5 ‘и 3’ LTR интегрированных провирусных ДНК-вирусов ВИЧ-1 от латентно инфицированных человеческих CD4 + Т-клеток. Всесторонняя оценка последовательности целых геномов элиминированных ВИЧ-1 клеток исключала любые внецелевые эффекты нашей технологии CRISPR / Cas9, которые могли бы поставить под угрозу целостность генома хозяина и, кроме того, не влияли на несколько индексов здоровья клеток, включая жизнеспособность, клеточный цикл и апоптоз. Персистирующая ко-экспрессия Cas9 и специфических нацеливающих РНК в элиминированных ВИЧ-1 Т-клетках защищала их от новой инфекции ВИЧ-1. Предоставленный клиническим путем CRISPR / Cas9 значительно уменьшал репликацию ВИЧ-1 в инфицированных первичных культурах CD4 + Т-клеток и резко уменьшал вирусную нагрузку в культуре ex vivo CD4 + Т-клеток, полученных от ВИЧ-1-инфицированных пациентов. Таким образом, редактирование генов с использованием CRISPR / Cas9 может обеспечить новый терапевтический путь для удаления ДНК ВИЧ-1 из CD4 + T-клеток и потенциально служить новой и эффективной платформой для лечения СПИДа.

СПИД остается одной из основных проблем общественного здравоохранения, поскольку более 35 миллионов человек во всем мире инфицированы ВИЧ-инфекцией, а новые инфекции продолжаются на уровне более двух миллионов в год. Антиретровирусная терапия (АРТ) эффективно контролирует виремию практически у всех ВИЧ-1 пациентов и частично восстанавливает первичную клетку-хозяин (CD4 + Т-клетки), но не устраняет ВИЧ-1 из латентно инфицированных Т-клеток12. В латентно инфицированных CD4 + Т-клетках интегрированные провирусные ДНК-копии сохраняются в состоянии покоя, но могут быть реактивированы для получения вируса, обладающего репликацией, когда активируются Т-клетки, что приводит к быстрому вирусному отскоку при прерывании антиретровирусной терапии345678. Поэтому большинство ВИЧ-1-инфицированных людей, даже тех, кто очень хорошо реагирует на АРТ, должны поддерживать АРТ в течение всей жизни из-за стойкости инфицированных ВИЧ-1 клеток-резервуаров. Во время латентности ВИЧ-инфицированные клетки продуцируют мало или вообще не имеют вирусного белка, тем самым избегая вирусных цитопатических эффектов и уклоняясь от зазора иммунной системой хозяина. Поскольку покоящийся отсек Т-клеток с памятью CD4 + считается наиболее известным латентно инфицированным пулом клеток, он является ключевым направлением исследований, направленных на искоренение скрытой инфекции ВИЧ-1.

Недавние усилия по искоренению ВИЧ-1 от этой популяции клеток использовали прежде всего подход «шока и убийства» с обоснованием того, что индуцирование реактивации ВИЧ в Т-клетках памяти CD4 + может приводить к элиминации вирус-продуцирующих клеток путем цитолиза или иммунных ответов хозяина. Например, эпигенетическая модификация структуры хроматина имеет решающее значение для установления вирусной реактивации. Следовательно, ингибирование гистондезацетилазы (HDAC) Trichostatin A (TSA) и vorinostat (SAHA) привело к реактивации скрытого вируса в клеточных линиях101112. Соответственно, другие HDACi, включая вориностат, вальпроевую кислоту, panobinostat и rombidepsin, были протестированы ex vivo и в лучшем случае привели к временному увеличению виремии1314. Аналогичным образом, агонисты протеинкиназы С могут потенциально реактивировать ВИЧ либо отдельно, либо в сочетании с HDACi1516. Тем не менее, существует множество ограничений такого подхода: (i) поскольку большая часть геномов ВИЧ в этом резервуаре нефункциональна, не все интегрированные провирусы могут продуцировать репликационно-компетентный вирус17; (ii) общее количество CD4 + Т-клеток, реактивированных из покоящихся CD4 + T-клеток лейкоцитов ВИЧ-1, было обнаружено с помощью анализов вирусного размножения намного меньше, чем количество инфицированных клеток, что было обнаружено с помощью тестов на основе ПЦР, что указывает на то, что не все клетки в этом резервуаре повторно активируются18; (iii) иммунный ответ цитотоксического Т-лимфоцита (ЦТЛ) недостаточно эффективен для устранения реактивированных инфицированных клеток19, и (iv) неинфицированные Т-клетки не защищены от ВИЧ-инфекции и поэтому могут поддерживать вирусный отскок.

Эти наблюдения указывают на то, что стратегия лечения ВИЧ-1-инфекции должна включать методы, которые непосредственно устраняют провирусный геном из большинства ВИЧ-1-позитивных клеток, включая CD4 + Т-клетки, и защищают клетки от будущей инфекции, с небольшим или никаким вредом к хозяину. Сгруппированные, регулярно промежуточные, короткие палиндромные повторы (CRISPR) / CRISPR-ассоциированные 9 (Cas9) -нуклеаза имеют широкую полезность для редактирования генома в широком диапазоне организмов, включая дрожжи, дрозофилу, данио, C. elegans и мышей, и были применены в широком спектре исследований in vivo и in vitro к заболеваниям человека2021222324. Недавно мы модифицировали систему CRISPR / Cas9, чтобы обеспечить распознавание специфических последовательностей ДНК, расположенных в промоторе ВИЧ-1, охватывающих 5′-длинную концевую последовательность (LTR) 2526. Используя эту модифицированную систему, мы теперь демонстрируем удаление интегрированных копий провирусного ДНК-фрагмента из скрытой ВИЧ-1-инфицированной линии Т-лимфоидных клеток человека, полностью исключающей вирусную продукцию, индуцированную ингибированием HDAC. Результаты секвенирования целых геномов и комплексного биоинформационного анализа исключают любую генотоксичность для ДНК клетки-хозяина. Кроме того, мы обнаружили, что поставляемый в клинических условиях CRISPR / Cas9 снижает вирусную репликацию при заражении ВИЧ-1 первично культивируемых CD4 + Т-клеток. Результаты указывают на этот подход в качестве перспективного потенциального терапевтического средства для искоренения ВИЧ-1 из Т-резервуаров-хозяев принимающих пациентов для предотвращения повторного появления СПИДа.

Мы впервые протестировали способность нашей модифицированной системы редактирования генов CRISPR / Cas9 устранить геном ВИЧ-1 в человеческой линии Т-лимфоцитов, 2D1011. Эти клетки содержат интегрированные копии одного круглого HIV-1PNL4-3, у которого в геноме отсутствуют последовательности, кодирующие большую часть полипротеина Gag-Pol, но охватывает полноразмерные 5 ‘и 3’ LTR, и включает ген, кодирующий зеленый белок маркера флуоресцентный белок (GFP), заменяющий белок Nef в скрытом состоянии (фиг.1А). Таким образом, 2D10 является подходящей клеточной линией, чтобы сначала установить доказательство принципа ликвидации ВИЧ-1 из-за единообразного характера интегрированного провируса. Лечение клонированных клеток 2D10, стабильно экспрессирующих Cas9, но не гРНК, с провоспалительными агентами, такими как фосфор миристатацетат (PMA) и / или ингибитор HDAC трихостатин A (TSA), в значительной степени стимулирует активность промотора ВИЧ-1, что приводит к получению вирусных белков и GFP в более чем 90% обработанных клеток (фиг.1B, левые панели), обеспечивая удобную модель клеточной культуры для изучения вирусной латентности и реактивации. Совместная экспрессия Cas9 вместе с gRNAs A и B, сконструированная соответственно для нацеливания на высококонсервативную последовательность среди всех вирусных изолятов, охватывающих область LTR U3, при nt -287 / -254 (gRNA A) и nt -146 / -113 (gRNA B ) (Фиг.1А) полностью исключает продукцию GFP, индуцированную PMA / TSA, что указывает на ингибирование экспрессии гена ВИЧ-1 в предварительно отобранной смешанной клональной популяции Т-клеток, экспрессирующих как плазмиды экспрессии плазмы Cas9, так и gRNA (фиг.1B, правые панели ). Экспрессию gRNAs и Cas9 проверяли RT-PCR и Вестерн-блот, соответственно (фиг.1C, D). Экспрессия ВИЧ-1 полностью удалялась из клеток, экспрессирующих как плазмиды экспрессии плазмы Cas9, так и gRNA, показанные методом детектирования проточной цитометрии GFP-продуцированием случайно выбранными Cas9-положительными клональными клетками с экспрессией gRNA или без нее (фиг.22A). Кроме того, мы обнаружили, что GFP-продуцирование эффективно блокировалось во многих клонов, которые выражали только одну гРНК (A или B), до уровней, аналогичных уровням, вызванным ко-экспрессией как A, так и B (фиг. S2B, также см. Фиг. S2A ), предполагая, что экспрессия любой gRNA в одной конфигурации может инициировать расщепление на обоих LTR для достижения искоренения провирусной ДНК.

Мы проверили сайт (ы) интеграции провирусной ДНК ВИЧ-1 путем секвенирования целых геномов (WGS) клеток 2D10. Мы использовали CREST call27 структурной вариации (SV) для идентификации точек останова, вызванных провирусной ДНК-интеграцией в геноме хозяина, и использовали геном hg19 и геном ВИЧ-1, KM390026.1 в качестве эталонных геномов для считывания последовательностей ДНК. Мы идентифицировали четыре межхромосомные транслокации, обозначенные CTX (рис. S3), которые связаны с ДНК ВИЧ-1. Были обнаружены точки останова между ВИЧ-1 5 ‘LTR и P163.3: 1991382 и HIV-1 3’ LTR P613.3: 1991378, сопоставление с экзоном 2 гена MSRB1 метионинсульфоксидредуктазы B1 (NM_01332) и соответствующее ранее отображенное местоположение для провируса в ячейках 2D101128. Кроме того, два CTX были сопоставлены с хромосомой 1 с точкой останова между P13.2: 114338315 и HIV-1 5 LTR и другими точками останова между HIV-1 3 LTR и P13.2: 114338320. Кроме того, мы отметили, что четыре нуклеотида TAAG были удалены между двумя точками останова в хромосоме 1P13.2. Провирус вируса ВИЧ-1 в хромосоме 1, который ранее не был обнаружен картированием с добавлением линкера, был интегрирован во втором интроне (114339984-114320431) гена основного белка 1 сперматозоидов (RSBN1) (NM_018364). Схематическое изображение идентифицированных консенсусных последовательностей для сайтов интеграции ДНК ВИЧ-1 в хромосомах 1 и 16 показано на рисунке S3.

Анализ с малой дальностью амплификации ДНК LTR выявил ожидаемый фрагмент ДНК 497 п.о. в контрольных клетках и второй фрагмент ДНК такого же размера (504 п.о.) после обработки Cas9 / gRNAs A и B (фиг.2A). Результаты прямого секвенирования ДНК ПЦР-ампликона предполагали, что наблюдаемый фрагмент ДНК 504-bp в клетках, обработанных Cas9 / gRNA, был создан путем соединения остаточного 5′-LTR с остальными 3′-LTR после расщепления Cas9 / gRNA B (фиг. 2B). Мутация Indel с семинуклеотидной вставкой была также обнаружена на стыке 5′- и 3′-сайтов слияния клональных клеток (фиг.2B). ПЦР-амплификатор 257 п.о., соответствующий ответному элементу Rev (RRE), который расположен в центре вирусного генома, отсутствовал, подтверждая, что Cas9 / gRNAB удаляет последовательности ДНК, охватывающие между двумя терминальными повторами (фиг.2А) , Дальнейший ПЦР-анализ контрольных клеток 2D10, экспрессирующих Cas9, но не гРНК, с использованием пары праймеров, полученных из второго интрона RSBN1, подтвердил наличие ДНК-фрагмента длиной 6130 п.н., соответствующего интегрированному геному ВИЧ-1 плюс его хромосому 1 (фиг.2С). Также присутствовал фрагмент ДНК с 264 нуклеотидами, который представляет собой последовательность ДНК-хозяина из другой копии хромосомы 1 (показана на дне геля). В клетках, обработанных Cas9 / gRNA A и B, фрагмент ДНК из 6130 нуклеотидов, соответствующих интегрированному геному ВИЧ-1, полностью отсутствовал. Вместо этого ПЦР-амплификация продуцировала меньший фрагмент ДНК из 909 нуклеотидов. Последовательность ампликонов верифицированного удаления интегрированной вирусной ДНК, проходящей между B-областью 5′-LTR и B-доменом 3 ‘LTR (рис. S4A, B). Опять же, мы обнаружили 264-нуклеотидный фрагмент ДНК, амплифицированный из гена хозяина из другой хромосомы (фиг.2C).

Мы исследовали хромосому 16 для присутствия провирусной ДНК ВИЧ-1 с использованием длинноцепочечной ПЦР с использованием пары праймеров, соответствующей второму экзону гена MSRB1, и сравнивали его состояние в клетках, обработанных казецидом / gRNA A / B. Результаты показали, что ожидаемый фрагмент ДНК 5467 п.н. генома ВИЧ-1 и его фланкирующая ДНК-хозяина в хромосоме 16 отсутствовали. Вместо этого мы обнаружили фрагмент ДНК меньшего размера 759 п.о., который отражал присоединение остаточной U3-области 5′-LTR после расщепления гРНК А до остальной области U3 3′-LTR при расщеплении gRNA B (фиг.2D). Прямое секвенирование фрагмента ДНК 759 п.н. идентифицирует сайты экспрессии вирусной ДНК (рис. S5A, B). Меньший фрагмент ДНК длиной 110 п.о. был получен в результате амплификации ДНК-хозяина из другой копии хромосомы 16. Эти наблюдения являются убедительным доказательством того, что молекулы, редактирующие ген, эффективно устраняют множественные копии интегрированной провирусной ДНК генома ВИЧ-1 , которые разбросаны между различными хромосомами.

Для дальнейшей проверки эффективности нашей стратегии редактирования генов на основе лечения на основе каз9 / гРНК при элиминации провирусной ДНК ВИЧ-1 из латентно инфицированных Т-клеток мы проанализировали появление вставки / делеции (InDel) и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в геномы ВИЧ-1 контрольных и ВИЧ-1 -эпидемированных клеток, используя GATK-вызов29 против эталонной ДНК ВИЧ-1 (присоединение GenBank № KM3900261). В соответствии с результатами, показанными на фиг.2, считывания из последовательности целых геномов, отображаемых на 5′- и 3′-LTR, и на провирусный геном в контрольных клетках 2D10, поддерживая точность и надежность глубокого охвата ДНК ВИЧ-1 путем секвенирования генома (фиг.3А). В обработанных Cas9 / gRNA клетках 2D10 в интегрированном представлении геномики (IGV) было обнаружено полное удаление большого фрагмента ДНК, соответствующего провирусной ДНК ВИЧ-1, с данными, которые отображаются на 3′-LTR (фиг.3B). Считывание картирования ко всему провирусному геному между двумя LTR полностью отсутствовало, предполагая, что обе копии интегрированного генома ВИЧ-1 в клетках-хозяевах полностью устранены и что экспрессия Cas9 / gRNA в одной клональной клетке может достигать 100% -ного редактирования гена / элиминация, возможно, связанная с повторным редактированием генома стабильно выраженной Cas9 / gRNA. Кроме того, эти результаты показывают, что после расщепления вирусных 5 ‘и 3’ LTR и удаления вирусного генома вирусная ДНК, вероятно, деградирует, так что в геном хозяина не происходит транспонирование или реинтеграция.

Для определения восстановительных событий после вызванного A9 / A / B расщепления обоих LTR мы использовали BWA-вызов 27 структурного варианта (SV) в ДНК из клеток с экспрессией ВИЧ-1 и идентифицировали точки останова больших вставок и / или удаления. Результаты подтвердили, что никакая вырезанная ДНК ВИЧ-1 из одной хромосомы не была вставлена ​​в геном хозяина и / или в интегрированную копию провирусной ДНК на другой хромосоме, кроме того, исключая понятие повторной интеграции вырезанной вирусной ДНК в клетку-хозяин геном. Однако мы идентифицировали три точки останова, вызванные делецией фрагментов ДНК, соответствующих сайтам интеграции вирусной ДНК в геном хозяина. Одна левая точка останова, расположенная в конце 5 ‘LTR у нуклеотида 636 (= ВИЧ: 9710), поддерживаемая 10 прочтениями. Одна правая точка останова показала две модели: одну на ВИЧ: 9073 (= ВИЧ: -3), поддерживаемую 6 прочтениями с конверсиями 2 C → G и 4 C → T; и ВИЧ: 9075 (= ВИЧ: -1), поддерживаемый 63 показаниями (фиг.3C, D). Следует отметить, что эти две точки останова могут фактически отражать присутствие всех 634 нуклеотидов LTR после удаления полной провирусной ДНК с помощью Cas9 / gRNAs A или B на 5 ‘и 3′ LTR, за которыми следует точное повторение ДНК на сайт расщепления. Третья точка останова расположена в середине 3’-LTR у нуклеотида 9389 (= ВИЧ: 313) с вставкой С, поддерживаемой считыванием 87/161, и вставкой CTAAGTT, поддерживаемой 69/161 прочтением (фиг.3Е). Эта точка останова представляет собой соединение ДНК после расщепления на участках А и В 5 ‘и 3’ LTR (фиг.3F).

Мы также исследовали влияние CRISPR / Cas9-опосредованного удаления провирусной ДНК ВИЧ-1 из гена RSBN1 на уровне продуцирования РНК из RSBN1 и нескольких других клеточных генов, расположенных в непосредственной близости от сайтов провирусного введения, как показано в Фиг.4А. Результаты RT-PCR из пяти контролей и пяти элиминированных клонов 1-й клетки ВИЧ-1 не оказали значительного влияния на уровень экспрессии RSBN1, хотя на уровнях соседней РНК были обнаружены более мелкие вариации менее 0,4 раза (фиг.4В ), которые не могут быть отнесены к стратегии редактирования генов и могут не влиять на общую экспрессию их белков. Аналогично, устранение генома ВИЧ-1 из хромосомы 16 не оказало существенного влияния на экспрессию сайта интеграции, то есть гена MSRB1 и его окружающего гена (фиг.4C, D). Мы также исследовали влияние Cas9 / gRNAs A и B на несколько параметров, связанных со здоровьем клеток, включая жизнеспособность клеток, прогрессирование клеточного цикла и апоптоз с использованием нескольких клональных клеток после элиминации HIV-1 с помощью Cas9 / gRNAs A и B Мы не обнаружили постоянных и значительных вредных воздействий на жизненно важные признаки клеток-хозяев после элиминации провирусной ДНК ВИЧ-1 с помощью Cas9 / gRNAs A и B (рис. S6-8).

Чтобы расширить сферу анализа потенциальных нецелевых мишеней, мы биоинформативно сравнили результаты InDel с секвенированием цельного генома клеток 2D10 после лечения системой A / B Cas9 / gRNAs, которая вызвала полную ликвидацию провирусной ДНК ВИЧ-1. Чтобы улучшить доверие к InDel-коду, мы нацелили последовательность цельного генома на 100 × охват, но статистические анализы показали, что мы фактически достигли общего охвата 109,3 × для контрольных клеток и 112,7 × для элиминированных ВИЧ-1 клеток (таблица S1). Уровни охвата варьировались для каждой хромосомы, начиная> 96 × для хромосомы 1 и> 110 × для хромосомы 16 (рис. S9). Используя геном человека (hg19) в качестве контрольной последовательности, мы идентифицировали 1,361,311 InDels (вставки / делеции <50 б.п.) в контроле (+ Cas9 / -гРНК) и 1,358,399 в клетках, элиминированных ВИЧ-1 (таблица S2) и 3,973,098 одиночных нуклеотидов полиморфизм (SNP) в контроле и 3 961 395 в клетках, элиминированных ВИЧ-1 (таблица S3). Сравнительный анализ биоинформатики между контрольными и элиминированными ВИЧ-1 клетками выявил 32 399 соматических InDels (небольшая вставка / делеция, названная Стрелкой), 46 614 соматических SNV (однонуклеотидные вариации, называемые MuTect) и 52 SV (структурные вариации, включая большие InDels называемый CREST) ​​между двумя последними группами, которые были распределены в разных геномных областях (таблица S4).

После отбрасывания небольших InDels, которые мы обнаружили в общедоступной базе данных dbSNP, мы идентифицировали 30 156 InDels и 43 858 SNV в клетках, элиминированных ВИЧ-1. Фильтрация гетерозиготных мутаций уменьшила это число до 989 InDels. Чтобы определить, являются ли эти отфильтрованные InDels мутациями de novo, вызванными нашей системой редактирования A / B Cas9 / gRNA, мы выделили последовательности с длительностью 30 п.н., ± 300 bp или ± 600 bp, фланкирующие каждый отфильтрованный InDel, и использовали Blastn (обрезание e-value: 1000 ) для сравнения их с потенциальными геномными геномными геномными геномными сайтами, предсказанными по сходству последовательностей при 0-7 несоответствиях, и против последовательностей ВИЧ-1 на мишени. Без каких-либо несоответствий мишеням gRNAs A и B мы не обнаружили нецелевого участка вокруг извлеченных последовательностей 60, 600 и 1200 bp фильтрованных InDels. В пределах экстрагированных последовательностей с 60 п.о. мы не обнаружили нецелевых сайтов даже с 7 несоответствиями при длинах выравнивания> 12 нуклеотидов из PAM NRG (которые должны быть на 100% сопоставлены). В пределах экстрагированных последовательностей в 600 п.о. мы не обнаружили нецелевого сайта с 3 несоответствиями для мишеней gRNA A или B. С 4-7 несоответствиями мы обнаружили только один потенциальный объект с неактивным участком с 6 несоответствиями при длине выравнивания 20 bp из PAM, а другой с 3 несоответствиями с длиной выравнивания 12 bp от PAM для цели A и еще одним потенциальным сайтом с нечетным мишенью с 4 несоответствиями длиной 16 bp от PAM для цели B. В пределах выделенных последовательностей 1200 bp для 3 несоответствий, мы не обнаружили нецелевых сайтов для Target A, но один потенциальный нецелевой объект с 2 несоответствиями в 13 bp из PAM для цели B. С критериями несоответствия 3-7 для последовательностей 1200 п.о. мы обнаружили только шесть потенциальных нецелевых сайтов для цели А и двух потенциальных нецелевых сайтов для цели Б (фиг.4Е). Вместе эти данные настоятельно свидетельствуют о том, что ни один из инделей, обнаруженных в клетках с вырезанным геномом ВИЧ-1, не находится в пределах 60 б.п. Целей A или B любых потенциальных нецелевых сайтов, как прогнозируется критериями поиска, допускающими до 7 несоответствий. Расширяя поисковые последовательности до 600 или 1200 б.п., были идентифицированы относительно редкие участки вне цели, включая различное количество несоответствий и выровненную длину. С идеальной совпадением с последней последовательностью семян 12 bp плюс PAM NRG ни один из индексов не попал в зону поиска 60-1200 последовательностей ДНК. Наша общая интерпретация этих данных подтверждает, что предыдущий анализ Surveyor приводит к этим клеткам, а также к другим типам клеток25, и устанавливает очень строгий анализ того, что нецелевые эффекты на геном Т-клетки хозяина не вызваны нашими Cas9 / gRNAs ДНК-эксцизионная система ВИЧ-1.

Мы выбрали несколько T-клеточных клонов, провирусная ДНК которых была удалена Cas9 / gRNAs и поддерживалась на разных уровнях, экспрессия Cas9, а также gRNAs для оценки степени новой инфекции ВИЧ-1. Как видно на фиг. S10A, клон C7 экспрессирует Cas9, но не gRNA B, тогда как клон AB8 не обнаруживает обнаруживаемого уровня Cas9, но содержит gRNA B. Два дополнительных клона AB9 и AB5 с равным количеством gRNA B и различными уровнями экспрессии Cas9 были отобраны для исследования повторного инфицирования. Инфекция этих клеток ВИЧ-1NL4-gfp с последующей продольной оценкой репликации вируса проточной цитометрией показала, что клетки, экспрессирующие только Cas9 или gRNA B, были инфицированы ВИЧ-1 и поддерживали репликацию вируса на протяжении всех этих исследований (18-й день пост-инфекция) (фиг. S10B). Напротив, клетки, экспрессирующие как Cas9, так и gRNA B, были устойчивы к инфицированию ВИЧ-1 и не поддерживали репликацию вируса. AB5, который показал более высокий уровень Cas9, оказался более устойчивым к вирусной репликации, чем AB9, что показало снижение экспрессии Cas9 (рис. S10A, B). На рисунке S10C суммированы количественные значения результатов, показанных на панели B. Результаты показывают, что внутриклеточное присутствие как каз9, так и LR-направленных гРНК может эффективно защищать культуру Т-клеток человека от новой инфекции ВИЧ-1.

Мы тестировали способность Cas9 / gRNAs подавлять инфицирование ВИЧ-1 CD4 + Т-клеток, полученных от здоровых людей. Мы выбрали вектор лентивируса для доставки ДНК экспрессии Cas9 и gRNA из-за его высокой эффективности трансдукции и низкой токсичности. Результаты трансдукции LV показали эффективное расщепление ДНК LTR HIV-1 LV, экспрессирующими как Cas9, так и gRNAs, но не в контрольных клетках, трансдуцированных LV, экспрессирующих только Cas9 (фиг.5A). Следует отметить, что наши gRNAs не расщепляют LTR ЛВ, у которых отсутствует область модуляции U3, поэтому они не влияют на экспрессию генома LV. Соответственно, анализ проточной цитометрии показал функциональную инактивацию интегрированного генома ВИЧ-1 в латентно инфицированных Т-клетках при трансдукции с помощью LV-Cas9 / gRNA (фиг.5B). Опять же, мы не обнаружили доказательств гибели клеток, которые могут быть связаны с Cas9 / gRNAs в первичных клетках, подтверждая наши наблюдения, показанные на рис. S6. Как только эффективность доставки гена редактирующей молекулы с помощью LV была проверена в линии Т-клеток, мы заразили первичные культуры CD4 + Т-клеток ВИЧ-1JRFL или HIV-1PNL4-3, затем трансформировали их либо с помощью контрольного LV Cas9, либо из LV Cas9 plus LV gRNA (фиг.5C). По сравнению с контролем, в CD4 + Т-клетках, обработанных LV Cas9 / gRNA (рис. 5D), наблюдалось существенное снижение количества копий ВИЧ-1. Усиление вирусной ДНК выявило ожидаемую амплификацию 398 п.н. в контрольных клетках и фрагмент ДНК подобного размера с меньшей интенсивностью в клетках, трансдуцированных LV Cas9 / gRNA в CD4 + Т-клетках (фиг.5Е).

Мы также оценили способность поставляемого лентивирусом каз9 / гРНК при редактировании генома ВИЧ-1, присутствующего в ТБ-клетках РВМС и CD4 +, полученных от пациентов с ВИЧ-1 + во время обычных посещений клиники СПИД-больницы Университета Темпл. Для этого исследования доказательной концепции изначально мы стремились подготовить РВМС и CD4 + Т-клетки у четырех пациентов (от TUR0001 до TUR0004, случаи 1-4), которые проходили антиретровирусную терапию и проявляли разнообразные ответы на лечение, определяемые анализом вирусной нагрузки и процент клеток CD4 + (фиг. S11A). Процедура, которую мы использовали для приготовления РВМС и CD4 + Т-клеток, и исследование CD4 + Т-клеток, а также график лечения лентивирусом и улавливания клеток показаны на рисунке S11B. Чистоту Т-клеток CD4 + подтверждали проточной цитометрией конъюгированного с FITC анти-CD4-антитела (фиг. S11C).

Результаты трансдукции РВМС с лентивирусом-Cas9 и лентивирусом-Cas9 / gRNA выявили значительное снижение, 81% в случае 1 и 91% в случае 2, в число вирусных копий популяций клеток, экспрессирующих Cas9 и gRNA (фиг.6A). Аналогичные результаты были получены после лентивирусной трансдукции CD4 + T-клеток, которая показала> 92% -ное снижение вирусных копий в случае 1 и 56% для случая 2 при экспрессии как Cas9, так и gRNA по сравнению с контрольными клетками, экспрессирующими только Cas9 (фиг.6B ). Стандартные кривые и участки амплификации, используемые для абсолютной количественной оценки числа копий гена-глобина и Gag, показаны на рисунке S13. Изучение гена гена p24 гена в CD4 + T-клетках подтвердило репликацию вируса в 1 случае (71%) и в случае 2 (62%) при однократной трансдукции клеток с лентивирусом-Cas9 / gRNA по сравнению с тем, что наблюдалось при использовании лентивирусов- Cas9 (фиг.6C). Кроме того, мы исследовали уровень Gag p24 в РВМС, полученный из случаев 3 и 4 после доставки Cas9 / gRNA лентивирусом. Результаты этого исследования показали 39% и 54% снижение продукции ВИЧ-1 p24 из случаев 3 и 4 соответственно после трансдукции клеток терапевтическим лентивирусом (фиг. S12).

Затем мы оценили характер мутаций, введенных Cas9 / gRNAs в образцах пациентов, путем амплификации и секвенирования вирусной ДНК. Наша начальная генная амплификация CD4 + T-клеток с использованием праймеров, охватывающих -374 / + 43, не обнаружила никакой полосы в случае 1, а в случае 2 наблюдалась полоса ДНК в контрольном образце, у которого отсутствовала экспрессия гРНК (фиг.6D). Это наблюдение предполагает, что последовательность генома ВИЧ-1 в случае 1 может отличаться от последовательности праймеров, используемых нами для амплификации гена (фиг.6D). В случае 2, где мы обнаружили ожидаемый фрагмент ДНК в необработанных клетках, мутации, которые были введены Cas9 / gRNA, возможно, устранили распознавание последовательности ДНК с помощью ПЦР-праймера, что мешает амплификации ДНК. Использование альтернативного набора праймеров, который распознает различные области LTR, привело к получению ожидаемого 398-нуклеотидного ампликона во всех образцах (фиг.6Е). Возможно, что аналогично результатам из 2D10 клеток после обработки Cas9 / gRNAs (показано на фиг.2A) некоторые из 397 нуклеотидных фрагментов ДНК, наблюдаемые в присутствии экспрессии gRNA, являются результатом присоединения оставшихся 5 ‘и 3’ последовательности вирусного LTR после удаления всей кодирующей последовательности ВИЧ-1. Последовательность ампликона подтвердила влияние Cas9 / gRNA на редактирование вирусного генома в ожидаемых положениях и показала наличие мутаций InDel и единственного нуклеотида (SNV) внутри и / или рядом с последовательностью PAM в LTR (рис. 6F).

Несмотря на свой замечательный терапевтический успех и эффективность, АРТ-лечение не способно искоренить ВИЧ-1 у инфицированных пациентов, которые, следовательно, должны пройти лечение в течение всей жизни. Таким образом, необходима новая терапевтическая стратегия для достижения постоянной ремиссии, позволяющей пациентам прекратить АРТ и снизить ее сопутствующие затраты и потенциальные долгосрочные побочные эффекты. Наши выводы касаются ключевых препятствий для достижения этой цели, поскольку мы разработали методы CRISPR / Cas9, которые ликвидировали интегрированные копии ВИЧ-1 из Т-клеток человека CD4 +, ингибировали инфицирование ВИЧ-1 в первично культивируемых человеческих CD4 + Т-клетках и подавляли репликацию вируса ex in vivo в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) и CD4 + Т-клетках ВИЧ-1 + пациентов. Они также затрагивают еще одну ключевую проблему, свидетельствующую о том, что такое редактирование генов эффективно препятствует репликации вируса, не вызывая генототоксичность для размещения ДНК или вызывая разрушающие эффекты через пути клеток-хозяев. Предварительные исследования с использованием модификации генов на основе нуклеазы цинкового пальца (ZFN), транскрипционной активатор-подобной эффекторной нуклеазы (TALEN) и систем CRISPR / Cas9 вызвали большой интерес к их потенциальным возможностям подавлять вирусную инфекцию либо путем изменения рецепторов вируса, либо введения мутаций в вирусный геном (см. обзор 2630). Все эти исследования предполагают, что стратегии редактирования генов могут быть сконструированы для нацеливания на определенные области вирусного генома и после их эффективного доведения до инфицированных клеток, их надежная противовирусная активность эффективно подавляет репликацию вируса. Тем не менее, есть несколько важных вопросов, которые требуют пристального внимания, включая тщательный дизайн стратегии таргетинга, которая обеспечивает наивысший уровень специфичности и безопасности с оптимальной эффективностью редактирования.

В этом исследовании из-за сложности, связанной с определением сайтов и чисел случайно интегрированной провирусной ДНК ВИЧ-1 в культуре первичных клеток, инфицированных in vitro, и сложности полномасштабной характеристики InDel / Excision Cas9 / gRNAs в этих клетках , в качестве первого шага мы решили использовать клональную клеточную линию 2D10 в качестве модели латентной Т-клетки человека, чтобы установить: (i) способность Cas9 / gRNA удалять всю кодирующую последовательность интегрированных копий ВИЧ-1 ДНК с использованием последовательности ультрагенных целых геномов и (ii) исследовать ее безопасно связанную с нецелевыми эффектами и жизнеспособностью клеток. Как только эти цели были достигнуты, мы переключили наше внимание на первичную клеточную культуру, а также на образцы пациентов, чтобы исследовать эффективность CRISPR / Cas9 в воздействии на вирусную ДНК-нагрузку в лабораторных условиях.

Мы обнаружили, что CRISPR / Cas9 отредактировал несколько копий вирусной ДНК, разбросанных среди хромосом. Комбинированное лечение латентно-инфицированных Т-клеток с помощью Cas9 plus gRNA A и B, которые распознают специфические мотивы ДНК в области LTR L3, эффективно устраняло весь фрагмент вирусной ДНК, охватывающий два LTR. Остальные 5 ‘LTR и 3’ LTR сайты расщепления Cas9 и gRNA B в хромосоме 1, а также Cas9 и gRNAs A и B в хромосоме 16 были соединены реставрацией ДНК хозяина на участках, расположенных точно по трем нуклеотидам выше PAM. Геномная оценка клеток 2D10, обработанных CRISPR / Cas9 ВИЧ-1-инфицированными клетками 2D10, четко подтвердила полное удаление интегрированных копий вирусной ДНК из второго интрона RSBN1 и экзона 2 генов MSRB1. Для решения критической проблемы, связанной с ее спецификой и потенциальными нецелевыми и неблагоприятными последствиями, мы проанализировали это всесторонне и на беспрецедентном уровне детализации, путем секвенирования целых геномов и биоинформационных анализов. Они выявили много естественных мутаций в геномах контрольных клеток и гРНК A- и B-опосредованной элиминации ДНК ВИЧ-1. Обнаруженные мутации включали естественные InDels, базовые эксцизии и базовые замены, все из которых более или менее ожидаются в быстро растущих клетках в культуре, включая клетки Jurkat 2D10. Критической проблемой является наше открытие о том, что ни одна из этих мутаций не была результатом нашей системы редактирования генов, поскольку мы не идентифицировали идентичности последовательностей ни с gRNA A, ни с B в пределах 1200 нуклеотидов любого такого сайта мутации. Кроме того, наш метод экспрессии ДНК ВИЧ-1 не оказывал вредного воздействия на проксимальные или дистальные клеточные гены и не оказывал влияния на жизнеспособность клеток, прогрессирование или пролиферацию клеточного цикла и не вызывал апоптоз, тем самым сильно поддерживая его безопасность на этой трансляционной фазе, всеми мерами in vitro, оцениваемыми в культивируемых клетках. Мы обнаружили, что уровни экспрессии Cas9 и gRNAs уменьшились после нескольких проходов и в конечном итоге исчезли, но до тех пор, пока присутствуют Cas9 и одиночные или мультиплексные гРНК, клетки остаются защищенными от новой инфекции ВИЧ-1.

Еще один важный вопрос о трансляционной выполнимости, который мы рассмотрели, заключается в том, может ли CRISPR / Cas9-опосредованная элиминация ВИЧ-1 предотвратить или подавить ВИЧ-1-инфекцию в наиболее важных популяциях человеческих и пациентов-мишеней. Мы обеспечиваем критический новый прогресс, наблюдая в РВМС и CD4 + Т-клетках у ВИЧ-1-инфицированных пациентов, что данные, полученные с помощью лентивирально Cas9 / gRNAs A / B, значительно уменьшали число вирусных копий и уровни белка. Используя праймерные наборы, направленные в LTR, мы амплифицировали и обнаруживали остаточные фрагменты вирусной ДНК, которые не были полностью удалены в этих клетках, но были затронуты Cas9 / gRNAs и содержали мутанты InDel вблизи последовательности PAM. Эти данные подтвердили, что CRISPR / Cas9 оказывает эффективную противовирусную активность в РВМС ВИЧ-1 пациентов. Мы также обнаружили, что введение каз9 / гРНК A / B посредством доставки лентивируса в первичные культивируемые человеческие CD4 + ВИЧ-1JRFL- или ВИЧ-1NL4-3-инфицированные Т-клетки значительно сократило число вирусных копий, подтверждая ранее полученные нами и другие результаты, интегрированные HIV-1-направленные Cas9 и gRNAs (отличные от наших гРНК A и B, используемые в настоящее время), дали устойчивость к заражению ВИЧ-1 в клеточных линиях3132. С понятием, что CRISPR / Cas9 может ориентироваться как на интегрированные, так и на эписомальные последовательности ДНК, о чем свидетельствует его способность к редактированию различных человеческих вирусов, а также плазмидных ДНК в любой конфигурации313233343536, вполне вероятно, что как интегрированные, интегрированная, свободно плавающая внутриклеточная ДНК ВИЧ-1 отредактирована Cas9 / gRNA.

Как отмечалось, в ходе наших исследований АРТ не было включено до лечения с помощью CRISPR / Cas9, поскольку наша цель в этом исследовании заключалась в определении степени подавления вируса во время продуктивной стадии вирусной инфекции. Мы наблюдали значительный уровень подавления, предполагающий, что CRISPR / Cas9 может эффективно отключать экспрессию функционально активных интегрированных копий ДНК ВИЧ-1 в хромосоме хозяина. Это подтверждается нашими наблюдениями с использованием 2D10 CD4 + T-клеток, где скрытые копии ВИЧ-1, которые интегрированы в хромосомы 1 и 16, были эффективно устранены CRISPR / Cas9. Наши дальнейшие исследования направлены на устранение влияния CRISPR / Cas9 in in vitro инфицированных CD4 + Т-клеток, где вирус контролируется АРТ и когорта наивных и АРТ-пациентов с CD4 + Т-клетками. Результаты этих исследований должны определить, попадает ли вирус в скрытую стадию или нет, в контексте АРТ, и реагирует на CRISPR / Cas9. Следует отметить, что результаты этих исследований ex vivo с использованием АРМ пациентов с АРТ и CD4 + Т-клеток показывают, что CRISPR / Cas9 эффективно подавляет репликацию вируса путем введения мутаций InDel.

Наши результаты показывают всесторонне и окончательно, что вся кодирующая последовательность интегрированного с хозяином ВИЧ-1 была искоренена в человеческих 2D10 Т-клетках, обеспечивая сильную первую стадию поддержки потенциальной трансляционной способности такой системы к Т-клеточной направленной терапии ВИЧ-1 у пациентов. Полное отсутствие геномных и нецелевых функциональных эффектов во всех анализах также обеспечивает критическую поддержку для перспектив разработки такого подхода для будущих терапевтических применений.

При оценке терапевтической стратегии на основе CRISPR / Cas9 крайне важно понять, что не только ВИЧ-1 будет устранен из латентно инфицированных клеток, но большинство неинфицированных клеток станут устойчивыми к ВИЧ-инфекции. Таким образом, существует высокая вероятность того, что восстановительные вирусные инфекции будут содержаться в резистентных клетках. Тем не менее, перед тем, как этот тип стратегии может быть реализован, остаются серьезные проблемы. Во-первых, важно максимизировать ликвидацию вирусных последовательностей у пациентов. Это потребует анализа квази-видов ВИЧ-1, содержащихся в CD4 + Т-клетках пациентов, и разработки подходящих, то есть персонализированных CRISPR. Во-вторых, для доставки большинства циркулирующих Т-клеток потребуется улучшенная доставка CRISPR / Cas9. Таким образом, наши новые выводы ex vivo о том, что наш подход, основанный на доставке лентивирусов, снижает число копий ДНК ВИЧ-1 и уровни белка в РВМС инфицированных ВИЧ-1 пациентов, дает убедительные доказательства доказательств того, что CRISPR / Cas9 можно эффективно использовать как часть стратегий лечения ВИЧ.

Репортерная клеточная линия Jurkat 2D10 была описана ранее11 и культивирована в среде RPMI, содержащей 10% FBS и гентамицин (10 мкг / мл). 2 × 106 клеток электропорировали 10 мкг контрольной плазмиды pX260 или pX260 LTR-A и pX260 LTR-B плазмид, по 5 мкг каждая (Neon System, Invitrogen, импульс 3 раза 10 мс / 1350 В). Через 48 ч среду заменили на одну, содержащую пуромицин 0,5 мкг / мл. После однонедельного отбора пуромицин удаляли, и клеткам разрешалось расти еще на одну неделю. Затем клетки разбавляли до концентрации 10 клеток / мл и высевали в 96-луночные планшеты, 50 мкл / лунку. Через две недели одноклеточные клоны подвергали скринингу для повторной реактивации репликации ВИЧ-1 с GFP (12 часов PMA 25 нМ / TSA 250 нМ) с использованием ручного цитометра Guava EasyCyte Mini. Неактивные клоны использовали для дальнейшего анализа.

Баффи пальто было получено с помощью CNAC Basic Science Core I (Медицинская школа Льюиса Каца в Университете Темпл, Филадельфия). РВМС выделяли из периферической крови человека центрифугированием с градиентом плотности с использованием реактива Фиколла-Пака. (Подробнее см. В S1 Experimental Procedures).

Клонирование лентивирусных конструкций, а также упаковка и очистка лентивирусов и трансдукция первичной культуры подробно описаны в экспериментальных процедурах S1.

Сыворотку ВИЧ-1JRFL использовали из супернатантов РВМС, инфицированных ВИЧ-1 в течение 6 дней, осветляли при 3000 об / мин в течение 10 минут и 0,45 мкм фильтровали. Репортерный вирус ВИЧ-1NL4-3-EGFP-P2A-Nef получали путем трансфекции HEK 293 Т-клеток плазмидой pNL4-3-EGFP-P2A-Nef и обрабатывали как лентивирусные запасы (см. Выше). HIV-1JRFL титровали с использованием Gag p24 ELISA, HIV-1 NL4-3-EGFP-P2A-Nef GFP-FACS инфицированных HEK 293 Т-клеток.

Инфекция ВИЧ-1 in vitro и обнаружение и количественное определение вируса, включая p24 ELISA, описаны в экспериментальных процедурах S1.

Единичный субклонный контроль C11 и экспериментальный AB5 из родительских 2D10 T-клеток были проверены на эффективность выреза по назначению и функциональное подавление реактивации репортера HIV-1 EGFP. Геномную ДНК выделяли с помощью набора NucleoSpin Tissue (Macherey-Nagel) в соответствии с протоколом производителя. Геномную ДНК подавали в Институт биогенной биологии (http://www.novogene.com/en/) для WGS и анализ биоинформатики. Вкратце, качество ДНК дополнительно проверяли на 1% агарозных гелях, проверяли чистоту ДНК с использованием спектрофотометра NanoPhotometer® (IMPLEN, CA, USA) и измеряли концентрацию ДНК с использованием набора для анализа ДНК Qubit® в Qubit® 2.0 Fluorometer (Life Technologies, CA , США). Подробные процедуры получения геномной ДНК, секвенирования и биоинформатики и анализы SURVEYOR описаны в экспериментальных процедурах S1.

Суммарную РНК экстрагировали из клеток Jurkat с использованием набора RNeasy (Qiagen) с расщеплением ДНКазы I на колонке. Следующие 0,5 мкг РНК использовали для реакций обратной транскрипции M-MLV (Invitrogen). Для скрининга экспрессии gRNA использовали специфический обратный праймер (pX260-crRNA-3 ‘/ R, таблица I.3 в экспериментальных процедурах S1), используя стандартную ПЦР с использованием олигонуклеотидов целевого А или В в качестве прямого праймера (табл. 5 в экспериментальных процедурах S1) и электрофорезе в агарозном геле. Для проверки соседних генов экспрессию олиго-dT-праймерной смеси использовали в RT, а кДНК подвергали ПЦР SybrGreen в реальном времени (Roche) с использованием специфичных для мРНК пар праймеров и β-актина в качестве эталона (таблица I в экспериментальных процедурах S1).

Экспрессия GFP и RFP в клетках Jurkat 2D10 определяли количественно в живых клетках с использованием проточного цитометра Guava EasyCyte Mini (Guava Technologies). Для титра репортерного вируса ВИЧ-1 клетки трипсинизировали через 48 часов после инфицирования, промывали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 10 минут, затем трижды промывали в PBS и анализировали на GFP FACS. Экспрессию CD4 в первичных Т-клетках проверяли путем прямой маркировки с CD4 V5 FITC-антителом (BD Biosciences), а затем FACS.

Клетки Jurkat промывали, подсчитывали и разбавляли до плотности 1 × 105 клеток / мл в PBS. Для каждого образца 100 мкл клеток в суспензии смешивали с 100 мкл реагента для окрашивания V-PE при комнатной температуре (реагент Guava Nexin) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации образцы были получены с использованием проточного цитометра Guava EasyCyte Mini.

Жизнеспособность клеток оценивали с использованием окрашивания пропидиум йодидом. К 200 мкл живых клеток в суспензионном растворе PI добавляли до конечной концентрации 10 мкг / мл. Образцы инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации образцы были получены с использованием проточного цитометра Guava EasyCyte Mini.

Клетки промывали 1 × PBS и затем ресуспендировали в 250 мкл 1 × PBS при комнатной температуре. Эту суспензию добавляли по каплям до 1 мл 88% этанола -20 ° С для конечной концентрации 70% этанола. Клетки фиксировали в течение ночи при -20 ° С, затем промывали, инкубировали с 10 мкг / мл пропидиевого йодида и раствора РНКазы А 100 мкг / мл в 1 × PBS в течение 30 минут при 37 ° С, затем образцы охлаждали до 4 ° С и приобретали используя мини-проточный цитометр Guava EasyCyte Mini.

Использовались стандартные методы экспрессии белка, включая вестерн-блот и иммуноцитохимия. Подробнее см. В экспериментальных процедурах S1.

Для исследований инфекции ВИЧ-1 in vitro, Buffy пальто было получено от здоровых людей, приобретя у Biological Specialty Corporation (Colmar, PA).

Как процитировать эту статью: Kaminski, R. et al. Устранение геномов ВИЧ-1 из Т-лимфоидных клеток человека с помощью CRISPR / Cas9 Gene Editing. Sci. По донесению
6, 22555; doi: 10.1038 / srep22555 (2016).

Мы благодарим прошлых и настоящих сотрудников Департамента неврологии и Центра нейровирусов за обмен знаниями и реагентами на протяжении всех наших исследований. В частности, мы выражаем благодарность докторам. Shohreh Amini, Hassen Wollebo, Jennifer Gordon и Jay Rappaport за их научный вклад и Джеффри Б. Татро и доктора Мартина Уайта за редакционную помощь этой рукописи. Эта работа была поддержана грантами, предоставленными Национальными институтами здравоохранения: R01 MH092371 (до KK), R01 NS087971 (WH и KK) и P30 MH092177 (до KK).

Авторские вклады Задуманные эксперименты: К.К., У.Х. и R.K. Выполненные эксперименты: R.K., Y.C., A.N. и Y.Z. Анализируемые данные: K.K., W.H. и R.K. Подготовленная рукопись: K.K., W.H., R.K., A.N. и J.K. Предоставляемые реагенты / материалы / инструменты анализа: T.F., E.T. и J.K.

(A) (Top) Схематическое представление структурной организации интегрированной провирусной ДНК ВИЧ-1, выделяющей положение длинного концевого повтора (LTR), различные вирусные гены, натянутые LTR, и расположение репортера d2EGFP. (Снизу) Иллюстрация 5 ‘LTR и нуклеотидных последовательностей целевых областей A (gRNA A) и B (gRNA B), используемых для редактирования, и мотивы для связывания различных факторов транскрипции. Стрелка на +1 изображает сайт начала транскрипции. (B) Схема строения проточной цитометрии EGFP и флуоресцентной микроскопической визуализации CD4 + T-клеток до и после лечения PMA / TSA показывает индуцированную PMA / TSA реактивацию скрытого вируса в контрольных клетках, экспрессирующих только Cas9, но не в клетках, экспрессирующих как Cas9 и gRNA. (C) обнаружение РНК-ПЦР гРНК A, gRNA B и β-актиновой РНК в клетках, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими Cas9-гРНК. β-актином является контроль загрузки РНК. (D) Обнаружение белка Cas9 с помощью Вестерн-блот-анализа в контрольных клетках и клетках с экспрессией ВИЧ-1 / EGFP. β-тубулин служил в качестве контроля загрузки белка.

(A) Анализ ДНК показывает обнаруженные 497- и 504-нуклеотидные ампликоны, соответствующие соответственно LTR ВИЧ-1 в контрольных клетках и в клетках, ко-экспрессирующих Cas9 и gRNAs. Показаны положения ампликонов, соответствующих RRE и β-актину. (B) Нуклеотидный состав амплифицированной ДНК LTR из клеток, обработанных CRISPR / Cas9, а также положения праймеров, используемых для амплификации ПЦР различных областей вирусного генома. Показана интеграция 7-нуклеотидной мутации InDel после удаления фрагмента вирусной ДНК, расположенного между B-мотивом 5 ‘и 3’ LTR. Серийная последовательность для gRNA B подсвечивается черным цветом. (C, D) Показаны сайты интеграции ВИЧ-1 в хромосоме 1 (панель C) и хромосоме 16 (панель D). На каждой панели показаны результаты ДНК-анализа продукта ПЦР, амплифицированного специфическими праймерами (Р1 и Р2), полученными из клеточных генов, прерванных вставками вирусных ДНК. Диаграммы каждой хромосомы, содержащей полноразмерную интегрированную ДНК ВИЧ-1 до лечения CRISPR / Cas9, и остаточную ДНК-последовательность LTR после лечения Cas9 / gRNAs, изображены на основе секвенсирования Sanger основных фрагментов ДНК, наблюдаемых на агарозном геле. Звездочки в панелях C и D указывают на второстепенные полосы ДНК, указывающие на полное удаление вирусной ДНК, когда использовались либо A, либо B-мишени в пределах 5 ‘или 3’ LTR.

(A, B). Интегративный геномический обзор считывания карт против генома ВИЧ-1 (KM390026.1), который был назван BWA, показал наличие провирусной ДНК-последовательности ВИЧ-1 в контрольных клетках с экспрессией Cas9, но не gRNAs ( Panel A), но их полное отсутствие в Т-клетках после экспрессии как Cas9, так и gRNAs A и B (панель B). (C, D) Структурный вариант CREST-анализа идентифицирует две точки останова на 5 ‘и 3’ концах обоих LTRS, поддерживаемых указанными показаниями после расщепления Cas9 / gRNAs A / B. Иллюстрируется представление интегративной геномики (IGV) считывания карт против генома ВИЧ-1 (KM390026.1). (E) Идентификация специфической точки останова gRNAs (A, B) на сайте 9389 (красная стрелка) с помощью структурных вариантов, называемых CREST. Вертикальная фиолетовая линия указывает на положение, в которое были присоединены остальные 5 ‘и 3’ LTR после расщепления. (F) Иллюстрация последовательности ДНК на месте соединения (красная стрелка) после удаления нуклеотидов между точными участками среза, т. Е. Три нуклеотида из PAM (красная стрелка) 5 ‘LTR у мишени A с помощью gRNA A и 3’ LTR в мишени B посредством gRNA B.

(A) Схематическое изображение хромосомы 1, в которой показано место интеграции провирусной ДНК ВИЧ-1 в клеточный ген RSBN1 и положение соседних генов. (B) Экспрессия генов, расположенных в разных точках до места провирусной интеграции до и после удаления вирусной ДНК с помощью Cas9 / gRNAs. Экспрессия генов была идентифицирована с помощью обратной транскрипции и qPCR, и значения были нормированы на β-актиновый транскрипт. (C) Линейная структурная организация сегмента хромосомы 16, иллюстрирующая положение MSRB1, сайт интеграции ДНК ВИЧ-1 и нуклеотидную структуру экзона 2 MSRB1, где вставлена ​​вирусная ДНК. Показана позиция нескольких клеточных генов вблизи MSRB1. (D) Результаты SyberGreen qPCR, иллюстрирующие экспрессию MSRB1 и его соседней экспрессии гена в клетках до элиминации ДНК ВИЧ-1 и после уничтожения ДНК. В таблице показаны мишени / ссылки для каждого транскрипта клеточного гена, полученного из 5 отдельных контрольных и 5 отдельных элиминированных клонов 1-й клетки ВИЧ-1. (E) Нецелевая оценка путем цельного геномного секвенирования и биоинформационной интерпретации. Графическая диаграмма демонстрирует положение предсказанных участков нецелевого назначения с 3-7 нуклеотидными несоответствиями в расширенных 30, 300 и 600 п.н., фланкирующих отфильтрованные сайты InDel в Т-клетках с вырезанной ДНК ВИЧ-1. Цифры рядом с внецелевой последовательностью указывают на нуклеотиды последовательности расширения 1200 bp. Неиспользуемые нуклеотиды были выделены зеленым цветом в неконтрастных участках gRNA A (синий) и оранжевом в не-целевых сайтах gRNA B (фиолетовый). Последовательность PAM была подчеркнута красным цветом. Следует отметить, что места вне цели находятся далеко от положения InDels и не обнаруживают мутаций в предсказанном третьем нуклеотиде из PAM.

(A) ПЦР-фрагментный анализ тромбоцитов 2D10, обработанных с помощью экспрессирующих LV gRNAs A / B, Cas9 или обоих Cas9 и gRNAs A / B. Показаны положения полноразмерного ампликона (417 п.н.) и меньшего фрагмента ДНК (227 п.о.) после удаления 190 п.н. между гРНК А и В. Амплификация фрагмента β-актина 270 п.о. показана как контроль. (B) Типичные диаграммы рассеяния GFP (HIV-1) и RFP (Cas9), экспрессирующие клетки, демонстрирующие, что после инфицирования LV 72,9% клеток 2D10 экспрессируют Cas9, который после индукции с PMA / TSA более 45% этих клеток (31,8% ) не показывают никаких доказательств для экспрессии GFP, что указывает на элиминацию ДНК ВИЧ-1. (C) Схема экспериментальной процедуры экспериментов по in vitro-инфекции в первичных CD4 + Т-клетках. CD4 + Т-клетки выделяли из свежеприготовленных меченых антителами РВМС путем отрицательного отбора на магнитных колонках (Miltenyi Biotec), а затем активировали 48 ч обработкой анти-CD2 / CD3 / CD28 с последующим 6-дневным расширением, опосредованным rIL-2 человека. Следующие клетки инфицировали ВИЧ-1 спинулированием и через 2 дня трансдуцировали лентивирующими коктейлями, содержащими lenti-Cas9, с или без lenti-gRNA LTR A / B. Через 4 дня клеточные супернатанты и клетки собирали и анализировали на присутствие ВИЧ-1. (D) CD4 + Т-клетки, полученные из РВМС, недавно выделенных из оболочки, были инфицированы ВИЧ-1JRFL или ВИЧ-1NL4-3, как описано в экспериментальных процедурах, а число копий ВИЧ-1 определялось TaqMan qPCR и нормировалось на β-глобин номер копии гена. Значительное снижение (48%) количества копий ВИЧ-1JRFL после 6 дней заражения и еще более резкое снижение ВИЧ-1NL4-3 наблюдалось при экспрессии LV-Cas9 / gRNA по сравнению с теми, которые получали LV-Cas9. (E) ПЦР-анализ ДНК LTR и β-актина (контроль) из инфицированных ВИЧ-1 CD4 + Т-клеток, обработанных LV-Cas9, в присутствии или отсутствии ЛВ-гРНК A / B. Показаны позиции 398 bp-1 LTR и 270 bp β-актиновых ампликонов.

(A) РВМС от двух ВИЧ-инфицированных добровольцев лечились LV-Cas9 или LV-Cas9 плюс LV-gRNAs A / B (описанные в материалах и методах), а копии вирусной ДНК были определены с помощью qPCR. Как видно, после нормализации ДНК-глобинов было обнаружено значительное снижение числа вирусных копий. (B) CD4 + Т-клетки, выделенные из РВМС, размножали в средах, содержащих человеческий IL-2 (20 Ед / мл) и инфицированных LV-Cas9 или LV-Cas9 + LV-gRNA A / B с последующим определением номера копии вирусной ДНК 4 дня спустя — qPCR. Подобно РВМС, резкое сокращение количества копий ДНК ВИЧ-1 наблюдалось в клетках, получавших LV-Cas9 / gRNAs по сравнению с LV-Cas9. (C) CD4 + Т-клетки после обработки лентивирусным вектором, экспрессирующим Cas9 или Cas9 и gRNAs A / B, собирали и репликацию вируса определяли с помощью ELISA p24 Gag. (D) ПЦР-анализ ДНК, выделенных из образцов пациентов после лечения лентивирусом с помощью праймеров, расширяющихся -374 / + 43. Показана позиция 417 ожидаемых ампликонов. Контроль представляет собой амплификацию ДНК LTR из инфицированных РВМС ВИЧ-1JRFL в течение 6 дней после инфицирования. (E) ПЦР-амплификацию вирусного LTR (как описано в D) с использованием другого набора праймеров, охватывающих -416 — -19 LTR. Показана позиция 398 п.н. ампликона. (F) TA клонирование и секвенирование фрагмента LTR (показанного на панели E) у пациента 2 показали вставку, делецию и однонуклеотидное изменение (SNV) в некоторой амплифицированной ДНК. Обратите внимание, что в анализе не может быть обнаружено большое выделение ДНК, которое требует праймеров, полученных из внешней части вирусного генома, то есть фланкирования сайта интеграции.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *