Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Неполная нейтрализация и отклонение от кривых сигмоидальной нейтрализации для ВИЧ-нейтрализующих моноклональных антител

Incomplete Neutralization and Deviation from Sigmoidal Neutralization Curves for HIV Broadly Neutralizing Monoclonal Antibodies
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4534392/

Я прочитал политику журнала, и авторы рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: EF, HS и TW работают в коммерческих компаниях, Abcam Burlingame, Crucell Holland B.V. и Monogram Biosciences Inc. соответственно. Это не меняет нашей приверженности ко всем политикам ПЛОС-патогенов при совместном использовании данных и материалов.

Задуманные и разработанные эксперименты: LEM EF KJD MJvG ZE HS DRB. Выполнены эксперименты: LEM EF KL DS ZE JAB MSS TW. Проанализированы данные: LEM EF DS ZE MSS TW. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: MJvG ZE RWS HS TW MSS. Написал документ: LEM EF MJvG KJD PP DRB.

Широко нейтрализованные моноклональные антитела ВИЧ (bnMAbs) PG9, PG16, PGT151 и PGT152 были показаны ранее, чтобы иногда демонстрировать необычный профиль нейтрализации вируса с несигмоидальным наклоном и плато при <100% нейтрализации. В текущем исследовании нас интересовало определение степени несигмоидальных склонов и плато при <100% для ВИЧ bnMAbs в более общем плане. Используя как панель 278 псевдовирусов в анализе CD4 T-клеток (U87.CCR5.CXCR4), так и группу из 117 вирусов в анализе TZM-bl, мы обнаружили, что bnMAbs, нацеленный на многие нейтрализующие эпитопы шипа, имеет профили нейтрализации при по меньшей мере, один вирус, который плавился при <90%. На обеих панелях bnMAbs, нацеленные на вершину V2 Env и gp41, скорее всего, демонстрируют кривые нейтрализации, которые плавают на 100%. Напротив, bnMAbs, нацеленные на эпитопы с высокой маннойным патчем, с меньшей вероятностью демонстрируют такое поведение. Два сайта CD4-связывания (CD4bs) Abs также показали это поведение относительно редко. Явление неполной нейтрализации наблюдалось также в большой группе клонированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), полученной из вирусных стай пациентов. Кроме того, пять bnMAbs сравнивали с 18-вирусной панелью молекулярных клонов, продуцируемой в клетках 293T и PBMC, и анализировали в клетках TZM-bl. Примеры плато <90% наблюдались при обоих типах продуцирования вируса, при этом не наблюдалось последовательных закономерностей. В заключение, неполные нейтрализационные и несигмоидальные кривые нейтрализации возможны для всех ВИЧ bnMAbs против широкого спектра вирусов, продуцируемых и анализируемых как в клеточных линиях, так и в первичных клетках, с последствиями для использования антител в терапии и в качестве инструментов для разработки вакцин.

Описаны антитела, которые сильно нейтрализуют широкий спектр циркулирующих штаммов ВИЧ. Эти антитела нацелены на множество сайтов на огибающем белке ВИЧ, три копии которого ассоциируют с образованием тримера, который украшает поверхность мембраны вирусной частицы. Некоторые из этих антител направляют области белка оболочки близко к мембране, некоторые связываются с верхней частью тримера, другие связываются через углеводы, которые покрывают белок оболочки, а другое подмножество связывается с тем же местом, что и CD4 рецептора ВИЧ человека. Несмотря на эффективное блокирование 50% инфекции при низких концентрациях антител, для некоторых конкретных комбинаций вирусов и антител доля вирусных частиц устойчива к нейтрализации антител даже при чрезвычайно высоких концентрациях. Это явление называется неполной нейтрализацией, а также часто приводит к несигмоидальным кривым доза-реакция, когда концентрация антител нанесена на график против уровня вирусной инфекции. Ранее антитела, направленные на вершину тримера, были связаны с неполной нейтрализацией и несигмоидальными кривыми. В этом исследовании мы показываем, что представители всех групп антител, описанных выше, приводят к неполной нейтрализации по меньшей мере для одного вируса, но это явление более часто встречается у тех, кто связывает вершину и стебель тримера. Устойчивые популяции вируса были замечены, был ли вирус продуцирован в естественной мишени ВИЧ-инфекции (человеческие CD4 + Т-клетки) или сконструированные человеческие клетки, более широко используемые для получения вируса для проверки функции антитела. Понимание этого явления важно для будущего использования антител в качестве терапевтических средств и для исследований вакцин, поскольку устойчивая популяция вирусов может привести к неспособности контролировать вирусную инфекцию у пациентов.

Все соответствующие данные содержатся в документе и файле поддержки.

Глюкопротеин оболочки ВИЧ-1 (Env), единственная мишень нейтрализующих антител (nAbs), представляет собой гетеротример состава (gp120) 3 (gp41) 3. Белок gp120 включает около 25 N-связанных гликанов, которые содержат почти 50% его массы [1], а белок gp41 обычно включает в себя четыре консервативных N-связанных гликана на С-концевой части эктодомена [2]. В то время как вирус использует гликаны в качестве стратегии предотвращения иммунного обнаружения, существует несколько областей Env, которые хорошо известны как уязвимые для распознавания широко нейтрализующих антител (bnAb) [3-6]. Три области обнаружены на gp120: сайт связывания CD4 (CD4bs), область V2 на вершине шипа Env, который включает гликаны в N160 и область, включающую V3, которая включает в себя гликаны, образующие высокомагнозный пластырь, и, в частности, гликана в N332. Недавние структурные исследования показывают, что вершины V2 и высокомагнозные патч-эпитопы образуют смежную область в верхней части тримерного энвикового шипа [7,8]. Одна область обнаружена на gp41 вблизи вирусной мембраны и известна как Мембранный проксимальный внешний регион (MPER). Кроме того, недавно были определены 3 новых региона уязвимости, соединяющих gp120 и gp41 [9-12]. Признание каждого из этих нейтрализующих эпитопов широко нейтрализующими моноклональными антителами (bnMAbs) имеет переменную зависимость гликанов.

Ранее мы показали, что некоторые bnMAbs демонстрируют кривые несигмоидальной нейтрализации, которые плато при <100% для некоторых изолятов [13,14]. В этих случаях было показано, что поведение частично связано с гетерогенностью гликанов в эпитопе Env. Поэтому стоит вкратце рассмотреть каждый из эпитопов bnAb, в свою очередь, и, в частности, роль гликанов в каждом эпитопе, прежде чем рассматривать нейтрализацию более подробно. CD4bs является консервативной областью на gp120, участвующей в связывании рецептора. Первое выделенное антитело, распознающее эту область, b12 [15], остается одним из наиболее изученных. Однако он является менее широким и мощным, чем недавно изолированные CD4bbnMAbs, такие как VRC01 [16], PGV04 [17], NIH-45-46, 12A12, 3BNC117 [18] и CH103 [19], которые нейтрализуют до 55 -90% циркулирующих вирусов. Учитывая VRC01 и PGV04, кристаллические структуры bnMAbs, связанные с ядром gp120, показывают, что оба контакта с гликаном на N276 являются частью их эпитопа, но, в то время как нейтрализация PGV04 резко снижается путем его удаления, усиливается нейтрализация с помощью VRC01 [16,17 , 20]. Этот гликан также необходим для нейтрализации другим CD4bs bnMAb, HJ16 [21]. Помимо этого гликана, ни один другой гликан не был так сильно связан с нейтрализацией вируса с помощью CD4bs-нацеливания bnMAbs, хотя обе нейтрализации VRC01 и PGV04 усиливаются удалением гликана при N461 и, кроме того, удаление гликанов при N301 или N386 может увеличить доступность CD4bs [22].

PG9 и PG16 [13,23-25], PGT141-145 [26], CH01-04 [27], PGDM1400 [28] и CAP256-VRC26 [29], нацеливают четвертичный сайт V2 на вершине Env, который включает глюкан на N160. Кристаллическая структура PG9, связанная с каркасом V1 / V2, показала, что PG9 делает основные контакты с этим гликаном [25] вместе с нитью C V1 / V2 и гликаном либо на N156 (CAP45), либо на N173 (ZM109). Последующие исследования показали, что эпитоп PG9 включает в себя Man5GlcNAc2 на N160 и высококапсулированных гликанах с маннойным или комплексным типом на вторичном сайте (N156 или N173) [30]. Дальнейшие структурные исследования со стабилизированным триером Env показали, что только один антигенсвязывающий фрагмент PG9 (Fab) связывается с каждым триром Энва [31]. Кроме того, исследования методом молекулярного моделирования и изотермической титровой калориметрии показали, что PG9 может взаимодействовать с гликоном N160 на соседнем gp120-протомере в комплексе антитело-тример [31].

Третья область gp120, на которую нацелена bnMAbs, представляет собой набор перекрывающихся эпитопов, которые, по-видимому, связаны с гликаном в N332 как существенный вклад в связывание антител. Некоторые из наиболее эффективных bnMAbs для ВИЧ, PGT121-123, PGT125-7, PGT128 и 10-1074 относятся к таковым для этого региона, а также к 2G12, PGT130-131 и PGT135-137. 2G12 связывает терминальную маннозу гликанов в N295, N332, N339 и N392. PGT121-123 связывают gp120 V1, V3 и несколько окружающих гликанов [7]. Центральным гликаном является гликоин Man8 / 9GlcNAc2 в остатке N332, но также включены сложные или гибридные гликаны при N137, N156 и N301 [7,22]. PGT128 связывает гликаны в N332, N301 и белковой последовательности на C-концевой стезе V3 [32]. PGT135 связывает гликаны в N332, N392 и N386 и последовательность белка в V3 и V4 [33].

BnMAbs 4E10, 2F5, Z13e1 и 10E8 распознают MPER на gp41 [34-36]. Хотя эти bnMAbs, как известно, не дают прямых контактов с гликанами, было показано, что частичное дегликозилирование gp140 усиливает связывание 4E10 и 2F5 [37]. Напротив, было показано, что недавно описанные анти-gp41 / gp120 bnMAbs PGT151 и PGT152 связываются с гликозами тройного и тетраантранарного комплексного типа у N611 и N637. Эти взаимодействия гликанов необходимы для нейтрализации как удаления обе полностью нейтрализованной нейтрализации для всех тестируемых изолятов [9]. Было показано, что недавно идентифицированный bnMAb 35O22 нацелен на сайт, охватывающий gp41 и gp120, с использованием гликанов N88, N230 и N241 [10]. Кроме того, было обнаружено, что ранее описанный bnMAb 8ANC195 [18] связывает Env через контакты в gp120 и gp41 в рамках одного протомера [11].

Несколько bnMAbs были особенно связаны с неполной нейтрализацией. Примечательно, что серия bnMAbs серии PGT150 не всегда обеспечивает 100% -ную нейтрализацию даже при возможности нейтрализовать исследуемый вирус с величиной IC50 менее 1 мкг / мл. Максимальная нейтрализация колеблется от 50 до 100%, при этом PGT151 и PGT152 достигают нейтрализации менее 80% против 26% и 20% из 117 протестированных вирусов. Аналогично, PG16 и в меньшей степени PG9 также были показаны ранее для отображения кривых нейтрализации для некоторых изолятов, которые плато при <100% и не являются сигмоидальными [13,14]. Также была описана неполная нейтрализация мощного MPER bnMAb 10E8, и это частично связано с гетерогенностью гликанов, особенно у N625 [38].

Неполная нейтрализация может иметь серьезные последствия для способности nAbs защищать от воздействия ВИЧ. Если передаваемые вирусы являются гетерогенными по чувствительности к нейтрализации, как это наблюдается для псевдовирусов и первичных вирусов, выращенных в РВМС, то отказ антитела нейтрализовать популяцию вирусов полностью может привести к установлению инфекции. Однако следует отметить, что неполная нейтрализация не сообщалась для образцов сыворотки от доноров элитного нейтрализатора. В настоящем исследовании нам было интересно исследовать степень несигмоидальных склонов, которые могут плато на уровне <100% для ВИЧ bnMAbs, нацеленных на четыре наиболее изученных региона шипы Env, вовлеченных в широкую нейтрализацию. Мы обнаружили, что все bnMAbs подвержены кривым ингибирования, которые не достигают 100%, и большинство bnMAbs также имели кривые нейтрализации с несигмоидальными склонами, но bnMAbs, нацеленные на определенные области тримера, были более склонны к этим эффектам. Первичные изоляты и молекулярные клонированные вирусы, полученные в первичных клетках, также были неполностью нейтрализованы, что свидетельствует о том, что это явление может быть значительным in vivo.

Панель bnMAbs, нацеленная на различные области на Env, тестировалась в высоко количественном анализе нейтрализации псевдовируса на панели из 278 вирусных клонов (фиг. A в тексте S1). Псевдовирус, вводящий в клетки U87, экспрессирующие CXCR4 или CCR5, измеряли люциферазной активностью. Вирусы, которые были нейтрализованы IC50> 1 мкг / мл, далее не рассматривались, потому что мы не могли исключить возможность того, что при / выше этой концентрации IC50 будет слишком высоким для 100% -ной нейтрализации, которая должна быть достигнута с помощью типичной сигмоидальной кривой на самом высоком антителе (50 мкг / мл). Для каждого bnMAb мы определяли максимальную процентную нейтрализацию (MPN), то есть процент, при котором пласты нейтрализующей кривой для этих вирусов нейтрализуются IC50 <1 мкг / мл. Для тестируемой группы bnMAbs b12, 2G12, PGT136 и PGT137 имели относительно низкое количество вирусов, нейтрализованных IC50 <1 мкг / мл (таблица 1), что может создать небольшое смещение выборки в ранжировании этих двух bnMAbs.

общее количество вирусов с IC50 <1 мкг / мл.

Кривая нейтрализации, что плато на уровне менее 100% указывает на то, что существует доля вирусов, устойчивых к нейтрализации, которые, вероятно, выражают долю шипов Env, которые не распознаются соответствующим bnMAb. На фиг.1А bnMAbs упорядочиваются слева направо в соответствии с уменьшением медианы MPN (фиг. A в тексте S1). Ни у одного из bnMAbs не было медианных значений MPN, которые были <90%, но все bnMAbs нейтрализовало по меньшей мере один отдельный вирус с <90% MPN, за исключением PGT122, PGT127 и PGT136 (рис. 1A). Как группа, bnMAbs, которые нацелены на высокоманичный патч: PGT121-123, PGT125-131, PGT135-137 и 2G12 (рис. 1A, точки пурпурных данных) имели наивысшие медианные значения MPN. Из этих bnMAbs у PGT121-123 был самый высокий медиан MPN, нейтрализующий вирусы до 100% в среднем, в то время как у другого высокоманинозного патча, нацеленного на bnMAbs, были средние значения MPN 99%. Из bnMAbs, которые нацелены на высокоманитозный патч, у 2G12 был самый низкий средний показатель MPN на 98%. Однако 2G12 является необычным bnMAb, потому что его эпитоп содержит исключительно гликаны, и поэтому он более зависит от нескольких гликановых сайтов, чем другой высокоманичный патч bnMAbs [39-41]. PGT130 и 135 также показали меньшую полную нейтрализацию, чем другие высокоманикозные патч bnMAbs, их средние значения MPN были эквивалентными, но значения MPN были такими же низкими, как 79 и 83% для отдельных вирусов.

(A) bnMAbs упорядочиваются слева направо в соответствии с уменьшением медианы максимальной максимальной нейтрализации. Каждая точка на графике представляет собой процент, на котором кривая нейтрализации плакатируется для одного вируса. Проценты, превышающие средние медианы bnMAb группы баров, которые имеют одинаковые значения. Пунктирная линия обозначает 90%. Полосы представляют собой медианные, а усырованные бары представляют собой межквартильный диапазон. Точки данных окрашены в соответствии с тем местом, на которое нацелены объекты bnMAb: высокоманитовый патч (пурпурный), CD4bs (красный), вершина V2 (синий) и MPER (зеленый). (B) Процент вирусов нейтрализован с максимальной нейтрализацией> 95% (синий),> 90% (зеленый) и> 65% (красный). Группы BnMAb обозначены над черным рисунком и описаны в тексте.

CD4bs bnMAbs также имели высокие средние значения MPN 100% и 99% для PGV04 и b12 соответственно. Эти результаты показывают, что эти два CD4bs, нацеленные на bnMAbs, в значительной степени демонстрируют полную нейтрализацию, и, если гетерогенность гликанов является источником неполной нейтрализации, это может отражать относительную нечувствительность к экспрессии гликана Env, как было описано ранее для bnMAb b12 [14]. Однако следует отметить, что b12 нейтрализует относительно небольшую часть панели вирусов, которая, возможно, искажает его среднее значение MPN. Эти данные не позволяют однозначно заключить, что CD4bs bnMAbs как класс менее подвержены неполной нейтрализации; для этого потребуется оценка более широкой панели CD4bs bnMAbs.

Из bnMAbs, нацеленных на вершину V2 (рис. 1A, синие точки данных), PG9 приводит группу со средним значением MPN 99%, хотя, как видно из PGT130 и 135, многие отдельные вирусы приводили к значениям MPN до 72% тогда как медианные значения MPN для PGT 141-145 и PG16 варьируются от 95 до 98%. Ранее сообщалось, что для PG9 и PG16 неполная нейтрализация может быть отнесена, в частности, к гетерогенности гликанов. JR-FL E168K представляет собой пример псевдовируса, который отображает кривые плаценты нейтрализации PG9 и PG16 <100%. Примечательно, что нейтрализация PG9 и PG16 JR-FL E168K, продуцируемая в присутствии ингибитора гликозидазы, является антагонистической кривой с максимальной ингибирующей способностью ~ 100% [14].

Ориентация gp41 bnMAbs показала наименьшие медианные значения MPN (рис. 1A, зеленые точки данных) при 93% для 4E10 и 96% для 2F5. Неспособность 4E10 и 2F5 достичь 100% -ной нейтрализации для их кривых нейтрализации, на первый взгляд, несовместима с ассоциацией гетерогенности гликанов с неполной нейтрализацией, поскольку эти bnMAbs не нацелены на гликаны как часть их известных эпитопов. Фактически, нейтрализация 2F5 и 4E10 псевдовируса HIV-1 CRF07_BC по имени FE увеличивалась при удалении одиночных гликанов при N197, N301, N355 (gp120) и N625 (gp41) [42]. Кроме того, дегликозилирование олигомеров gp140 Env с PNGase F увеличивало связывание 2F5 и 4E10 с белком [37]. Эти результаты можно объяснить, если гликаны на gp120 и / или на gp41 влияют на доступность MPER в контексте вирусной мембраны.

Примечательно, что среднее значение MPN для каждого bnMAb не полностью описывает его склонность к неполной нейтрализации. Другим способом оценки эффективности нейтрализации является рассмотрение межквартильного диапазона индивидуальных значений MPN вируса, из которых возникает медиана. Во всех тестируемых bnMAbs, независимо от эпитопа, наблюдалась общая тенденция увеличения межквартильного диапазона по мере уменьшения медианы MPN (как показано на рис. 1A), в которой межквартильный диапазон каждого MPN определяется как разброс популяции и определяет где находятся средние 50% населения (усыщенные бары). PG16, PGT144 и 4E10 показали наибольший разброс, указывая на то, что эти bnMAbs показали большую изменчивость в их способности связывать гетерогенные оболочки разных вирусов.

Процент общего количества вирусов, нейтрализованных на разных максимальных уровнях, был определен для всех вирусов, которые привели к IC50 <1 мкг / мл (рис. 1B и рис. B в тексте S1), и данные предполагали естественное деление bnMAbs на три группы. BnMAbs в группе 1 нейтрализуют> 90% восприимчивых вирусов с значениями MPN> 95% и включают PGT121-123, PGT125-28, PGT136 и PGV04. Группа 2 bnMAbs была менее эффективной, что привело к нейтрализации 60-84% восприимчивых вирусов с значениями MPN> 95%. Группа 2 bnMAbs, включают b12, PGT125-127, 130-131, 135,137, 141-143, 145, 2G12 и PG9. Группа 3 bnMAbs, PG16, PGT144, 2F5 и 4E10, была наименее способной полностью нейтрализовать вирусы, для которых они имеют IC50 <1 мкг / мл. Для этой группы только 36-60% восприимчивых вирусов были нейтрализованы с значениями MPN> 95%. Процент вирусов, нейтрализованных при> 98%, был в целом относительно сходным для соматических вариантов данного семейства, хотя нейтрализующая активность этих вариантов против отдельных вирусов может существенно различаться [13,26]. PGT128 и PGT145, самые широкие и наиболее мощные соматические варианты их соответствующих семейств нейтрализуют большинство вирусов с показателями MPN> 98% по сравнению с их схожими клонов. Напротив, PGT136, наименее широкая и мощная из семейства PGT135, нейтрализовала наибольшую долю вирусов до торможения> 98% по сравнению с ее сестринскими клонами. Однако из-за его более низкой активности только небольшое количество вирусов было нейтрализовано PGT136 с IC50 <1 мкг / мл, поэтому в этом анализе рассматривалось только ограниченное подмножество вирусов, что может объяснить относительную эффективность PGT136 при полной нейтрализации.

В то время как неполная нейтрализация предполагает возможность смешанной популяции оболочек дикого типа, процентная доля которой не нейтрализуется данным антителом, приводящим к резистентности доли вирионов, кривая нейтрализации без сигмоида с плато <100% предполагает популяцию вирусов с различной чувствительностью к нейтрализации антител. Совершенная сигмоидальная кривая зависимости доза имеет наклон 1. Наклон кривой нейтрализации для bnMAb, который одинаково хорошо связывает все функциональные спайки Env на популяции вирусов дикого типа и одинаково хорошо нейтрализует соответствующие вирусы, должен быть близок к 1 (фиг. 2А и фиг. C в тексте S1). BnMAb, который нейтрализует подмножество вирусов в популяции вирусов дикого типа менее эффективно, чем другие вирусы в этой популяции, может вызвать кривую нейтрализации, которая плавится на уровне <100% и будет иметь наклон <1 (фиг. 2A). Более крутая кривая с наклоном> 1 (рис. 2А) предполагает либо необратимость нейтрализации, кооперативность при связывании с тримерами, либо благоприятный профиль кинетической нейтрализации, который затем влияет на скорость нейтрализации соответствующих вирусов. Мы определили срединные наклоны кривой для bnMAbs (рис. 2B и рис. D в тексте S1) и обнаружили, что общий тренд наблюдался для срединных наклонов, как это было видно для средних значений MPN, и два имели умеренную корреляцию (Spearman r = 0,745 и P-значение <0,0001) (рис. 2C и рис. E и F в тексте S1). Опять же, высокая манноза патч-и CD4bs-таргетинг bnMAbs наиболее соответствовала идеальному поведению со срединными склонами ~ 1, а V2-вершина и MPER-таргетинг bnMAbs имели срединные наклоны, которые наиболее отклонялись от 1. Исключением было PG9, которые обычно имеют кривые сигмоидальной нейтрализации, такие как высокоманитовый пластырь и CD4bs, нацеленные на bnMAbs. Медианный наклон 4E10, 0,6, был самым удаленным от стандартного склона. V2-ориентированный bnMAbs-ориентир составлял от 0,6 до 0,9. Высокий маннозный патч bnMAbs варьировался от 0,8 до 1,1. Ни один из bnMAbs не имел срединных наклонов кривой <0,6, и все bnMAbs имели по крайней мере один вирус, для которого наклон был <0,72. PGT130 и PGT131 имели наибольший спрэд в поведении склона, предполагая, что нейтрализация этими bnMAbs была наиболее чувствительной к изолированному контексту гетерогенности Env. Медианные значения MPN от каждой пары bnMAb-вируса также стратифицировали в соответствии с вирусной кладой для оценки того, не были ли определенные группы вирусных штаммов неполностью нейтрализованы всеми bnMAbs (фиг. J в тексте S1). Никакой четкой зависимости от кладов не наблюдалось, хотя некоторые отдельные вирусы менее полностью нейтрализованы всеми bnMAbs.

(A) Репрезентативный эксперимент по нейтрализации PG16 ВИЧ-вирусов: MGRM-Chronic-B-017.c13, наклон = 1,0 (красный круг); MGRM-G-022.c02, наклон = 1,2 (черный квадрат); MGRM-Chronic-B-006.c06, наклон = 0,7 (светло-серый треугольник); и MGRM-AG-011.c15, наклон = 0,4 (темно-серый бриллиант). (B) Наклоны кривой нейтрализации были определены для данных из фиг. 1A. BnMAbs упорядочиваются по уменьшающимся медианам. Полосы представляют собой медианные, а усырованные бары представляют собой межквартильный диапазон. Точки данных окрашены в соответствии с тем местом, на которое нацелены объекты bnMAb: высокоманитовый патч (пурпурный), CD4bs (красный), вершина V2 (синий) и MPER (зеленый). Пунктирная линия обозначает наклон 0,5. (C) Значение склона кривой нейтрализации каждого bnMAb для каждого вируса по оси y нанесено на график относительно соответствующего MPN для каждой пары вирусов-bnMAb по оси x. Для статистического анализа использовалась корреляция Спирмена. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена был рассчитан на 0,745 и значение Р <0,0001.

Чтобы исследовать большое количество вирусов и надежно определить, была ли достигнута полная нейтрализация, в приведенном выше исследовании использовалась высокопроизводительная количественная система анализа псевдовируса и клетки U87, экспрессирующие CXCR4 или CCR5 в качестве клеток-мишеней. Однако многие недавно описанные bnMAbs (включая семейство PGT151) были охарактеризованы анализом на основе клеток TZM-bl с использованием другой 117-псевдовирусной панели. Поэтому мы определили MPN bnMAbs, используя эту систему. На фиг.3А bnMAbs упорядочивают слева направо в соответствии с уменьшением медианы MPN, как показано для анализа клеток U87 на фиг.1А. Общий уровень неполной нейтрализации был аналогичен таковому для анализа клеток U87 со средними значениями MPN bnMAbs в диапазоне от 94 до 100%, и все bnMAbs нейтрализуют по меньшей мере один вирус с MPN <90% (фиг. G в S1 Text). Кроме того, как было описано ранее для анализа клеток U87, большая часть bnMAbs, которая связывает высокомагнозный пластырь, привела к полнейшей нейтрализации на панели 117-вируса со средними значениями MPN, близкими к 100%, и большинство вирусов, нейтрализованных до> 90%. Опять же, как видно из анализа U87, когда bnMAbs были разделены на группы на основе их медианы MPN восприимчивых вирусов (рис. 3B и рис. H в тексте S1). PGT121 и 123 были среди bnMAbs с наиболее эффективной нейтрализацией, причем большинство вирусов нейтрализовалось между 95-100% (рис. 3B), хотя некоторые выбросы имели более низкие значения MPN (рис. 3A). Однако отдельные вирусы были нейтрализованы определенными bnMAbs в гораздо меньшей степени (например, 56%, 60% и 75% для PGT135, 128 и 123 соответственно), несмотря на IC50 <1 мкг / мл. Следует отметить, что bnMAbs PGT130 и 135 были менее способны, чем другие высокомагнозные патч bnAbs, для получения высоких уровней нейтрализации вируса в соответствии с результатами анализа клеток U87, показанными на фиг.1А. PGT130 приводил к значениям MPN> 90% для многих вирусов (рис. 3B), но также приводило к значительному количеству менее полностью нейтрализованных вирусов (рис. 3A). С другой стороны, PGT135 приводил к разрозненной схеме MPN с очень широким диапазоном значений (рис. 3A). Следует отметить, что PGT135 нейтрализует меньшее количество вирусов с IC50 <1 мкг / мл в этой 117-вирусной панели, чем любой другой bnMAbs, за исключением PGT144.

(A) bnMAbs упорядочиваются слева направо в соответствии с уменьшением медианов MPN. Каждая точка на графике представляет собой процент, на котором кривая нейтрализации плакатируется для одного вируса. Пунктирная линия обозначает 90%. Полосы представляют собой медианные, а усырованные бары представляют собой межквартильный диапазон. Точки данных окрашены в соответствии с сайтом bnMAb: high-mannose patch (пурпурный), CD4bs (красный), вершина V2 (синий) и gp41 (зеленый). (B) Процент вирусов, нейтрализованных MPN> 65% (красный),> 90% (зеленый) и> 95% (синий). (C) Каждая точка на графике представляет процент, на котором кривая нейтрализации плакатирована для одного вируса против PGT121 (пурпурный), PG9 (синий) или PGV04 (красный). Система анализа, используемая для измерения нейтрализации, указана выше точек данных, которые заполняют круги для анализа монограммы U87 и незаполненных квадратов для анализа CAVD TZM-bl.

Вместе с высокоманикозным патчем bnAbs антитела CD4bs проявляли очень высокую тенденцию к полной нейтрализации против 278-вирусной панели в анализе клеток U87. В соответствии с этим, CD4bs-антитело 12A12 приводило к значениям MPN> 90% всех, кроме трех вирусов, в анализе TZM-bl (фиг. 3A) со средним значением MPN 100%. Напротив, другое антитело CD4bs PGV04 приводило к значительно меньшей полной нейтрализации. Хотя медианные значения MPN для этого bnMAb в обоих анализах были близки к 100%, более отдельные вирусы были неполностью нейтрализованы в TZM-bl, чем в анализе клеток U87 (рис. 3A).

Вершина V2 bnMAbs была показана в клеточной системе U87, чтобы иметь большую склонность к получению неполной нейтрализации, чем CD4bs или высокоманикозное связывание bnMAbs. Аналогично, в анализе TZM-bl PG9 и PGT143-144 приводили к большему разбросу значений MPN, чем PGT121, 123, 125, 127, 128 и 12A12, причем многие вирусы показывали между нейтрализацией 90-95% и числом, которое было нейтрализовано только от 75 до 90% (рис. 3В). Однако уровень неполной нейтрализации PG9 и PGT143-144 сравним в этом анализе с показателем PGT130, 135 и PGV04 (рис. 3A).

Наконец, две связанные специфичности PGT151 и PGT152, которые нацелены на новый описанный зависимый от расщепления глина-эпитоп gp120 / gp41 глина [9], показали наименее полную нейтрализацию с широким диапазоном значений MPN от 57-100% и 51-100% соответственно (Фиг. 3А). Оба показали значительную долю вирусов с значениями MPN <90% (рис. 3B). Это согласуется с предыдущими выводами для этих bnMAbs [9].

Хотя исследования U87 и TZM-bl, описанные здесь, используют разные клетки-мишени и различные вирусные панели, тенденции, наблюдаемые для bnMAbs, проверенных в обоих тестах, аналогичны (сравните фиг.1A и 3A). Прямое сравнение результатов представлено для bnMAbs PGT121, PG9 и PGV04 на фиг.3C (рис. I в тексте S1). PGT121, который показал наиболее полную нейтрализацию в обоих анализах по сравнению с другими bnMAbs, приводит к несколько большему диапазону значений MPN в анализе панели U87-cell / Monogram, чем в анализе панели TZM-bl / CAVD. Аналогично, PG9, который приводит к менее полной нейтрализации, чем PGT121 в обоих тестах, показал несколько больший диапазон значений в анализе клеток U87. Напротив, PGV04 приводит к более полной нейтрализации в анализе U87 и меньшем диапазоне значений по сравнению с анализом TZM-bl. Тем не менее, анализ U87-клеток / монограмм включал 278 вирусов и анализ TZM-bl / CAVD 117. Это различие в количестве вирусов и используемых расходящихся вирусах указывает на некоторую осторожность в некоторых более подробных результатах двух анализов.

Ранее подмножество bnMAbs, нацеленное на высокоманичный патч, вершину V2 и сайт связывания CD4, характеризовалось для нейтрализации молекулярных клонов вируса в анализе нейтрализации PBMC [43,44]. Клоны были выделены из вирусных роев подтипа B у пациентов, которые участвовали в амстердамских исследованиях по ВИЧ-инфекции и СПИДу и производились в РВМС. Здесь мы рассмотрим описанное выше подмножество bnMAbs для способности нейтрализовать вирус, полученный от вируса, до 100%. Большая вариабельность, присущая анализу нейтрализации РВМС, делает невозможным определение MPN с высокой степенью точности, достижимой в анализах псевдовируса, и затрудняет воспроизводимость. Кроме того, для репликации компетентного вируса существует множество раундов инфекции во время анализа нейтрализации по сравнению с анализом псевдовируса, где нет нового вирусного потомства. Однако с этими оговорками мы проанализировали способность bnMAbs нейтрализовать вирусы в анализе PBMC (фиг. 4A и фиг. K в тексте S1). Независимо от эпитопа, каждый bnMAb показал большое разнообразие значений MPN для разных вирусов. PGT121 продуцировал наименее неполную нейтрализацию с медианом MPN 90%, но со значениями от 64 до 100%. У антител к CD4-связывающему сайту VRC01 и NIH45-46 54W были средние значения MPN 74 и 87% соответственно. Как PGT121, так и NIH45-46 54W, bnMAbs с наиболее полной полной нейтрализацией, показали большую группу вирусов, которые были хорошо нейтрализованы (MPN> 85%) и меньшая группа вирусов, образующих «хвост» на рис. 4А точек ниже 85%. Другие bnMAbs нейтрализуют больше вирусов неэффективно (MPN <85%), и в результате на рис. 4А больше 85%, что приводит к более равномерному распределению значений MPN для этих bnMAbs по сравнению с PGT121 и NIH45-46W (рис. 4A ).

(A) Каждая точка на графике представляет собой процент, на котором кривая нейтрализации плакатирована для одного вируса КЛА, выращенного в РБМК, в клетках PBMC. Пунктирная линия обозначает 90%. (B) Каждая точка на графике представляет собой процент, на котором кривая нейтрализации плакатируется для одного вируса молекулярного клона против bnMAbs, перечисленных выше точек данных. Клоны вируса были получены как в клетках 293Т, так и в РВМС, как указано на оси х. Точки данных окрашены в соответствии с сайтом bnMAb: high-mannose patch (пурпурный), CD4bs (красный), V2 apex (синий), gp41-gp120 интерфейс (зеленый). Полосы представляют собой медианные, а усырованные бары представляют собой межквартильный диапазон.

Учитывая нашу предыдущую работу [9,14], описывающую влияние гетерогенности гликанов на неполную нейтрализацию PG9 и PG16, мы предположили, что продуцирование вируса в клеточной линии 293T или первичные РВМС могут изменить плато кривой нейтрализации bnMAb против данного вируса , Одним из препятствий для исследования этой гипотезы является то, что большинство вирусов, используемых в панелях нейтрализации, описанных на фиг.1-3, являются псевдовирусами и поэтому не могут быть выращены в первичных клетках. Поэтому для изучения влияния типа клеток-продуцентов на неполную нейтрализацию мы использовали 18-вирусную панель молекулярных клонов, которая, в отличие от псевдовирусов (рис. 1, 2 и 3) или панелей, полученных из пациента (рис. 4), может могут быть получены либо в клетках 293T, либо в культурах PBMC и анализированы в анализе нейтрализации TZM-bl. PGT121 сравнивали с PG9, PG16, PGDM1400 и PGT151 (фиг. 4B). Наблюдаемые общие тенденции были одинаковыми для вирусов, выращенных в клетках 293T или РВМС, хотя наблюдалась несколько большая неполная нейтрализация для вирусов, выращенных в PBMC. Для PGT121 средний показатель MPN составлял 100% для вирусов, выращенных в 293T и 96% для вирусов, выращенных в PBMC; для PG9 соответствующие значения составляли 98% и 88%. Значения для других bnMAbs суммированы на рис. L в тексте S1. Что касается большой группы вирусов, выращенных PBMC, то в целом средние значения MPN были ниже для вируса, рожденного PBMC, чем вирусы, выращенные в клетках, для клеток молекулярного клона, чем 293T, хотя для некоторых отдельных вирусов было отмечено обратное, то есть наблюдались более высокие значения MPN для молекулярных клонов, выращенных PBMC, чем вирус, выращенный в клетках 293T (фиг. M в тексте S1).

Ранее мы показали, что для меньшего числа изолятов как PG9, так и PG16 имеют кривые нейтрализации, которые достигают <100% и несигмоидальных склонов (Walker, 2009) [14]. В текущем исследовании нам было интересно определить больше о масштабах этого явления, и поэтому мы проанализировали профили нейтрализации bnMAbs, нацеленные на четыре основные области Env, используя большую группу псевдовирусов в количественном высокопроизводительном анализе U87 нейтрализации. Мы обнаружили, что bnMAbs, которые нацеливают эпитопы в регионе, включающие высокоманикозный патч и два CD4bs bnMAbs, нейтрализуют большинство вирусов с значениями MPN, близкими к 100%. Напротив, bnMAbs, нацеленные на область вершины V2, и MPER чаще всего нейтрализуют вирусы с значениями MPN <100%. Часто нейтрализация до менее чем примерно 95% была связана с несигмоидальными кривыми нейтрализации (рис. 2). Высокоманитовый пластырь и CD4bs, нацеленные на bnMAbs, чаще всего показывали стандартные кривые нейтрализации, а вершина V2 и МПЕР-прицеливание bnMAbs показали более высокую частоту несигмоидальных кривых. Однако следует отметить, что все bnMAbs показали менее 95% нейтрализационных и несигмоидальных кривых нейтрализации для некоторых изученных изолятов.

Чтобы расширить эти результаты, профили нейтрализации bnMAbs были оценены с помощью большой панели псевдовирусов в анализе TZM-bl (рис. 3). Опять же, семейства PGT121 и 128, нацеленные на высокоманифокальный патч, нейтрализуют большинство вирусов с величиной MPN, близкой к 100%. CD4bs bnMAbs 12A12 и PGV04 также нейтрализовали многие вирусы с значениями MPN, приближающимися к 100%, хотя PGV04 также приводил к неполной нейтрализации MPN <90% для значительной доли вирусов. Аналогично, связывание V2 с вершиной bnMAbs PG9, PGT143-145 чаще всего нейтрализует вирусы с субоптимальным значением MPN <90%. Примечательно, что это исследование включало добавление двух недавно описанных гликанозависимых gp120 / gp41 bnMAbs, PGT151-152, которые демонстрировали переменные значения MPN с значительной долей вирусов, нейтрализованных до менее 90%. В целом, результаты двух анализов нейтрализации были схожи с некоторыми показателями большей тенденции к неполной нейтрализации в анализе клеток U87, чем анализ TZM-bl.

Механизм (ы) неполной нейтрализации и кривые несигмоидальной нейтрализации выходят за рамки настоящего исследования, но более раннее исследование bnMAbs PG9 и PG16 показало важность гетерогенности гликозилирования для этих особенностей [14], и эта гетерогенность коррелировала с критическое участие гликанов в эпитопах, связанных PG9 и PG16 [7,25,31]. Здесь показаны неполные нейтрализации и несигмоидальные кривые для других bnMAbs, нацеленных на вершину V2 и, в частности, для gp41 bnMAbs. Из них семейство PGT151 зависит от триа и тетра-антенных комплексных гликанов на N611 и N637 для функции нейтрализации [9] и приводит к наименее полной нейтрализации в анализе TZM-bl, при этом значения MPN составляют 57 и 51% для PGT151 и 152 соответственно. В противоположность этому, MPER Abs, как правило, не связаны с гликанной зависимостью связывания, но это не было тщательно исследовано [42], и статус гликана может влиять на доступность MPER к Abs после взаимодействия CD4, когда MPER Abs считается действовать [45]. Кроме того, неполная нейтрализация bnMAb 10E8 была частично связана с гетерогенностью гликанов [38]. Высокие значения MPN для bnMAbs, нацеленных на патч с высоким маннозой, вначале кажутся несовместимыми с их зависимостью от связи гликанов, а предыдущие данные, свидетельствующие о гетерогенности гликанов, могут привести к неполной нейтрализации с помощью специфичных для вершины bnMAbs. Однако структурные исследования показали, что PGT128 контактирует с N332-гликаном в инженерном внешнем домене gp120, взаимодействуя с терминальными маннозовыми остатками D1 и D3-плечей [32]. Это маннозное представление существует только на гликанах Man8 / 9GlcNAc2, что говорит о том, что гликаны в N332 могут быть выражены как относительно гомогенные Man8GlcNAc2 и / или Man9GlcNAc2 в псевдовирусах [32] и gp120 Env protein [46]. Аналогично, PGT122 в комплексе со стабилизированным триммером Env gp140 показывает, что центральным N332 гликаном является Man8GlcNAc2. Эта однородность может быть существенным фактором способности bnMAbs, которые зависят от гликана на N332, эффективно связывать большую долю оболочек изолята и, следовательно, нейтрализовать подавляющее большинство вирионов. Кроме того, некоторые bnMAbs, распознающие этот регион, могут переносить некоторую гетерогенность в использовании гликанов [44] и / или использовать альтернативные гликановые сайты [28], которые могут способствовать переносу гетерогенности гликанов. Примечательно, что количество гликановых сайтов, на которых зависит маньячный патч bnMAbs, зависит от нейтрализации. Следовательно, те bnMAbs, которые требуют больше гликановых сайтов, таких как PGT135 / 136, имеют более низкие средние значения MPN. CD4bs bnMAbs в первую очередь чувствительны к гликану при N276 [20,21], а гетерогенность в этой позиции является кандидатом на неполную нейтрализацию популяции вируса. Следует подчеркнуть, что могут существовать механизмы, отличные от гетерогенности гликанов, для неполных нейтрализационных и несигмоидальных кривых нейтрализации, которые еще предстоит понять; примером может служить конформационная неоднородность тримера Env [47, 48].

В то время как неполная нейтрализация ВИЧ bnMAbs здесь четко продемонстрирована, важно установить, как неполная нейтрализация в анализах псевдовирусов относится к антивирусной активности bnMAbs in vivo. В качестве первого шага мы исследовали влияние на первичные вирусы in vitro путем изучения частоты неполной нейтрализации в большой группе молекулярных клонированных вирусов, полученных из родов пациентов из амстердамских когортных исследований по ВИЧ-инфекции и СПИДу. Эти клоны размножали и анализировали в культурах PBMC, что увеличивает уровень изменчивости, свойственный анализу, и уменьшает уверенность, с которой мы можем определить полную нейтрализацию. Кроме того, абс титровали из более низкой концентрации, чем в других аналитических системах, что означает, что, хотя обрезание 1 мкг / мл было использовано, как описано выше, некоторые абс, возможно, не достигли насыщающих концентраций в этом анализе. Однако среди большой первичной вирусной панели и пяти тестируемых bnMAbs были ясные примеры как неполной нейтрализации (<90%), так и полной нейтрализации (100%) (рис. 4). Таким образом, мы можем заключить, что это явление не является артефактом использования 293T клеточных продуцируемых псевдовирусов для анализа нейтрализации. Эти данные непосредственно не касались того, является ли вирус, произведенный в клетках 293T или первичных клетках, более или менее восприимчивым к неполной нейтрализации bnMAbs. Для решения этой проблемы мы протестировали 18-вирусную панель молекулярных клонов, продуцируемую в обоих типах клеток, и показали, что продуцирование в РВМС не отменяет неполный фенотип нейтрализации (фиг. 4 и фиг. M в тексте S1) на индивидуальной основе вируса. Однако медианные значения MPN для каждого bnMAb через панель с 18 вирусами были ниже для вирусов, выращенных с помощью PBMC, чем у тех, которые были созданы для клонов, выращиваемых клетками 293T. Эта неполная нейтрализация чаще наблюдалась с использованием вируса, получающего ПБМК, в среднем, является потенциально важным ограничением использования 293T клеточных культивируемых псевдовирусов для характеристики вероятной in vivo эффективности анти-ВИЧ bnMAbs.

Как описано, ключевым вопросом для дальнейшего изучения является то, как неполная нейтрализация влияет на способность bnMAbs опосредовать защитные эффекты. Защита была явно продемонстрирована у макак посредством пассивной передачи многих bnMAbs, когда вирус заражения был полностью нейтрализован [49-55] и был полезен для лечения ранее существовавшей инфекции у макак и гуманизированных мышей [56-60]. Никаких систематических исследований по защите не проводилось, когда зараженный вирус обнаруживает неполную нейтрализацию исследуемого bnMAb. Однако недавнее исследование показало, что PG9 обеспечивает адекватную и типичную защиту против зараженного вируса, который показал неполную нейтрализацию в анализе TZM-bl, но по существу полную нейтрализацию в анализе PBMC [61]. Необходимы дальнейшие исследования защиты, чтобы твердо установить значение неполной нейтрализации для профилактики bnMAbs и при анализе стратегий вакцинации.

Образцы крови человека от здоровых доноров были получены в Службе нормального донора крови в Исследовательском институте Скриппса. Сбор образцов крови для изоляции РВМС и последующая пропаганда ВИЧ-1 был одобрен Институциональным советом по обзору Исследовательского института Скриппса (номер протокола HSC-06-4604), все образцы анализировались анонимно. Амстердамские когортные исследования по ВИЧ-инфекции и СПИДу (ACS) проводятся в соответствии с этическими принципами, изложенными в декларации Хельсинки, и до сбора данных было получено письменное информированное согласие. Исследование было одобрено Институциональным комитетом медицинской этики академического медицинского центра.

2G12, 4E10 и 2F5 (Polymun Scientific, Вена, Австрия) были закуплены Консорциумом нейтрализующих антител IAVI. Рекомбинантный bnMAb IgG1 b12 был экспрессирован Центром развития антител и производства (Исследовательский институт скрипов, La Jolla, CA) в клетках яичника китайского хомячка (CHO-K1), очищенный с использованием аффинной хроматографии (GammaBind G Sepharose, GE Healthcare) и чистоту и целостность проверяли с помощью SDS-PAGE. PGT 121-123, PGT 125-131, PGT 135-137, PGT 141-145, PGV04, PDGM1400, PGT151-153 и PG9 / 16, были временно экспрессированы с помощью системы экспрессии FreeStyle 293 (Invitrogen). Антитела очищали с использованием аффинной хроматографии (протеин A Sepharose Fast Flow, GE Healthcare), а чистоту и целостность проверяли с помощью SDS-PAGE.

Monogram Biosciences выполнили анализы нейтрализации с использованием псевдовируса, который подвергается одному раунду репликации, как описано ранее [62]. Вкратце, псевдовирусы, способные к единому раунду заражения, получали путем совместной трансфекции клеток HEK293 с субгеномной плазмидой, pHIV-1lucu3, которая включала ген люциферазы светлячков и вторую плазмиду pCXAS, которая экспрессировала клон ВИЧ-1 Env. Псевдовирусы собирали через 3 дня после трансфекции и использовали для инфицирования линии клеток U87, экспрессирующих корецепторы CCR5 или CXCR4. Анализ нейтрализации псевдовируса с использованием клеток-мишеней TZM-bl был ранее описан [63]. Для анализов нейтрализации с использованием РВМС: человеческие РВМС были получены от здоровых индивидуумов, выделенных и стимулированных, как описано ранее [44,64]. Инфекционные вирусные клоны вируса ВИЧ-1 выращивали и титровали на CD8 + -определенной PBMCS [65]. Контроль за вирусом контролировали с помощью p24 ELISA (Aalto Bioreagents, Dublin, Eire). Для анализа PBMC-нейтрализации, как описано ранее [44].

Статистический анализ проводился с Prism 5.0c для Mac (GraphPad).

На рис. J показаны отдельные значения MPN для всех bnMAbs и вирусов с панели 278-virus (A) и панели 117-virus (B), для которой значение IC50 <1 мкг / мл, выстроенное в соответствии с вирусом по оси X. На фиг. М показаны значения MPN для 18 молекулярных клонов-вирусов, полученных как в клетках 293T, так и в РВМС, соединенных черными полосками, проверенные bnMAbs указаны выше графика.

(XLSX)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *