Нажмите "Enter", чтобы перейти к контенту

Характеризация большой группы моноклональных антител кролика против ВИЧ-1 gp120 и выделение новых нейтрализующих антител против петли V3

Characterization of a Large Panel of Rabbit Monoclonal Antibodies against HIV-1 gp120 and Isolation of Novel Neutralizing Antibodies against the V3 Loop
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4454676/

Конкурирующие интересы: авторы прочитали политику журнала, и авторы этой рукописи имеют следующие конкурирующие интересы: MWC имеет долю в NeoVaxSyn Inc. и является генеральным директором / президентом. NeoVaxSyn Inc. не способствовала этой работе или интерпретации данных. Это не изменяет приверженность авторов политикам PLOS ONE по обмену данными и материалами.

Задуманные и разработанные эксперименты: YQ SB AA MWC. Выполнены эксперименты: YQ SB AA HS MB FL KR CL. Проанализированы данные: YQ SB AA MB CL DCM MWC. Написал документ: YQ SB AA HS MB FL KR CL DCM MWC.

Недавно мы сообщали о индукции мощных, кросс-кладовых нейтрализующих антител (nAbs) против вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1) у кроликов с использованием gp120 на основе консенсусной последовательности M-группы. Чтобы лучше охарактеризовать эти антитела, было создано 93 гибридомы, которые представляют собой самую большую группу моноклональных антител (mAb), когда-либо генерированных вакцинированным кроликом. Один наиболее часто распознаваемый эпитоп изолированных mAb находился на самом С-конце белка (APTKAKRRVVEREKR), а затем на петле V3. Было выделено в общей сложности семь mAb против V3, два из которых (10A3 и 10A37) проявили нейтрализующую активность. В отличие от 10A3 и большинства других анти-V3-петлей nAbs, 10A37 был атипичным, а его эпитоп больше позиционировался к С-концевой половине петли. Насколько нам известно, 10A37 является наиболее мощным и широко нейтрализующим mAb против V3, индуцированным вакцинацией. Интересно, что все семь mAb против V3 конкурировали с PGT121, что указывает на возможность того, что ранняя индукция мощных антител к анти-V3-контурам может предотвратить индукцию более широко нейтрализующих антител, подобных PGT121, которые нацелены на консервативное основание стержня V3.

Все соответствующие данные содержатся в документе и его файлах вспомогательной информации.

Критической проблемой для разработки вакцины против вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) является трудность в индуцировании широко нейтрализующих антител (bnAb) против большого количества существующих вирусных вариантов [1-3]. Гликопротеины оболочки gp120 и gp41 являются единственными антигенами ВИЧ-1 на поверхности вириона, нацеленной на nAbs. Поэтому характеристика иммуногенных и структурных особенностей оболочки ВИЧ-1 важна для разработки иммуногенов для вызывания bnAbs и для понимания гуморального ответа на ВИЧ-1-инфекцию [4-6].

Моноклональные антитела (mAbs) были важными инструментами для зондирования антигенных структур. Недавние разработки технологий для сортировки отдельных В-клеток, специфичных для антигена [7,8], высокопроизводительных клональных систем памяти B-клеток [9] и секвенирования следующего поколения (NGS) [10] позволили выделить большое количество новых bnAbs против ВИЧ-1 от инфицированных вирусом пациентов [11]. Эти bnAbs определили четыре основные цели на оболочке ВИЧ-1: сайт связывания CD4 (CD4BS), гликаны вокруг N160 вместе с консервативными элементами на V1 / V2, основание и гликаны вокруг петли V3 и проксимальную мембрану (MPER) gp41 (как описано в [12,13]). Недавно были идентифицированы эпитопы с участием как gp120, так и gp41 [14-17].

В отличие от bnAbs, выделенных из инфицированных ВИЧ-1 людей, ограниченные оболочкой mAb, генерируемые вакцинированными субъектами, как животными, так и людьми, ограничены. Ранние исследования изолировали многие мышиные mAb от иммунизированных животных. Однако большинство не обладало значительной нейтрализующей активностью [18-23]. Позднее Gao et al. сообщили о двух mAb, выделенных из gp140-иммунизированных мышей, которые перекрестно реагировали со всеми тестируемыми белками оболочки, но ни один mAb не нейтрализовал первичные вирусы ВИЧ-1 [24]. Derby et al. выделили шесть mAb против gp120 у мышей, иммунизированных растворимым gp140 [25]. Эти антитела могли нейтрализовать гомологичный SF162, и их активность зависела от структур гликозилирования петель V1, V2 или V3. Однако только один анти-V3 mAb отображал нейтрализационную активность кросс-кладов, которая зависела от типа петли V1, присутствующей на гетерологичных вирусах. В последнее время Sundling et al. использовали модель человеческого примата (NHP) для оценки иммунитетов оболочки, которые вызывали антитела против CD4BS, изолируя панель функциональных mAb от иммунизированных макак резуса [26]. Однако было создано только восемь mAb, которые проявляли нейтрализующую активность против ограниченного числа преимущественно изолятов 1-го уровня ВИЧ-1 (а именно: MN.3, HXBc2, SF162 и MW965.26). В клиническом исследовании RV144 сообщалось, что эффективность защиты составляет 31%, а защита коррелирует с наличием анти-V2-петлевых антител у иммунизированных индивидуумов [27-29]. Совсем недавно из RV144 были выделены четыре mAb V2 [30]. Эти mAb идентифицировали аминокислотный остаток 169, нейтрализовали лабораторные штаммы ВИЧ-1 уровня 1 и опосредуемую антителом зависимую от клеток цитотоксичность (ADCC). Кроме того, из участников исследования RV135 были выделены два других нейтрализующих mAb V3 (CH22 и CH23), которые показали ограниченную нейтрализацию штаммов уровня 1 [31].

Кролики широко используются в исследованиях вакцины против ВИЧ-1. По сравнению с другими животными моделями кролики достаточно велики для сбора достаточного количества антисывороток для оценки nAb и могут развиваться длинные CDR3 [4,24]. Хотя у кроликов было ограничено использование зародышевой линии антител, особенно в тяжелой цепи [32,33], их иммунная система достаточно похожа на иммунную систему человека [34-38], чтобы оценить потенциальную индукцию nAb. Кроме того, гибридные гибриды кроликов могут быть получены для получения mAb для определения специфических характеристик отдельных антител. В последнее время Chen et al. [39] сообщили о генерации и характеристике двенадцати mAb от ВИЧ-1 Env-иммунизированных кроликов, три из которых проявили нейтрализующую активность.

Недавно мы сообщали о индукции мощных нейтрализующих антител с использованием растворимого gp120 на основе консенсусной последовательности M-группы (MCON6, [40,41]) у кроликов [42]. Хотя первичный нейтрализующий эпитоп оказался петлей V3, и что нейтрализующая активность в значительной степени была связана с изолятами вируса уровня 1, кросс-кладовая нейтрализующая широта была существенной. Дальнейшая характеристика антител против gp120 в последующем исследовании показала, что некоторые из них могут конкурировать с bnAbs VRC01, PGT121 и PGT126 при связывании gp120, что указывает на то, что антитела, связанные с эпитопами, нацеленными на эти bnAbs [43].

Хотя нам не удалось индуцировать «истинные» bnAbs с использованием нашего режима вакцины, важно было (1) далее характеризовать характер сильной нейтрализующей активности против цикла V3, (2) идентифицировать целевые эпитопы антител, которые конкурировали с bnAbs VRC01 и PGT121 / 126, (3) определяют иммуногенные эпитопы антител, которые не проявляют нейтрализующую активность для развития лучших иммуногенов или стратегий иммунизации, и (4) изучают пути созревания этих антител. Для достижения этих целей антитела должны быть охарактеризованы на клональном уровне. В этом исследовании мы сгенерировали 93 гибридомы одного из кроликов, иммунизированных gp120, которые устанавливали необычно сильный ответ nAb против вируса AE уровня 1 Clade (штамм TH023.6, ID50> 43 740). Насколько нам известно, эта панель mAbs представляет собой самую большую коллекцию антител, когда-либо созданных кроликом против HIV-1 gp120. Этот отчет призван дать обзор, а не полную характеристику всех генерируемых mAb. Основное внимание будет уделено характеристике мутаций петли V3.

Использованная белковая вакцина gp120 была получена из pcDNA-MCON6gp160 (любезно предоставлено доктором Беатрис Ханом [41]). Более подробное описание подробно описано в предыдущей публикации [42]. Белок gp120 очищали от супернатанта клеточной культуры с использованием тандемной аффинной хроматографии (колонки Con A Sepharose и Ni-NTA), как описано ранее [44]. Три женщины новозеландских белых кроликов (2,5-3 кг, Чарльз-Ривер) иммунизировали подкожно gp120, составленным Zn-хитозаном на неделях 0, 3, 9, 15 и 27, как описано ранее [42]. Один кролик (gp120-R2) с самым высоким типом nAb был повышен на 65 неделе. На неделе 76 животное инъецировали внутривенно 1 мг gp120 в PBS для повышения эффективности генерации гибридом. Через четыре дня селезенку собирали для слияния. Все проведенные исследования были одобрены IACUC в Университете штата Айова (№ 10-09-6772-LM).

Слияние было выполнено, как описано ранее [40], с несколькими незначительными модификациями. Вкратце, спленоциты кролика и клеточная линия 240E-1 слияния (любезно предоставленная доктором Кэтрин Л. Найт [40]) сливались в соотношении 2: 1 с 50% PEG 1500 (Sigma-aldrich P7181). Гибридомы отбирали путем выращивания в средах, содержащих HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин) (Sigma-aldrich H0262). Супернатанты гибридомы собирали и скринировали на связывание gp120 с помощью ELISA и для активности нейтрализации, как описано ниже. Гибридомы, которые были положительными для связывания gp120, клонировали путем предельного разведения, расширяли и замораживали при -140 ° C для будущего использования.

ELISA выполняли, как описано ранее [42, 43] с некоторыми изменениями. Для определения титра антител и скрининга нашей гибридомной панели указанные белки наносили на 96-луночные планшеты Nunc-Immuno в течение ночи при 4 ° С при 30 нг на лунку с использованием антиген-покрывающего буфера (15 мМ Na2CO3, 35 мМ NaHCO3, 3 мМ NaN3, pH 9,6). Для скрининга гибридом для пептидов внутренней области (ID-P) и картирования тонких эпитопов позитивных антител к V3-петле 15-мерных линейных перекрывающихся пептидов покрывали на 96-луночных планшетах Nunc-Immuno в течение ночи при 4 ° C при 20 пмоль на лунку в лунке тот же буфер для антигенного покрытия. Непокрытые поверхности блокировали 200 мкл блокирующего буфера (PBS, pH 7,4, содержащего 2,5% обезжиренного молока и 5% сыворотки теленка) в течение 1 часа при 37 ° C. Затем лунки промывали пять раз промывочным буфером (PBS, содержащим 0,1% Tween 20) с использованием автоматизированной моечной машины Biotek. Для титра антител все кроличьи сыворотки последовательно разбавляли в блокирующем буфере, как показано на рисунках, и 100 мкл добавляли в каждую лунку. Для перекрестной реактивности нашей группы гибридом и картирования тонкого эпитопа V3 все супернатанты гибридомы разбавляли 1: 2 блокирующим буфером и 100 мкл добавляли в каждую лунку. Для реактивности гибридом с ID-P 100 мкл супернатанта гибридомы добавляли непосредственно в каждую лунку. Остальная часть процедуры была аналогична описанной ранее [42, 43]. Все анализы проводились в двух экземплярах.

15-мерный перекрывающий пептид, установленный для gp120 на основе консенсусной последовательности M-группы (CON-S), был получен из программы NIH AIDS Reagent Program (Cat # 9487). V3 и V5 на основе последовательности MCON6 (H-TRPNNNTRKSIHIGPGQAFYATGEIIGDIRQAH-OH и H-GNNSNKNKTETFRPG-OH соответственно) были синтезированы коммерчески CHI Scientific (Maynard, MA). Пептиды покрывали на лунки при 20 пмоль на лунку.

Анализы нейтрализации вируса проводились с использованием однопериодных вирусных инфекций ВИЧ-1 клеток TZM-bl, как описано в другом месте [42, 45, 46]. Вкратце, инактивированные теплом сыворотки кроликов (56 ° C в течение 1 часа), супернатант гибридомы или очищенный IgG разводили в 100 мкл среды для культивирования клеток (DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% пенициллина / стрептомицина). Испытуемые образцы разбавляли в диапазоне от 1:20 до 1: 43740 в клеточной культуральной среде и предварительно инкубировали с вирусом (~ 150 000 относительных легких единичных эквивалентов) в течение 1 часа при 37 ° C перед добавлением клеток. После 48-часовой инкубации клетки лизировали и активность Люка определяли с использованием люминометра с микротитровальной пластинкой и реагента BriteLite Plus (Perkin Elmer). Титры нейтрализации — это разбавление образца (для сыворотки) или концентрация антител (для sCD4, очищенных препаратов IgG и моноклональных антител), при которых относительные единицы люминесценции (RLU) были уменьшены на 50% по сравнению с RLU в контрольных лучах вируса после вычитания фонового RLU в ячеистые контрольные лунки.

Конкурсные испытания проводились путем модификации ранее описанного метода [43]. Количество используемого антигена покрытия составляло 30 нг на лунку. Вкратце, равное количество супернатанта гибридомы добавляли к равному количеству блокирующего буфера. Это начальное разведение затем подвергали двухкратным серийным разведениям. Моноклональные антитела разводили до концентрации 1 мкг / мл в блокирующем буфере. 50 мкл разбавленного антитела добавляли в каждую лунку вместе с 50 мкл серийно разведенного супернатанта гибридомы. Следовательно, конечная концентрация моноклональных антител во время анализа составляла 0,5 мкг / мл в каждой лунке, а начальное супернатантное разведение составляло 1: 4. Для тестирования конкуренции при более высокой концентрации 50 мкл супернатанта гибридомы добавляли непосредственно 50 мкл конкурирующего антитела (при концентрации 1 мкг / мл), что приводило к разведению 1: 2. Антитела, используемые для соревнований, включали VRC01 [8] и PGT121 [47]. Для конкуренции очищенного моноклонального антитела с PGT121 10A37 разбавляли до концентрации 6 мкг / мл в блокирующем буфере и затем подвергали двухкратным серийным разведениям. 50 мкл разбавленного антитела PGT добавляли в каждую лунку вместе с 50 мкл последовательно разведенного 10A37 антитела. Следовательно, конечная концентрация PGT составляла 0,5 мкг / мл в каждой лунке, а начальная концентрация 10А37 составляла 3 мкг / мл. Другой mAb (2C2), который был выделен у кролика, иммунизированного C-терминальной 54 аминокислотой gct41 ectodomain gp41 (который будет опубликован в другом месте), использовался в подобных концентрациях, как отрицательный контроль. VRC01 или PGT121 детектировали с использованием HRP-конъюгированного Fc-специфического антитела против человека, как описано ранее [43].

Общая РНК была экстрагирована из гибридом с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen) с использованием автоматизированной платформы Qiacube. После экстракции образцы РНК обрабатывали ДНКсезом (Invitrogen) для удаления геномной ДНК. Образцы подвергали синтезу кДНК с использованием случайных гексамеров и обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen). Вкратце, 2 мкл случайных гексамеров (Roche) и 2 мкл 10 мМ dNTP добавляли к 22 мкл ДНК-обработанной РНК (что эквивалентно приблизительно 3 × 106 клеткам). Смесь нагревали до 65 ° С в течение 5 мин, затем слегка охлаждали на льду. Затем к смеси добавляли 8 мкл 5-кратного первого струнного буфера, 2 мкл 0,1 М DTT, 2 мкл RNaseOUT (Invitrogen) и 2 мкл SuperScript III. Реакцию инкубировали при 25 ° С в течение 5 мин, 45 ° С в течение 45 мин и 70 ° С в течение 15 мин. Полученную кДНК подвергали амплификации гена антитела с использованием полимеразы платины (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. Праймеры для амплификации генов антител были основаны на предыдущей публикации [48]. Праймеры, используемые для амплификации тяжелой цепи, были 5′-AGGAATTCTGCAGCTCTGGCACAGGAGCTC-3 ‘и 5′-CTCCGGATCCGTCGACAGGACTCACCACCTGAGGAGACGGTGACCA-3’. Праймеры, используемые для амплификации каппа-цепи, представляли собой 5′-TATCCGTGCACTCCACCATGGACACGAGGGCCCCCACT-3 ‘и 5′-GTTAGATCTATTCTACTCACGACCTTTGACCACCACCTCGGTCCCTCCGCCGAA-3′ или 5’- TCACTGGCGGTGCCCTGGCAGGCGTCT-3 ‘(только 10A37). Условия использования были следующими: Начальная денатурация при 94 ° C в течение 5 минут; затем 35 циклов 94 ° C в течение 30 секунд, 68 ° C в течение 1,5 минут; конечное удлинение при 68 ° С в течение 7 минут; удерживать при 4 ° C. Полученные продукты ПЦР были непосредственно секвенированы. Альтернативно, гибридомы 10А3 и 10А37 подвергали генерации кДНК генной генерации антитела и ПЦР с использованием одностадийной RT-PCR системы SuperScript III (Invitrogen) с использованием описанных праймеров.

Цепочки тяжелых и каппа-цепей анализировали с помощью IMGT / V-квеста [49] для определения использования зародышевой линии, присутствующих мутаций и длины домена CDR. Выравнивание последовательности белка проводили с Clustal Omega (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

Различные вариабельные области антитела были клонированы либо в pFUSEss-CHIg-hG1, и pFUSEss-CLIg-hk (человеческие консервативные области, тяжелая и каппа-цепь 10A3 соответственно, InvivoGen) или pFUSEss-CHIg-rG и pFUSEss-CLIg-rk2 (консервативные области кроликов, 10A37 тяжелая и каппа-цепь соответственно, InvivoGen) векторы для выражения. Тяжелые цепные праймеры для 10А3 были 5′-ACGTGAATTCGCAGGAGCAGCTGGAGGAGTC-3 ‘и 5′-GACCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAG-3’. Целевые праймеры каппа для 10А3 были 5′-GGTCGAATTCAGCTCAAGTGCTGACCCAG-3 ‘и 5′-GACCCGTACGTTTGACCACCACCTCG-3’. Тяжелые цепные праймеры для 10А37 представляли собой 5′-ACGTGAATTCGCAGGAGCAGCTGGTGGAGTC-3 ‘и 5′-GCCCACTCGAGACGGTGACCAGGGGGGGTGGGC-3’. Целевые праймеры каппа для 10А37 представляли собой 5′-GGCGAATTCAGCCCTTGTGATGACCCAG-3 ‘и 5′-CGAGCTAGCTCGCTCTAACAGTCACCCCTATTG-3’. Узлы ограничения, введенные для последующего клонирования, подчеркнуты. ПЦР-продукт тяжелой цепи для 10А3 и вектора расщепляли EcoRI и NheI. ПЦР-продукт каппа-цепи для 10А3 и вектора расщепляли EcoRI и BsiWI. Продукт ПЦР тяжелой цепи для 10A37 и вектора расщепляли EcoRI и XhoI. ПЦР-продукт каппа-цепи для 10A37 и вектора расщепляли EcoRI и NheI. Стандартные протоколы лигирования генерировали конечные 10A3 кроличье-человеческие химеры и 10A37 кроличьи экспрессирующие векторы, а последовательность подтвердила слияние фальсифицированной области области.

Для очистки антител 10A3 и 10A37 конструкции тяжелой и каппа-цепи были трансформированы в клетки фристайла 293F с 293фектином (Invitrogen). Супернатант собирали через 5 дней после трансфекции и осветляли центрифугированием с последующей иммобилизованной очисткой аффинной хроматографии на белке А (Pierce). Очищенные 10А3 и 10А37 диализовали в PBS (рН 7,4), аликвоты и затем хранили при -80 ° С.

В предыдущих докладах мы описали ответы антител против мономерного MCON6 gp120 у кроликов после пяти иммунизаций в течение примерно 29 недель [42,43]. Мы выбрали одного из животных (кролик № 2), который установил сильную нейтрализующую активность против Clade AE, изолята 1-го уровня TH023.6 (ID50> 43,740 в анализе TZM-bl), а также некоторую активность против изолятов уровня 2 для длительного -термическая оценка. Животным дали на отдых в течение 38 недель и иммунизировали 6-й раз на неделе 65 (фиг.1А). Образец сыворотки собирали непосредственно перед иммунизацией (называемой «до 6-й») для оценки долговечности ответов на антитела и для определения исходного уровня и через две недели после иммунизации на неделе 67 (называемой «пост 6-й») для оценки отозвать ответы.

(A) Сроки проведения иммунизации и сбора проб. (B) Сравнение антигенспецифических титров антител после 5-го, до 6-го и после 6-й иммунизации. В качестве отрицательного контроля использовали образец сыворотки из совпадающего по возрасту животного с матерью-иммунизацией, обозначенного как «PBS». A450 представляет собой значение поглощения при 450 нм. Эта же легенда внизу используется для всех панелей. (C) Нейтрализующая активность против MN.3, MW965.26 и SF162.LS. (D) Образец сыворотки после 6-й иммунизации был протестирован на предмет конкуренции против VRC01 и PGT121. Значения на оси х представляют собой концентрацию сыворотки (1 / коэффициент разбавления).

Уровни антител контролировали с помощью ELISA с использованием аутологичного антигена (фиг.1В). Образец сыворотки, собранный через две недели после пятой иммунизации (на 29-й неделе), использовался для прямого сравнения. В качестве отрицательного контроля использовалась сыворотка от совпадающего по возрасту, подмешанного иммунитета кролика (обозначаемого как «PBS»). Результаты показали, что уровень антител снижался примерно в 7-8 раз в течение 38 недель периода покоя после пятой иммунизации (предполагаемый период полураспада около 12,7 недель). Однако после шестой иммунизации уровень антител повышался до уровня, достигнутого после пятой иммунизации, которая, по-видимому, являлась максимальным достижимым титром антител. Иммуногенный профиль линейного эпитопа, определенный методом ELISA с использованием 15-мерных перекрывающихся пептидов, во многом был подобен наблюдаемому после пятой иммунизации (S1 Fig. [43]).

Как описано ранее [42, 43], эффективность нейтрализующей активности, индуцированной у этого кролика, была довольно существенной, хотя и в значительной степени против вирусов первого уровня. Более интересно, были обнаружены антитела, которые могли конкурировать с bnAbs VRC01, а также PGT121 и PGT126 в связывании gp120 [43]. Хотя мы не обнаружили широко нейтрализующую активность против вирусов второго уровня, мы предположили, что лучшее понимание антител, индуцированных gp120, может обеспечить лучший дизайн будущих иммуногенов, а также стратегии иммунизации. Наша цель состояла в том, чтобы охарактеризовать эти антитела на моноклональном уровне. Поскольку такие характеристики являются трудоемкими и трудоемкими, мы сначала изучили, поддерживал ли кролик nAbs, а также конкурирующие антитела VRC01- и PGT121, прежде чем проводить подробный молекулярный анализ.

Нейтрализующую активность сывороток от до и после 6-й иммунизации тестировали на вирусы уровня 1A от Clade B (MN.3 и SF162.LS) и Clade C (MW965.26). Образец сыворотки после 5-й иммунизации также тестировался для сравнения. Как и ожидалось, нейтрализующая активность снижалась против всех трех вирусов в период покоя между пятой и шестой иммунизацией (рис. 1С), как и снижение, наблюдаемое в титрах антител (рис. 1А). После шестой иммунизации сывороточная нейтрализация увеличивалась, но оставалась на несколько более низком уровне, чем то, что наблюдалось после пятой иммунизации. Следует отметить, что значительное повышение инфекционной активности псевдовируса наблюдалось в манекен-иммунизированной сыворотке при использовании в высоких концентрациях (менее 1: 100 разведения, проявлялось как отрицательная нейтрализация). Причина этого явления пока неизвестна. Анализ конкуренции антител также показал, что антитела, которые могли конкурировать с bnAbs VRC01 и PGT121 в связывании gp120, также поддерживались (рис. 1D), хотя и на несколько более низком уровне по сравнению с уровнем, наблюдаемым после пятой иммунизации [43]. Все вместе, эти результаты показали, что, несмотря на небольшое снижение активности нейтрализации и уровня антител, которые конкурируют с bnAbs, общее качество ответов на антитела оставалось в значительной степени неизменным, несмотря на длительный период покоя. Основываясь на этих результатах, мы решили дополнительно характеризовать ответы антител, генерируя mAb.

Чтобы генерировать гибридомы, кролику вводили внутривенно 1 мг растворимого gp120 в PBS без адъювантов на 76 неделе. Четыре дня спустя спленоциты собирали для получения гибридом. Из десяти 96-луночных планшетов, используемых для слияния, были получены 548 гибридом. Супернатанты гибридомы собирали и скринировали на связывание gp120 с помощью ELISA. В общей сложности 95 клонов были специфичными к gp120 (17,3% эффективности клонирования), хотя два были потеряны во время распространения.

С давней целью создания базы данных, основанной на вакцинах «антителодиома» для gp120, мы приложили усилия, чтобы определить эпитопы, распознаваемые mAb, выполнив ELISA с супернатантом культуры гибридом. Помимо gp120, была оценена реакционная способность против трех других белковых конструкций, полученных из оболочки, включая gp120-OD (внешний домен MCON6 gp120, о котором мы сообщали недавно, [42]), BG505 SOSIP gp140 (растворимая, стабильная тримерная оболочка, [50, 51]), и eOD-GT6 (инженерный внешний домен, который может связывать BCR зародышевой линии VRC01; [52]). Для сужения эпитопов использовалось много пептидов, которые, как было показано, были высокоиммуногенными (S1 Fig, [43]). Результаты этих ELISA приведены на рис. 2. Линейные эпитопы для 35 из 93 mAb были идентифицированы: группа 1 (C1), группа 2 (C2), группа 3 (C5), группа 4 (V3) и группа 5 (V5). Остальные mAb, эпитопы которых не могли быть определены для коротких линейных пептидов, были сгруппированы в зависимости от их реактивности против gp120, gp120-OD и gp140.

Гибридомы оценивали по реакционной способности против gp120, gp120-OD, BG505 SOSIP gp140, а также eOD-GT6 и большой панели пептидов. Гибридомы расположены группами в зависимости от их линейных эпитопов или их реакционной способности к трем белкам. NT: не проверено.

Из 35 mAb с известными линейными эпитопами 20 были против пептида 9096, который расположен на самом C-конце gp120 в C5-области, что указывает на то, что он является чрезвычайно иммуногенным на растворимом gp120. Пять других mAb были направлены против эпитопов во внутренней области: три против C1 (пептиды 8991 и 8992) и два против C2 (пептиды 9035 и 9036). Интересно, что mAb 5-37 реагирует как с пептидами 9035, так и с 9036, тогда как mAb 9-59 связывает только пептид 9035. Кроме того, только 9-59 связаны gp140, что указывает на четкую разницу между двумя mAb в аминокислотных остатках, которые распознаются и / или угол захода на посадку эпитопа. Хотя пептид 9003, расположенный только выше по течению от петли V1, также был иммуногенным, мы не выделяли никаких mAb, направленных против пептида. Во внешней области gp120 семь mAb (1-35, 1-36, 2-37, 8-34-1, 9-13, 10A3 и 10A37) были направлены против контура V3 и трех mAb (2-5- 1, 9-6 и 5-12) связывают пептид V5. Чтобы облегчить визуализацию, на кристаллическую структуру SOSIP gp140 нанесен ряд иммуногенных эпитопов (рис. 3).

Кристаллическую структуру тримера BG505 SOSIP gp140 (pdb: 4NCO) использовали для иллюстрации местоположений иммуногенных пептидов. Для ясности показана только часть gp120. Внешний домен показан в извести, а внутренняя область показана в трех оттенках серого. Часть пептида 9094 и 9096 из области С5 (обозначенная в более светлом пурпуровом оттенке) не показана в кристаллической структуре. Стрелка указывает на положение пяти аминокислот (VKIEP) на пептиде 9094. Для простоты местоположения петель V3 и V5 показаны только на виде сбоку.

Было семь mAb, которые связывали gp120 и gp120-OD, но не SOSIP gp140 (mAb в группе 8 и mAb 5-12 в группе 5). В целом, MCON6 и BG505 имеют 81% идентичность аминокислотной последовательности. Таким образом, одна из возможностей заключается в том, что аминокислотные последовательности между MCON6 и BG505 различны у этих эпитопов. Альтернативно, эпитопы могут быть недоступны на тримерном SOSIP gp140. Интересно, что 5-12 был единственным mAb, который мог связывать eOD-GT6. Более того, это был единственный mAb V5, который не смог привязать gp140. Удивительно, что анализ выравнивания аминокислотной последовательности области вокруг петли V5 показал, что последовательность SOSIP gp140 на самом деле более гомологична MCON6 gp120, чем eOD-GT6 (рис. 4). В настоящее время неизвестно, почему 5-12 mAb связывается с MCON6 gp120, gp120-OD и eOD-GT6, но не с SOSIP gp140.

Показаны последовательности для трех антигенов, используемых для ELISA (MCON6 gp120, BG505 SOSIP gp140 и eOD-GT6). Пептид V5, используемый для ELISA, помещается в коробку. Идентичные аминокислотные остатки обозначены красным. Остатки, которые контактируют с bnAb VRC01 или CD4, обозначены красными или голубыми кругами.

Так как сыворотка от кролика показала значительную конкуренцию против VRC01 и PGT121 (рис. 1D), мы скринировали все гибридомы для конкурирующих действий против этих bnAbs. К сожалению, мы не обнаружили никаких гибридом, которые могли бы конкурировать с VRC01 за связывание gp120, предполагая, что такие антитела могут быть редкими. Учитывая, что только небольшая часть спленоцитов, вероятно, давала гибридомы, вероятно, что В-клетки, экспрессирующие конкурирующие антитела VRC01, не были включены в нашу панель. При скрининге mAb, которые могли конкурировать с PGT121, мы обнаружили семь гибридом, обладающих низкой, но определенной активностью (рис. 5A). Интересно, что все конкурирующие гибридомы были реакционноспособны против пептида V3 (рис. 2), предполагая, что конкуренция в сыворотке, наблюдаемая против PGT121, может быть обусловлена ​​сильным анти-V3-антителом. Наконец, мы провели скрининг всех гибридом для нейтрализации активности против псевдовирусов уровня 1 SF162.LC и MW965.26. Супернатанты культуры из двух V3-пептидных положительных гибридом, 10A3 и 10A37, показали сильную нейтрализующую активность (см. Ниже).

(A) Супернатанты культуры гибридом, специфичные к петле V3, оценивали для конкурирующей активности против PGT121 для связывания gp120. Значения на оси х представляют собой концентрацию супернатанта (1 / коэффициент разбавления). (B) Рекомбинантный mAb 10A37 использовали для конкурентного анализа. В качестве отрицательного контроля использовали анти-gp41, рекомбинантный mAb 2C2.

Так как все mAb петли против V3 могли конкурировать с PGT121, а две из них проявляли нейтрализующую активность, все они были дополнительно охарактеризованы. Во-первых, анализ тонкого эпитопного картирования проводился с использованием перекрывающихся линейных пептидов с 15 мерами, которые охватывают всю длину цикла V3 (рис. 6). Результаты ELISA показали, что пептид 9048 (NNNTRKSIRIGPGQA) является наиболее иммунореактивным сегментом в петле V3, так как пять mAb могут взаимодействовать с этим пептидом. Это согласуется с наблюдением, что N-концевая половина петли V3 более иммуногенна, чем C-концевая половина [42, 43]. mAb 1-36 и 8-34-1 распознают только пептид 9048. Другая пара, 2-37 и 9-13, связанная с пептидами 9047 (CTRPNNNTRKSIRIG) и 9048. Гибридома 1-35 была только слабо положительной для пептида 9050 (RIGPGQAFYATGDII) , Две гибридомы, которые были идентифицированы как имеющие нейтрализующую активность, 10А3 и 10А37, демонстрировали совершенно разные образцы распознавания пептидов. 10A3 наиболее сильно реагировали на пептид 9049 (RKSIRIGPGQAFYAT), но также распознавали пептиды 9047 и 9048. Пептид 9049 имеет кончик короны V3 (GPGQ) почти точно в центре. Это предполагает, что mAb 10A3 имеет профиль многих других нейтрализующих mAb против V3, таких как 447-52D [53] и HGN194 [54]. В отличие от 10А3, 10А37 сильно реагирует с пептидом 9050 и умеренно до пептида 9051 (GQAFYATGDIIGDIR). Из семи mAb 10A37 был единственным, который распознавал пептид 9051, что указывает на то, что распознавание C-концевой половины цикла V3 действительно редко. В связи с этим, 10A37 представляет собой новый mAb V3.

Конъюгативные антитела V3 тестировали на связывание с перекрывающимися 15-мерными пептидами, охватывающими весь цикл с помощью ELISA. Последовательности пептидов показаны внизу.

Чтобы дополнительно характеризовать mAb V3 на молекулярном уровне, гены антител были RT-PCR амплифицированы из гибридом, секвенированы и проанализированы с использованием базы данных IMGT / V-QUEST [49]. Во-первых, многие из mAb использовали одни и те же гены зародышевой V (рис. 7, S2 рис.). Четыре из mAb (10A37, 1-36, 2-37 и 10A3), включая две, которые проявили нейтрализующую активность, использовали V1S45 * 01 VH ген. mAb 8-34-1 и 9-13 были получены из V1S40 * 01. Были две пары mAb, которые использовали один и тот же ген Vk (V1S36 * 01 для 10A37 и 1-35, и V1S56 * 01 для 1-36 и 8-34-1). Интересно, что легкая цепь mAb 10A37 и 1-35, оба из которых связаны пептидом 9050, были почти идентичны. Напротив, последовательности HCDR, которые были получены из разных зародышевых линий, были только примерно на 53-56% идентичными.

Тяжелая и легкая цепи семи V3-позитивных mAb были выровнены для анализа. Сравнение проводили на основе реакционной способности пептидов, показанной на фиг.6. Процентные показатели указывают на тождество аминокислот между двумя сравниваемыми CDR.

Подобно 10А37 и 1-35, mAbs 1-36 и 8-34-1, оба из которых связаны только с пептидом 9048, были получены из одного и того же гена V1S56 * 01 Vk. Аминокислотные идентификаторы для LCDR1, -2 и -3 составляли 63%, 100% и 93% соответственно. Несмотря на то, что их VH-гены были получены из разных зародышевых линий, их последовательности HCDR1 и HCDR3 были очень похожими (78% и 63% соответственно). И наоборот, mAb 10A3 и 2-37, оба из которых связаны пептидами 9047 и 9048, происходили из той же самой зародышевой линии V1S45 * 01 VH, но их последовательности HCDR1, -2 и -3 были заметно различны (только 56%, 33% и 20 % идентичности, соответственно). Эти различия могли бы позволить 10A3 сильно связывать пептид 9049 и проявлять нейтрализующую активность.

Для дальнейшей характеристики нейтрализующей активности рекомбинантные mAb 10A3 и 10A37 клонировали, экспрессировали и очищали. Их эффективность и широту оценивали с использованием стандартного теста нейтрализации TZM-bl против большой панели псевдовирусов уровня 1 и 2 из разных кладов (рис. 8). Рекомбинантный mAb 10A3 нейтрализовал несколько изолятов Clade B и Clade C уровня 1A и 1B, а также один вирус Clade C вируса уровня 2 (TV1.21). Нейтрализация потенции и широты mAb 10A37 была более впечатляющей, чем 10A3, способной нейтрализовать несколько дополнительных вирусов. В частности, 10А37 проявлял сильную нейтрализующую активность против вируса Clade AE ​​TH023.6, который, как было показано, очень восприимчив к иммунной сыворотке, показанной в предыдущем докладе [42]. Кроме того, 10A37 удалось нейтрализовать вирус Clade C 25710-2.43 уровня 2, который является одним из двенадцати изолятов вируса, которые относятся к новой «глобальной группе эталонных штаммов» [55]. К сожалению, 10A37 не нейтрализует ни один из других одиннадцати вирусов из «глобальной панели» (то есть IC50> 25 мкг / мл). 10А37 и 10А3, объединенные, смогли нейтрализовать 11 из 15 тестируемых вирусов уровня 1А и 1В (73%) и только 3/18 уровня 2 вируса (17%). Однако их было недостаточно для повторной полной нейтрализующей активности антител, присутствующих в иммунной сыворотке, которая была в состоянии нейтрализовать MN.3 [42].

V3 положительные mAb 10A37 и 10A3 были протестированы на нейтрализацию против псевдовирусов, принадлежащих к различным кланам и уровням ВИЧ-1, и показаны их значения IC50 (мкг / мл). Эти mAb сравнивали с комбинацией двух mAb (CH01 и VRC-CH31), которые, как известно, демонстрируют широкую кросс-кладевую нейтрализацию [56].

На фиг.5А мы показали, что все mAb анти-V3-контура проявили способность конкурировать с PGT121 для связывания gp120. Чтобы подтвердить, что антитела против V3-петли действительно способны конкурировать с PGT121, мы использовали рекомбинантный 10A37. Как показано на фиг.5B, 10A37 удалось эффективно конкурировать с PGT121 для связывания gp120. Эти результаты показывают, что конкурирующая активность PGT121, наблюдаемая нами в иммунных сыворотках, может быть фактически обусловлена ​​антителами против V3, а не истинными антителами, подобными PGT121, которые связывают V3 и глицин, непосредственно примыкающий к C-концу V3.

В области разработки вакцины против ВИЧ-1 очень мало помогло недавнее открытие новых bnAbs [11]. Кроме того, анализ глубокого секвенирования выявил сложную эволюцию, которую должна зародить зародышевую линию иммуноглобулина, чтобы генерировать эти редкие антитела [57,58]. Дополнительные исследования структуры антител, особенно когда они выполняются в комплексе с гликопротеинами оболочки ВИЧ-1, дали ценную информацию для создания рационально разработанных иммуногенов [50-52]. Тем не менее, перевод информации, полученной в результате этих исследований, на разработку иммуногенов, которые могут вызывать подобные bnAbs, был затруднен. Критический факт, который необходимо иметь в виду, состоит в том, что инфицированные ВИЧ-1 люди предоставляют среду, в которой реакции вируса и иммунной системы развиваются вместе. Эта динамическая среда, создаваемая хронической вирусной инфекцией, трудно реплицировать с использованием любого режима вакцинации. Следовательно, хотя характеристика ответов антител у инфицированных вирусом людей ценна, исследования иммунизации на моделях на животных остаются жизненно важным средством оценки реалистичных стратегий вакцинации против ВИЧ-1.

Из всех исследований иммунизации ВИЧ-1 Env, проведенных на животных моделях, только ограниченное число исследований пытались дополнительно охарактеризовать ответы антител на клональном уровне. Генерирование mAb является трудоемким и трудоемким процессом. Тем не менее, они могут значительно помочь в понимании иммунного ответа, как показано в этом исследовании. Во-первых, mAb позволяют точно отображать эпитопы В-клеток, что было бы невозможно при использовании поликлональной антисыворотки. Это обеспечило бы необходимую информацию для создания всеобъемлющей карты вакцин-индуцированного антителоида против гликопротеина оболочки ВИЧ-1, который, по нашему мнению, будет иметь решающее значение для разработки вакцины, которая может индуцировать bnAbs против вируса. В этом исследовании, в качестве первоначальной попытки определить эпитопы, признанные тем, что мы считаем самой большой группой моноклональных антител против gp120, сгенерированных до настоящего времени, мы исследовали реакционную способность антител к различным белковым конструкциям и некоторые из иммуногенных пептидов, идентифицированных из перекрывающегося пептидного ELISA [ 43]. Характеристика целевых эпитопов значительно поможет нашему пониманию иммунных реакций против ВИЧ-1. В этом отчете основное внимание было уделено основным модам V3, поскольку два из них проявили сильную нейтрализующую активность против вирусов уровня 1 с заметной шириной.

Цикл V3 известен как основной нейтрализующий детерминант более двух десятилетий [59,60]. Несмотря на то, что nAbs, нацеленные на этот эпитоп, имеют ограниченную ширину и в основном против вирусов уровня 1, они являются единственными, которые могут быть вызваны последовательно как у животных, так и у людей в условиях вакцинации. Следует, однако, отметить, что не все нейтрализующие mAb анти-V3 обладают одинаковой эффективностью или широтой; в то время как некоторые только нейтрализуют аутологичные штаммы вакцины, другие действительно имеют заметную ширину. Большинство широко нейтрализующих mAb V3, которые были известны до настоящего времени, были получены от инфицированных вирусом пациентов, включая 447-52D, о которых сообщалось более 20 лет назад [53]. Недавно Hioe et al. [60] проверили широту и эффективность семи антагонистов антител против V3 человека. Их исследование показало, что тестируемые псевдовирусы 56/98 (57%) (как изоляты уровня 1, так и 2 из Clades A, AG, B, C и D) могут быть нейтрализованы одним или несколькими mAb (с использованием методологии Area Under Curve). Более того, 9/24 (37,5%) вирусы уровня 2 могут быть нейтрализованы одним или несколькими mAb. В другом исследовании Corti et al. [54] характеризуется анти-V3 mAb HGN194 в прямом сравнении с 447-52D. В то время как 447-52D могли нейтрализовать только 88% 1-го уровня и 4% тестируемых вирусов уровня 2, HGN194 смог нейтрализовать все уровни 1 и 11% вирусов уровня 2, что говорит о превосходной широте.

В отличие от mAb, образующихся от инфицированных вирусом людей, гораздо меньше мАт, полученных от животных, иммунизированных антигенами ВИЧ-1, особенно тех, которые проявляют нейтрализующую активность. В последнее время, однако, Chen et al. сообщил о выделении двенадцати mAb у кролика, иммунизированного вакцинированной вакциной JR-FL gp120 с ДНК-белком ДНК [39]. Одно из полученных антител, R56, предназначалось для цикла V3 и нейтрализованных вирусов множественного уровня 1, принадлежащих Clades B, C, AE и AG, а также двух уровней вирусов второго уровня в стандартных тестах TZM-bl. Нелегко сравнить эффективность нейтрализации или широту различных mAb, охарактеризованных в разных лабораториях, потому что не все те же вирусы протестированы, и анализы не выполняются с идентичными вирусными запасами. Сказав это, эффективность 10А37 оказалась выше, чем у R56. Например, 10A37 нейтрализовало пять вирусов, которых R56 не смог, включая MS208.A1 (Clade A), 6535.3 (Clade B), ZM109F.PB4, 00836-2.5 и 25710-2.43 (Clade C). Эффективность нейтрализации (IC50) 10A37 также была значительно больше R56 для множественных вирусов: TH023.6 (<0,03 против 18,57 мкг / мл)), SF162.LS (<0,03 против 0,1), Bal.26 (0,15 против 2.07), Bx08.16 (0.61 против 3.18), SS1196.1 (2.97 против 7.18). Единственный вирус R56 нейтрализован, но не мог на 10A37 был TV1.21 (Clade C). Однако 10A3 может нейтрализовать TV1.21 с большей эффективностью, чем R56 (5,1 против 25,63 мкг / мл). Удивительно, но ни один из трех mAb кролика не мог нейтрализовать MN.3, который обычно считается высокочувствительным изолятом уровня 1. Хотя существует известная структурная основа для отказа R56 нейтрализовать MN.3 [61], причина отсутствия нейтрализации на 10A3 и 10A37 еще предстоит определить. Интересно, что ни 10A3, ни 10A37 не нейтрализовали BG505ΔCT / T332N, несмотря на то, что эти два mAb сильно реагировали на SOSIP gp140 с помощью ELISA (рис. 2).

Одним из преимуществ mAb является то, что они позволяют функциональное разделение антител с различными свойствами. Таким образом, одна из наших целей заключалась в том, чтобы изолировать mAb, которые могли конкурировать с bnAbs VRC01 или PGT121 в привязке gp120. К сожалению, нам не удалось определить какие-либо конкурирующие мотыги VRC01. С другой стороны, мы идентифицировали семь mAb, которые могли конкурировать с PGT121, и они оказались специфичными для цикла V3. Этот результат указывает на то, что конкурирующая активность PGT121, обнаруженная нами в иммунных сыворотках [43], вероятно, связана с высоким уровнем антител против петли V3. Это открытие подчеркивает возможность того, что индукция высоких титров антител V3-петли может препятствовать выведению более эффективных антител, подобных PGT121. Таким образом, может быть разумным свести к минимуму иммуногенность петли V3 в будущей конструкции иммуногена.

Еще одним важным преимуществом работы с mAb является способность оценивать репертуар антител и функционировать на молекулярном уровне. Это особенно полезно при оценке множественных mAb, которые нацелены на близлежащие эпитопы в данной области (например, V3-петле), но при этом обладают различными функциональными фенотипами (например, нейтрализующими или нейтрализующими). Хорошими примерами являются нейтрализующий mAb 10A37 и нейтрализующий mAb 1-35. Эти mAb нацелены на один и тот же эпитоп (т. Е. RIGPGQAFYATGDII), хотя и с различным сродством. Хотя их легкие цепи происходят из одной и той же зародышевой линии и практически идентичны последовательно, их последовательности тяжелой цепи довольно расходятся, что указывает на то, что различия в их тяжелых цепях, вероятно, объясняют фенотипическую разницу. Следует подчеркнуть, что генерируемые нами mAb скорее всего представляют собой лишь небольшое подмножество всех антител, которые могут связывать любой данный эпитоп. Таким образом, они обеспечивают лишь моментальный снимок длинного эволюционного пути. Последовательное профилирование всех выраженных антител у иммунизированного животного с использованием NGS обеспечивало бы средства для изучения различий в пути созревания нейтрализующих и нейтрализующих антител без ограничений, налагаемых гибридомной продукцией.

Предполагая, что все В-клетки имеют равные шансы слиться в гибридомы и что специфичность антител не влияет на выживаемость гибридом, частота гибридом, нацеленная на данный эпитоп, должна представлять относительную иммуногенность эпитопа. В связи с этим единственным наиболее частым эпитопом, распознаваемым mAb, является пептид 9096 (20 из 93 mAb), который мы ранее идентифицировали как единственный наиболее иммуногенный пептид на основе ELISA с антисывороткой. Пептид 9096 находится на самом С-конце gp120. Следующим наиболее иммуногенным эпитопом является петля V3. Учитывая, что антитела, которые связывают эти эпитопы, либо нейтрализуются, либо нейтрализуются с ограниченной шириной, для улучшения фокусировки иммунных реакций в отношении эпитопов, нацеленных на bnAbs, потребуется лучшая иммуногенная или вакцинная стратегия. Хотя нам не удалось индуцировать bnAbs в этом исследовании с использованием MCON6 gp120, разработанные нами методологии и созданные нами реагенты должны облегчить оценку ответов антител против других иммуногенов или стратегий вакцинации в будущем.

В этом исследовании ответы антител против MCON6 gp120 у кролика были дополнительно охарактеризованы на клональном уровне с использованием большой панели моноклональных антител (mAb), полученных от иммунизированного животного. Эпитопы определяли с использованием набора различных конструкций белка оболочки, а также линейных пептидов. Наиболее иммуногенный эпитоп был на С-конце белка, а затем на петле V3. Были выделены два новых нейтрализующих антитела (nAbs) против петли V3 (10A3 и 10A37). В то время как 10А3 был похож на многие ранее изолированные нейтрализующие mAb, распознающие N-концевую половину петли V3, включая коронку на кончике, 10A37 был атипичным с эпитопом, расположенным ближе к C-концевой половине петли. 10A37 проявляли сильную нейтрализующую активность с существенной широтой против множественных кладов ВИЧ-1, которые проявляют фенотип нейтрализации уровня 1А и уровня 1B. Насколько нам известно, это наиболее эффективный и широко нейтрализующий mAb против V3, выделенный из вакцинированного животного или человека на сегодняшний день. Дальнейшая характеристика его структуры, а также связанного с ней эпитопа может дать важную информацию о механизме нейтрализации.

ELISA проводили с антисывороткой, собранной у кролика № 2 после шестой иммунизации с использованием перекрывающихся пептидов. Номера пептидов представляют собой номера каталогов из Программы реактивов против СПИДа NIH. На рисунке показана схема gp120. A450 представляет собой значение поглощения при 450 нм.

(TIFF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Выражения показаны для V-областей (A) тяжелых и (B) каппа-цепей семи антител. Показаны области кадрирования (FR) и дополнительные определяющие области (CDR, красный текст) с сохранением аминокислот ниже выравнивания: «*» идентичны, «:« очень похожи ». «Немного похоже. Выравнивания выполнялись в Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).

(TIFF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Следующие реагенты были получены в рамках программы NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 Consensus Group M Env (№ 9487); HIV-1 gp120 MAb (VRC01) от доктора Джона Маскола (Cat # 12033) и PGT121 (Cat # 12343). Мы благодарны д-ру Беатрисе Хану, доктору Кэтрин Л. Найт, д-ру Эвон Ивонн Джонс и д-ру Джону П. Муру за создание конструкций MCON6, конструкций 240E-1, pHLsec и BG505 SOSIP gp140 соответственно.

Комментариев нет.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *