Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

CRISPR-Cas9 может запретить репликацию ВИЧ-1, но NHEJ Repair облегчает удаление вирусов

CRISPR-Cas9 Can Inhibit HIV-1 Replication but NHEJ Repair Facilitates Virus Escape
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4786927/

В нескольких недавних исследованиях было показано, что кластеризованные регулярно интерполированные короткие палиндромные повторы (CRISPR) -связанные эндонуклеазы Cas9 могут использоваться для направленного РНК (gRNA) -описанного, специфичного для последовательности расщепления провирусной ДНК ВИЧ в инфицированных клетках. Мы здесь демонстрируем глубокое ингибирование репликации ВИЧ-1, используя Т-клетки с Cas9 и антивирусными гРНК. Однако вирус быстро и последовательно избегал этого торможения. Последовательность вариантов выхода ВИЧ-1 выявила нуклеотидные вставки, делеции и замены вокруг участка расщепления Cas9 / gRNA, которые являются типичными для восстановления ДНК негомологическим концом присоединения. Таким образом, мы демонстрируем эффективность CRISPR-Cas9 как антивирусного подхода, но любая терапевтическая стратегия должна учитывать последствия вирусного выхода.

Сгруппированные регулярно промежуточные короткие палиндромные повторы — система Cas9 представляет собой универсальный инструмент для разработки генома, позволяя индуцировать двухцепочечные разрывы на определенных участках ДНК. Специфичность последовательности обусловлена ​​gRNA, которая направляет Cas9 в комплементарную последовательность, присутствующую непосредственно вверх по течению 3-го протоспасера, смежного мотива в ДНК-мишени. В клетках млекопитающих двухцепочечные разрывы могут восстанавливаться с помощью негомологического пути конечного соединения (NHEJ), что приводит к частому введению вставок, делеций и нуклеотидных замещений в сайт расщепления или путем гомологического восстановления, который зависит от наличия гомологичных последовательностей ДНК.1,2

В нескольких исследованиях показано, что система Cas9 / gRNA может использоваться для ингибирования вирусных вирусов патогенных ДНК человека, включая вирус гепатита B, 3,4,5,6,7,8 вирус Эпштейна-Барра, 9 и вирус папилломы человека.10 Репликация ретровирусы, такие как ВИЧ-1, также могут быть ингибированы с помощью системы Cas9 / gRNA путем нацеливания на транскрибируемый с обратной транскрипцией промежуточный продукт репликации ВИЧ-1 или провирусную ДНК после интеграции в клеточный геном.2,11,12,13. Подходы к генной терапии для лечения ВИЧ-1 инфицированных людей, в которых Cas9 и антивирусные гРНК направлены на инфицированные ВИЧ-1 клетки для инактивации или удаления интегрированного провируса или в которых стволовые клетки крови используются против новых инфекций. Однако опосредованное Cas9 / gRNA ингибирование продуцирования и / или репликации вируса было показано только в краткосрочных экспериментах, в то время как мы знаем, что ВИЧ-1 может вырваться из большинства, если не всех типов ингибиторов, включая противовирусные препараты с малой молекулой и последовательность -специфическая атака интерференцией РНК. Поэтому мы решили идентифицировать стратегии вирусного побега от ингибирования, опосредованного Cas9 / gRNA.

В силиконе были использованы алгоритмы для выбора 19 гРНК, которые должны нацеливаться на ДНК ВИЧ-1 с высокой эффективностью и не оказывать влияния на клеточную ДНК (см. Дополнительную таблицу S1). Было выбрано семь гРНК, которые нацелены на область длинного концевого повтора (LTR), присутствующую на 5 ‘и 3′ концах провирусного генома (рис. 1а). Пять из них (gLTR1-5) также нацелены на дополнительный ген nef, который перекрывает 3’-LTR, но это не является существенным для репликации вируса in vitro. Двенадцать целевых последовательностей gRNAs, которые кодируют другие вирусные белки, включая хорошо сохраняющиеся домены в генах основного гэга, pol и env, и последовательности перекрывающихся рамок считывания, такие как гены tat и rev (рисунок 1a). Девять выбранных последовательностей мишеней gRNAs, которые высококонсервированы среди разных изолятов ВИЧ-1 (энтропия Шеннона <0,2, gLTR7, gGag1, gGagPol, gPol1-4, gTatRev и gEnv2), тогда как другие гРНК нацелены на менее консервативные домены ВИЧ-1 (Shannon энтропия ≥0.20; gLTR1-6, gGag2, gVpr, gEnv1 и gNef).

Мы впервые протестировали противовирусную активность в транзиторных трансфекциях клеток 293Т с плазмидами, экспрессирующими ВИЧ-1, Cas9 и одну из антиретровирусных гРНК или контрольных гРНК, нацеленных на не-ВИЧ-последовательности (люцифераза, GFP). Для количественной оценки экспрессии гена ВИЧ-1 мы измеряли вирусный капсидный белок (CA-p24), полученный через 2 дня после трансфекции (рис. 1b). Аналогичный высокий уровень СА-р24 наблюдался, когда тестировались разные контрольные гРНК, но этот уровень был значительно снижен для всех анти-ВИЧ-гРНК, что, вероятно, связано с индуцированным Cas9 / gRNA расщеплением плазмиды ВИЧ-1. Соответственно, ингибирующий эффект не наблюдался в контрольных экспериментах только с кас9 или гРНК (данные не показаны). Могут быть некоторые небольшие различия в противовирусной активности среди гРНК, но мы решили перенести все ингибиторы вперед на антивирусные тесты в стабильно трансдуцированные Т-клетки.

SupT1 Т-клетки сначала трансдуцировали с помощью LT9-экспрессирующего лентивирусного вектора. Стабильно трансдуцированные клетки отбирали и затем трансформировали лентивирусным вектором, экспрессирующим одну из противовирусных гРНК. Следует отметить, что ни одна из выбранных гРНК не нацелена на лентивирусные векторы. При инфицировании трансдуцированных клеток изолятом ВИЧ-1 LAI контролировали репликацию вируса путем измерения уровня СА-р24 в супернатанте культуры. Эффективная репликация вируса была очевидна в контрольных нетранзируемых клетках SupT1 и в только трансформированных кад9-клетках, что отразилось на быстром повышении уровня СА-р24 (рис. 2а) и появлении больших индуцированных вирусом синцитий и гибели клеток около 10-го дня после инфекции (рис. 2, б) показано среднее время повторной репликации ВИЧ-1 из четырех экспериментов). Репликация ВИЧ-1 в клетках, трансдуцированных с помощью Cas9 и gRNAs, нацеленных на плохо консервативные последовательности LTR (gLTR1-6), была лишь незначительно задержана (фиг. 2a и данные не показаны), а прорывная репликация, приводящая к большим синцитиям, наблюдалась в 12-14 дней (рисунок 2b ). Репликация в клетках, трансдуцированных Cas9 и gLTR7, которая нацелена на высококонсервативную и существенную область TATA-блока промотора LTR, была более отложена и привела к прорывной репликации через 19 дней. Подобный раскол наблюдался при нацеливании на белок-кодирующие области. Ориентация высококонсервативных последовательностей ВИЧ-1 (gGag1, gGagPol, gPol1-4, gTatRev и gEnv2) проявляет более устойчивый антивирусный эффект (прорывная репликация через 20-43 дня, рисунок 2b), чем нацеливание на менее консервативные домены (gGag2, gVpr, gEnv1 , и gNef; прорывная репликация в 11-17 дней; Рисунок 2b). Удивительно, но, несмотря на свою способность подавлять продукцию вируса (рис. 1b), некоторые из gRNAs в течение короткого времени блокировали репликацию вируса, и ни одна из них не препятствовала прорыву вирусной репликации. Более того, время, необходимое для репликации прорыва, не коррелировало с эффективностью ингибирования продуцирования ВИЧ-1 в клетках 293T (см. Дополнительный рисунок S1).

Прорывные вирусы могут представлять собой варианты вирусного побега, которые больше не подавляются системой Cas9 / gRNA. Интересно, что время, требуемое для прорывной репликации вируса, было больше для целевых последовательностей, которые более консервативны (Рисунок 2c: обратная корреляция между днем ​​прорывной репликации и энтропией Шеннона). Вдоль этих линий ранний побег, наблюдаемый для gRNAs, нацеленных на неконсервированные домены, можно объяснить многими вариантами спасения, доступными для вируса, тогда как относительно поздний побег, наблюдаемый для gRNAs, нацеленных на консервативные домены, может быть вызван меньшим количеством вариантов выхода, поскольку важные последовательности являются целевыми. Тем не менее, плохое торможение и очень быстрый вирусный побег, наблюдаемый для некоторых из гРНК, примечателен тем, что эволюционный процесс, лежащий в основе вирусного побега, т. Е. Генерация вариации последовательности и последующий рост вариантов с улучшенной пригодностью, обычно занимает несколько недель или даже месяцев , например, для ингибиторов интерференции РНК, проверенных в той же экспериментальной системе.14

Сначала мы проверили, действительно ли прорывные вирусы действительно устойчивы к конкретному набору Cas9 / gRNA, переходя на свежие соответствующие клетки Cas9 / gRNA SupT1 и контролируют нетрансдуцированные клетки. Прорывные вирусы реплицировались с одинаковой эффективностью на обеих клеточных линиях (см. Дополнительный рисунок S2), которые подтвердили фенотип эвакуации. Обе клеточные линии также были инфицированы LAI ВИЧ-1 дикого типа, показывающие блок селективной репликации в ограниченных клетках Cas9 / gRNA.

Затем мы секвенировали область гРНК-мишени прорывных вирусов в нескольких независимых культурах. Поразительно, мы наблюдали мутации в мишени для всех вирусов-побегов (рис. 3 и дополнительный рисунок S3). Вирусы, которые быстро ускользнули от гРНК, нацеленных на неконсервированные домены LTR (gLTR1-6), часто получали делеции (размером 1-31 нт, в 20 культурах) и инсерции (1-3 nt; в шести культурах), а одна культура приобретала точечной мутации в цели. Напротив, устойчивые к gLTR7 вирусы, которые развивались медленнее, приобрели замены (1 или 2 нт, в трех культурах, один раз в сочетании с делецией 1 нт) и 1-дюймовые вставки (три культуры). Цель gLTR7 включает в себя поле TATA, которое может объяснить, почему большие удаления не допускаются. Возникновение однонуклеотидных замещений в критических положениях мишеней подтверждает изысканную последовательность специфичности действия Cas9 / gRNA.

Эта тенденция дифференциального мутационного спектра между консервативными и менее консервативными мишенями была подтверждена для гРНК, которые нацелены на кодирующие белок области. Мы наблюдаем преимущественно замещенные нуклеотидные замены (1 или 2 нт) в консервативных основных генах. Вставки были ограничены размером 3 нт, так что добавлен кодон, но открытая рамка считывания не прерывается. Достойный процент полученных замен представляет собой молчащие изменения кодонов, что опять-таки указывает на давление на вирус для поддержания потенциала кодирования. Напротив, нуклеотидные делеции и вставки, которые сдвигают открытые рамки считывания, часто наблюдаются при нацеливании на менее консервативные гены vpr и nef, которые не требуются для репликации ВИЧ-1 на клетках SupT1.

Положение всех наблюдаемых мутаций было нанесено на график относительно мишени gRNA (положение -1 до -20, рисунок 4) и 3-nt protospacer смежный мотив (позиция 1-3), и мы указали положение ожидаемых двухцепочечных разрывов. За исключением одной точечной мутации в соседней области мотив protospacer, все мутации группируются вокруг сайта расщепления Cas9 в положении -3,15,16,17, что указывает на то, что мутации-побеги были получены в процессе ингибирования ВИЧ-1. Более конкретно, мы предлагаем, чтобы Cas9 / gRNA ингибирует расщепление ДНК, но последующий ремонт NHEJ-пути будет генерировать мутации, которые обеспечивают устойчивость к вирусу. Связанное расщепление Cas9 и восстановление NHEJ объясняют немедленное бегство ВИЧ-1, когда нацелены некритические последовательности.

Вставки и делеции являются отличительной чертой действия NHEJ, но такие изменения генома неприемлемы в критических последовательностях ВИЧ-1, что объясняет частые наблюдения нуклеотидных замещений в консервативных мишенях. Альтернативно, эти мутации могли быть сгенерированы во время процесса обратной транскрипции, подверженного ошибкам во время вирусной репликации или клеточной активности APOBEC, как описано в более стандартных сценариях эволюции вируса.18 В ходе обычной эволюции ВИЧ-1 преобладают переходы с G-to-A как преобладающая мутация. Например, в аналогичном исследовании эволюции вируса с интерференционными противовирусными средствами РНК 19 80% полученных мутаций были переходов (91 из 113 замен, см. Дополнительную таблицу S2) и 46 изменений G-to-A. В этом исследовании Cas9 / gRNA наблюдалась совершенно другая картина: наиболее частыми мутациями были только 44% переходов (27 из 62 мутаций) и трансверсия A-to-C. Вместе с кластеризацией мутаций вокруг сайта расщепления Cas9 и их быстрым появлением эти данные сильно указывают на участие пути Cas9-NHEJ в генерации большинства и, возможно, всех белков-мутаций. С другой стороны, мы не можем формально исключить, что регулярная эволюция ВИЧ-1 способствовала исчезновению вируса, например. путем создания мутации G-to-A в смежном мотиве протоспасера.

Взятые вместе, мы демонстрируем, что ВИЧ-1 может эффективно нацеливаться на систему Cas9 / gRNA, но что связанный процесс восстановления NHEJ создает варианты вирусного выхода. Это приводит к немедленному выходу, когда целевые вирусные последовательности нацелены. При сохранении последовательностей, кодирующих белок, кодирующих ВИЧ-1, вирусный выпад может быть значительно задержан и уровень ингибирования сравним с уровнем, наблюдаемым для некоторых антивирусных shRNAs, нацеленных на консервативные домены ВИЧ-1. Комбинации таких мощных shRNAs обеспечивают долговременное ингибирование репликации вируса. 20,21,22. Сгруппированные регулярно интерполированные красные палиндромные повторы / антивирусная стратегия Cas9 могут также обеспечивать устойчивый терапевтический эффект, когда гРНК, нацеленные на высококонсервативные последовательности ВИЧ-1, применяются в комбинаторном режиме , Так как Cas9 расщепляет ДНК в положении -3 и большинство мутаций-побегов кластера вокруг этого положения, этот субдомен последовательности-мишени должен быть особенно сохранен для уменьшения возможностей выхода вируса. Связанное действие по восстановлению расщепления Cas9-NHEJ может также предлагать альтернативную антивирусную стратегию, в которой вводятся мутации для ослабления пригодности сохраняющегося вируса. Мы наблюдали быстрое опосредованное мутацией эвакуацию, когда атакули несущественные последовательности, но даже эти мутации, вероятно, уменьшат вирусную репликативную пригодность in vivo, что говорит о силе такой стратегии ослабления. Альтернативно, клеточные гены, которые необходимы для репликации ВИЧ-1, такие как гены, кодирующие корецептор CCR5, могут быть нацелены на Cas / gRNAs. Более того, эти сгруппированные регулярно промежуточные короткие палиндромные повторы / стратегии Cas9 могут сочетаться с другими антивирусными подходами, будь то обычные противовирусные препараты или стратегии генной терапии.

Плазмиды. Лентивирусный вектор LentiCas9-Blast (адгезивная плазмида № 52962), содержащая касеть экспрессионной линии Streptococcus pyogenes Cas9 с экспрессией кодонов и LentiGuide-Puro (адгенитная плазмида # 52963) с кассетной экспрессией gRNA, были подарками от Feng Zhang.23. Олигонуклеотиды, кодирующие gRNAs, были лигировали в сайт BsmB1 вектора LentiGuide-Puro. Контрольные гРНК, нацеленные на люциферазу светлячков и ген EGFP13, были включены (см. Дополнительную таблицу S3). Плазмида pLAI кодирует изолят ВИЧ-1 подтипа B LAI.24

Культура клеток и трансфекция. Человеческие клетки эмбриональной почки 293T и клетки SupT1 T культивировали, как описано ранее.25 293T клетки трансфицировали 200 нг pLAI, 500 нг плазмидой LentiCas9-Blast и 500 нг плазмидой LentiGuide-Puro путем осаждения фосфатом кальция.

Лентивирусное векторное продуцирование и трансдукция. Лентивирусный вектор получали и титровали, как описано ранее.20 Вкратце, вектор был получен путем трансфекции 293T-клеток лентивирусной векторной плазмидой и упаковывающих плазмид pSYNGP, pRSV-rev и pVSV-g с Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, Блейсвейк, Нидерланды). После трансфекции среду заменяли OptiMEM (Invitrogen, Life Technologies, Bleiswijk, Нидерланды) и клетки культивировали в течение 48 часов. Лентивирусный вектор, содержащий супернатант, фильтровали (0,45 мкм), аликвотировали и хранили при -80 ° С. Клетки SupT1 (2 × 105 клеток в 1 мл культуральной среды) трансдуцировали равным количеством частиц вируса LentiCas9-Blast (Cas9) (на основе CA-p24) и культивировали с 1 нг / мл бластицидина в течение 1 недели для отбора трансдуцированных клетки. Затем клетки трансдуцировали с равным количеством различных частиц вируса LentiGuide-Puro (gRNA) и культивировали с помощью 1 мкг / мл пуромицина для выбора для клеток с двойным трансдуцированием.

ВИЧ-1-инфекция и эволюция. Запасы LAI ВИЧ-1 были получены путем трансфекции 293T клеток молекулярным клоном pLAI. Производство вируса измеряли с помощью иммуноферментного анализа с ферментным связыванием CA-p24.26 Т-клетки SupT1 (2 × 105 клеток в 1 мл культуральной среды) были инфицированы равным количеством вируса ВИЧ-1 ЛАИ, соответствующего 1 нг CA-p24. Клетки пассировали два раза в неделю. Распространение вируса контролировали путем измерения продукции CA-p24 в супернатанте культуры и подсчета образования синцитий каждые 3 или 4 дня. На пике инфекции, когда наблюдались массовые синцитии, бесклеточный вирус пассировался в свежие клетки, трансформированные в соответствующие клетки. Когда синцитии были очевидны в недавно инфицированных клетках, клеточная ДНК, содержащая интегрированный провирус, была выделена для секвенирования анализа области мишеней gRNA (ПЦР и праймеры секвенирования, перечисленные в дополнительной таблице S4), как описано ранее.27

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Рисунок S1. Способность Cas9 / gRNA ингибировать репликацию ВИЧ-1 не коррелирует с эффективностью молчания экспрессии вирусных генов.

Рисунок S2. Эффективная репликация вариантов выхода ВИЧ-1 на экспрессирующие клетки SupT1-Cas9 / gRNA.

Рисунок S3. Последовательность области мишеней gRNA в прорывных вирусах, полученных в 2-6 независимых культурах ВИЧ-1 на разных клетках SupT1-Cas9-gRNA.

Таблица S1. Избранные гРНК, нацеленные на ВИЧ-1.

Таблица S2. Модели замещения нуклеотидов, наблюдаемые в вариантах побега ВИЧ-1.

Таблица S3. Целевая последовательность контрольных гРНК.

Таблица S4. Праймеры, используемые для секвенирования целевых областей гРНК в ВИЧ-1.

Дополнительные ссылки

Ган Ван является получателем стипендии Китайского стипендиального совета (CSC). Мы благодарим Э. Эрреру Каррильо, К. Кристеллу и Ю. Чжэн за помощь. Авторы не заявляют никаких конкурирующих интересов.

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Cas9 / gRNA нацеливание генома ВИЧ-1. (a) Провирусная ДНК ВИЧ-1 с положением гРНК, испытанным в этом исследовании. (б) Эффективность гРНК для замораживания ДНК ВИЧ-1 была протестирована в клетках 293Т, трансфицированных плазмидами, экспрессирующими Cas9, gRNA и HIV-1 LAI. Для количественной оценки экспрессии вирусного гена вирусный капсидный белок (CA-p24) измеряли в супернатанте культуры через 2 дня после трансфекции. Показаны средние значения (± SD) четырех экспериментов. Статистический анализ (анализ t-теста независимых образцов) показал, что экспрессия CA-p24 в присутствии противовирусных гРНК значительно отличается от значений, измеренных контрольными gRNAs против люциферазы и GFP (* P <0,05).

Репликация ВИЧ-1 в экспрессирующих каз9 и гРНК клетках. (a, b) клетки SupT1, стабильно трансдуцированные с экспрессирующими векторы вектора вируса каз9 и гРНК, были инфицированы LAI ВИЧ-1. Мониторинг вируса контролировался путем измерения уровня СА-р24 в супернатанте культуры (а) и путем подсчета формирования индуцированных вирусом синцитий (б). Указывается день, когда наблюдались массивные синцитии, что отражает прорыв вирусной репликации. Показаны средние значения четырех экспериментов (± SD). SupT1, контролируют непереведенные клетки. SupT1-Cas9, клетки, трансдуцированные только с экспрессирующим вектором Cas9. (в) Корреляция между уровнем ингибирования (день прорывной репликации, как показано в b, и сохранение последовательности мишеней среди разных изолятов ВИЧ-1 (энтропия Шеннона, как показано в дополнительной таблице S1). Коэффициент корреляции Пирсона был рассчитан: r = -0,58.

ВИЧ-1 ускользает от ингибирования Cas9 / gRNA посредством мутаций в целевой области. Целевую область гРНК в прорывных вирусах, полученных в двух-шести независимых культурах ВИЧ-1 на различных клетках SupT1-Cas9-gRNA, секвенировали. Для каждой гРНК показана нуклеотидная последовательность ВИЧ-1 дикого типа. Кодоны помещаются в серый цвет, если это применимо, с переведенной аминокислотной последовательностью с правой стороны. Последовательность protosacer смежных мотивов (PAM) помещается в коробку, а стрелка указывает участок расщепления Cas9 в положении -3. Указаны нуклеотидные и аминокислотные замены, вставки и делеции (Δ). Данные для всех тестируемых гРНК показаны на фиг. S3.

Мутации с мутацией ВИЧ-1 группируются вокруг участка расщепления Cas9. Положение всех замеченных нуклеотидных делеций, вставок и замещений (как показано на фиг. 3 и дополнительной фигуре S3) было нанесено на график относительно целевой последовательности gRNA (положение от -1 до -20) и PAM (положение 1-3). Стрелка указывает участок расщепления Cas9 в положении -3.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *