Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Редактирование генома CXCR4 с помощью CRISPR / cas9 вызывает клетки, устойчивые к инфекции ВИЧ-1

Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4612538/

Эти авторы внесли одинаковый вклад в эту работу.

Редактирование генома через CRISPR / Cas9 стало эффективным и надежным способом для точного и целенаправленного изменения генома живых клеток. CXCR4 является ко-рецептором инфекции вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) и считается важной терапевтической целью для СПИДа. CXCR4 опосредует вирусный вход в клетки человека CD4 + путем связывания с белком оболочки, gp120. Здесь мы показываем, что ген человека CXCR4 эффективно разрушается с помощью CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования генома, что приводит к резистентности к ВИЧ-1 первичных CD4 + Т-клеток человека. Мы также показываем, что CA9-опосредованная абляция CXCR4 демонстрирует высокую специфичность и незначительные эффекты вне цели, не влияя на деление клеток и их распространение. Точное и эффективное редактирование генома CXCR4 обеспечит новую стратегию терапевтического применения против ВИЧ-1 инфекции.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1) вызвал глобальную эпидемию, поскольку он был обнаружен и подтвержден как патоген синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) в 1983 году. Он может вызвать прогрессирующий иммунодефицит и тяжелые нейрокогнитивные расстройства и в конечном итоге привести к смертельному СПИДу1. Хотя высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) может снизить виремию до клинически необнаружимых уровней и продлить жизнь ВИЧ-1-инфицированных людей234, она имеет множество ограничений, таких как высокая стоимость и побочные эффекты, такие как лекарственная устойчивость и токсичность5. Кроме того, резервуар скрытой инфекции ВИЧ-1 может вызвать отскок вируса после прекращения антиретровирусной терапии (АРТ )6. Следовательно, существует настоятельная необходимость в разработке альтернативных терапевтических подходов. Ввод ВИЧ-1 опосредуется его гликопротеином на поверхности оболочки путем последовательного связывания с клеточным первичным рецептором CD47, а затем с хемокиновым рецептором CCR5 (R5-тропический) 8 или CXCR4 (X4-тропик) 9. CCR5, который экспрессируется в лимфоцитах, миелоидных клетках или CD4 + T-клетках, ответственен за установление новых инфекций и доминирует в хронической фазе инфекции. Редкие особи естественной гомозиготной мутации CCR5-Δ32 обладают высокой устойчивостью к заражению ВИЧ-1 и не имеют очевидных изменений фенотипа, кроме увеличения восприимчивости к некоторым патогенам1011. Как только инфекция установлена, ВИЧ-1 может использовать CXCR4 в качестве альтернативного рецептора для входа. X4-тропические штаммы ВИЧ-1 присутствуют в половине инфекций поздней стадии и связаны с более быстрым прогрессированием заболевания12. Основываясь на предыдущих выводах, как CCR5, так и CXCR4 могут служить терапевтическими целями с помощью технологий создания генома.

Естественная гомозиготная мутация CCR5-Δ32 обеспечивает устойчивость к ВИЧ-инфекции после трансплантации стволовыми клетками CCR5Δ32 / Δ3213. Кроме того, было показано, что нарушение рецептора CCR5 аутологичных CD4 + T-клеток циановыми пальцевыми нуклеазами (ZFNs) может эффективно ингибировать инфицирование ВИЧ-1 в CD4 + T-клетках14. Кроме того, генетическая модификация как CCR5, так и CXCR4 в первичных человеческих CD4 + Т-клетках ZFN защищает клетки от инфицирования трофических штаммов ВИЧ-1 CCR5 и CXCR415. В последнее время генетическое возмущение, опосредованное сгруппированным регулярно пересекающимся красным палиндромным повторением (CRISPR) -CRISPR-ассоциированным белком 9 (Cas9), обеспечивает альтернативный подход к разрушению генов и редактированию генома.

Система CRISPR-Cas первоначально была идентифицирована в бактериях и археях как часть адаптивной иммунной системы, состоящей из РНК CRISPR (crRNAs) и CRISPR-ассоциированных белков для распознавания и деградации бесплатных последовательностей заражающих вирусов и плазмид 16. Было показано, что эта система обладает огромным потенциалом для редактирования генов у различных хозяев, таких как растения, данио, дрозофила, мыши, резус, а также в клетках человека161718. Современный инструмент для редактирования генома системы Type II CRISPR / Cas9 индуцирует двойные разрывы ДНК (DSB) 19. DSB могут стимулировать механизмы восстановления клеток, в том числе не гомологичное концевое соединение (NHEJ) и восстановление, связанное с гомологией (HR), но в большинстве случаев NHEJ является преобладающим механизмом для восстановления DSB2021. Этот путь восстановления сопровождается нуклеотидными вставками, делециями или мутациями смены кадров, что приводит к разрушению или модификации гена22.

Недавно CCR5 был успешно нацелен с использованием активаторов транскрипции, таких как эффекторные нуклеазы (TALEN) и CRISPR / Cas9 в плюрипотентных стволовых клетках и гемопоэтических стволовых клетках2324. Тем не менее, нацеливание CXCR4 на CRISPR / Cas9 еще предстоит разработать. В текущем исследовании мы использовали систему CRISPR / Cas9 для введения мутаций функции потери CXCR4 в клетках Ghost-CXCR4, клетках Jurkat и первичных человеческих CD4 + Т-клетках. Биаллельная инактивация CXCR4 с помощью lentivirus-опосредованной доставки конструкций CRISPR / cas9 сделала модифицированные клетки устойчивыми к ВИЧ-1 инфекции. Последовательный анализ прогнозируемых нецелевых сайтов выявил специфический таргетинг на CXCR4 и незначительный нецелевой мутагенез. Таким образом, нарушение CRISPR / Cas9 CXCR4 обеспечивает превосходный инструмент для модификации генов для терапевтического применения в будущем.

Чтобы генетически разрушить аллель CXCR4, мы разработали 10 гРНК для нацеливания Cas9 на консервативные сайты гена CXCR4 человека и резус-макаки (фиг.1a) и создали модульный лентивирусный вектор sgRNA: Cas9 для доставки гРНК в клетки. Чтобы проверить эффективность каждой гРНК для прямой опосредованной Cas9 абляции CXCR4, мы заразили клеточную линию Ghost X4, которая была получена из клеток остеоновой саркомы человека (HOS) человека, экспрессирующих CXCR42526 с лентивирусом при множественности инфекции (MOI) 40. Через три дня после трансдукции мы проводили анализы T7EN1 для измерения вставки / делеции (indels) в локусе CXCR4 и наблюдали, что CXCR4 был аннулирован до 39,22% клеток Призрака в зависимости от используемой гРНК (рис.1b, c). При секвенировании Сэнгера мы наблюдали, что четыре из десяти gRNAs эффективно индуцировали мутации indel в гене CXCR4 (фиг.1d).

Для дальнейшей оценки эффективности гРНК-опосредованного нарушения CXCR4 в клетках Ghost X4 мы провели анализ проточной цитометрии для анализа уровней белка CXCR4 через 48 часов после трансдукции. Мы обнаружили, что количество клеток, экспрессирующих CXCR4, уменьшилось до 23,5% и 29,5% населения после лечения гРНК №6 или №7 соответственно (фиг.2а). Сортированные FACS клетки показали гомогенность в отсутствии экспрессии CXCR4 (фиг.2b). Часть трансдуцированных клеток на фиг.2а собирали и подвергали вестерн-блотам, и результаты показали, что уровень экспрессии CXCR4 был значительно снижен после трансдукции CXCR4-gRNA lentivitus (фиг.2с).

Затем мы проверили, может ли CRISPR / Cas9-опосредованное разрушение гена CXCR4 ингибировать инфицирование ВИЧ-1, воспользовавшись линией клеток репортера Ghost X4, содержащей кассету экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP), приводимую в действие элементом LTR ВИЧ-1, что позволяет оценки и количественного определения заражения ВИЧ-1 проточной цитометрией. Мы трансдуцировали репортерные клетки Ghost X4 с лентивирусом, несущим gRNA # 6 или # 7, окрашенные клетки с анти-CXCR4-PE и отсортированными клетками, которые были недостаточны в экспрессии CXCR4. Затем мы заразили отсортированные клетки Ghost X4 (как показано на рисунке 2b) ВИЧ-1NL4-3, CXCR4-тропический вирус ВИЧ-1 при M.O.I 1,0 и измерили их уровни GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Мы показываем, что клетки Ghost X4, модифицированные lentivirus # 6 или # 7 gRNA / Cas9, были отрицательными для экспрессии GFP по сравнению с контрольными клетками (фиг.3a), что указывает на то, что CRISPR / Cas9-опосредованное редактирование генома CXCR4 защищает клетки Ghost X4 от ВИЧ- 1. Чтобы количественно проверить, может ли изменение CXCR4 обеспечить защиту клеток Ghost X4, мы проанализировали процент положительных клеток GFP путем проточной цитометрии через 4 дня после вирусной инфекции. Мы наблюдали полную потерю экспрессии GFP в отредактированных CXCR4 клетках по сравнению с контрольными клетками, которые содержат 55,3% GFP-положительных клеток (фиг.3b), что указывает на ограниченную инфекцию ВИЧ-1 в клетках с модифицированным CXCR4. Кроме того, мы провели ELISA p24 (рис.3c) и анализ ПЦР в реальном времени (рис. 3d) и обнаружили, что вирус не обнаруживается до 3-го дня, а титр вируса и количество копий ВИЧ-1NL4-3 значительно снизились в день 4 или 5-го дня в редактируемых геномом клетках Ghost X4 по сравнению с контрольными клетками. В совокупности эти результаты продемонстрировали, что обе антитела, кодируе- мые G6-средой # 6 и # 7, C9CR4 могут защитить клетки Ghost X4 от инфекции ВИЧ-1.

Человеческие CD4 + Т-клетки являются основными клетками-мишенями ВИЧ-1-инфекции. Чтобы определить, может ли CXCR4 разрушение гена CRISPR / Cas9 защитить клетки Jurkat от заражения ВИЧ-1, мы трансдуцировали T-клетки Jurkat контрольным, № 6 или № 7 CXCR4-gRNA / Cas9-лентивирусом и провели анализ T7EN1. Как показано на фиг.4а, мы наблюдали высокую эффективность на целевом уровне для № 6 и № 7 гРНК с 45,03% и 44,31% абляцией гена CXCR4, соответственно. Секвенирование ДНК Sanger мишеней подтвердило, что мутации были введены в ген CXCR4 в Т-клетках Jurkat, трансдуцированных лентирусом # 6 или # 7 gRNA / Cas9 (фиг.4b). Кроме того, мы также собирали некоторые клетки после трансдукции для анализа вестерн-блоттинга и наблюдали значительное снижение экспрессии белка CXCR4 в клетках, которые были трансдуцированы с помощью # 6 или # 7 gRNA / Cas9 (фиг.4c).

Чтобы оценить экспрессию белка CXCR4 в Т-клетках Jurkat после трансдукции lenti-CXCR4-gRNA / Cas9 с контрольным, № 6 или № 7 CXCR4-gRNA / Cas9-лентивирусом, мы окрашивали клетки анти-CXCR4-PE и проводили проточный цитометрический анализ. Мы обнаружили, что клетки, трансдуцированные геномной ДНК # 6 или # 7, отображали два подмножества клеток, которые представляют CXCR4-негативные и -положительные популяции (рис.5a, b). Напротив, отрицательные (неокрашенные клетки Ghost X4) или клетки с положительным контролем (mock lentivirus) показали только один поднабор клеток (либо CXCR4-негативные, либо положительные клетки) (фиг.5a, b). Чтобы проверить, может ли изменение CXCR4 обеспечить защиту вирусу ВИЧ-1NL4-3, мы заразили модифицированные клетки Jurkat T вирусом ВИЧ-1NL4-3 и провели анализы ELISA с антигенами p24 через 1, 3, 5 и 7 дней после инфицирования. Мы наблюдали, что уровень p24 ВИЧ-1NL4-3 был намного ниже в обработанных геномом клетках Jurkat T по сравнению с контролем (рис.5c). Все эти данные демонстрируют, что гена 6 или # 7 gRNA / Cas9 может нарушать ген CXCR4 в T-клетках Jurkat, что приводит к защите от инфекции ВИЧ-1.

Учитывая высокую эффективность редактирования генома CXCR4 lentiCRISPR / Cas9 в клетках Ghost X4 и Jurkat T, мы проверили возможность удаления CXCR4 в первичных CD4 + Т-клетках человека. Мы трансфицировали активированные первичные человеческие CD4 + Т-клетки контрольной плазмидой # 6 или # 7 CXCR4-gRNA / Cas9 и проводили анализы T7EN1 через 3 дня после трансфекции. Мы наблюдали, что как 6, так и 7 gRNA индуцировали мутации indel в гене CXCR4 в первичных Т-клетках (фиг.6а), что было менее эффективным, чем клетки Jurkat (фиг.5а). Анализ секвенирования ДНК 10 клонов подтвердил индексы в целевых сайтах # 6 или # 7 гРНК гена CXCR4 в CD4 + T-клетках (фиг.6c). Чтобы определить эффективность модификации CXCR4-gRNA / Cas9 в обеспечении защиты первичных CD4 + Т-клеток от инфекции ВИЧ-1, мы инфицировали клетки (содержащие модифицированный CXCR4) CXCR4-тропическим HIV-1NL4-3 и культивировали в течение 7 дней. Анализ ELISA показал, что уровень p24 уменьшился более чем на 64% в клетках, трансфицированных # 6 или # 7 CXCR4-gRNA / Cas9 по сравнению с контрольными клетками на 7-й день (фиг.6d). Эти результаты показывают, что нарушение экспрессии CXCR4 в человеческих CD4 + Т-клетках CRISPR / Cas9 обеспечивает частичную защиту от инфекции ВИЧ-1.

Было хорошо документировано, что CXCR4 играет важную роль в гемопоэтических клетках, дифференцировке тимуса, а также миграции клеток-предшественников и самонаведения2728. Кроме того, потенциальные внецелевые эффекты CRISPR / Cas9 могут индуцировать токсичность генов в клетках и увеличивать риск смерти клеток1929, и затем мы исследовали, может ли потеря CXCR4 влиять на жизнеспособность клеток. Мы трансфицировали человеческие первичные CD4 + Т-клетки контролем, № 6 или № 7 CXCR4-gRNA / Cas9 и подсчитывали живые клетки в течение 7 дней. Как показано на фиг.6е, мы наблюдали, что скорость роста и пролиферация клеток, трансфецированных # 6 или # 7, были подобны скорости роста клеток, трансфицированных контрольной плазмидой.

Резус макак — отличная модель приматов, не относящаяся к человеку, для тестирования методов генной терапии ВИЧ-1 и измерения безопасности и эффективности противовирусных вакцин. Чтобы обеспечить доказательство концепции будущих исследований клинической терапии с использованием системы lentiCRISPR / Cas9, мы выделили CD4 + Т-клетки из цельной крови макаки Резуса и стимулировали ее обработкой анти-CD3 / анти-CD28 шариками для трансфекции. Поскольку целевые сайты CXCR4, выбранные для этого исследования, идентичны у резуса и человека, мы трансфицировали резус CD4 + Т-клетки с генами # 6 или # 7 и проводили анализ T7EN1. Наши результаты показывают, что как g6НК, так и 6-я гена индуцировали мутацию гена CXCR4 в CD4 + клетках резус-макаки (фиг.6b), что указывает на то, что редактирование генома CXCR4 может быть достигнуто lentiCRISPR / Cas9 в Rcus macacque CD4 + T-клетках.

Система CRISPR / Cas9 представляет собой мощный инструмент для разработки генома; однако потенциальное расщепление от цели не всегда является серьезной проблемой для будущих терапевтических применений30. Чтобы определить внецелевые эффекты lentiCXCR4-gRNA / Cas9, мы выровняли последовательности мишеней # 6 и # 7 с геномом человека для поиска всех потенциальных нецелевых сайтов с помощью онлайн-инструмента (http: // crispr.mit.edu) 19. Как показано на рисунке 6f, мы идентифицировали две и пять потенциальных нецелевых последовательностей с высокими показателями для # 6 и # 7 gRNA, соответственно. Затем мы ПЦР амплифицировали геномную ДНК после трансдукции и секвенировали ДНК размером 500 п.о., охватывающую область вне мишени с использованием клонирования ТА. Как показано на рисунке 6f, мы не обнаружили никаких мутаций на этих сайтах в трансформированных lentiCRISPR / Cas9 клетках Ghost X4, что свидетельствует о том, что в нашем единственном эксперименте по трансфекции гРНК не существует мутагенеза вне мишени.

ВААРТ эффективно используется для борьбы с ВИЧ, но он не может искоренить вирус. Интересно отметить, что гомозиготная трансплантация костного мозга CCA5 delta32 для пациентов с ВИЧ-инфекцией успешно уничтожила ВИЧ до неопределяемого уровня31. Однако широкое клиническое применение этого подхода ограничено из-за токсичности путем аллогенного отторжения и очень ограниченной доступности HLA-совместимых гомозиготных доноров CCR5 delta32. Недавно ZFN-опосредованная генетическая модификация в аутологичных CD4 + Т-клетках оказалась эффективной при нарушении CCR5 и может стать альтернативной терапией для лечения СПИД14. CCR5 также может быть эффективно разрушен в гемопоэтических стволовых клетках (HSC), чтобы ингибировать заражение ВИЧ у гуманизированных мышей3233. Кроме того, модифицированные геном аутологичные HSC могут быть трансплантированы ВИЧ-инфицированным лицам34. Эти стратегии направлены только против трофических вирусов CCR5. Однако в предыдущих сообщениях было показано, что 46% пациентов, получавших АРТ, имеют как штаммы R5, так и X4 и 4% только с штаммами X4-HIV и что вирус CCR5 может развиваться, чтобы использовать CXCR4 в качестве корецептора для инфицирования клеток35. Таким образом, нарушение CXCR4 может быть дополнительной стратегией для ингибирования заражения ВИЧ-1, особенно у пациентов с хронической прогрессией заболевания153637. Для достижения полного клиренса ВИЧ одновременное нарушение как CCR5, так и CXCR4 в первичных человеческих CD4 + Т-клетках может потребоваться для лечения установленной инфекции ВИЧ-115. ZFN также были предназначены для нацеливания провирусной ДНК, которая вводится в человеческий геном38 и нарушает CXCR4 в человеческих CD4 + Т-клетках36. Хотя ZFN могут служить мощной технологией для редактирования генома, требуемая специфичность связывания ДНК требует обширного процесса скрининга, а модульная конструкция трудоемкая и дорогостоящая. Недавно была разработана система CRISPR / Cas9 для манипулирования геномом, и ее способность точно модифицировать эндогенные гены может способствовать лечению заболеваний. В этом исследовании мы применили систему CRISPR / Cas9 для нацеливания гена CXCR4 и определили два эффективных целевых сайта. Две gRNAs могут опосредовать разрушение Cas9 CXCR4 в клетках Ghost-X4, клетках Jurkat, а также первичные человеческие CD4 + Т-клетки с эффективностью более 40% мутагенеза. Кроме того, мы также показываем, что эти модифицированные геном клетки устойчивы к инфекции с помощью X4 тропического ВИЧ-1. Таким образом, CRISPR / Cas9-опосредованная делеция CXCR4 обеспечивает альтернативный способ лечения X4-тропической ВИЧ-инфекции.

Однако для терапевтических целей специфичность нуклеазы Cas9 является важным фактором, который следует учитывать39. Предыдущие исследования показали, что среди пяти гРНК, предназначенных для нацеливания человеческого CCR5-гена с помощью системы CRISPR / Cas9, два из них обладают потенциальной нецелевой активностью на человеческом гене C-C хемокинового рецептора типа 2 (CCR2) 40. В другом отчете тщательный BLAST-поиск в базе данных NCBI показал, что последовательность gRNA 20 нт против гена CCR5 человека не выявила потенциальных эффектов вне мишени в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSCs) 41. Недавние исследования показали, что редактирование CRISPR / Cas9 CD34 + HSC с одиночной гРНК индуцирует высокоэффективную аблацию CCR5 и мутагенез с низкой мишенью23. Кроме того, сообщалось, что у нокаута CCR5, вызванного lentivirus42 и аденовирусом43 Cas9, были низкие эффекты с низкой мишенью. В наших исследованиях внецелевые последовательности были предсказаны для каждой CKCR4-гРНК с использованием оптимизированного инструмента проектирования CRISPR, как описано ранее44. Потенциальные последовательности были далее выровнены с геномом человека для поиска эффективных мест вне цели. Мы не обнаружили каких-либо нецелевых модификаций, которые были проанализированы секвенсированием Сэнгера. Поэтому в этом исследовании мы показываем, что система CRISPR / Cas9 оказывается конкретной и высокоэффективной для ориентации на CXCR4.

Вызывает беспокойство то, что абляция CXCR4 может нарушать гемопоэтические клетки и дифференцировку тимуса, а также миграцию клеток-предшественников и самонаведение2728. CXCR4 и его лиганд CXC12 (SDF-1) играют важную роль в сохранении HSC в костном мозге, а потеря экспрессии CXCR4 в зиготе приводит к эмбриональной летальности мышей45. Поэтому, возможно, нецелесообразно полностью выбивать CXCR4 в клинических испытаниях. Однако нарушение ZFN CXCR4 не влияет на пролиферацию CD4 + Т-клеток человека3637. В соответствии с предыдущими сообщениями, наши результаты также показали, что нарушение CXCR4 CRISPR / Cas9 не привело к снижению клеточного роста. Кроме того, Cxcr4-дефицитные Т-клетки человека по-прежнему сохраняют свою иммунную функцию (по крайней мере частично) в мышиной модели 3646. Таким образом, одной из возможностей для выкидывания CXCR4 в терапии человека может быть временная абляция CXCR4 для зрелых посттимических CD4 + Т-клеток. Поскольку нет естественных гомозиготных мутаций CXCR4, обнаруженных у людей, последствия выбивания CXCR4 в конкретных типах клеток должны быть дополнительно изучены и исследованы до того, как их можно будет использовать для клинической терапии. Кроме того, наша предыдущая работа показала, что мутант CXCR4, P191A, может заменить эндогенный CXCR4 для поддержания нормальной функции, но уменьшить репликацию ВИЧ-129. Следовательно, в будущих исследованиях, связанных с генной терапией ВИЧ-1, мы предлагаем, чтобы физиологически функциональный CXCR4 (например, мутант P191A) можно вводить, когда CXCR4 HSCs нарушается, чтобы вызвать резистентность к ВИЧ-1 и в то же время восстанавливать физиологическая функция CXCR4.

Таким образом, мы обнаружили два сайта в CXCR4, которые могут быть эффективно нацелены и, в частности, системой CRISPR / Cas9, что приводит к абляции абляции C-CCR4. Мы также показываем, что модифицированные клетки устойчивы к инфекции ВИЧ-1 типа X4, и это может предоставить нам альтернативный подход генной терапии для лечения СПИДа. Хотя lenti-CRISPR / Cas9 предоставляет мощные средства для разрушения CXCR4, необходимо изучить оптимизированные методы доставки с использованием аденовируса, чтобы еще больше улучшить их специфичность и свести к минимуму озабоченность по поводу терапевтической безопасности. Из-за различия в вирусной инфекции совместное нарушение CCR5 и CXCR4 должно быть протестировано с использованием системы CRISPR / Cas9, опосредованной опосредованным или аденовирусом, в будущем. Более того, успешное разрушение CXCR4 в CD4 + T-клетках резус-макаки может ускорить исследования генной терапии СПИДа в моделях приматов, отличных от человека.

ГРНК-кодирующие кДНК для десяти мишеней, сохраняющихся как у человека, так и у генной гены CXCR4 человека и резуса, были спроектированы и синтезированы для создания конструкций lenti CXCR4-gRNA-Cas9, как описано ранее19. Вкратце, 24-б.п. передние и обратные праймеры, включая целевую последовательность 20 bp и липкий конец BsmbI, отжигали и вставляли в плазмиду lentiCRISPR-v2 (Addgene 52961), переваренную BsmbI (Fermentas). Последовательности праймеров показаны в таблице S1.

Клетки HEK293T, клетки Ghost-CXCR4 (X4), клетки Jurkat и вирус ВИЧ-1 использовали, как описано ранее47. Образцы цельной крови от здоровых доноров были приобретены в Центре крови Ухань (Ухань, Китай). Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) отделяли от цельной крови центрифугированием с помощью Ficoll-Paque Premium (BD). Первичные человеческие CD4 + Т-клетки дополнительно очищали и обогащали комплексом для выделения CD4 + Т-клеток (Miltenyi Biotech) в соответствии с инструкциями производителя, а затем поддерживали в полной среде RPMI, дополненной 10% FBS. Перед трансфекцией первичные человеческие CD4 + Т-клетки стимулировали от 2 до 3 дней пластиной с анти-CD3 / анти-CD28-покрытием в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (20 МЕ / мл, Roche Applied Science). РВМС цельной крови из здоровой макаки резуса (выращиваемой в Центре эксперимента животных и лаборатории ABSL-3, Уханьский университет, Китай) выделяли центрифугированием с помощью Ficoll-Paque Premium (BD). Клетки CD4 + T дополнительно очищали с помощью набора для выбора CD4 + T-клеток приматов (Miltenyi Biotech). Затем клетки активировали анти-CD3 (клон FN-18) / анти-CD28 (клон L293) (Invitrogen), нанесенный на культуральную планшету в течение 3 дней.

Стимулированные первичные человеческие или Rcus macaque CD4 + T-клетки подвергали электротрансфекции с помощью CXCR4-gRNAs-Cas9 или контрольных плазмид с использованием набора Nucleofector T-клеток # VPA-1002 (набора для ячеек T-клеток человека Amaxa) или 4D-нуклеофорктора P3 первичной клетки × Kit ( V4XP-3012). Короче говоря, 5 × 106 CD4 + Т-клеток на образец собирали и дважды промывали в PBS. Клетки ресуспендировали в 100 мкл Nucleofector Solution с 2 мкг плазмид соответственно. Смесь клеток / ДНК переносили в сертифицированную кювету и электротрансфицировали с помощью устройства Naxleofector II Amaxa с использованием Nucleofector Program T-020 или Lonza 4D-Nucleofector System. После трансфекции клетки культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS в течение двух дней, а затем использовали для дальнейшего анализа. Клетки подсчитывали с использованием метода исключения трианового синего красителя на гемоцитометре под микроскопом.

Для получения лентивируса клетки HEK 293T, высеваемые на 100-миллиметровой пластинке, трансфицировали 6,0 мкг lentiCXCR4-gRNA-Cas9 или lenti-CRISPR-v2 контрольных плазмид, 4,5 мкг psPAX2 и 3,0 мкг VSV-G плазмид с использованием реагента Полиэтиленимина (PEI, Polysciences , Warrington, PA) в соответствии с инструкциями производителя. После инкубации в течение 72 часов супернатанты трансфицированных клеток, содержащих лентивирус, собирали и фильтровали с помощью фильтра 0,45 мкм, а затем хранили при -80 ° С. Вирусные титры определяли с помощью вирусного счетчика (Virocyt 2100). Клетки Ghost-CXCR4 или клетки Jurkat T (1 × 105), высеянные в 12-луночном планшете, трансдуцировали лентивирусом при moi 40. Для T-клеток Jurkat спин-трансдукцию проводили центрифугированием пластины, покрытой 8 мкг / мл полибрена (Sigma-Aldrich) при 1200 g в течение 2 часов при 25 o C и культивировали еще 2 часа в инкубаторе. Затем среду изменяли свежим RPMI 1640, дополненным 10% FBS. Эти трансдуцированные клетки инкубировали в течение 2 дней и затем собирали для экстракции геномной ДНК или окрашивали антителом PE-CXCR4 и оценивали с помощью проточной цитометрии. Штамм ВИЧ-1, NL4-3 (ВИЧ-1NL4-3), был получен, как описано в нашей предыдущей работе47.

Геномную ДНК экстрагировали из клеток с использованием набора ДНК Midi Kit крови и клеток (TIANGEN, Китай) в соответствии с протоколом производителя. Для оценки частоты мутаций анализ T7 эндонуклеазы I (T7EN1) проводили, как описано ранее48. Вкратце, геномную область, фланкирующую целевой сайт gRNA, амплифицировали ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в таблице S1. 800 нг очищенных продуктов ПЦР смешивали с 2 мкл NEB-буфера 2.0 (New England Biolabs) и деионизировали H2O, чтобы получить общий объем 20 мкл. Смесь отжигали с образованием гетеродуплексов. После этого гетеродуплексы расщепляли 1 мкл T7 Endonuclease I (10 единиц / мкл, New England Biolabs) при 37 ° C в течение 30 минут. Переваренную ДНК анализировали на электрофоретической системе с использованием 1,5% агарозного геля. Частоту мутации определяли количественно (программное обеспечение Image J, NIH Image-BioLab) и рассчитывали, как описано ранее39. Для анализа последовательности очищенный продукт ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega), а затем рекомбинанты секвенировали с использованием праймера T7.

Для определения эффективности инфицирования ВИЧ-1 немодифицированные или CXCR4-gRNA / Cas9-модифицированные клетки Ghost X4 подвергались воздействию HIV-1NL4-3 при m.o.i 1,0. Через 6 часов клетки трижды промывали PBS и культивировали в свежей среде. В разные моменты времени клетки собирали и оценивали для экспрессии GFP через проточную цитометрию в промывочном буфере (1 мМ ЭДТА, 1,0% FBS, 1,0% формальдегид, 0,2% глутарового альдегида в PBS). Результаты представлены в виде гистограмм флуоресценции с использованием GraphPad Prism 6.01 (GraphPad Software). Для определения эффективности разрушения CXCR4 трансдуцированные лентивирусом клетки Ghost X4 или Jurkat T-клетки окрашивали конъюгированным с PE (Phycoerythrin) антителом против человеческого CXCR4 (Biolegend) и анализировали или сортировали по проточной цитометрии (FACSan, Beckman Coulter). Данные были построены в программном обеспечении FlowJo (Treestar). Часть этих трансдуцированных клеток лизировали в буфере (50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,25% дезоксихолата), содержащем коктейль ингибитора протеазы (Roche Applied Science) в течение 30 мин на льду. Лизаты денатурировали в 2 × SDS-загрузочном буфере кипячением в течение 10 минут и подвергали непрерывному SDS-PAGE на 4-15%. После переноса белка в нитроцеллюлозные мембраны (Millipore) для определения экспрессии CXCR4 на клеточной поверхности использовали антитело против CXCR4 (ab2074, Abcam) и Immobilon Western хемилюминесцентный субстрат HRP (Millipore). Полосы сканировали Fujifilm LAS 4000. Для обнаружения флуоресцентной микроскопии экспрессии GFP в клетках Ghost X4 немодифицированные или CXCR4-гРНК / модифицированные кадмией клетки подвергали воздействию HIV-1NL4-3 при m.o.i 0,1. Через 6 часов инфицирования клетки трижды промывали PBS и культивировали в свежей среде. Флуоресцентную микроскопию использовали для выявления ВИЧ-1-инфекции после трех дней воздействия вируса.

6 × 104 отсортированных клеток Ghost-CXCR4 или несортированных Т-клеток Jurkat высевали в 12-луночный планшон за день до заражения ВИЧ-1. Затем этим клеткам вводили вирус HIV-1NL4-3 в течение 8 часов при комнатной температуре. 1,0 для клеток Ghost-CXCR4 и 0,1 для T-клеток Jurkat в общем объеме 500 мкл свободной от сыворотки среды. Среду удаляли и клетки культивировали со свежей полной средой после промывки PBS 3 раза. В разные дни после инфицирования вирусный запас, свободный от клеток, был обнаружен для антигена p24 ВИЧ-1 с использованием набора ELISA Kit p24 (RETRO-TEK), и клеточная геномная ДНК была выделена для количественной ПЦР, специфичной для кляпа HIV-1 или человека β -глабин с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Invitrogen). Грунты показаны в таблице S1.

Последовательности CXCR4-gRNA были взорваны с помощью онлайн-инструмента (http://crispr.mit.edu) для поиска прогнозируемых внецелевых сайтов. Допускались разрывы в 6 п.п. по сравнению с целевой консенсусной последовательностью, и потенциальные последовательности были выровнены с геномом человека с помощью инструмента выравнивания по горизонтали (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Последовательности этих предсказанных внецелевых сайтов амплифицировали ПЦР и клонировали в вектор pGEM-T для секвенирования для идентификации активности вне мишени. Для статистического анализа данные анализировались с использованием программного обеспечения OriginPro8.0. Статистическую значимость определяли по критерию Стьюдента t, при этом р <0,05 считали статистически значимым. Все эксперименты проводились как минимум три раза.

Как процитировать эту статью: Hou, P. et al. Редактирование генома CXCR4 с помощью CRISPR / cas9 дает клетки, устойчивые к инфекции ВИЧ-1. Sci. По донесению
5, 15577; doi: 10.1038 / srep15577 (2015).

Эта работа финансировалась Китайской национальной специальной исследовательской программой по основным инфекционным заболеваниям (2014ZX10001003 и 2012ZX10001006-002) и провинциальной научно-технической компанией провинции Хубэй. D.G. поддерживается Высшей медицинской академической программой провинции Хубэй. Эта работа была также поддержана Фондом научных исследований Китая (2015T80838 и 2014M560622) в SC. Авторы благодарят доктора Фэн Чжан (Broad Institute of MIT и Гарвард, США) и доктора Циньшуэ Ху (Уханский институт вирусологии, Китайская академия наук) для любезно предоставленной плазмиды lenti-CRISPR и ВИЧ-1NL4-3 соответственно. Мы также благодарим Dheeraj Bhavanasi за помощь в пересмотре рукописи.

Авторские вклады D.G. задумал, спроектировал и контролировал проект, и написал рукопись. P.P.H. и S.L.C. разработал и провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. S.L.W. помогли в создании плазмиды. X.Y. и M.J. подготовили человеческие первичные Т-клетки. J.H. помогли в написании рукописи. K.Z. и W.Z.H. обеспечил целую кровь макаки Резуса. Y.C. и W.H. обеспечил конструктивный совет в экспериментах.

(a) Принципиальная схема gRNAs, нацеленная на локус CXCR4. РНК-направленный ген, нацеленный на эукариотические клетки, включает экспрессию белка Cas9 и gRNA под контролем промотора U6 полимеразы III человека. Cas9 разматывает ДНК-дуплекс и расщепляет обе нити при распознавании целевой последовательности гРНК, когда 3′-конец мишени содержит домен протоплазиса с соседним мотивом (PAM). Любая геномная последовательность формы 5′-GN19NGG-3 ‘или 5′-CCNN19C-3’ в принципе может быть нацелена. Для всех гРНК исходный 5’G (красный) может улучшить транскрипцию. (б) Схема гРНК для нацеливания на CXCR4. gRNAs показаны красным цветом. Синие стрелки представляют собой праймерную пару, используемую для усиления области. (c) Анализ T7EN1 каждого gRNA-lentiCRISPR / Cas9, нацеленного на CXCR4 в клетках Призрака. Клетки Ghost X4 инфицировали указанным CXCR4-гРНК-лентивирусом при M.O.I. из 40. Геномную ДНК из клеток экстрагировали и ПЦР амплифицировали для проверки нарушения CXCR4 с помощью анализа T7 эндонуклеазой I с использованием 1,5% агарозного геля. Нижние мигрирующие полосы (обозначенные стрелками) на дорожках указывают на нарушенные аллели CXCR4. Процент indels измерялся программным обеспечением Image J. (d) Последовательности ДНК локусов CXCR4 модифицированных клеток Ghost. Все продукты ПЦР (с, верхняя полоса, около 783 п.о.) вставляли в Т-вектор и анализировали секвенированием ДНК. Последовательности PAM выровнены и выделены красным цветом; последовательности таргетинга были показаны синим цветом; мутации в целевых последовательностях в черном; удаления указаны с (-) и вставками с (+). N / N указывает отношение WT или мутаций к общим секвенированным клонам. Никаких мутаций в контрольных образцах не наблюдалось.

(a) Анализ проточной цитометрии экспрессии CXCR4 в lentiCRISPR / Cas9-трансдуцированных клетках Ghost X4. Клетки Ghost X4, трансдуцированные CXCR4-gRNA-лентивирусом (M.O.I. 40), окрашивали конъюгированным с PE-антителом антителом, специфичным для CXCR4, и анализировали с помощью проточной цитометрии. Лечение вируса CXCR4-gRNA отмечено в верхней части каждой панели. Для CXCR4-gRNA / Cas9 отредактированных клеток Ghost X4 было проведено различие между конкретными положительными и отрицательными популяциями CXCR4. Показанные значения представляют собой проценты положительных или отрицательных клеток CXCR4. Неокрашенные клетки Ghost X4 рассматривались как отрицательный контроль и клетки, инфицированные вирусом lenti-CRISPR, как положительный контроль. Анализ проводился в программном обеспечении Flow Jo (Tree star). (b) Очищенная популяция продуцированных CXCR4-gRNA трансформированных лентивирусами клеток Ghost X4, полученных на фиг.1a, которые были отсортированы FACS из-за отсутствия клеточной поверхности CXCR4. (в) Вестерн-блот-анализ экспрессии CXCR4 в клетках Ghost X4, трансдуцированных CXCR4-gRNA-лентивирусом (как в а). Обработанные lentivirus клетки Призрака собирали и анализировали путем Вестерн-блоттинга с антителом против CXCR4 или анти-β-актина.

(a) Определение флуоресцентной микроскопии экспрессии GFP, активированной ВИЧ-1-инфекцией. Немодифицированные или CXCR4-gRNA / Cas9-модифицированные клетки Ghost X4, отсортированные по FACS, подвергались воздействию ВИЧ-1NL4-3 при M.O.I. 0,1. Через 6 часов инфицирования клетки трижды промывали PBS и культивировали в свежей среде. Флуоресцентную микроскопию использовали для выявления ВИЧ-1-инфекции после трех дней воздействия вируса. Ячейки Ghost X4 стабильно трансдуцируются ретровирусным вектором MV7neo-T4 (CD4) и содержат стабильный элемент репортера LTR-GFP. При заражении ВИЧ-1 белок Tat будет связываться с промотором LTR, чтобы дополнительно активировать экспрессию GFP. (b) Анализ FACS экспрессии EGFP, активированного ВИЧ-1-инфекцией. Анализы выполняли как в (а), за исключением инфекции ВИЧ-1NL4-3 при M.O.I. 1,0. Процент ВИЧ-1-инфицированных клеток Ghost X4 определяли количественно путем определения GFP-положительных клеток с использованием FACS через четыре дня после инфицирования. (c, d) p24 ELISA и qPCR-детектирование уровня ВИЧ-1NL4-3 в немодифицированных или CXCR4-gRNA / Cas9-модифицированных клетках Ghost X4, отсортированных по FACS. ВИЧ-1, как это сделано в (б). В указанные моменты времени после инфицирования культуральные супернатанты собирали для ELISA-детектирования экспрессии ВИЧ-1 p24, в то время как геномную ДНК клеток экстрагировали и подвергали количественной ПЦР в реальном времени с использованием ген-специфических праймеров для ВИЧ-1 gag и человеческого β-глобинового гена. В (d) относительные числа копий кляпа были нормированы на β-глобин. Нормализацию проводили на основе амплификации гэг-гена в немодифицированных клетках с ВИЧ-1-инфекцией в течение 1 дня. Среднее ± SEM представляет собой среднее значение трех независимых экспериментов. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.

(a) Геномное нарушение CXCR4 было обнаружено с помощью анализа T7EN1. Т-клетки Jurkat трансдуцировали контрольным или CXCR4-гРНК-лентивирусом при M.O.I. из 40. После 48-часовой инфекции геномную ДНК экстрагировали и ПЦР амплифицировали для анализа T7EN1. Ожидаемая длина ДНК аллеля дикого типа составляла 783 п.о. Нижние полосы указывали на нарушенные CXCR4 аллели. Процент indels измерялся программным обеспечением Image J. (b) Последовательности ДНК локусов CXCR4 модифицированных клеток Jurkat. Анализы проводили, как на фиг.1c, d. (c) Вестерн-блот-анализ экспрессии CXCR4 в трансдуцированных CXCR4-gRNA lentivirus T-клетках Jurkat. Т-клетки Jurkat трансдуцировали контрольным или CXCR4-гРНК-лентивирусом при M.O.I. 40. Через 48 часов клетки собирали и анализировали путем Вестерн-блоттинга с анти-CXCR4 или анти-β-актин-антителом.

(a, b) FACS-анализ, показывающий отсутствие экспрессии CXCR4 в обработанных CXCR4-gRNA lentivirus T-клетках Jurkat. Трансдуцированные lentivirus клетки Jurkat T окрашивали антителом PE-CXCR4 и анализировали с помощью FACS (как на фиг.2). Лечение отмечалось в верхней части каждой панели. Неокрашенные Т-клетки Юрката определяли как отрицательное подмножество CXCR4, тогда как контрольные (пустые векторы) обработали клетки как положительное подмножество CXCR4. Трансдуцированные T-клетки Jurkat, экспрессирующие CXCR4-гРНК (# 6 и # 7), выявили два клеточных подмножества (CXCR4-отрицательные и положительные). (c) Т-клетки Jurkat, обработанные CXCR4-гРНК, были очень устойчивы к заражению ВИЧ-1. Немодифицированные или CXCR4-gRNA / Cas9-модифицированные T-клетки Jurkat были инфицированы ВИЧ-1NL4-3 при M.O.I. 0,1. В разные моменты времени супернатант, свободный от клеток, собирали и титровали с помощью ELISA с захватом p24. График представляет собой один из трех независимых экспериментов по заражению, а полосы ошибок представляют собой SEM. * p <0,05, ** p <0,01.

(a) редактирование LentiCRISPR / Cas9 CXCR4 в CD4 + Т-клетках. Первичные человеческие CD4 + Т-клетки трансфицировали CXCR4-gRNA / Cas9 или контрольные плазмиды. Через 36 часов клетки собирали для экстракции геномной ДНК и анализа T7EN1. Нижние полосы в полосе 6 и 7 обозначают мутантные аллели CXCR4. (b) LentiCRISPR / Cas9 эффективно разрушает CXCR4 в Rcus macacque CD4 + Т-клетках. Целевые сайты # 6 и # 7 CXCR4-gRNA сохраняются между людьми и макаками резус. Частоты разрушения измеряли с помощью анализа T7EN1. (c) Последовательности модифицированного гена CXCR4 в человеческих CD4 + Т-клетках. Продукты ПЦР (в а) клонировали в Т-вектор и 10 рекомбинантов анализировали секвенированием ДНК. Никаких мутаций в контрольных образцах не наблюдалось. (d) модифицированные человеческие CD4 + Т-клетки противостоят инфекции ВИЧ-1. Первичные CD4 + Т-клетки (2 × 106) в 6-луночном планшете стимулировали и трансфецировали контрольной плазмидой № 6 CXCR4-gRNA / Cas9 с помощью Amaxa 4D-Nucleofector. Через 48 часов к клеткам добавляли вирус ВИЧ-1NL4-3 (M.O.I 0,1) в течение 4 часов, а затем супернатанты клеток удаляли и добавляли свежую среду. В указанные моменты времени супернатанты, свободные от клеток, собирали и тестировали с помощью ELISA для определения вирусных титров. График представляет собой один из 3 независимых экспериментов по заражению, а полосы ошибок представляют собой SEM. * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. (e) Оценка распространения клеток с потерей CXCR4 с помощью CRISPR / Cas9. Первичные человеческие CD4 + Т-клетки трансфектировали, и все живые клетки подсчитывали в разное время после трансфекции. Данные взяты из одного из трех независимых экспериментов. (f) Анализ частоты мутаций на прогнозируемых участках, не предназначенных для мишеней. Места вне цели были предсказаны и выровнены с геномом человека. Вирус инфицированных вирусом lentiCXCR4-gRNA / Cas9 клеток Ghost X4 собирали для извлечения геномной ДНК и амплифицировали ПЦР для предсказанных мест с неактивными мишенями. Продукты ПЦР затем клонировали в Т-вектор и подвергали секвенированию. Внецелевые последовательности в красном цвете указывают разные базы на целевых сайтах. По меньшей мере, 10 рекомбинантных клонов были секвенированы и не наблюдалось эффектов вне мишени. N / N указывает количество мутаций на полные колонии с последовательностью.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *